一、苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达（论文文献综述）
孔浩然[1]（2020）在《苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估》文中研究说明长期以来,具有高效、速效、经济和使用方便的有机合成农药是养殖场赖以防蝇的最主要的手段,但是由于长时间、大量、长期使用有机合成灭虫剂,“3R”问题（resistance,resurgence,residue）也会随之而来,同时化学灭虫剂的作用也难以得到保证,甚者危害人类健康,污染环境。而生物型灭虫剂拥有低毒、易降解、对人畜无害、害虫不容易产生耐药性等特点,可满足生态学发展的需求,是未来新型杀虫剂研制的重要方向之一。近年来,生物型杀虫剂研制发展较为迅速、应用也较为广泛,尤其以苏云金芽孢杆菌为代表新型制剂正处于研发和应用阶段,其防虫原理是分泌的内毒素（伴胞晶体）具有胃毒素,害虫因此停止进食,最后因饥饿、神经紊乱、细胞壁破裂而死。苏云金芽孢杆菌以色列亚种最初用于杀虫主要是针对双翅目蚊的卵和幼虫,本实验意外发现该亚种的内毒素CryIVD基因对家蝇（尤其是对其蝇的卵）具有着较强的杀灭作用。本文参照NCBI GenBank 中已发布的目的基因序列（登录号EU124377.1）,采用软件Primer6.0设计用于扩增CryIVD基因的引物,并在两端引入限制性酶切位点。对增殖的苏云金芽孢杆菌以色列亚种提取基因组DNA,采用PCR技术扩增CryIVD基因,将PCR产物与pMD19-T载体连接构建克隆质粒,然后进行酶切鉴定并测定序列,并进行同源性分析;将目的进行连接至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建重组质粒pGEX-4T-CryIVD,经PCR鉴定为阳性克隆后,并对其采用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹技术进行鉴定;利用重组表达CryIVD在体外开展了急性毒理试验,评估对家蝇的杀灭效果。结果表明:成功扩增出目的基因,其大小为660 bp。序列分析显示,其与Bacillus thuringiensis strain DAB-Bt2 Cry4d gene同源性最高,达100%,进化树分析也显示其与Bacillus thuringiensis strain DAB-Bt2 Cry4d gene 在遗传距离上最为接近;质粒pGEX-4T-CryIVD经IPTG诱导后,可表达出目的蛋白,其大小约为51kDa融合蛋白;体外毒性试验结果表明:CryIVD蛋白对蝇卵的杀灭效果较好,其LD50可达7.87×107cells/g;而对家蝇成虫的杀灭效果一般,其LD50为6.30×105cells/只。由此可见,重组表达的CryIVD对家蝇的卵具有良好的杀灭作用,是一种具有潜在性地可替代化学药物灭蝇方法。
于爽[2]（2020）在《苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造》文中提出害虫是影响农林生产力的主要因素之一。随着化学杀虫剂对环境的污染日益严重,生物杀虫剂的应用越来越普遍。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）能够产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）、营养期杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins,Vips）等不同类型的杀虫蛋白,由于Vips与ICPs的杀虫谱和作用机制存在差异性,Vips一直是研究的热点。自发现Vip3A蛋白以来,虽然有大量的关于Vip3A蛋白的研究,但是其三维结构尚未解析,Vip3A蛋白结构与功能之间的关系知之甚少,而且还存在杀虫活性有待进一步提高等问题。本研究以对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的Vip3Aa39为对象,通过构建嵌合蛋白和突变体确定了Vip3Aa39关键功能区和关键氨基酸位点。无活性的vip3Ad是本研究新筛选获得,用于与vip3Aa39构建嵌合基因,以期得到关键氨基酸片段。通过对比vip3Aa39和vip3Ad核苷酸序列,利用同源重组技术,采用重叠延伸PCR方法进行了Vip3Aa39与Vip3Ad的氨基酸片段互换,构建10个嵌合基因,诱导表达蛋白对棉铃虫（Helicoverpa armigera）、小菜蛾（Plutella xyllostella）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）3种鳞翅目供试昆虫进行生物活性测定,并通过同源建模预测了Vip3Aa39改造蛋白的三维结构信息,对比分析嵌合蛋白的生物活性与结构关系得到Vip3Aa39关键氨基酸片段;为进一步研究Vip3Aa39蛋白杀虫关键氨基酸位点,对本实验室已验证杀虫活性有明显差异的Vip3Aa11与Vip3Aa39的氨基酸同源性进行分析,发现二者仅有39个氨基酸的差异,利用生物信息学方法,确定15个不同靶点,将Vip3Aa39蛋白中的相应氨基酸突变为Vip3Aa11相应的氨基酸,构建15个突变体。诱导表达后以棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾为供试昆虫进行生物活性测定,结合预测的Vip3Aa39突变体蛋白三维结构信息,确定影响Vip3Aa39蛋白活性的关键氨基酸位点5个。主要研究结果如下:1.筛选得到嵌合蛋白构建材料无活性的vip3Ad基因。为获得无活性Vip3A蛋白与已有高活性Vip3Aa39蛋白构建嵌合蛋白用以确定关键氨基酸片段,利用温度筛选法和PCR方法从4034份土样中筛选新基因。从菌株BJG810中得到了vip3Ad基因,vip3Ad基因的编码框长2361 bp,与vip3Ad2（CAI43276）核酸序列相似性达到99.36%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP346519。转化BL21（DE3）中,诱导表达,得到～88k Da的蛋白,生物活性测定表明蛋白对3种鳞翅目供试昆虫棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾均无杀虫活性,与Vip3Aa39序列比对表明两蛋白的氨基酸同源性为85%,获得了嵌合蛋白构建的基因材料。2.构建嵌合蛋白,获得了Vip3Aa39蛋白的关键氨基酸片段。成功构建以Vip3Ad蛋白N-端起始的Vip3Ad Aa类蛋白4个。将Vip3Aa39的N-端氨基酸片段替换为Vip3Ad蛋白的相应片段得到重组蛋白4个,分别为Vip3Ad Aa-1（氨基酸1-60被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-2（氨基酸1-116被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-3（氨基酸1-344被Vip3Ad取代）,Vip3Ad Aa-4（氨基酸1-455被Vip3Ad取代）。Vip3Ad Aa-1杀虫活性与Vip3Aa39相比对三种昆虫的LC50值均降低,杀虫活性显着增加,Vip3Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸（T6,N45,E60）;Vip3Ad Aa-2对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性与Vip3Aa39相比没有显着差异,而显着降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-3对棉铃虫的杀虫活性显着提高而降低了对甜菜夜蛾的杀虫活性;与Vip3Aa39相比,Vip3Ad Aa-4对小菜蛾的杀虫活性显着升高。成功构建Vip3Aa39的中间氨基酸片段替换为Vip3Ad相应片段的Vip3Aa Ad Aa类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad Aa-1（氨基酸116-210被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-2（氨基酸210-345被Vip3Ad取代）,Vip3Aa Ad Aa-3（氨基酸455-632被Vip3Ad取代）。Vip3Aa Ad Aa-1对甜菜夜蛾杀虫活性的显着降低,几乎丧失了对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性,氨基酸比对发现Vip3Aa Ad Aa-1与Vip3Aa39只有3个差异氨基酸位点（A134V,I176M,S200P）;Vip3Aa Ad Aa-2显着提高对棉铃虫的杀虫活性,降低了对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa Ad Aa-3对小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性均显着降低。成功构建以Vip3Ad蛋白C-端为结尾的Vip3Aa Ad类蛋白3个。分别为Vip3Aa Ad-1（氨基酸345-789被取代）,Vip3Aa Ad-2（氨基酸727-789被取代）;Vip3Aa Ad-3（氨基酸778-789被取代）。蛋白的杀虫活性表明:Vip3Aa Ad-1和Vip3Aa Ad-2对3种昆虫丧失了活性;Vip3Aa Ad-3对3种昆虫均具有杀虫活性,提高了对棉铃虫的杀虫活性而降低了对小菜蛾的杀虫活性。综合以上分析,Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210是维持对棉铃虫活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、210-345、778-789提升对棉铃虫的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、210-345、455-632、778-789是维持对小菜蛾活性的关键氨基酸片段,可以通过改造Vip3Aa39的氨基酸片段1-60、1-455提升对小菜蛾的杀虫活性;Vip3Aa39的氨基酸片段61-116、116-210、1-344、455-632是维持对甜菜夜蛾活性的关键氨基酸片段;其中Vip3Aa39的氨基酸片段116-210是对这三种昆虫的关键氨基酸片段;可以通过改造Vip3Aa39的1-60提升对三种试虫的生物活性。明确了两个重要氨基酸位点组合,（A134V,I176M,S200P）组合改造后对3种试虫活性丧失,说明是Vip3Aa39的关键氨基酸位点组合;（T6A,N45D,E60D）组合改造后对3种试虫生物活性显着升高,说明可以通过改造此氨基酸位点组合提高对3种试虫的生物活性。3.获得了15个突变体蛋白,确定5个Vip3Aa39杀虫的关键氨基酸位点。成功构建了15个突变体（N9S、A10T、T193S、L194S、S200G、N543S、L544I、G546E、E547D、V681T、I685T、R686S、L780I、K782H和N784Y）。对突变体蛋白进行杀虫活性测定和结构分析,结果表明:与Vip3Aa39相比,突变体蛋白对三种昆虫的杀虫活性均发生了不同程度的变化。L544I、R686S和N784Y突变体蛋白对棉铃虫和小菜蛾的杀虫活性均有显着提高;N9S、S200G、N543S、L544I、E547D、V681T、I685T和K782H突变体蛋白均显着提高了对甜菜夜蛾的杀虫活性。从而确定了L194、N543、L544、K782、N784五个氨基酸位点可能是对Vip3Aa39蛋白杀虫活性起关键作用的位点。4.嵌合蛋白和突变体蛋白胰蛋白酶消化结果显示,除Vip3Aa Ad-2,A10T外,其余均被消化成稳定的62k Da片段,证实胰蛋白酶参与了改造蛋白的活化;该结果进一步表明,Vip3Aa Ad-2、A10T蛋白不具有杀虫活性的原因也可能是因为该蛋白不能够被胰蛋白酶消化出核心片段。综上,本研究基于Vip3Aa39和Vip3Ad、Vip3Aa39和Vip3Aa11杀虫蛋白活性的差异以及氨基酸序列的差异,对Vip3Aa39进行改造,构建Vip3Aa39嵌合蛋白及突变蛋白,获得了与杀虫活性相关的关键活性区信息,对深入研究Vip3Aa杀虫基因的功能及功能与结构关系具有指导意义。并获得了高活性的Vip3Aa杀虫蛋白,为高效工程菌的构建和转基因植物的培育、延缓昆虫抗性提供了遗传材料,也为该类基因在生物农药、基因修饰等领域的应用提供理论依据。
王帆帆[3]（2019）在《Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性》文中研究表明本试验对8株分离自江苏省紫金山土壤的野生苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）进行筛选后,得到1株对食用菌异迟眼蕈蚊（Bradysia difformis Frey）有较好杀虫活性的Bt菌株23-5。同时,对该菌株进行了形态鉴定、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定和杀虫蛋白基因型鉴定等研究,并对该菌株含有的杀虫蛋白基因进行了原核表达,以期为食用菌Bt微生物农药的开发和应用提供理论依据。具体研究成果如下:1.通过胃毒法测定了8个Bt菌株对异迟眼蕈蚊的室内杀虫活性,结果表明8个Bt菌株中对异迟眼蕈蚊的校正死亡率最高可达84.48%（23-5菌株）,最低为43.11%。采用抑菌圈法测定了Bt菌株对平菇、毛木耳、茶树菇和双孢菇四种食用菌菌丝生长的影响,发现8个Bt菌株均减缓了四种食用菌菌丝生长速度,但最终菌丝仍然可以盖过Bt菌落继续生长。故选择校正死亡率最高的菌株23-5进行以下试验。2.对菌株23-5进行分类鉴定时主要采用形态鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定三种鉴定方法,同时采用PCR-RFLP法确定菌株23-5含有的杀虫蛋白类型。结果表明该菌株能够产生圆形或不规则形晶体,生理生化鉴定及16S rDNA鉴定结果均显示该菌株与苏云金芽孢杆菌最为接近。PCR-RFLP结果显示该菌株含有的杀虫蛋白基因型组合为cry4/10+cry11+cyt1+cyt2。所以确认该菌株属于苏云金芽孢杆菌（Bt）3.以NCBI上公布的与cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2五种杀虫蛋白基因相关信息为依据,扩增菌株23-5中各杀虫蛋白基因片段,结果显示23-5中含有的cry4B、cry10、cry11、cyt1、cyt2基因序列的长度分别为1470bp、2043bp、1941bp、750bp、792pb。各基因的克隆载体和表达载体分别构建成功后,进行PCR验证和双酶切验证。各杀虫毒蛋白基因的生物信息学分析表明Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa和Cyt2Ba蛋白均为亲水性蛋白,Cyt1Aa蛋白为疏水性蛋白,分别得到其氨基酸组成、理化性质和保守结构域。4.将各杀虫蛋白基因构建成功的表达载体进行蛋白表达和纯化,IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE结果表明杀虫蛋白Cry4B、Cry10、Cry11主要存在于表达菌株的沉淀中,呈包涵体形式,恢复其生物活性需通过变复性的方式,再进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt2主要存在于上清液,呈可溶形式表达,可直接进行融合蛋白的Ni柱亲和纯化;目标蛋白Cyt1表达不明显。融合蛋白Cry4B、Cry10、Cry11和Cyt2表达的大小分别为70KD、84KD、88kD和70kD。5.分别提取各工程菌株的目标蛋白,用Brandford法测定蛋白浓度,进行各目标蛋白的室内毒力测定。各蛋白浓度为250 ng/mL时,蛋白Cyt2对异迟眼蕈蚊的杀虫活性最高,校正死亡率达70.18%;蛋白Cry4B、Cry10、Cry11对异迟眼蕈蚊的杀虫活性较低,三者之间无显着性差异,校正死亡率为33.33-35.09%。
孙强,杨丽丽[4]（2014）在《Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展》文中指出球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericuss,Bs）Mtx1和苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis israelens,Bti）Cry4Ba是主要的杀蚊毒蛋白。通过对Mtx1毒蛋白杀蚊的作用机理,Cry4Ba毒蛋白的结构与作用机理的介绍,综述Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展,并对Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白的未来研究进行了思考。
苏天运[5]（2014）在《蚊虫对微生物和昆虫生长调节剂杀幼剂的抗药性及其管理》文中研究说明微生物和昆虫生长调节剂杀幼剂因具有相对靶生物特异性与环境保护理念越来越广泛用于蚊虫控制。该文回顾了这些杀虫剂的作用原理、在蚊虫控制方面的使用概况、抗药性发展及管理的策略与措施。涉及到的杀虫剂包括天然微生物杀虫剂苏云金杆菌以色列变种、球形芽孢杆菌、刺糖多孢菌多杀菌素,以及人工合成的昆虫生长调节剂如烯虫酯、吡丙醚和除虫脲。抗药性发展的预防和控制是可持续性蚊虫综合治理成功的关键之一。
杨丽丽[6]（2014）在《苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌主要杀蚊毒蛋白的克隆及表达》文中指出Cry4Aa、Cry4Ba是苏云金芽孢杆菌以色列亚种在芽孢时期产生的毒蛋白，Cry4Aa蛋白的分子量为130Kda，Cry4Ba蛋白的分子量为128Kda；Mtx1、Mtx2、Mtx3是球形芽孢杆菌SSII-1在营养期产生的毒蛋白，Mtx1蛋白的分子量为100Kda，Mtx2蛋白的分子量为31.8Kda，Mtx3蛋白的分子量为35.8Kda。为了进一步了解Cry4Aa、Cry4Ba、 Mtx1、Mtx2、Mtx3蛋白的特性，本文参照已发布NCBI的GenBank目的基因序列，采用软件Primer5设计Cry4Aa、Cry4Ba、Mtx1、Mtx2、Mtx3基因扩增引物，并加入酶切位点序列。以苏云金芽孢杆菌以色列亚种的质粒和球形芽孢杆菌SSII-1的染色体为模板，进行PCR扩增，将PCR产物与PMD18-T载体连接构建克隆质粒，然后进行酶切鉴定并测定序列，结果表明成功获得目的基因。将目的基因分别与pHT315载体连接，然后将表达质粒分别转入到大肠杆菌BL21和苏云金芽孢杆菌无晶体突变株内，使用IPTG诱导目的蛋白表达。生物测定结果表明Cry4Aa、Cry4Ba蛋白对淡色库蚊幼虫的致死率基本相同。但Cry4Aa、Cry4Ba蛋白的致死率要明显低于苏云金芽孢杆菌以色列亚种，这可能是由于苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌液中含有多种毒蛋白并且具有协同作用所造成的；Mtx1与球形芽孢杆菌的毒力相当，而Mtx2、Mtx3无毒。
胡泉芳[7]（2014）在《苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus turiesnginis,简称Bt）是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,其生物活性主要来源于杀虫晶体。研究Bt杀虫晶体形成的分子机制,对提高杀虫晶体蛋白的产量,增强Bt菌株杀虫毒力以及构建高效广谱的Bt工程菌株具有重要意义。有报道表明枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis,简称Bs）的同类残食行为能够影响芽胞的形成周期,因此本研究对Bt菌株是否存在同类残食行为开展了研究。根据Bt4.0718菌株基因组测序结果及生物信息学比对分析,发现该菌株含有Bs同类残食行为基因模块的同源序列,其中质粒上存在sdpRI-sdpABC模块,染色体上存在sdpRⅡ模块。同时发现Bt无晶体突变株XBU001的染色体上只含有sdpRⅡ模块。利用荧光染色技术及激光共聚焦显微镜观察发现,在对数生长期Bt4.0718菌株群体中只存在活菌体,而在稳定生长前期及稳定生长中期同时存在活菌体与死菌体,这些结果说明Bt4.0718菌株在培养过程中存在同类残食现象。在此基础上,本研究构建了 Bt无晶体突变株XBU001中sdpRⅡ基因模块的缺失突变株,扩增得到Bt4.0718菌株的sdpRI-sdpABC模块并克隆到pHT315载体,转化XBU001,为对同类残食行为基因模块进行初步研究奠定了基础。130～140 kDa的Cry1类原毒素非毒性C-端区域中富含半胱氨酸（Cys）残基,研究者普遍认为这些Cys残基对原毒素组装形成晶体具有重要作用,此外,在昆虫中肠蛋白酶水解激活的过程中被切除的部分N-端非毒性部分也包含了半胱氨酸残基。为了深入研究非毒性区域Cys残基的功能,本研究克隆了 Bt库斯塔克亚种（subsp.kurstaki）HD73菌株的cry1Ac基因,利用丝氨酸（Ser）扫描突变,对Cry1Ac原毒素非毒性区域的Cys进行单点突变及逐一叠加突变,将Cry1Ac原毒素非核心毒性区域的16个半胱氨酸（Cys）替换成丝氨酸（Ser）,并在本室无晶体突变株中XBU001中进行表达。相差显微镜观察所有重组工程菌株仍然能形成典型的菱形晶体,SDS-PAGE表明cry1Ac基因突变前后,所有突变重组工程菌株仍能表达130 kDa大小的目的蛋白。这些结果说明Cry1Ac原毒素非毒性部分的16个半胱氨酸残基的单点、多点突变并未影响其晶体的形成及表达。此外,表达野生和所有Cys残基叠加突变的Cry1Ac重组工程菌株对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的毒力无明显差异。本论文还研究了 Bt杰加森亚种（subsp.jegathesan）Cry30Ca的ORF2辅助蛋白对Cry11A表达的影响,通过基因工程重组技术,构建了置于cyt1AP/STAB 序列启动下cry11A单独、p20与cry11A、orf2-30Ca与cry11A的共表达载体。聚丙烯酰胺凝胶包埋技术结合质谱鉴定表明,辅助蛋白P20、ORF2-30Ca与Cry11A发生了共表达,相差观察分析表明3株重组工程菌株都能产生包涵体,SDS-PAGE分析ORF2-30Ca与Cry11A共表达时,其Cry11A的蛋白表达量仅为单独表达Cry11A或P20与Cry11A共表达时的1/2。对四龄致倦库蚊(Culex 的生测结果分析表明,ORF2-30Ca与Cry11A共表达时重组工程菌株的毒力也有所降低。这些结果均说明了 ORF2-30Ca不能辅助Cry11A的正确折叠,从而导致其形成的包涵体不稳定,在菌株内或菌株裂解后发生了降解。综上,本论文发现了 Bt4.0718菌株存在同类残食行为并对其基因模块功能进行了初步分析,为后续研究该行为对发酵周期的影响提供了借鉴基础。同时,Cry1Ac原毒素非毒性区域Cys残基的定点突变研究和ORF2-30C对Cry11A的辅助功能研究丰富了人们对杀虫晶体形成及表达调控机制的认识,为今后提高杀虫晶体蛋白表达量及构建高效Bt杀虫菌株提供了思路。
朱军[8]（2010）在《四川盆地苏云金芽胞杆菌cry和cyt基因的鉴定及其新型模式cry基因研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前世界上应用范围最广的生防微生物,它在农作物、园艺植物、森林以及卫生害虫的防治方面得到广‘泛的应用。由于Bt杀虫基因的巨大应用价值,世界许多国家都将Bt新资源的收集、鉴定与开发作为重点,开展了大规模资源采集、分析的基础性工作。深入发掘我国丰富的Bt菌株和基因资源,筛选高毒力及特异性菌株,分离克隆新型杀虫基因,其结果不但可以为生产高效的Bt菌制剂和生产菌株的轮换提供后备菌株,也可以为构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物带来基因资源。本研究立足具有独特生态环境和丰富生物多样性的四川盆地,对其Bt资源进行更为系统的调查研究,结果如下：1.采集四川盆地具有代表性的生态区土壤样品3834份,利用醋酸钠-抗生素法分离Bt菌1172株,平均分离率为13.9%。菌株的伴胞晶体有长（短）菱形、大（小）菱形、方形、球形和不定形等7种形状,充分显示了四川盆地Bt资源的多样性。采用PCR-RFLP鉴定方法对1172株菌株进行了cry和cyt基因的鉴定分析,共发现了cry1、cry2、cry3、cry9、cry8、cry4/10、cry30、cry40和cyt2等9种基因型；cryl和cry2型基因最丰富,分别占64%和39.4%; cry3、cry4/10、cry9、cry30和cyt2型含量较少;cry8和cry40类基因含量最少。对未鉴定出基因型的Bt菌株杀虫晶体蛋白进行了SDS-PAGE分析,结果表明这些菌株杀虫晶体蛋白类型存在多样性,可以推测这些菌株极有可能含不同的基因及基因组合。在PCR-RFLP鉴定过程中,发现菌株JF19-2、BtMc28、Hs18-1、Ywc2-8和Bm59-2含有新型模式cry基因。另外,本研究对部分Bt菌株进行了杀虫活性的测定,发现它们具有较宽的杀虫谱,对鳞翅目及双翅目害虫具有很好的杀虫活性。以上结果表明：四川生态区蕴藏着丰富而特别的Bt资源,为害虫的防治提供了基因及菌株资源。2.与Cryl类蛋白相比,Cry2A和Cyt类蛋白具有独特的结构和致病机制；另外,Cry2A和Cyt分别兼具较广的杀虫谱和对Cry类蛋白的协同作用等特性。因此本节首先对含cry2类基因的菌株的杀虫晶体蛋白进行分析,同时在鉴定四川盆地cry2和cyt2类基因基础之上,进一步对其基因的分布、基因的分型、以及新型基因的克隆和表达进行研究,结果表明：1)含cry2型基因的462个菌株主要分布在农田和森林之中,它们产生不规则形、棱形、方形和球状等4种伴胞晶体；通过SDS-PAGE分析可以看出,这些菌株主要表达4种不同的蛋白质,分子量为60—130 kDa之间；这些结果充分说明了四川盆地此类Bt菌株伴胞晶体蛋白具有多样性。2)PCR-RFLP分析表明,四川盆地含有3种不同的cry2基因类型：cry2Aa、cry2Ab和一个新型的cry2A类型（JF19-2菌株之中）；3)本地区仅在森林土壤之中发现11个含cyt2类基因的Bt菌,通过PCR-RFLP鉴定表明,这些基因属于cyt2Aa基因类型;4)以JF19-2及BtMc28（含cyt2Aa基因）为出发菌,采用Tail-PCR和PCR技术分别获得新型的cry2A类和cyt2Aa基因的全长序列,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry2Ag1和cyt2Aa3基因；5) cry2Ag1和cyt2Aa3基因在大肠杆菌中得到了表达,其中cry2Ag1基因表达产物对小菜蛾,棉铃虫及伊蚊都具有较好的杀虫活性,因此Cry2Ag1蛋白可以做为一个轮换或替代蛋白应用于双翅目、鳞翅目害虫的控制以及在转基因植物等领域；而cyt2Aa3的基因表达产物仅对伊蚊具有杀虫活性。本节研究明确了四川盆地cry2和cyt2类基因的分布、类型,同时发现了两个最有较好杀虫活性的杀虫晶蛋白,其研究成果在农业生产上具有重要意义和应用前景。3.含有新型的杀虫基因的BtMc28、Bm59-2、Hs18-1和Ywc2-8分别来自沐川原始森林、碧峰峡自然保护区、海螺沟冰川原始森林。本节对这4株Bt菌进行了生物学特性鉴定、新型模式基因克隆与表达研究。1)通过扫描电镜观察,这些菌株均产生球状晶体；2) SDS-PAGE分析结果显示,BtMc28主要表达3种分子量约为130、70和28 kDa的蛋白质,Ywc2-8与Hs18-1菌株均主要表达分子量为130和70 kDa的2种蛋白质,而Bm59-2只产生一种约70kDa的蛋白质;3)这4个菌株的质粒图谱在带型和大小上都存在很大差异（Hs18-1与Ywc2-8除外）,这们的质粒图谱都与对照菌不一样;4)这4个菌株的鞭毛生长情况、生理生化特性和碳源利用,同所报道的Bt菌类似;H血清型鉴定结果显示,BtMc28、HS18-1和Ywc2-8菌株为新的血清型亚种,命名为：Bt serovar sichuansis, Bt serovar muchuansis, Bt serovar yaansis;Bm59-2属于血清型为H22的B.thuringiensis serovar shandongiensis亚种。5)运用SON-PCR. Tail-PCR以及PCR技术分别从BtMc28、Hs18-1、Ywc2-8和Bm59-2中克隆了11个新型基因（其中8个为新型模式基因）,并获正式命名；这几个菌株在杀虫基因组成上存在差异（BtMc28含cry54Aa1、cry53Ab1、cry30Fa1、cry4Cc1、cyt2Aa3、Hs18-1含cry54Ba类,cry30Ga1、cry4Cb1;Ywc2-8含cry56Aa1、cry4Cb2、cry30Ea2、Bm59-2含cry52Ba1）; 6) cry56Aa1、cry54Aa、cry52Ba1、cry30Fa1、cry30Ga1和cry4Cb1基因在大肠杆菌中得到了表达；生测结果表明,Cry56Aa1、Cry54Aa1、Cry52Ba1、Cry30Fa1和Cry30Ga1具有较宽的杀虫谱,它们对鳞翅目及双翅目害虫具有杀虫活性,其中Cry56Aa1的杀虫谱最宽,它对小菜蛾、棉铃虫和伊蚊都具很好的活性。综上所述,通过对这4个菌株的生物学特性、杀虫蛋白基因的分析和表达研究,其研究结果可以为进一步利用这几株菌,提供一定技术支持和理论依据；新菌株、新型杀虫蛋白基因的分离和克隆在降低害虫抗性风险、提升我国的害虫生物防治和转基因抗虫植物在国际上的竞争力等方面,具有重要的意义。
张琪[9]（2010）在《苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定》文中研究表明Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis.subsp. israelensis,Bti）在芽形成孢阶段产生的δ-内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列,设计特异引物对Bt LLP29菌株中总DNA进行PCR扩增,得到大小约为1,000bp的类似cyt2B基因,对该基因进行克隆、表达,确定了菌株中cyt2B基因的存在,以pGEX-KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒,并对其杀蚊活性进行测定,从而试图探索Cyt2B蛋白的生物活性及其在菌株中的生物功能。结果表明,经PCR扩增、克隆、测序,获得序列大小约为1,000bp的基因全序列,序列里包含两个ORF,大小分别为789 bp和117 bp,其中789bp编码约为262个氨基酸,与文献中Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较,发现10个Bt cyt2B基因序列以及多个基因组片段,其中与己报道的cyt2Ba7,cyt2Ba8等5个基因全序列（包括原始基因片段）同源性达到98%。因此,判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS-PAGE验证诱导表达重组菌株,显示该蛋白大小约为30kD,确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试,与Bt LLP29菌株相比,该表达菌株并不显示杀蚊活性。
林琳[10]（2009）在《苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定研究》文中指出农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害,是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性,并且,对人畜安全,不污染环境。目前,己成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。Bt的主要杀虫活性与其携带的编码ICPs（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）的cry基因密切相关,因此,cry基因工程研究便成为近几年研究的热点。到目前为止,国际上已经克隆了476种杀虫蛋白基因,但是随着Bt应用的不断扩大,Bt ICPs基因均在不同程度上引发了昆虫的抗性,寻找新的菌株和基因是解决昆虫抗性问题的有效途径之一。本研究从全国19个省份采集了276份土样,利用温度筛选法并结合复红染色鉴定苏云金杆菌,共分离获得苏云金芽孢杆菌144株。对所分离的菌株进行了生理生化鉴定,有91株菌已经确定其亚种。再利用10对引物对所分离菌株进行cry/cyt基因的鉴定,有66株菌含有cry/cyt基因。在此基础上利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,将17个cry7/cry8基因分为四类,将13个cry11基因分为两类。本研究还对cry基因的分布规律和多样性,以及基因型和杀虫活性之间的关系进行了综合分析,这对于新基因型的发现、杀虫活性的预测,以及Bt资源的开发和利用均具有重要的意义。
二、苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达（论文提纲范文）
（1）苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文符号表 |
| 文献综述 |
| 1.1 家蝇的特征及防治现状 |
| 1.1.1 家蝇的形态特征 |
| 1.1.2 家蝇的生物学特性 |
| 1.2 家蝇的危害及其防治 |
| 1.2.1 家蝇的主要危害 |
| 1.2.2 家蝇的防治现状 |
| 1.3 苏云金芽孢杆菌及其应用研究进展 |
| 1.3.1 Cry蛋白的生物学特性 |
| 1.3.2 Cry蛋白的作用机理 |
| 1.3.3 Cry蛋白的研究进展 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和载体 |
| 2.2 试验家蝇 |
| 2.3 培养基和试剂 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 苏云金芽孢杆菌质粒的提取 |
| 2.6 核酸琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.7 大肠杆菌(DH5α)感受态的制备 |
| 2.8 目的基因的克隆 |
| 2.8.1 目的基因引物设计 |
| 2.8.2 CryIVD基因PCR扩增 |
| 2.9 CryIVD基因PCR产物胶回收 |
| 2.10 构建克隆载体pMD-19-T-CryIVD |
| 2.11 PCR鉴定pMD-19-T-CryIVD克隆 |
| 2.12 重组质粒pMD-19-T-CryIVD的提取 |
| 2.13 重组质粒pMD-19-T-CryIVD双酶切与产物的纯化 |
| 2.14 pGEX-4T-1-CryIVD原核表达载体的构建 |
| 2.15 PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1-CryIVD |
| 2.16 CryIVD基因的原核表达 |
| 2.17 SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况 |
| 2.17.1 SDS-PAGE检测 |
| 2.17.2 制胶和上样 |
| 2.17.3 电泳 |
| 2.17.4 染色和脱色 |
| 2.18 Western-blot鉴定重组蛋白 |
| 2.18.1 SDS-PAGE阶段 |
| 2.18.2 电转移阶段 |
| 2.18.3 免疫应答及显色反应 |
| 2.19 CryIVD杀虫蛋白杀蝇毒效观察 |
| 2.19.1 CryIVD杀虫蛋白对蝇卵毒效的初步观察 |
| 2.19.2 CryIVD杀虫蛋白对蝇卵的毒力测定 |
| 2.19.3 CryIVD杀虫蛋白对家蝇成虫的毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增 |
| 3.2 克隆载体pMD-19-T-CryIVD的PCR鉴定 |
| 3.3 克隆载体的酶切鉴定 |
| 3.4 CryIVD基因的测序结果 |
| 3.5 基因进化树结果 |
| 3.6 重组质粒表达载体pGEX-4T-1-CryIVD的鉴定 |
| 3.7 CryIVD基因的原核表达 |
| 3.8 免疫印迹结果 |
| 3.9 CryIVD杀虫蛋白杀蝇毒效观察 |
| 3.9.1 杀虫蛋白对蝇卵毒效的初步观察结果 |
| 3.9.2 蝇卵急性毒理试验结果 |
| 3.9.3 家蝇成虫急性毒理试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 苏云金杆菌作为新型杀虫剂研制与应用 |
| 4.2 CryIVD基因表达与利用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 1.1.1 Bt的分布及特征 |
| 1.1.2 Bt菌株分离及杀虫基因的鉴定方法 |
| 1.1.3 杀虫晶体蛋白 |
| 1.1.4 抗癌晶体蛋白 |
| 1.2 Vip简述 |
| 1.2.1 Vip的命名 |
| 1.2.2 Vip的分类 |
| 1.2.3 Vip3的杀虫机理 |
| 1.2.4 Vip3蛋白的应用 |
| 1.3 Bt蛋白的改造方式 |
| 1.3.1 定点突变 |
| 1.3.2 重组蛋白 |
| 1.3.3 随机突变 |
| 1.4 重要的鳞翅目害虫 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 vip3A杀虫基因筛选的试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 vip3A嵌合基因构建的试验材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 vip3Aa39基因突变的试验材料与方法 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 vip3A基因发掘 |
| 3.1.1 Bt菌株的分离鉴定 |
| 3.1.2 vip3A基因的鉴定 |
| 3.1.3 vip3Ad基因的克隆表达 |
| 3.1.4 室内杀虫活性测定 |
| 3.2 Vip3Aa39与Vip3Ad嵌合蛋白 |
| 3.2.1 嵌合基因的获得 |
| 3.2.2 Vip3Aa39 和嵌合蛋白的结构分析 |
| 3.2.3 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.2.4 嵌合蛋白的胰蛋白酶消化处理 |
| 3.2.5 嵌合蛋白杀虫活性分析 |
| 3.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 3.3.1 突变位点确定 |
| 3.3.2 含vip3Aa39的表达载体的构建 |
| 3.3.3 突变基因的克隆 |
| 3.3.4 Vip3Aa39与突变体蛋白的表达与分析 |
| 3.3.5 胰蛋白酶的敏感性分析 |
| 3.3.6 杀虫活性测定 |
| 3.3.7 Vip3Aa39突变蛋白结构分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 vip3A基因资源挖掘 |
| 4.2 Vip3Aa39 和 Vip3Ad 的嵌合蛋白 |
| 4.3 Vip3Aa39定点突变 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1.1 食用菌主要害虫 |
| 1.1.1 食用菌害虫害症状 |
| 1.1.2 眼蕈蚊为害特点 |
| 1.2 食用菌眼蕈蚊的防治 |
| 1.2.1 农业防治 |
| 1.2.2 物理防治 |
| 1.2.3 化学防治 |
| 1.2.4 生物防治 |
| 1.3 苏云金芽孢杆菌概况 |
| 1.3.1 苏云金芽孢杆菌的杀虫活性 |
| 1.3.2 苏云金芽孢杆菌的杀虫机理 |
| 1.4 高效杀虫BT工程菌的构建 |
| 1.4.1 种内改造 |
| 1.4.2 种间改造 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫、菌株和质粒 |
| 2.1.2 供试培养基 |
| 2.1.3 供试化学试剂 |
| 2.1.4 供试试剂盒 |
| 2.1.5 供试仪器 |
| 2.2 菌株筛选 |
| 2.2.1 Bt菌株室内毒力测定 |
| 2.2.2 Bt菌株对食用菌菌丝的影响 |
| 2.3 23 -5 菌株鉴定 |
| 2.3.1 形态鉴定 |
| 2.3.2 生理生化鉴定 |
| 2.3.3 16 S rDNA鉴定 |
| 2.4 23 -5 菌株杀虫蛋白基因型PCR-RFLP鉴定 |
| 2.5 23 -5 菌株杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 2.5.1 杀虫蛋白引物设计与PCR扩增 |
| 2.5.2 杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 2.5.3 克隆载体的酶切验证 |
| 2.6 23 -5 菌株杀虫蛋白的生物信息学分析 |
| 2.7 23 -5 菌株杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 2.7.1 载体双酶切及目的片段回收 |
| 2.7.2 目的片段与表达载体连接 |
| 2.7.3 表达载体的双酶切验证 |
| 2.8 23-5 菌株杀虫蛋白表达载体的表达及纯化 |
| 2.8.1 杀虫蛋白表达载体诱导表达 |
| 2.8.2 包涵体蛋白的复变性 |
| 2.8.3 融合蛋白的Ni柱亲和纯化 |
| 2.8.4 Western Blot |
| 2.9 目标蛋白工程菌室内毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株筛选 |
| 3.1.1 室内毒力测定 |
| 3.1.2 菌株对食用菌菌丝的影响 |
| 3.2 23-5 菌株鉴定 |
| 3.2.1 形态鉴定 |
| 3.2.2 生理生化鉴定 |
| 3.2.3 16S rDNA鉴定 |
| 3.3 23-5 菌株杀虫蛋白基因型鉴定 |
| 3.4 23-5 菌株杀虫蛋白基因克隆载体构建 |
| 3.4.1 PCR扩增结果 |
| 3.4.2 杀虫蛋白基因的克隆 |
| 3.5 23-5 菌株杀虫蛋白的生物信息学分析 |
| 3.6 2-5 菌株杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 3.6.1 杀虫蛋白基因表达载体构建 |
| 3.6.2 表达载体的酶切验证 |
| 3.7 23-5 菌株杀虫蛋白表达载体的表达及纯化 |
| 3.7.1 杀虫蛋白表达载体诱导表达 |
| 3.7.2 融合蛋白的Ni柱亲和纯化结果 |
| 3.8 目标蛋白工程菌室内毒力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 食用菌眼蕈蚊的防治 |
| 4.2 BT菌株杀虫蛋白基因型 |
| 4.3 杀虫蛋白原核表达的特点 |
| 4.4 杀虫蛋白应用研究 |
| 4.5 23-5 菌株的应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 攻读学位期间取得成果 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（4）Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展（论文提纲范文）
| 1 球形芽孢杆菌Mtx1研究 |
| 1.1 Mtx1简介 |
| 1.2 Mtx1基因工程研究 |
| 2 Cry4Ba研究 |
| 2.1 Cry4Ba作用机理和结构 |
| 2.2 Cry4Ba基因工程研究 |
| 3 问题与思考 |
（5）蚊虫对微生物和昆虫生长调节剂杀幼剂的抗药性及其管理（论文提纲范文）
| 1 微生物杀虫剂 |
| 1.1 苏云金杆菌以色列变种(Bacillus thuringiensis israelensis de Bajac,B.t.i.) |
| 1.1.1 细菌、毒素及作用原理 |
| 1.1.2 抗药性发展 |
| 1.1.3 抗药性管理 |
| 1.2 球形芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus Meyer和Neide,过去称为Bacillus sphaericus Neide) |
| 1.2.1 细菌、毒素及作用原理 |
| 1.2.2 抗药性发展 |
| 1.2.3 抗药性管理 |
| 1.3 刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) |
| 1.3.1 细菌、毒素及作用原理 |
| 1.3.2 抗药性发展 |
| 1.3.3 抗药性管理 |
| 2 昆虫生长调节剂 |
| 2.1 烯虫酯(methoperene)和吡丙醚(pyriproxyfen) |
| 2.1.1 成分及作用原理 |
| 2.1.2 抗药性发展 |
| 2.1.3 抗药性管理 |
| 2.2 除虫脲(diflubenzuron) |
| 2.2.1 成分及作用原理 |
| 2.2.2 抗药性发展 |
| 2.2.3 抗药性管理 |
| 3 总结与展望 |
（6）苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌主要杀蚊毒蛋白的克隆及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌简介 |
| 1.1.1 Cyt 蛋白 |
| 1.1.1.1 Cyt 蛋白种类与特性 |
| 1.1.1.2 Cyt 蛋白的结构 |
| 1.1.1.3 Cyt 蛋白的作用机制 |
| 1.1.1.4 Cyt 蛋白的研究进展 |
| 1.1.2 Cry 蛋白 |
| 1.1.2.1 Cry 蛋白简介 |
| 1.1.2.2 Cry 蛋白的结构 |
| 1.1.2.3 Cry 蛋白的作用机制 |
| 1.1.2.4 Cry 蛋白的研究进展 |
| 1.2 球形芽孢杆菌概述 |
| 1.2.1 Bin 毒素 |
| 1.2.1.1 Bin 毒素性质 |
| 1.2.1.2 Bin 毒素作用机理 |
| 1.2.1.3 Bin 毒素研究进展 |
| 1.2.2 Mtx1 杀蚊毒蛋白 |
| 1.2.2.1 Mtx1 杀蚊毒蛋白作用机理 |
| 1.2.2.2 Mtx1 研究进展 |
| 1.2.2.3 Mtx2 和 Mtx3 简介 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 供试蚊幼虫 |
| 2.1.3 培养基和试剂 |
| 2.1.3.1 培养基 |
| 2.1.3.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 苏云金芽孢杆菌质粒的提取 |
| 2.2.2 球形芽孢杆菌基因组的提取 |
| 2.2.3 核酸琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.2.4 大肠杆菌（DH5α）感受态的制备 |
| 2.2.5 目的基因的克隆 |
| 2.2.5.1 目的基因引物设计 |
| 2.2.5.2 高保真酶 PCR 扩增 |
| 2.2.6 PCR 扩增产物的回收 |
| 2.2.7 克隆载体的构建 |
| 2.2.8 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.2.9 克隆质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.10 测序 |
| 2.2.11 Cry4Aa、Cry4Ba、Mtx1、Mtx2 、Mtx3 基因穿梭载体的构建 |
| 2.2.12 Cry-BT 感受态细胞的制备 |
| 2.2.13 表达菌的制备 |
| 2.2.14 表达质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.15 表达菌的诱导表达 |
| 2.2.16 表达蛋白的的 SDS-PAGE 检测 |
| 2.2.16.1 准备工作 |
| 2.2.16.2 配制凝胶 |
| 2.2.16.3 5%浓缩胶的配置 |
| 2.2.16.4 样品处理与加样 |
| 2.2.16.5 电泳 |
| 2.2.16.6 染色和脱色 |
| 2.2.17 不同毒蛋白对蚊幼致死率测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因的克隆与序列分析 |
| 3.1.1 苏云金芽孢杆菌、球形芽孢杆菌 DNA 的提取 |
| 3.1.2 目的基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.3 测序分析 |
| 3.2 目的基因的原核表达 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 原核表达载体的双酶切鉴定 |
| 3.2.3 诱导目的蛋白表达 |
| 3.3 不同毒蛋白对蚊幼致死率的测定 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 实验中出现的问题与分析 |
| 4.3 克隆基因表达蛋白的功能性分析 |
| 4.4 本实验下一步工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 2 杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白的分类和命名 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的合成机制 |
| 2.2.1 转录水平调控 |
| 2.2.2 转录后水平调控 |
| 2.2.3 翻译水平调控 |
| 2.3 杀虫晶体蛋白的结构及作用机理 |
| 2.3.1 杀虫晶体蛋白的结构特征 |
| 2.3.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3 芽胞杆菌同类残食行为的发现与研究现状 |
| 4 杀虫晶体蛋白C-半段的功能研究 |
| 5 辅助蛋白基因的功能研究进展 |
| 6 立题依据和意义 |
| 第二章 Bt4.0718菌株同类残食行为及其功能基因初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 分子生物学试剂及生化试剂 |
| 1.1.5 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.6 试剂 |
| 1.1.7 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 基因模块的生物信息学分析 |
| 1.2.3 活、死细菌的荧光染色及激光共聚焦显微镜观察 |
| 1.2.4 Bt基因组DNA的提取 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 1.2.7 大肠杆菌的DNA转化 |
| 1.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 1.2.9 Red/ET同源重组 |
| 1.2.10 pMERⅡ质粒的构建 |
| 1.2.11 XBU001电转 |
| 1.2.12 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 1.2.13 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株筛选 |
| 1.2.14 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 1.2.15 XBU/pHTsdpRIABC菌株构建 |
| 1.2.16 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt4.0718菌株同类残食行为基因模块的初步分析 |
| 2.2 Bt4.0718菌株生长曲线测定和显微镜观察 |
| 2.3 Bt4.0718菌株同类残食现象的激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.4 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株的构建 |
| 2.4.1 pMERⅡ质粒的构建 |
| 2.4.2 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 2.4.3 XBU/△sdpRⅡ::Erm缺失突变株的筛选 |
| 2.5 XBU/pHTsdpRIABC表达菌株的构建 |
| 2.5.1 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 2.5.2 XBU/pHTsdpRIABC菌株鉴定 |
| 2.6 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Cry1Ac原毒素非毒性区域半胱氨酸残基的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 Bt基因组DNA的提取及PCR扩增 |
| 1.2.3 大肠杆菌质粒DNA的转化及质粒DNA的提取 |
| 1.2.4 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 1.2.5 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.6 PCR介导靶位点的突变 |
| 1.2.7 突变型pMHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.8 pHT1Ac35、pMHT1Ac35在XBU001中的表达 |
| 1.2.9 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体的提纯 |
| 1.2.10 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 1.2.12 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 2.2 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 2.3 pHT1Ac35表达载体电转化XBU001 |
| 2.4 突变型克隆载体pMU1Ac19的构建及突变碱基的确定 |
| 2.5 突变型表达载体pMHT1Ac35的构建 |
| 2.6 突变型表达载体pMHT1Ac35电转化XBU001 |
| 2.7 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.8 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.9 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.10 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 2.12 N-端突变型克隆载体突变碱基的确定 |
| 2.13 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的显微镜观察 |
| 2.14 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.15 Bt重组工程菌的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 辅助蛋白对Cry11A表达的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株的培养条件 |
| 1.2.2 pS11A、pS11A-p20及pS11A-orf2-30C重组质粒的构建 |
| 1.2.3 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体提纯 |
| 1.2.4 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.5 Bt菌株芽胞晶体蛋白混合物的凝胶包埋 |
| 1.2.6 重组蛋白的胶内酶解 |
| 1.2.7 蛋白酶解肽段的质谱分析及搜库分析 |
| 1.2.8 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒及Bt重组工程菌株的构建 |
| 2.2 Bt重组工程菌的相差显微镜观察 |
| 2.3 Bt工程菌重组表达产物的SDS-PAGE分析及质谱鉴定 |
| 2.4 Bt重组工程菌的蚊虫生测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略表(中英文对照) |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
（8）四川盆地苏云金芽胞杆菌cry和cyt基因的鉴定及其新型模式cry基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 苏云金芽胞杆菌研究历史 |
| 2 苏云金芽胞杆菌的生物学特性及分布 |
| 3 苏云金芽胞杆菌的分类鉴定 |
| 3.1 生理生化鉴定 |
| 3.2 血清型鉴定 |
| 3.3 酯酶型鉴定法 |
| 3.4 热解气相色谱法鉴定 |
| 3.5 基于编码H抗原的hag基因分析 |
| 4 Bt杀虫晶体蛋白基因 |
| 4.1 杀虫晶体蛋白cry基因的分类及克隆 |
| 4.2 杀虫晶体蛋白cyt基因的分类及克隆 |
| 4.3 杀虫晶体蛋白基因的表达调控 |
| 4.3.1 cry基因的启动子及转录水平的调控 |
| 4.3.2 转录后水平的调控 |
| 4.3.3 翻译后水平的调控 |
| 4.4 杀虫晶体蛋白基因的鉴定 |
| 4.4.1 PCR鉴定方法 |
| 4.4.2 其它鉴定方法 |
| 5 杀虫晶体蛋白结构与功能之间的关系 |
| 5.1 杀虫晶体蛋白结构分析 |
| 5.2 杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 5.2.1 Cyt蛋白作用的机理 |
| 5.2.2 Cry蛋白作用的机理 |
| 6 苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白的应用 |
| 7 本研究的立题依据和目的意义 |
| 第二章 四川盆地Bt的分离和杀虫晶体蛋白基因的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 土样来源 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 培养基与抗生素 |
| 1.1.4 酶与生化试剂 |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.1.6 PCR-RFLP鉴定 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 土样的采集、分离及菌株保存 |
| 1.2.2 扫描电镜观察 |
| 1.2.3 Bt总DNA及质粒DNA的提取 |
| 1.2.4 PCR反应及酶切分析 |
| 1.2.5 琼脂糖凝胶电泳及回收 |
| 1.2.6 SDS-PAGE电泳 |
| 1.2.7 大肠杆菌DH5 a热激感受态细胞制备及热激转化 |
| 1.2.8 新基因部分片段的克隆 |
| 1.2.9 生物测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株的分离 |
| 2.2 伴胞晶体形态的多样性 |
| 2.3 苏云金芽胞杆菌cry和cyt基因的鉴定 |
| 2.4 新型模式cry基因的发现 |
| 2.5 生物测定 |
| 2.6 杀虫晶体蛋白的测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 四川盆地cry2、cyt2基因鉴定及新型cry2A、cyt2A基因的克隆表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.3 E.coli质粒DNA提取 |
| 1.2.4 cry2及cyt2基因型鉴定 |
| 1.2.5 序列分析 |
| 1.2.6 全长基因的克隆 |
| 1.2.7 基因原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 基因在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 含cry2类基因Bt菌株的鉴定 |
| 2.2 cry2型基因的酶切鉴定分析 |
| 2.3 cyt2型基因的酶切鉴定分析 |
| 2.4 新型模式基因部分序列的克隆测序 |
| 2.5 新型基因全长序列的克隆与序列分析 |
| 2.6 Cry2Ag1及Cyt2Aa3蛋白氨基酸组成与序列分析 |
| 2.6.1 Cry2Ag1蛋白氨基酸组成 |
| 2.6.2 Cyt2Aa3蛋白氨基酸组成 |
| 2.7 cry2Ag1和cyt2Aa3基因表达载体的构建 |
| 2.8 cry2Ag1和cyt2Aa3基因在大肠杆菌中的表达 |
| 2.9 cry2Agl和cyt2Aa3基因表达产物的生物活性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 几株特异Bt菌的生物学鉴定及新型模式基因克隆与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.1.5 标准菌株 |
| 1.1.6 其它材料器材 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 Bt质粒提取 |
| 1.2.2 菌株的质粒图谱分析 |
| 1.2.3 Bt菌鞭毛观察 |
| 1.2.4 Bt菌碳源利用分析 |
| 1.2.5 Bt菌生理生化测定 |
| 1.2.6 编码H抗原蛋白的hag基因序列分析 |
| 1.2.7 H-血清型鉴定 |
| 1.2.8 DNA相关操作 |
| 1.2.9 序列分析 |
| 1.2.10 全长基因的克隆 |
| 1.2.11 基因原核表达载体的构建 |
| 1.2.12 基因在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株杀虫晶体蛋白特性鉴定 |
| 2.2 菌株质粒分析 |
| 2.3 菌株鞭毛生长情况 |
| 2.4 生理生化特性鉴定 |
| 2.5 碳源利用测定 |
| 2.6 编码H抗原蛋白的hag基因序列分析 |
| 2.7 H-抗血清的鉴定 |
| 2.8 新型模式cry基因克隆及其序列分析 |
| 2.9 蛋白氨基酸组成与序列分析 |
| 2.10 新型模式cry基因表达载体的构建 |
| 2.11 基因在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE检测 |
| 2.12 基因表达产物的生物活性 |
| 3 讨论 |
| 后续工作设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表科研论文情况 |
| 申请专利情况 |
| 正式命名的新型模式基因 |
（9）苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 苏云金芽孢杆菌概述 |
| 1.1 Bt 杀虫蛋白 |
| 1.2 VIP 杀虫蛋白 |
| 1.3 ICPs 基因蛋白 |
| 1.4 ICPs 蛋白晶体的作用机制 |
| 2 Cry 蛋白 |
| 2.1 Cry 蛋白的结构 |
| 2.2 Cry 蛋白的应用 |
| 3 Cyt 蛋白研究 |
| 3.1 Cyt 蛋白概述 |
| 3.2 Cyt 蛋白的分布和分类 |
| 3.3 Cyt 蛋白的结构 |
| 3.4 Cyt 蛋白的研究进展 |
| 3.5 Cyt 蛋白作用机制的研究 |
| 4 Bt 杀蚊研究 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 酶与试剂 |
| 1.4 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株培养 |
| 2.2 Bt 基因组DNA 的提取 |
| 2.3 cyt2B 基因的克隆 |
| 2.4 cyt2B 基因的原核表达 |
| 结果与分析 |
| 1 cyt2B 基因的克隆及序列分析 |
| 1.1 PCR 扩增及克隆重组质粒的鉴定 |
| 1.2 序列测定 |
| 1.3 生物信息学序列分析 |
| 2 原核表达 |
| 2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2 原核表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 目的蛋白诱导表达 |
| 3 Cyt2B 表达蛋白杀虫活性的测定 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及分布 |
| 1.2 苏云金芽孢杆菌的分离方法研究进展 |
| 1.2.1 弹土分离法 |
| 1.2.2 抗生素选择性筛选 |
| 1.2.3 利用醋酸钠进行选择筛选 |
| 1.2.4 温度筛选 |
| 1.3 Bt 的分类 |
| 1.4 Bt 的 cry/cyt 基因分类及鉴定 |
| 1.4.1 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因分类系统的建立 |
| 1.4.2 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因的鉴定方法 |
| 1.5 苏云金芽孢杆菌的 cry/cyt 基因与杀虫活力的关系 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料及仪器 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 土样：本实验从全国19 个省份采集不同植被、不同土壤类型的土样276 份，以供Bt 菌株筛选（详见附录1） |
| 2.1.1.2 菌株和质粒：见表2-1 |
| 2.1.1.3 培养基 |
| 2.1.1.4 引物 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 苏云金芽孢杆菌的分离 |
| 2.2.2 苏云金杆菌生理生化反应 |
| 2.2.3 苏云金芽孢杆菌的分子鉴定 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 |
| 2.2.6 PCR 产物纯化 |
| 2.2.7 PCR 产物连接 |
| 2.2.8 E. coli 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 2.2.10 E.coli 质粒DNA 提取 |
| 2.2.11 cry/cyt 基因序列分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 菌株分离 |
| 3.2 菌株生理生化鉴定 |
| 3.3 苏云金芽抱杆菌分子鉴定分析 |
| 3.3.1 cry/cyt 基因的鉴定 |
| 3.3.2 苏云金芽孢杆菌基因型的分布频率 |
| 3.3.3 cry/cyt 基因联合多样性的分析 |
| 3.4 苏云金芽孢杆菌 cry 基因的亚克隆及序列分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 菌株的分离 |
| 4.2 菌株的分布 |
| 4.3 分子鉴定 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达（论文参考文献）
- [1]苏云金芽孢杆菌内毒素CryIVD重组表达及灭蝇效果评估[D]. 孔浩然. 安徽农业大学, 2020(04)
- [2]苏云金芽胞杆菌Vip3Aa39的改造[D]. 于爽. 东北农业大学, 2020
- [3]Bt杀虫蛋白原核表达及对异迟眼蕈蚊的杀虫活性[D]. 王帆帆. 山西农业大学, 2019(07)
- [4]Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展[J]. 孙强,杨丽丽. 黑龙江八一农垦大学学报, 2014(03)
- [5]蚊虫对微生物和昆虫生长调节剂杀幼剂的抗药性及其管理[J]. 苏天运. 中国媒介生物学及控制杂志, 2014(03)
- [6]苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌主要杀蚊毒蛋白的克隆及表达[D]. 杨丽丽. 黑龙江八一农垦大学, 2014(08)
- [7]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究[D]. 胡泉芳. 湖南师范大学, 2014
- [8]四川盆地苏云金芽胞杆菌cry和cyt基因的鉴定及其新型模式cry基因研究[D]. 朱军. 四川农业大学, 2010(12)
- [9]苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2B基因的克隆、表达及杀蚊活性测定[D]. 张琪. 福建农林大学, 2010(04)
- [10]苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定研究[D]. 林琳. 黑龙江大学, 2009(12)