一、Study on the Regulation of Bcl-2 Gene on Rat Spermatogenic Cells Apoptosis in Transcription Level（论文文献综述）
郭茂[1]（2021）在《氰戊菊酯诱导雄性SD大鼠生殖损伤的机制研究》文中研究表明目的:探讨Fen干扰雄性SD大鼠生殖内分泌功能及诱导生精细胞凋亡损伤雄性大鼠生殖能力的机制。方法:预实验确定大鼠的Fen染毒剂量。正式实验中24只成年雄性SD大鼠随机分为对照组（Fen 0mg/（kg.d））、低剂量Fen染毒组（20 mg/（kg.d））、高剂量Fen染毒组（40mg/（kg.d））,每组8只,染毒组用不同浓度的Fen溶液等体积灌胃,对照组给予同染毒组等体积的玉米油,每日灌胃染毒1次,连续染毒30天。光学显微镜检测精子数量、精子活力和畸形率;HE染色法观察附睾及睾丸病理结构;TUNEL检测雄鼠睾丸中生精细胞的凋亡情况;免疫荧光检测雄鼠睾丸间质细胞数量;ELISA测定雄鼠血清Gn RH、LH、FSH、T、E2和睾丸中T、E2、INH-B、ROS、MDA的水平;RT-q PCR和Western Bolt检测FSHR、LHR、AR、ERβ、ABP、St AR、3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1、Bax、Bcl-2、Cyt c、Caspase 3和Caspase 9的m RNA和蛋白表达水平。结果:（1）Fen对雄性SD大鼠精子、睾丸和附睾损伤的检测结果显示,与对照组相比,40 mg/（kg.d）Fen染毒组精子数量减少、精子活力降低以及精子畸形率增加（P<0.05或P<0.01）;Fen染毒组大鼠睾丸生精小管生精细胞数量减少,生精细胞不同程度地缺失,附睾管上皮增厚、上皮细胞数量增多,管腔内精子数量减少。（2）Fen干扰雄性SD大鼠生殖内分泌功能的相关检测结果显示,与对照组相比,40 mg/（kg.d）Fen染毒组大鼠血清中Gn RH、E2以及睾丸中E2、INH-B的含量显着增加（P<0.05或P<0.01）,血清和睾丸中T含量显着减少（P<0.01,P<0.05）;睾丸AR、ERβ、ABP和CYP19A1的表达水平显着升高（P<0.01）,St AR、3β-HSD和CYP11A1的表达水平显着降低（P<0.01）;睾丸间质细胞数量显着减少（P<0.01）。（3）Fen诱导生精细胞凋亡的检测结果显示,与对照组相比,40 mg/（kg.d）Fen染毒组雄鼠睾丸生精细胞凋亡数量显着增多（P<0.01）;睾丸ROS和MDA的含量显着增加（P<0.01）;睾丸Bcl-2的表达水平显着降低（P<0.01）,Bax、Cyt c、Caspase3和Caspase 9的表达水平显着升高（P<0.01）。结论:（1）Fen可通过损伤雄鼠睾丸间质细胞、抑制T合成相关蛋白和酶的表达,以及上调芳香化酶的表达,导致雄鼠体内T和E2水平改变,而干扰雄性大鼠生殖内分泌功能,间接导致雄性生殖功能损害;（2）氰戊菊酯可能通过引起雄性大鼠睾丸ROS激增,而激活线粒体凋亡途径,导致睾丸生精细胞凋亡,而直接导致雄性生殖功能损害。
刘莹[2]（2021）在《甘氨酸对高氟诱导猪睾丸支持细胞损伤的保护作用及机制研究》文中提出睾丸支持细胞（Sertoli cell,SC）是启动雄性动物性机能发育和维持性成熟后精子发生的上皮细胞,它能够与生精细胞直接接触并为其提供营养,还可分泌多种细胞因子,维持精子发生过程,为维护睾丸生精环境、促进生精细胞的增殖和分化及保证雄性生精能力发挥重要作用。所以SC能够决定精子的质量,其增殖与生物功能对公猪繁殖力影响重大。氟是一种广泛存在于地下水的卤族元素,有研究表明高剂量的氟化物不仅可以导致多种类型细胞发生损伤,还可穿透雄性动物的血睾屏障,从而引起其生殖能力下降。它主要通过刺激细胞发生氧化应激而导致细胞功能受损,最终引起细胞凋亡。甘氨酸是一种公认的自由基清除剂,在细胞内属于抗氧化系统。有研究表明,甘氨酸具有多种生理功能,包括抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等,在维持机体生命活动方面发挥重要作用。为了探讨甘氨酸对过量氟化物暴露诱导的猪睾丸SC损伤的保护机制,我们在使用甘氨酸及氟化钠单独或同时处理猪睾丸SC后,检测其生理状态与功能的变化,并尝试阐明细胞变化过程中的部分分子机制。具体内容如下:在本研究中,首先检测了不同浓度氟化钠对猪睾丸SC活力的影响以及不同浓度甘氨酸对猪睾丸SC活力的保护能力。然后在此基础上探讨甘氨酸对氟化钠诱导的猪睾丸SC细胞周期、增殖能力以及迁移能力的保护作用。实验发现800μM的氟化钠能够显着抑制猪睾丸SC的活力（P<0.001）,并显着抑制细胞的增殖能力（P<0.05）,而迁移能力随时间增加而逐渐降低,当时间达到120h时迁移能力发生极显着的降低（P<0.001）。800μM的氟化钠还导致猪睾丸SC在G1期发生极显着阻滞（P<0.01）,进而引起S期细胞数量极显着减少（P<0.001）。而同时添加2 m M的甘氨酸可以有效缓解氟化钠对SC在增殖过程中的不利影响,使细胞的增殖能力恢复到正常水平。随后,为了了解甘氨酸对过量氟化钠暴露诱导的猪睾丸SC的损伤保护所涉及的生理过程及分子机制,实验对处理过程中细胞内氧化应激水平、线粒体功能、DNA损伤程度及凋亡等水平进行了检测。研究结果表明,甘氨酸能够显着抑制氟化钠诱导的猪睾丸SC内ROS的产生（P<0.0001）并在一定程度上起到补充GSH的作用;此外,甘氨酸还能够显着改善线粒体功能紊乱,恢复线粒体膜电位（P<0.0001）和促进ATP的产生（P<0.05）,从而抑制DNA损伤积累（P<0.01）和降低凋亡发生率（P<0.001）。补充甘氨酸还可显着下调高氟诱导的猪睾丸SC中衰老标志基因如P53、P21、HMGA2和P16INK4a基因的表达（P<0.05）,缓解由氟化钠诱导的猪睾丸SC衰老进程。在本研究过程中发现,甘氨酸对氟化钠诱导的猪睾丸SC增殖及损伤具有显着的保护作用,该机制主要通过抑制线粒体凋亡途径发挥作用,通过抑制氧化应激从而保护线粒体功能的前提下阻止细胞DNA损伤甚至凋亡,这对促进猪睾丸SC增殖、缓解SC在氧化应激刺激下损伤及凋亡提供了理论依据,同时为了解甘氨酸在SC保护中发挥作用提出新的见解。
李讨讨[3]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中研究指明绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
范小瑞[4]（2021）在《猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究》文中指出目的:自发性单侧隐睾公猪是一侧睾丸位于腹部或腹股沟管,这使得睾丸接近或位于体温环境。不同品种的仔猪中,单侧隐睾的发病率为2%。猪隐睾症主要关注的问题是,腹部异常高温导致隐睾睾丸正常精子发生中断。生殖细胞的建立和维持是保证一个物种生存的关键,受多种因素的影响,其中温度是最主要的因素。雄性生殖细胞（精子）是由精子发生的复杂过程产生的。精子发生是在低于核心体温2-8°C的阴囊温度下进行。睾丸暴露在体温环境导致精子发生阻滞,但具体的分子机制尚不清楚。自发性单侧隐睾是研究体温对精子发生影响的良好动物模型。方法:本研究以断奶前仔猪（20d,15Kg左右,4头）、隐睾和对侧阴囊公猪睾丸（7-9月龄,140-150Kg,4头）为研究对象,手术摘取两侧睾丸,部分置于液氮,用于提取总mRNA和蛋白,以及进行RNA-seq和i TARQ检测;部分置于Bouin氏固定液中,用于TUNEL、HE染色和免疫组织化学分析。雄性健康SD大鼠（30d,90～100g,6只）,手术诱导单侧隐睾,隐睾30d,3只手术摘取两侧睾丸,置于Bouin氏固定液中,用于免疫组织化学分析;3只用生物素示踪法检测两侧睾丸血睾屏障通透性变化。结果:1.自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化HE染色结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸只含有支持细胞和少量精原细胞,未见减数分裂后的生殖细胞。形态计量学研究结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸生殖细胞总数显着减少,支持细胞总数无显着变化;较断奶前仔猪睾丸,隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞总数均显着增加。2.自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响TUNEL结果显示,精原细胞凋亡信号明显减少。qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中PCNA和Bax的蛋白和mRNA水平显着降低;细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达升高。免疫组织化学结果显示,PCNA表达于精原细胞的细胞核。隐睾导致Bax在精原细胞的重新分配,从细胞质转移至细胞核表达。Bcl-2在各实验组中优先表达于近管腔部位生殖细胞的细胞质和细胞核。与对侧阴囊组相比,隐睾组PCNA阳性细胞和TUNEL阳性细胞减少。3.自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中LC3和Beclin1的蛋白和mRNA水平显着降低;p62的表达显着升高。免疫组织化学结果显示,LC3表达于精原细胞的细胞质。与对侧阴囊组相比,隐睾组LC3阳性细胞减少。4.自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中Claudin-11的蛋白和mRNA水平显着升高;Occludin和ZO-1蛋白和mRNA水平显着降低。免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11、Occludin和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。5.单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。生物素示踪结果显示,生物素进入隐睾睾丸管腔。6.转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响RNA-seq结果显示,断奶前仔猪和隐睾睾丸组织比较,共有6901个差异表达基因,其中4603个上调,2298个下调。隐睾和对侧阴囊睾丸组织比较,共有13873个差异基因,其中8216个上调,5657个下调。GO富集分析显示,隐睾睾丸和断奶前仔猪睾丸相比,较多差异基因的功能与细胞黏附、细胞发展和精子发生等有关;隐睾和对侧阴囊睾丸组相比,较多差异基因的功能与精子发生、细胞分化和细胞迁移等有关。KEGG Pathway富集分析显示,断奶前仔猪与隐睾睾丸相比,差异基因较多富集于代谢、ECM受体相互作用和细胞黏附等信号通路。隐睾睾丸与对侧阴囊睾丸相比,差异基因较多富集于物质代谢、细胞黏附分子（CAMs）和信号转导相关通路（凋亡、吞噬、Ras和MAPK通路）等,且CAMs通路相关基因大多上调表达,包括CLDN11（Claudin-11）。下调基因中Nectin-3在细胞黏附、迁移和极化中发挥作用。7.蛋白质组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响结果显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,1459个差异蛋白:773个上调,686个下调;隐睾组和对侧阴囊组相比,1424个差异蛋白:656个上调,768个下调。GO富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,较多差异蛋白的功能与细胞黏附、代谢和胞外基质等有关;隐睾组和对侧阴囊组相比,较多差异蛋白的功能与精子发生、繁殖和能量代谢有关。KEGG Pathway富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,差异蛋白主要富集在黏着斑信号、DNA复制和视黄醇代谢通路。隐睾组和对侧阴囊组相比,差异蛋白主要富集在DNA复制、蛋白酶体、缝隙连接和黏着连接通路。SDR5A1和CYP11A等的下调表达,提示睾酮合成和代谢受阻。结论:隐睾导致猪睾丸生殖细胞增殖不足,过度凋亡和自噬;支持细胞结构和功能受损,血睾屏障（BTB）通透性增加,支持细胞供能不足,最终导致猪睾丸生精障碍。
常征辉[5]（2021）在《益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究》文中研究指明少弱精子症是常见的男性不育疾病之一,其发病率在近些年逐年升高,亟需安全有效的治疗手段。西医治疗本病存在一定的局限性,疗效欠佳,中医药在男性不育的防治方面有独特优势。益肾兴阳胶囊作为一种中成药,早期主要用于治疗阳痿早泄,现在越来越广泛地用于治疗少弱精子症,因此研究并揭示益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制具有重要意义。然而,目前尚未对其整体的药效机理形成全面的认识,为此迫切需要有效的研究思路和方法来对其药效物质基础及作用机制进行研究,指导临床安全、合理地用药。论文包括文献综述、网络药理学预测和实验研究。文献综述系统总结了近年来中医药对少弱精子症的研究进展,探讨了传统中医药对少弱精子症的认识、中医辨证分型、中药复方研究等进展;从现代医学角度探讨了少弱精子症的病因、睾丸生精功能的调控机制、治疗方法等。以上内容的探讨,为本课题顺利开展做了铺垫。研究目的:本研究拟通过网络药理学预测益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键靶点、生物通路等相关机制,为动物实验药效机制研究奠定基础。设计动物实验,观察益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型精子质量、生精细胞凋亡、增殖分化、以及精子能量代谢的影响,阐述其作用机制,为益肾兴阳胶囊组方用药及作用机制提供实验探索。研究方法:1.网络药理学通过多个中药成分与靶标数据库收集和筛选益肾兴阳胶囊的化学成分,构建益肾兴阳胶囊作用靶点PPI网络（protein protein interaction network,PPI network）;同时从疾病基因数据库对少弱精子症靶点进行检索及筛选;并将疾病基因映射到PPI网络,获取益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点;构建益肾兴阳胶囊来源中药-成分-靶点-模块-通路网络,通过富集分析预测益肾兴阳胶囊的潜在作用机制。2.实验研究。复制环磷酰胺诱导的少弱精子症小鼠模型,采用精液分析、电镜、流式细胞、Western Blot等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、精子腺嘌吟核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）含量、生精细胞周期、睾丸超微结构、睾丸组织 B 细胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）、磷脂酶肌醇 3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3k）、蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、C-Kit 原癌基因（C-Kit proto-oncogeneprotein,C-Kit）、A 细胞凋亡信号调节激酶 1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）、c-JunN 端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）表达的检测。复制雷公藤多苷诱导的少弱精子症大鼠模型,采用精液分析、ELISA、流式细胞、RT-PCR等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、性激素水平、线粒体膜电位、睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路蛋白、电压依赖性阴离子通道2（Voltage-dependent anion channel 2,VDAC2）、电压依赖性阴离子通道 3（Voltage-dependent anion channel 3,VDAC3）、细胞周期检查点激酶 1（Cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1）、细胞周期检查点激酶 2（Cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2）蛋白表达的检测。研究结果:1.网络药理学共得到益肾兴阳胶囊418个化学成分、2447个靶点和少弱精子症134个致病基因;其中17个靶点为益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点,它们参与了 8个关键模块;中药-成分-靶点-模块-通路网络分析发现,其中有57个成分参与调控了关键的作用靶点和关键模块,有可能影响生精细胞凋亡、增殖分化和精子能量代谢。2.动物实验首先模型建立成功,与正常对照组相比,模型动物少弱精子症成立。小鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症小鼠模型精子质量和精子ATP含量（P<0.01）;睾丸组织超微结构与模型组相比,益肾兴阳胶囊各组生精细胞、支持细胞线粒体明显增多,轻微肿胀,并且可见正常形态高尔基体,睾丸超微结构改善明显。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症小鼠模型生精细胞周期、睾丸组织Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达（P<0.05）。大鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症大鼠模型精子质量、性激素水平和精子线粒体膜电位（P<0.05）。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路、VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达（P<0.05）。通过动物实验,验证了网络药理学相关的生物学通路预测。研究结论:1.益肾兴阳胶囊可以显着提高少弱精子症模型精子质量并改善睾丸组织超微结构损伤情况。2.益肾兴阳胶囊可以抑制少弱精子症模型生精细胞凋亡,具体机制可能与调控 Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达有关。3.益肾兴阳胶囊可以改善睾丸的生精功能,促进生精细胞增殖分化,具体机制可能与调控TGF-β1/Smads信号转导通路以及CHK1、CHK2蛋白表达有关。4.益肾兴阳胶囊可以增强少弱精子症模型精子能量代谢,具体机制可能与提高线粒体膜电位、增强VDAC2、VDAC3蛋白表达有关。综上所述,本研究证实了益肾兴阳胶囊具有补肾精、促生殖的治疗效果,也揭示了益肾兴阳胶囊通过抑制生精细胞凋亡、促进生精细胞增殖分化、增强精子能量代谢治疗少弱精子症的相关作用机制。
付国庆[6]（2021）在《基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究》文中指出邻苯二甲酸（2-乙基己基酯）（DEHP）是一种广泛使用的增塑剂,具有显着的雄性生殖毒性,可引起职业暴露人群血清睾酮和精子活力下降,精子数量减少。然而,全球范围内还没有完善的DEHP职业接触限值和职业危害防护措施。为了推进DEHP职业接触限值的研究,加强DEHP对雄性生殖毒性的防治,促进DEHP职业暴露人群的健康安全,采用动物实验证实了DEHP对雄性生殖毒性的影响,基于DEHP诱导的睾丸组织差异性表达pi RNA和PIWI蛋白预测DEHP诱导雄性生殖毒性的调控通路,探究预测通路在体内动物模型和体外细胞模型中的作用,初步提出了DEHP诱导雄性生殖毒性灵敏的效应指标以及可能的作用机理。筛选出DEHP诱导雄性生殖毒性可能的调控通路,为DEHP暴露灵敏效应标志物的筛选和职业接触限值的研究提供了基础的研究方向。构建DEHP暴露的大鼠模型,分别用pi RNA芯片和Western blot法检测大鼠睾丸组织pi RNA和PIWI蛋白表达水平,结果发现,DEHP暴露组大鼠睾丸中1351个pi RNA表达上调,944个pi RNA表达下调,选择10个经实时荧光定量PCR法检测验证的差异性表达pi RNA,用生物信息学方法进行靶基因预测以及GO和KEGG pathway富集,文献研究法探讨差异性表达的PIWI亚家族Piwil2蛋白的调控通路,综合分析差异性表达pi RNA和Piwil2调控通路,经筛选和初步验证Piwil2/STAT3/p53、Piwil2/PI3K/Akt、INSR/IRS1/PI3K/Akt/Fox O1和AMPK/Fox O1通路可能参与DEHP诱导的雄性生殖毒性调控。研究了经筛选的通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用。用250、500、1000 mg/kg DEHP的剂量连续染毒雄性大鼠28天,检测血清睾酮水平、附睾精子浓度、睾丸组织结构改变、睾丸组织凋亡和自噬水平评价雄性生殖毒性,检测睾丸组织中筛选通路相关蛋白表达水平,以了解它们在DEHP诱导雄性生殖毒性中的作用。结果发现,血清睾酮在所有DEHP暴露组均下降,是DEHP暴露的敏感指标。250 mg/kg·day暴露组DEHP诱导细胞自噬避免细胞凋亡,在500和1000 mg/kg·day暴露组,自噬水平下降,DEHP激活线粒体凋亡通路,导致睾丸细胞凋亡增加,睾丸组织损伤,可能与STAT3/p53通路有关。INSR、IRS1、Piwil2和STAT3是DEHP暴露灵敏且稳定的指标,其表达水平在所有暴露组均显着降低,可以作为DEHP早期暴露生物效应标志物进行进一步研究。探讨了piRNA/PIWI调控的不同通路在DEHP代谢产物MEHP诱导小鼠初级精母细胞（GC-2spd）毒性中的作用。用0、1、10、100μM MEHP和100μM NAC+100μM MEHP分别处理GC-2spd细胞,检测MEHP处理组和抗氧化剂NAC预处理组细胞氧化应激水平、凋亡和自噬水平以及pi RNA/PIWI调控通路相关蛋白表达水平。结果显示,在10、100μM MEHP暴露组,MEHP通过氧化应激介导STAT3/p53通路调控线粒体凋亡通路导致GC-2spd细胞凋亡,MEHP还通过氧化应激影响PI3K/Akt/m TOR和AMPK/m TOR通路促进GC-2spd细胞自噬。DEHP雄性生殖毒性现有的敏感效应指标为睾酮,INSR、IRS1、Piwil2和STAT3可以作为新的效应指标进行进一步的筛选,DEHP通过氧化应激调节STAT3/p53和PI3K/Akt/m TOR影响雄性生殖毒性,为DEHP雄性生殖毒性的防治提供可能的作用靶点,研究结果为DEHP职业接触限值研究提供基础资料,对促进DEHP职业健康安全具有重要意义。
高源[7]（2021）在《安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制》文中认为安格斯牛是肉牛生产的主要品种之一,具有性成熟早、易产、初生重小、生长速度快、肉质好、适应力强等优点。安格斯牛作为肉质好的代表品种被大量引进用来改良地方牛品种,在优质高档牛肉的生产方面取得了显着成效。公牛是种牛群的重要组成部分,在肉牛群体遗传性能改良过程中发挥着重要作用。种公牛为肉牛的生产提供大量优质的精液,以便优良遗传性状得以稳定遗传,因此理想的繁殖性能对种公牛至关重要。睾丸是精子发生的重要器官,正常的睾丸发育是种公牛优良繁殖性能的基础,因此探究公牛睾丸发育及精子发生的遗传机理和分子调控机制,对选育高产优质种公牛具有重要意义。睾丸发育和精子生成依赖于转录、转录后水平相关基因精确的调控,而非编码RNA被证实在转录或转录后水平调控中扮演着极其重要的角色。因此,本研究选用安格斯牛为研究对象,在转录组水平进行ncRNA（lncRNA、miRNA、circRNA）的鉴定分析及功能验证,意在寻找安格斯牛性成熟过程中睾丸发育与精子生成相关的ncRNA,从而从ncRNA的角度解析牛睾丸发育的遗传基础。同时,借助单细胞转录组测序技术进行公牛睾丸发育的细胞图谱绘制和标记基因鉴定,为探索公牛精子生成、睾丸体细胞发育的分子调控及转录调节机制提供了基础数据。本研究的主要结果如下:（1）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸lncRNA进行测序分析,共鉴定出23,735个lncRNA;其中,540个lncRNA（P<0.05）和3,525个mRNA（P-adj<0.05）差异表达;GO和KEGG富集分析表明差异表达的lncRNA靶基因和mRNA大多富集在与精子发生相关的过程中富集;通过lncRNA-mRNA互作分析,构建了与睾丸发育相关的15个DE lncRNA和12个顺式作用靶基因的互作网络,其中lncRNA的靶基因（SPATA16、TCF21、ZPBP、PACRG、ATP8B3、COMP、ACE和OSBP2）与牛睾丸发育和性成熟有关。（2）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸miRNA进行测序分析,共鉴定出566个已知的miRNA,以及86个新miRNA;差异表达分析表明,性成熟期与初生期相比共有223个差异表达的miRNA（202个已知和21个新的miRNA）;相较于初生期组,性成熟期睾丸中有112个miRNA表达上调（92个已知的和20个新的miRNA）和111个表达下调的miRNA（110个已知的和20个新的miRNA）（P-adj<0.05,|log2fold-change|>1）;根据KEGG富集分析发现,差异表达的miRNA靶基因富集到与睾丸发育、精子生成相关的通路中。（3）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸circRNA进行测序分析,共鉴定出28,065个候选的circRNA,其中7,458个circRNA在初生期和性成熟期牛睾丸中共同存在;初生期和性成熟期牛睾丸中存在987个circRNAs差异表达（P<0.05）,以初生期为对照,性成熟期表达上调的有710个circRNAs,下调的有277个circRNAs。GO和KEGG功能富集分析发现差异circRNA的宿主基因显着富集在了36个GO项以及8条通路。（4）根据circRNA测序数据筛选出差异表达的circ SMC1B,并验证发现circ SMC1B在性成熟期高表达,且在牛雄性生殖干细胞中高表达。通过过表达circ SMC1B且利用CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现circ SMC1B促进牛m GSCs的增殖和凋亡;RNAhybrid软件预测及双荧光素酶报告实验证明circ SMC1B竞争性结合let-7i;通过CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现let-7i靶向HMGA1和NR6A1抑制牛m GSCs的增殖和凋亡;且发现circ SMC1B可竞争性结合let-7i调节靶基因HMGA1和NR6A1表达,促进m GSCs增殖凋亡。（5）利用scRNA-seq技术对性成熟前后牛睾丸细胞进行转录组测序,通过聚类分析将睾丸细胞分为12个类群,其中包括9种体细胞和3种生殖细胞;并鉴定出一些牛睾丸不同类群细胞的特异标记基因,如ARSE、CLEC12B、GAS1、KRT8、LOC101908015、HIGD1B、CCL21、ESX1、MEIOB、SPATA19等;通过聚类分析将睾丸生殖细胞分为13个类群,分别在其中鉴定了特异表达的基因,这为解释牛睾丸发育和精子生成的机制提供了理论依据。本研究通过RNA-seq和scRNA-seq对公牛睾丸组织编码基因和ncRNA表达进行综合分析,发现公牛睾丸组织中存在大量与睾丸发育和精子发生相关的差异表达ncRNA和mRNA,且鉴定出公牛睾丸组织中不同细胞类群的特异标记基因,这为丰富公牛睾丸发育和精子生成转录调节机制提供了宝贵资源,为利用分子辅助选育技术筛选优良种公牛,建立公牛良种繁育体系提供了可靠的理论指导和技术支撑。
凌春美[8]（2021）在《JNK信号通路在Nano-TiO2致TM4细胞中BTB连接蛋白异常表达的作用研究》文中指出目的:纳米二氧化钛（Nano titanium dioxide,Nano-TiO2）可诱导血睾屏障（Blood-testis barrier,BTB）破坏,然而其具体机制尚未完全阐明。本研究以BTB连接蛋白为重点,探讨JNK信号通路在Nano-TiO2诱导其异常表达中的作用,并从细胞凋亡的角度探讨相关机制,以期为Nano-TiO2致BTB损伤的毒性机制提供一定的理论依据。方法:本研究选用小鼠睾丸支持细胞（TM4）为实验对象,利用不同浓度（0、50、100、150和200μg/m L）的Nano-TiO2干预细胞24 h,采用倒置相差显微镜观察细胞形态、CCK-8法分析细胞活性、JC-1法测定线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）、Annexin V-FITC/PI试剂盒测定细胞凋亡、Western Blot法测定凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3）和JNK信号通路蛋白（JNK和p-JNK）的表达、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）观测BTB连接蛋白（ZO-1、Claudin-11和β-catenin）的表达,以分析Nano-TiO2对BTB连接蛋白、细胞凋亡及JNK信号通路的影响;进一步利用20μM JNK信号通路抑制剂（SP600125）与150μg/m L Nano-TiO2联合干预细胞24 h,分析细胞活性、MMP、细胞凋亡、凋亡相关蛋白及BTB连接蛋白的变化,探究JNK信号通路在Nano-TiO2诱导BTB连接蛋白异常表达及细胞凋亡中的作用。结果:1.CCK-8实验发现,与对照组相比,细胞活力在100、150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着下降（P<0.01）;IF结果发现,与对照组相比,ZO-1、Claudin-11和β-catenin蛋白表达量在150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中明显减少;凋亡相关指标分析发现,与对照组相比,MMP在150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着下降（P<0.05）,细胞凋亡在150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着升高（P<0.05）,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3表达水平在150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着增加（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平在100、150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着下降（P<0.01）。2.与对照组相比,p-JNK蛋白表达水平在100、150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着升高（P<0.05）,p-JNK/JNK比值在150和200μg/m L Nano-TiO2处理组中显着增大（P<0.05）。3.与150μg/m L Nano-TiO2处理组相比,Nano-TiO2和SP600125联合处理能显着缓解Nano-TiO2诱导的p-JNK蛋白表达水平和p-JNK/JNK比值增加（P<0.01）,细胞活力下降（P<0.05）,BTB连接蛋白（ZO-1、Claudin-11和β-catenin）水平降低,MMP下降（P<0.05）,细胞凋亡增加（P<0.05）,凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3）的异常表达（P<0.05）。结论:Nano-TiO2可引起TM4细胞活力下降,BTB连接蛋白（ZO-1、Claudin-11和β-catenin）表达减少,细胞异常凋亡以及JNK信号通路激活;激活的JNK信号通路可参与调控Nano-TiO2引发的BTB连接蛋白水平降低,其机制可能与其介导TM4细胞凋亡有关。
夏蒙蒙[9]（2020）在《miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究》文中指出第1章miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究目的:本研究旨在探索miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.合成miR-194-5p前体基因序列,构建GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒。用HEK293T细胞包装获得的慢病毒感染睾丸畸胎瘤细胞（F9细胞）,经嘌呤霉素筛选后,获得稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株,流式细胞仪分析过表达细胞比例,qRT-PCR验证过表达后miR-194-5p的表达水平,qRT-PCR和Western Blot验证miR-194-5p过表达后Stra8的表达水平。2.利用流式细胞仪检测miR-194-5p过表达后细胞凋亡水平,分析前期RNA-Seq筛选出的Stra8基因敲除小鼠差异表达的细胞凋亡相关分子,qRT-PCR及Western Blot检测这些分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势,揭示调控细胞凋亡的信号通路。3.MDC染色法检测miR-194-5p过表达后细胞自噬水平,qRT-PCR及Western Blot检测自噬相关分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势。结果:1.序列测定结果显示:构建的GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒无突变且序列正确。利用HEK293T细胞成功包装出miR-194-5p慢病毒,感染F9细胞,筛选后得到稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株。流式仪分析过表达细胞比例高;qRT-PCR和Western Blot结果显示,miR-194-5p F9细胞株中miR-194-5p表达水平升高,Stra8 mRNA和蛋白表达水平均降低。2.流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,miR-194-5p F9细胞的细胞凋亡率显着增加。与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞中Bc12表达水平降低,而JNK、p-JNK、Bax、Bak、Cytochrome C、Caspase9 以及 Caspase3 表达水平升高。这种表达趋势在Stra8 HOM小鼠睾丸组织与WT小鼠睾丸组织的比较中也得到验证。3.MDC染色结果显示,与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞自噬显着性增加。过表达miR-194-5p后,自噬底物分子P62表达降低,自噬相关分子Nrld1、Ulk1、Atg5、Vps18及自噬标记物LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。在Stra8 HOM小鼠睾丸中,与WT小鼠睾丸组织相比较,P62表达水平降低,LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。这与miR-194-5p F9细胞中的趋势相一致。结论:miR-194-5p可能通过抑制Stra8表达进而通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路促进F9细胞和生精细胞的细胞凋亡,可能通过抑制Stra8表达促进F9细胞和生精细胞的细胞自噬。第2章睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究目的:本研究旨在研究Tex33的表达模式及其在精子发生中的作用。方法:1.Tex33多克隆抗体的制备与鉴定:PCR扩增Tex33基因ORF序列并构建pET-30a-Tex33原核表达重组质粒。IPTG诱导Tex33原核蛋白表达,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化Tex33原核蛋白,经梯度尿素复性后免疫雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。运用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western Blot检测抗体的特异性及有效性。2.应用RT-PCR及Western Blot分析Tex33基因在小鼠多种组织中的表达模式;运用RT-PCR及Western Blot方法分析Tex33基因在精子发生不同发育时相中的表达模式;应用免疫荧光染色法分析Tex33蛋白在睾丸组织和精子中的细胞及亚细胞定位。3.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Tex33基因敲除小鼠;应用Western Blot及睾丸组织免疫荧光染色等方法进行基因敲除小鼠的鉴定。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:观察并比较Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸、附睾形态及睾丸/体重比是否存在差异;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠睾丸的组织学结构;运用PAS染色法观察Tex33 HOM小鼠顶体发育过程;应用H&E染色法结合CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子质量;应用α-Tubulin免疫荧光染色法观察Tex33 HOM小鼠manchette微管形态结构;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠卵巢的组织结构;运用小鼠合笼实验分析Tex33 HOM小鼠的生育能力。结果:1.RT-PCR法成功扩增了 Tex33基因ORF序列,测序结果显示:构建的pET-30a-Tex33原核表达重组质粒序列完全正确。经IPTG诱导、纯化和复性后,成功获得了高纯度的Tex33原核蛋白。经4次重复免疫新西兰大白兔,获得了 Tex33多克隆抗体。ELISA检测发现多克隆抗体效价为1:1 00 0000。Western Blot结果显示:Tex33多克隆抗体能特异性识别睾丸组织和纯化的Tex33蛋白,其大小与预测的相一致。2.多组织RT-PCR分析发现,Tex33基因的三个剪接体均为睾丸组织特异性表达。Western Blot结果显示Tex33蛋白也仅在睾丸组织中表达。RT-PCR分析表明,Tex33基因的剪接体V2在小鼠出生后第21天开始微弱表达,第28天达到高峰,之后一直维持到成年。V1和V3从出生后第28天开始表达,直到成年维持在最高水平。Western Blot结果显示,Tex33蛋白表达开始于出生后第28天,持续高表达至成年。免疫荧光染色结果显示Tex33蛋白定位于精子细胞的顶体及manchette微管,在成熟精子中位于顶体及精子的尾部全长。3.运用CRISPR/Cas9技术靶向敲除Tex33基因的外显子2-4号,PCR法对Tex33基因敲除子代小鼠进行基因型鉴定。Western Blot及免疫荧光染色结果显示:Tex33 HOM小鼠睾丸内无Tex33蛋白表达,提示Tex33基因敲除小鼠构建成功。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸及附睾体积大小无显着性差异;Tex33 HOM小鼠的睾丸/体重比与WT小鼠相比无统计学差异;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠睾丸组织结构与WT小鼠无显着差异,生精小管的直径及各级生精细胞排列均正常;PAS染色对精子发生时相进行分析,结果表明Tex33 HOM小鼠顶体发育过程无明显异常;精子涂片H&E染色发现Tex33 HOM小鼠的精子形态与WT小鼠相比无明显差异,应用CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子运动能力,结果显示,Tex33 HOM小鼠的精子数量、前向运动力和总运动力与WT小鼠相比无显着性差异;睾丸组织α-Tubulin免疫荧光染色,发现Tex33 HOM小鼠和WT小鼠manchette微管形态均正常;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠和WT小鼠卵巢组织形态无明显差异;小鼠合笼实验结果显示Tex33 HOM雄性及雌性小鼠与WT小鼠相比平均每窝产仔率无统计学差异。结论:成功制备了特异性的高效Tex33多克隆抗体。Tex33是一种特异性表达于睾丸组织,具有高度遗传保守性的精子顶体及尾部基因,Tex33基因敲除并不影响小鼠精子发生过程,也不影响小鼠的生育能力,可能与其他基因共同调控精子形成过程,但其并非精子发生所必须。
管斯琪[10]（2020）在《补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究》文中研究表明目的人类生育力逐年降低已经成为影响发展的医学和社会学问题,男性因素导致的不孕不育占了 40%-50%,其中少弱精子症是男性不育症最常见的病因之一。对于特发性精液异常,西药治疗效果欠佳,手术治疗的应用范围存在一定局限性,而中医药具有较好的疗效。菟枸助育汤是在五子衍宗丸的基础上加减化裁而来,临床用于治疗少弱精子症逾20年,但目前尚无相关的研究。故本研究设计临床试验,观察评价菟枸助育汤对男性不育少弱精子症患者的临床疗效,并设计动物实验探究菟枸助育汤的核心药对“菟丝子-枸杞子”对生精功能障碍模型大鼠生精功能的影响,并对其具体的作用机制进行探讨。方法临床研究:收集男性不育少弱精子症76例,采用无病例对照研究的方法,观察菟枸助育汤对少精子症和弱精子症受试者精液质量（包括精液液化状态、精液量、精子活动率、精子浓度和总数等指标）和中医证候评分的干预作用。入组时,采集所有受试者的一般信息、病史、合并用药、体格检查等相关资料。研究第1天起每日给予入组的受试者菟枸助育汤中药免煎颗粒治疗,疗程共90天,分别于第0、30、60、90天各进行一次访视,记录受试者的精液常规结果和中医证候评分,同时进行安全性观察,记录各类不良事件,填写病例报告表,每次访视时严格进行脱落、剔除的评估,最后统计所有数据。实验研究:1.将78只SD大鼠随机分为空白对照组（NC组）、模型对照组（GTW组）、左卡尼汀组（GTW+LEV组）、菟丝子-枸杞子药对组（GTW+SCFL组）和药对+抑制剂组（LY+SCFL组）。2.除NC组以外,其余各组用雷公藤多苷（40mg/kg）灌胃4周,建立生精功能障碍模型。3.第5周起GTW+LEV组（予10ml/kg左卡尼汀灌胃）、GTW+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）和LY+SCFL组（予菟丝子-枸杞子中药液灌胃）每日分别予以相应药物干预,LY+SCFL组于第1周起每周1次尾静脉注射PI3K抑制剂。4.实验8周后测定各组大鼠精子质量、附睾/睾丸脏器系数,检测性激素、抑制素B、附睾肉毒碱的水平,光镜下和透射电镜下观察睾丸的组织病理形态和细胞的超微结构,用免疫组化法、western blot以及Real-Time PCR技术检测大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、Bad、Bcl-2 和 Bax 蛋白及 mRNA 的表达。结果临床研究:本研究共完成临床病例76例,纳入研究的男性不育少精子症和弱精子症患者经过菟枸助育汤治疗后,总体的精液质量中液化状态、PR精子百分比、PR+NP精子百分比、精子浓度和精子总数等疗效性指标显着改善,具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;中医证候评分随着治疗进行有了明显的下降（P<0.05或P<0.01）;疗效判定为“痊愈”的11例,“显效”29例,“有效”32例,“无效”4例,总有效率为94.74%。整个观察期间脱落病例4例,无剔除病例,未见任何不良反应报告。实验研究:经菟丝子-枸杞子干预后的GTW+SCFL组与GTW组相比,大鼠的一般状态、附睾脏器系数、精子质量、卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）和附睾肉毒碱均有显着的改善,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;睾丸组织病理形态及细胞的超微结构观察发现,GTW+SCFL组与GTW组比较,生精小管结构、排列较正常,生精细胞明显增多,形态改善,内含的线粒体等细胞器增多;免疫组化、western blot和Real-Time PCR结果显示,与GTW组比较,GTW+SCFL组大鼠睾丸SCF、c-kit、PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白含量升高,Bax、Bad蛋白表达下降（P<0.05或P<0.01）;LY+SCFL组与GTW+SCFL组相比,SCF、c-kit和PI3K的表达无明显差异,p-Akt和Bcl-2表达减少,Bad和Bax的蛋白表达增加（p<0.05或P<0.01）。结论1.菟枸助育汤在改善男性不育少弱精子症患者的精液参数和肾虚证候中医评分方面疗效显着,能提高患者的生精功能。2.菟枸助育汤中的核心药对“菟丝子-枸杞子”可以改善生精功能障碍模型大鼠一般状态、附睾脏器系数、精子质量、FSH、LH、PRL和附睾肉毒碱,并对雷公藤多苷致睾丸组织和生精细胞的形态结构和功能的损伤具有较好的修复作用。3.“菟丝子-枸杞子”药对可以有效调控模型大鼠睾丸组织SCF、c-kit、PI3K、p-Akt、BAD、Bcl-2、Bax 蛋白及其 mRNA 的表达,通过调控 SCF/c-kit-PI3K-Bcl-2 信号通路促进生精细胞增殖和抑制生精细胞凋亡的作用。综上,菟枸助育汤可有效提高男性不育少弱精子症患者的生精功能,临床疗效显着,其作用机制可能是通过SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路调控生精细胞增殖和凋亡来实现的。
二、Study on the Regulation of Bcl-2 Gene on Rat Spermatogenic Cells Apoptosis in Transcription Level（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Study on the Regulation of Bcl-2 Gene on Rat Spermatogenic Cells Apoptosis in Transcription Level（论文提纲范文）
（1）氰戊菊酯诱导雄性SD大鼠生殖损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 农药杀虫剂对男(雄)性生殖毒性机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）甘氨酸对高氟诱导猪睾丸支持细胞损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 睾丸SC的研究进展 |
| 1.1 睾丸SC的结构特点 |
| 1.2 睾丸SC发挥多种生理功能 |
| 1.3 睾丸SC的凋亡的主要方式 |
| 第二章 氧化应激与凋亡及其相关机制 |
| 2.1 氧化应激的概念 |
| 2.2 氧化应激介导的细胞损伤 |
| 2.2.1 ROS介导的线粒体功能障碍 |
| 2.2.2 氧化应激介导的DNA损伤 |
| 2.2.3 细胞衰老 |
| 第三章 氟与甘氨酸的研究进展 |
| 3.1 氟在哺乳动物体内的吸收与分布 |
| 3.2 氟污染对哺乳动物生殖的影响 |
| 3.3 细胞凋亡的三种主要调控途径 |
| 3.4 甘氨酸的概述 |
| 3.5 甘氨酸在哺乳动物体内发挥的主要生理功能 |
| 3.6 总结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 甘氨酸对NaF诱导的猪睾丸SC增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 甘氨酸可恢复NaF诱导的猪睾丸SC细胞活力 |
| 2.2 甘氨酸可提高由NaF诱导的猪睾丸SC增殖能力 |
| 2.3 甘氨酸可缓解NaF诱导的猪睾丸SC G1 期阻滞 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 甘氨酸对NaF诱导的猪睾丸SC功能损伤及凋亡的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 甘氨酸可降低NaF诱导的猪睾丸SC氧化应激水平,抑制细胞内过量ROS产生 |
| 2.2 甘氨酸能够恢复由NaF诱导的猪睾丸SC MMP并促进产生ATP |
| 2.3 甘氨酸能够保护的猪睾丸SC DNA不受NaF诱导损伤,抑制DNA片段化 |
| 2.4 甘氨酸能够降低NaF诱导的猪睾丸SC凋亡率 |
| 2.5 甘氨酸可延缓NaF诱导的猪睾丸SC衰老 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（4）猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 隐睾症及其激素调节机制的研究进展 |
| 1.1 隐睾症 |
| 1.2 隐睾症流行病学研究 |
| 1.3 隐睾症激素调节机制的研究 |
| 2 隐睾影响哺乳动物精子发生的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物精子发生 |
| 2.2 隐睾影响精子发生的研究 |
| 3 隐睾睾丸形态计量学研究进展 |
| 3.1 隐睾睾丸细胞计数的研究 |
| 3.2 隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞的研究 |
| 4 隐睾睾丸细胞增殖研究进展 |
| 4.1 增殖相关蛋白的研究 |
| 4.2 睾丸细胞增殖的研究 |
| 4.3 隐睾影响睾丸细胞增殖的研究 |
| 5 隐睾睾丸细胞凋亡的研究进展 |
| 5.1 凋亡的概念及分子机制的研究 |
| 5.2 凋亡调节哺乳动物精子发生的研究 |
| 5.3 隐睾影响精子发生的凋亡信号研究 |
| 6 隐睾睾丸自噬的研究进展 |
| 6.1 自噬的概念及作用机制的研究 |
| 6.2 自噬调节精子发生的研究 |
| 6.3 隐睾睾丸自噬的分子机制研究 |
| 7 隐睾睾丸支持细胞间血睾屏障研究进展 |
| 7.1 血睾屏障紧密连接分子组成的研究 |
| 7.2 隐睾影响血睾屏障紧密连接分子的研究 |
| 8 转录组测序技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 8.1 转录组与转录组测序技术 |
| 8.2 转录组测序技术在睾丸基因表达差异的研究 |
| 8.3 转录组测序技术在隐睾睾丸基因表达差异的研究 |
| 9 蛋白质组学技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 9.1 蛋白质组学与蛋白质组学技术 |
| 9.2 蛋白质组学技术在睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 9.3 蛋白质组学技术在隐睾睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 10 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制作石蜡切片 |
| 2.2 HE染色 |
| 2.3 睾丸的形态计量学 |
| 2.4 睾丸细胞计数 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 猪睾丸组织形态学变化 |
| 3.2 猪睾丸组织形态计量学变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA合成 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 qRT-PCR |
| 2.3 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3.1 总蛋白提取 |
| 2.3.2 Western Blot |
| 2.4 免疫荧光化学 |
| 2.5 免疫组织化学 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对生殖细胞凋亡的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达量的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞增殖的影响 |
| 4.2 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞凋亡的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸自噬相关基因LC3、p62和Beclin1 mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸自噬蛋白LC3定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关基因Claudin-11、Occludin和ZO-1mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸支持细胞标记蛋白GATA-4 定位的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠隐睾模型的建立 |
| 2.2 免疫组织化学 |
| 2.3 血睾屏障通透性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11和ZO-1定位的影响 |
| 3.2 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 断奶前仔猪、隐睾和对侧阴囊睾丸的转录组学分析 |
| 3.2 差异基因GO分析 |
| 3.3 差异基因KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对精原细胞分化的影响 |
| 4.2 隐睾对生殖细胞减数分裂的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞间连接的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第八章 蛋白组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白的鉴定 |
| 3.2 蛋白定量和差异蛋白筛选 |
| 3.3 差异表达蛋白GO分析 |
| 3.4 差异表达蛋白KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对睾酮产生的影响 |
| 4.2 隐睾对细胞周期的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞连结的影响 |
| 4.4 隐睾对代谢的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 中医药对少弱精子症的认识 |
| 2. 中医病因及辨证分型 |
| 3. 中药复方研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 现代医学对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 少弱精子症的病因 |
| 2. 睾丸生精细胞增殖分化相关机制 |
| 3. 少弱精子症的西医治疗 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第一部分 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的网络药理学预测 |
| 1. 引言 |
| 2. 方法与材料 |
| 2.1 益肾兴阳胶囊活性成分筛选及作用靶点预测 |
| 2.2 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症PPI网络的构建 |
| 2.3 功能模块分析及作用机制解析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 益肾兴阳胶囊化学成分筛选、作用靶点和疾病靶点预测结果 |
| 3.2 少弱精子症和益肾兴阳胶囊蛋白互作网络构建 |
| 3.3 功能模块分析结果 |
| 3.4 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制和有效成分分析 |
| 3.5 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的活性成分验证 |
| 4. 讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型治疗作用与机制的实验研究 |
| 第一章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子ATP影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型生精细胞周期影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织生精细胞、支持细胞超微结构影响 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织PI3K、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达影响 |
| 参考文献 |
| 第二章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型血清性激素影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子线粒体膜电位影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路影响 |
| 参考文献 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达的影响 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 DEHP的来源与危害 |
| 1.2 职业人群DEHP暴露现状 |
| 1.3 国内外PAEs职业接触限值制定现状 |
| 1.4 国内外男性生殖安全现状 |
| 1.5 DEHP对雄性生殖安全的影响 |
| 1.6 DEHP对雄性生殖安全影响机制的研究现状 |
| 1.6.1 氧化应激在雄性生殖毒性中的作用 |
| 1.6.2 凋亡和自噬在雄性生殖系统中的作用 |
| 1.6.3 piRNA/PIWI通路对男性生殖功能的调控 |
| 1.6.4 PIWI蛋白参与其他信号通路的调控 |
| 1.7 课题研究意义、研究内容 |
| 1.7.1 课题研究意义 |
| 1.7.2 课题研究内容 |
| 第2章 DEHP诱导雄性生殖毒性中piRNA/PIWI介导的通路研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 建立DEHP暴露导致雄性生殖毒性的动物模型 |
| 2.2.1 实验动物的选择 |
| 2.2.2 DEHP染毒时间和染毒途径的选择 |
| 2.2.3 DEHP染毒剂量的确定 |
| 2.2.4 实验动物的染毒方法 |
| 2.2.5 动物模型样本组织收集 |
| 2.3 DEHP诱导大鼠生殖毒性的研究 |
| 2.3.1 DEHP诱导大鼠生殖毒性的检测方法 |
| 2.3.2 DEHP诱导大鼠生殖毒性的分析 |
| 2.4 DEHP对大鼠睾丸组织piRNA和 PIWI蛋白表达水平的影响 |
| 2.4.1 大鼠睾丸组织PIWI蛋白表达水平检测的实验方法 |
| 2.4.2 大鼠睾丸组织piRNA表达水平检测实验方法 |
| 2.4.3 大鼠睾丸组织PIWI蛋白表达水平的分析 |
| 2.4.4 大鼠睾丸组织piRNA表达水平分析 |
| 2.5 基于piRNA/PIWI预测DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路 |
| 2.5.1 piRNA介导的DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路的研究 |
| 2.5.2 基于piRNA/PIWI预测DEHP诱导雄性生殖毒性调控通路的理论分析 |
| 2.5.3 预测的piRNA/PIWI调控通路中蛋白表达水平检测及分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 DEHP诱导青春期大鼠生殖毒性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 不同DEHP暴露水平对青春期大鼠生殖毒性的研究 |
| 3.2.1 DEHP暴露的大鼠模型构建 |
| 3.2.2 大鼠生殖功能检测方法 |
| 3.2.3 DEHP暴露对大鼠生殖功能的影响 |
| 3.2.4 DEHP暴露对睾丸组织形态学的影响 |
| 3.2.5 不同剂量DEHP对睾丸细胞凋亡和自噬的影响 |
| 3.2.6 DEHP对大鼠睾丸组织形态学、细胞凋亡和自噬影响的分析 |
| 3.3 不同暴露水平的DEHP对大鼠生殖毒性的作用机制 |
| 3.3.1 DEHP暴露对大鼠睾丸组织氧化应激的影响 |
| 3.3.2 DEHP对大鼠睾丸组织氧化应激影响的分析 |
| 3.3.3 STAT3/p53 通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用 |
| 3.3.4 FoxO通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用 |
| 3.4 DEHP诱导青春期雄性大鼠生殖毒性的分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 DEHP代谢产物MEHP对小鼠初级精母细胞(GC2-spd)毒性作用的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 GC-2spd细胞染毒方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 细胞染毒时间和染毒剂量的研究 |
| 4.3 MEHP对 GC-2spd细胞氧化应激的影响 |
| 4.3.1 抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)浓度筛选实验研究 |
| 4.3.2 GC-2spd细胞内氧化应激的检测方法 |
| 4.3.3 MEHP影响GC-2spd细胞氧化应激的分析 |
| 4.4 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞毒性的影响 |
| 4.4.1 MEHP暴露的GC-2spd细胞凋亡水平评价方法 |
| 4.4.2 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞凋亡影响的分析 |
| 4.5 不同剂量MEHP影响GC-2spd细胞自噬的研究 |
| 4.5.1 GC-2spd细胞自噬的检测方法 |
| 4.5.2 不同剂量MEHP对 GC-2spd细胞自噬影响的分析 |
| 4.6 不同剂量MEHP诱导GC-2spd细胞毒性机制的研究 |
| 4.6.1 MEHP对 GC-2spd细胞STAT3/p53 通路的影响 |
| 4.6.2 MEHP对 GC-2spd细胞FoxO通路的影响 |
| 4.6.3 STAT3/p53和FoxO通路在MEHP暴露的GC-2spd细胞中的作用 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
（7）安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛睾丸发育 |
| 1.1.1 出生后牛睾丸生长发育 |
| 1.1.2 牛的精子发生 |
| 1.1.3 牛睾丸间质细胞和支持细胞发育 |
| 1.2 非编码RNA与睾丸发育 |
| 1.2.1 miRNA与睾丸发育 |
| 1.2.2 lncRNA与睾丸发育 |
| 1.2.3 circRNA与睾丸发育 |
| 1.2.4 ceRNA调控与睾丸发育 |
| 1.3 单细胞测序技术与睾丸发育 |
| 1.3.1 单细胞测序技术 |
| 1.3.2 单细胞测序技术在睾丸发育中的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 安格斯牛睾丸组织不同时期lncRNA鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 切片制备和HE染色 |
| 2.2.2 总RNA提取 |
| 2.2.3 文库构建及测序 |
| 2.2.4 转录组测序数据分析 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离和RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 睾丸组织的形态学检测 |
| 2.3.2 牛睾丸中lncRNA和 mRNA的测序信息 |
| 2.3.3 lncRNAs和 mRNA的基因组特征和表达谱分析 |
| 2.3.4 差异表达的mRNA富集分析 |
| 2.3.5 差异lncRNA靶基因富集分析 |
| 2.3.6 差异 lncRNA 及 mRNA 的表达谱验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 安格斯牛睾丸组织不同时期miRNA鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 文库构建、测序及分析 |
| 3.2.3 RT-qPCR验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛睾丸小RNA测序文库质控分析 |
| 3.3.2 牛睾丸已知和新miRNA的鉴定和特征分析 |
| 3.3.3 性成熟前后睾丸差异表达的miRNA |
| 3.3.4 差异表达的miRNA靶基因预测 |
| 3.3.5 差异表达的miRNA靶基因富集分析 |
| 3.3.6 差异表达的miRNA RT-qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 安格斯牛睾丸组织不同时期circRNA鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 文库构建及测序 |
| 4.2.3 测序结果分析 |
| 4.2.4 RT-qPCR验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛睾丸circRNA鉴定 |
| 4.3.2 初生期和性成熟期睾丸circRNA差异表达 |
| 4.3.3 差异表达circRNA宿主基因的富集分析 |
| 4.3.4 差异表达的circRNA RT-qPCR验证 |
| 4.3.5 circRNA-miRNA-mRNA网络的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 circSMC1B通过靶向let-7i调控公牛生殖干细胞的增殖及凋亡 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 circSMC1B全长扩增及载体构建 |
| 5.2.2 细胞增殖实验 |
| 5.2.3 细胞凋亡实验 |
| 5.2.4 RNA提取及cDNA合成及RT-qPCR实验 |
| 5.2.5 双荧光素酶报告系统载体构建 |
| 5.2.6 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 circSMC1B鉴定 |
| 5.3.2 circSMC1B促进mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.3 circSMC1B促进mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.4 circSMC1B竞争性结合let-7i |
| 5.3.5 let-7i抑制mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.6 let-7i抑制mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.7 let-7i靶向HMGA1、NR6A1 调控mGSCs细胞增殖凋亡 |
| 5.3.8 circSMC1B竞争性结合let-7i促进mGSCs增殖凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛睾丸组织发育的单细胞转录图谱绘制 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验样品 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 睾丸单细胞悬液制备 |
| 6.2.2 单细胞测序基本流程 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 睾丸样本的HE染色 |
| 6.3.2 单细胞数据的质控和细胞类型鉴定 |
| 6.3.3 牛睾丸不同细胞群特异表达基因的鉴定分析 |
| 6.3.4 牛睾丸生殖细胞类型鉴定及分化过程 |
| 6.3.5 牛精原细胞基因动态表达 |
| 6.3.6 牛精母细胞基因动态表达 |
| 6.3.7 牛精子细胞基因动态表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）JNK信号通路在Nano-TiO2致TM4细胞中BTB连接蛋白异常表达的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.4 相关实验试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Nano-TiO_2表征 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活性 |
| 2.2.4 JC-1法检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP) |
| 2.2.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测BTB相关蛋白表达 |
| 2.2.7 Western Blot(WB)检测蛋白表达 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 技术路线 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nano-TiO_2表征 |
| 3.2 Nano-TiO_2对BTB连接蛋白及细胞凋亡的影响 |
| 3.2.1 Nano-TiO_2诱导TM4细胞形态变化和活力下降 |
| 3.2.2 Nano-TiO_2诱导TM4细胞上BTB连接蛋白表达下降 |
| 3.2.3 Nano-TiO_2诱导TM4细胞凋亡 |
| 3.3 Nano-TiO_2引起TM4细胞中JNK信号通路激活 |
| 3.4 JNK信号通路在Nano-TiO_2诱导BTB连接蛋白表达异常下降和细胞凋亡中的作用 |
| 3.4.1 SP600125 抑制Nano-TiO_2引起的JNK信号通路激活 |
| 3.4.2 JNK信号通路参与Nano-TiO_2诱导的TM4细胞活力下降 |
| 3.4.3 JNK信号通路参与Nano-TiO_2诱导的BTB连接蛋白表达降低 |
| 3.4.4 JNK信号通路参与Nano-TiO_2诱导的TM4细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Nano-TiO_2表征 |
| 4.2 Nano-TiO_2暴露引起BTB连接蛋白表达异常下降和TM4细胞凋亡 |
| 4.3 Nano-TiO_2引起TM4细胞中JNK信号通路激活 |
| 4.4 JNK信号通路参与Nano-TiO_2诱导的BTB连接蛋白表达下降和TM4细胞凋亡 |
| 5 结论 |
| 局限性及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 Nano-TiO_2对雄性生殖毒性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师评阅表 |
（9）miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 慢病毒载体及菌株 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 RNA提取(Trizol法) |
| 2.2 RNA逆转录 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 GV369-miR-194-5p重组质粒的构建 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 2.7 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的建立 |
| 2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.9 MDC法检测细胞自噬 |
| 2.10 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.11 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 过表达miR-194-5p慢病毒重组质粒的构建 |
| 3.2 过表达miR-194-5p慢病毒的包装 |
| 3.3 稳定过表达miR-194-5p F9细胞株的构建与鉴定 |
| 3.4 miR-194-5p通过Stra8调控细胞凋亡 |
| 3.5 miR-194-5p靶向Stra8通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路调控生精细胞细胞凋 |
| 3.6 miR-194-5p通过Stra8促进细胞自噬 |
| 讨论 |
| 第2章 睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验载体及菌株 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Tex33多克隆抗体的制备 |
| 2.2 基因型鉴定 |
| 2.3 多组织RNA提取(Trizol法)及逆转录 |
| 2.4 多组织PCR扩增 |
| 2.5 多组织Western Blot |
| 2.6 石蜡切片的制作 |
| 2.7 H&E染色 |
| 2.8 PAS染色 |
| 2.9 组织免疫荧光染色 |
| 2.10 精子质量分析 |
| 2.11 敲除小鼠生育力检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 Tex33多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.2 Tex33基因在小鼠体内的组织表达模式 |
| 3.3 Tex33基因在小鼠精子发生的时间表达模式 |
| 3.4 Tex33蛋白在小鼠精子发生中的表达定位 |
| 3.5 应用CRISPR/Cas9系统构建Tex33基因敲除小鼠并鉴定 |
| 3.6 Tex33基因敲除小鼠的表型分析 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 MicroRNA参与调控睾丸支持细胞的增殖与粘附功能 |
| 参考文献(References) |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药诊治男性不育少弱精子症的研究进展 |
| 1 少弱精子症诱因 |
| 2 中医病名 |
| 3 中医病因病机 |
| 4 中医药治疗 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白及通路的研究进展 |
| 1 精子发生的三个阶段 |
| 2 生精细胞的增殖 |
| 3 生精细胞的凋亡 |
| 4 生精细胞增殖、凋亡相关蛋白 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 菟枸助育汤治疗男性不育少弱精子症的临床研究 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 菟丝子-枸杞子对生精功能障碍SD大鼠生精功能的影响 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于SCF/c-kit--PI3K--Bcl-2通路探讨菟丝子-枸杞子调控生精细胞增殖与凋亡的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、Study on the Regulation of Bcl-2 Gene on Rat Spermatogenic Cells Apoptosis in Transcription Level（论文参考文献）
- [1]氰戊菊酯诱导雄性SD大鼠生殖损伤的机制研究[D]. 郭茂. 遵义医科大学, 2021
- [2]甘氨酸对高氟诱导猪睾丸支持细胞损伤的保护作用及机制研究[D]. 刘莹. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控[D]. 李讨讨. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究[D]. 范小瑞. 山西农业大学, 2021(02)
- [5]益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究[D]. 常征辉. 北京中医药大学, 2021(02)
- [6]基于职业安全视角的DEHP对雄性生殖健康损伤及机制研究[D]. 付国庆. 武汉科技大学, 2021(01)
- [7]安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制[D]. 高源. 西北农林科技大学, 2021
- [8]JNK信号通路在Nano-TiO2致TM4细胞中BTB连接蛋白异常表达的作用研究[D]. 凌春美. 石河子大学, 2021(02)
- [9]miRNA-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究及睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究[D]. 夏蒙蒙. 扬州大学, 2020(04)
- [10]补肾生精法治疗少弱精子症及其调控生精细胞增殖与凋亡的研究[D]. 管斯琪. 北京中医药大学, 2020(04)