一、鼻腔免疫研究进展（论文文献综述）
曹洪恩[1]（2021）在《基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究》文中提出对于常驻的传染性病原微生物,通过接种疫苗形成群体免疫从而产生免疫屏障是恢复正常学习、工作和生活状态唯一的办法。鼻腔黏膜免疫具有无需注射、施用方便和免疫效力高的特点,不仅能够诱导系统和黏膜免疫应答,而且还可以激发细胞免疫反应,已成为人们日益青睐的新接种途径。然而,由于重组蛋白和多肽抗原免疫原性弱以及鼻腔特殊的环境和结构特点,导致鼻用疫苗免疫活性低,需要开发新型鼻腔黏膜免疫佐剂,提高鼻用疫苗的免疫应答水平。本论文选择具有增强鼻腔给药作用或潜在免疫调节活性的表面活性剂与促进蛋白折叠的化学伴侣Tween80（T80）形成复配体系,将复配体系与模型抗原卵清蛋白（OVA）配伍,分析了 T80复合体系和OVA的相互作用;根据影响复配体系鼻腔黏膜免疫性能的物理化学性质,以及OVA在复配体系中的结构稳定性优化选择了佐剂的组成;研究了 T80复配体系的溶血活性和OVA模型疫苗的鼻腔黏膜免疫活性,并将具有较强免疫性能的T80复配体系与存在免疫调节活性的硒碳纳米粒子（Se/C）和模拟谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性的二苄基二硒醚（DDSe）联用,实现了佐剂的协同免疫效应。研究结果可用于指导开发安全、高效、价格低廉以及易于生产的鼻腔黏膜免疫佐剂。1.通过佐剂组成的优化选择,得到了 T80与非离子表面活性剂Brij 30（B30）复配的2wt%T80/B30（4:6）小囊泡体系。T80/B30（4:6）总浓度低于cac时,T80/B30单体的烷基链与OVA残基非极性侧链及非极性侧链形成的疏水微区作用,使OVA的三级结构略有变化;T80/B30（4:6）总浓度在cac-cmc*之间时,T80/B30在OVA上的吸附对蛋白三级结构的影响不大;T80/B30（4:6）总浓度高于cmc*时,T80/B30混合胶束与OVA发生作用,对OVA的三级结构产生轻微的影响。2wt%T80/B30（4:6）小囊泡体系的粒径约为30nm,是疫苗佐剂的理想尺寸,且具有较低的表面张力和较小的接触角,有利于疫苗对鼻黏膜的润湿和铺展,OVA在该囊泡体系中的二级结构和三级结构保持相对完整。2 wt%T80/B30（4:6）体系存在较好的溶血安全性,诱导的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,其免疫应答类型是Th2型,介导体液免疫反应。2.选择与第2章中B30疏水尾链相同,但聚氧乙烯链明显较长的聚氧乙烯-9-月桂醚（P9LE）与T80复配。当T80/P9LE（4:6）总浓度在cac-cmc*之间时,OVA的荧光强度随T80/P9LE浓度增加变化很小;当T80/P9LE（4:6）总浓度大于cmc*后,T80/P9LE混合胶束与OVA发生较弱的相互作用,使OVA三级结构发生微小的变化。通过佐剂组成的优化选择获得了 2 wt%T80/P9LE（4:6）混合胶束体系,OVA在该体系中的二级结构和三级均比较稳定,且其溶血活性相对较低,诱导的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,激发Th2型免疫应答。与第2章中2 wt%T80/B30（4:6）相比,虽然2 wt%T80/P9LE（4:6）的鼻腔黏膜免疫活性低于2 wt%T80/B30（4:6）,但其溶血性明显好于2 wt%T80/B30（4:6）,且对抗原蛋白结构的影响很小。3.根据鼻腔黏膜在生理pH条件下带负电荷的特点,引入阳离子表面活性剂氯化十六烷基吡啶（CPC）,通过优化组成得到了 0.5 wt%T80/CPC（8:2）混合胶束体系。T80/CPC（8:2）的总浓度低于cac时,T80/CPC单体主要通过静电作用与OVA结合,OVA的荧光强度略微降低。T80/CPC（8:2）总浓度大于cmc*后,T80/CPC混合胶束与OVA作用,使OVA的三级结构发生轻微的变化。0.5wt%T80/CPC（8:2）体系具有较低的溶血活性,经鼻腔免疫小鼠后,产生的OVA特异性IgG抗体滴度显着高于对照OVA（p<0.001）,与阳性对照霍乱毒素B亚单位（CTB）接近。该体系明显增强了细胞免疫,激发了略偏向Th2型的混合型免疫反应,可在鼻黏膜和肺部诱导高水平的OVA特异性sIgA抗体。0.5 wt%T80/CPC（8:2）诱导的OVA特异性IgG抗体滴度与第2章中的2 wt%T80/B30（4:6）接近,但 sIgA 抗体水平显着高于 2 wt%T80/B30（4:6）（p<0.001）。4.将T80与阳离子电荷密度高、生活物相容性好的新型高分子阳离子表面活性剂PN320复配,通过组成的优化获得了 1 wt%T80/PN320（3:5）混合胶束体系。该体系与OVA复配后,Zeta电势约为20.31 mV,可在鼻腔黏膜较好地吸附,但又不会因过高的阳离子电荷密度产生细胞毒性;OVA在该体系中的α-螺旋结构是纯OVA的97.8%,荧光强度为纯OVA的85.1%（λex=295 nm）,较好地保持了蛋白结构的完整性。1 wt%T80/PN320（3:5）溶血活性低,诱导的IgG抗体滴度略高于第2章的2 wt%T80/B30（4:6）,明显高于第 3 章的 2 wt%T80/P9LE（4:6）（p<0.01）,与第 4 章的 0.5 wt%T80/CPC（8:2）和CTB相近,免疫应答类型为略微偏向于Th2型的混合免疫反应。1 wt%T80/PN320（3:5）在鼻黏膜和肺部产生的sIgA抗体水平显着高于2wt%T80/B30（4:6）（p<0.001）,是非常有潜力的鼻用疫苗佐剂。5.将论文中第2到第5章中具有优良鼻腔黏膜免疫活性的T80复配体系与存在免疫调节功能的Se/C和模拟GSH-Px活性的DDSe混合,实现了佐剂的协同免疫作用。与Se/C混合后,2 wt%T80/B30（4:6）体系和1 wt%T80/PN320（3:5）体系的免疫性能明显增强。1 wt%T80/PN320（3:5）+Se/C的鼻腔黏膜免疫活性明显强于2 wt%T80/B30（4:6）+Se/C,与CTB接近,且Se/C的加入使1wt%T80/PN320（3:5）的免疫应答类型从略偏向于Th2型的混合免疫反应转为略偏向Th1型的混合免疫反应,有效地增强了细胞免疫应答。合成的Se/C新材料还具有较强的抗菌性能,进一步拓展了佐剂的用途,如疫苗防腐和抗药性等。与DDSe联用后,0.5%T80/CPC（8:2）体系诱导的OVA特异性IgG和sIgA抗体水平显着提升,与CTB相近,且免疫应答类型从略偏向于Th2型的混合免疫反应转为略偏向Th1型的混合免疫反应,明显地增强了细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫反应。
马尚[2]（2020）在《CS-IONzyme作为催化佐剂提高H1N1流感黏膜疫苗免疫效果机制的研究》文中研究指明流感是一种具有高度传染性的疾病,甲型H1N1流感病毒pdm09自2009年初次出现以来,共造成全世界约575400人死亡,给人类生命健康带来巨大的威胁。鼻腔是流感病毒入侵机体的主要部位,如果在鼻腔建立良好的黏膜免疫,则可以第一时间有效地阻断病毒的感染。鼻腔免疫全灭活病毒（Whole inactivated virus,WIV）疫苗是一种预防流感病毒感染的有效措施,但是单独的灭活病毒免疫效果并不理想。氧化铁纳米酶（Iron oxide nanozymes,IONzymes）可模拟多种类酶活性,如过氧化物酶（peroxidase,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）活性等。在pH酸性条件下,IONzyme表现出类过氧化物酶（peroxidase,POD）活性,有利于胞内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生,该特点有助于树突状细胞（Dendritic cells,DCs）成熟,提高天然免疫水平。此外,对IONzymes表面参杂壳聚糖（chitosan,CS）可提高其类酶活性,同时改变表面电荷,有利于提高抗原递送效率,因此推测壳聚糖修饰纳米酶（CS-IONzyme）可能是一种新型黏膜疫苗佐剂。本研究首先评估CS-IONzyme-H1N1流感黏膜疫苗的黏膜递送能力。其次,体外评价CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响。最后,通过小鼠免疫和攻毒试验,评价该疫苗的免疫保护效率,为CS-IONzyme作为鼻腔黏膜免疫佐剂的应用提供理论依据。研究内容主要分为以下三个部分:1、CS-IONzyme对H1N1 WIV黏附鼻腔上皮细胞和DCs募集的影响本试验应用水热法合成了 CS-IONzyme,并与H1N1 WIV吸附连接,制备H1N1 WIV-CS-IONzyme流感黏膜疫苗,并对小鼠进行滴鼻免疫试验。采集鼻腔进行免疫荧光试验及共聚焦显微镜观察发现,与单独抗原组相比,CS-IONzyme能够显着增加H1N1 WIV的黏膜递送数量和黏附时间并在鼻腔黏膜下招募了大量的DCs聚集,这些DCs可以伸出跨上皮树突（transepithelial dendrites,TEDs）摄取腔外黏附的H1N1 WIV粒子。通过流式细胞术及门控策略进一步对鼻腔细胞悬液分析发现,CS-IONzyme可以上调鼻腔黏膜上皮细胞的CCL20、TLR2和TLR4的表达水平,使用TLR2和TLR4抑制剂后,鼻黏膜上皮的CCL20表达水平和黏膜下DCs的数量显着下降。上述结果表明,CS-IONzyme通过TLR2/4信号通路诱导鼻腔黏膜上皮细胞表达趋化因子CCL20,招募DCs至鼻黏膜下方,通过TEDs摄取H1N1 WIV。2、CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响为了探讨CS-IONzyme对小鼠DCs天然免疫应答水平的影响,本试验将CS-IONzyme与小鼠原代DCs共孵育24 h后,收集DCs及细胞上清液,检测DCs表型标志、细胞因子的分泌、吞噬FITC-Dextran、刺激CD4+T细胞增殖和ROS水平。结果显示,与对照组相比,CS-IONzyme显着增强DCs表面标志CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达;同时促进细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12p70、IL-6和IL-10的分泌;抑制吞噬FITC-Dextran能力;在混合淋巴细胞反应试验中,显着刺激CD4+T细胞的增殖;促进DCs胞内ROS的产生。此外,使用ROS抑制剂后,DCs表型标志CD40和MHCⅡ的表达显着下降,细胞因子的分泌（TNF-α、IL-1β、IL-12p70、IL-6和IL-10）显着下降,上述结果表明,CS-IONzyme通过ROS通路增强DCs天然免疫应答水平。3、H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔黏膜递送疫苗的免疫保护效力评价小鼠鼻腔免疫H1N1 WIV-CS-IONzyme疫苗,28 d后,鼻腔感染106 EID50的H1N1流感病毒,监测小鼠体重和存活率,观察第5 d和第7 d肺脏病变,检测第5 d肺脏中病毒载量。结果显示,与H1N1 WIV（存活率30%）组对比,H1N1 WIV-CS-IONzyme组可完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击（存活率100%）,体重影响较小;第5 d和第7 d脏器病变和组织切片观察,发现H1N1 WIV-CS-IONzyme组肺脏未见明显病变;通过EID50滴定法测定脏器中病毒载量,发现H1N1 WIV-CS-IONzyme组肺脏中病毒载量显着低于单独病毒疫苗组。上述结果表明,H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔黏膜递送疫苗,可以显着提高对小鼠的保护。
袁丽英,王娟,邓胜朝,李菲,王贵平,贾爱卿[3]（2021）在《鼻腔免疫疫苗的前景和未来面临的挑战》文中研究指明与传统接种方式的疫苗相比,鼻腔免疫疫苗有更多的优势,主要包括:接种方式便捷,无需处理针头,使从业人员免受针刺损伤,接种者对鼻腔疫苗产品的接受度较高等,这令鼻腔免疫技术得到迅速发展。鼻腔免疫疫苗未来面临的主要挑战是:如何将体外试验数据转化为临床效果;制定接种方案时,应特别关注如何让这种独特的黏膜接种途径满足更多疾病、更多人群和更广泛的医疗环境条件需求。本综述从鼻腔接种疫苗的现状、应用前景等方面进行阐述,同时,依据鼻腔结构和生理学特点,概述了通过鼻腔免疫的颗粒溶剂的包装形式和使用方法,以及鼻腔免疫的优缺点。
王佳璐[4]（2019）在《表达伪狂犬蛋白的枯草芽孢杆菌构建及其鼻腔免疫效力研究》文中认为伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是引起猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）（国外常称作Aujeszky病）的一种疱疹病毒,各个年龄段的猪对伪狂犬病毒都有易感性且表现出不同的症状:仔猪往往表现为高死亡率;母猪表现为流产、死胎和木乃伊胎;公猪表现为不育。目前,大量伪狂犬变异毒株在我国多个省份爆发,传统疫苗难以提供有效的保护力。因此,如何设计开发更为有效的伪狂犬疫苗成为一个热点问题。伪狂犬病毒传播途径广泛,主要通过鼻腔进行传播,伪狂犬病毒感染后在鼻腔上皮细胞中通过gC和gD蛋白介导完成首轮复制,因此gC和gD蛋白能够有效诱导免疫应答,被广泛用于疫苗制备;随后病毒会迅速感染嗅神经,进而在感觉神经元中建立潜在感染,感染后的耐过猪能通过唾液、鼻涕、尿液、粪便和精液等持续向环境中排毒。通过鼻腔免疫可以有效阻止伪狂犬病毒感染,而鼻腔免疫在临床使用时由于鼻腔的结构和功能限制往往需要配合免疫增强剂抗原递送载体使用才能达到较好的免疫效果。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis,B.subtilis）作为抗原递送载体和免疫增强剂可以刺激机体产生高水平的先天性黏膜免疫反应,此外其需氧的特性更适合于鼻腔免疫。本研究构建了表达伪狂犬gC和gD蛋白优势抗原表位的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa,并通过鼻腔免疫验证了两株重组枯草芽孢杆菌可以有效刺激鼻腔黏膜免疫和全身系统性免疫反应。本研究表明重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa有潜力开发成为预防猪伪狂犬病的鼻腔疫苗。本研究主要内容包含以下三个方面:（1）伪狂犬病毒gC和gD蛋白的优势抗原表位分析及表达通过NCBI登录号KM061380.1下载得到伪狂犬病毒ZJ01株基因组,以该基因组为模板,设计一对特异性引物通过PCR扩增出伪狂犬gC和gD蛋白全长,并利用蛋白结构分析预测软件TMHMM 2.0软件对gC和gD蛋白的氨基酸序列跨膜结构进行预测分析。截取其膜外部分用DNAstar软件包中Protean软件分析蛋白优势抗原表位位置,预测得到两个蛋白的优势抗原表位,命名为gCa和gDa。以gC和gD为模板,设计两对特异性引物通过PCR扩增出gCa和gDa,凝胶回收试剂盒回收后进行后续试验。（2）表达gC和gD蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌构建在上一部分成功获得伪狂犬病毒gC和gD蛋白的优势抗原表位后,我们进行了表达该优势抗原表位的重组枯草芽孢杆菌的构建。首先,以pLJM1-EGFP为模板设计一对特异性引物通过PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白EGFP基因,与上述（1）试验中得到gCa和gDa通过重叠延伸PCR进行连接,得到gCa-EGFP与gDa-EGFP,通过In-fusion无缝克隆试剂盒将gCa-EGFP与gDa-EGFP连接到质粒p43NMK（PstI和HindⅢ 双酶切后进行凝胶回收所得）,测序正确后得到重组质粒p43NMK-gCa-EGFP和 p43NMK-gDa-EGFP。通过电击转化（条件为:22 KV/cm,25μF,2000Ω,5 ms）将重组质粒p43NMK-gCa-EGFP和p43NMK-gDa-EGFP转化进入预先制备的枯草芽孢杆菌WB800感受态中,通过硫酸卡那霉素抗性筛选得到阳性克隆,命名为B.sutilis-gCa和B.subtilis-gDa,对阳性克隆提取质粒后测序正确后进一步通过Western-blot验证蛋白表达及共聚焦显微镜观察荧光。（3）重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa鼻腔免疫效力研究本部分试验评估了上述（2）试验中构建的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa的鼻腔免疫效力。通过60只健康的SPF雌性BALB/C小鼠随机分成4组,分别在0天和14天进行鼻腔免疫PBS,枯草芽孢杆菌WB800混合PRV灭活病毒（B.subtilis-PRV）、B.subtilis-gCa和 B.subtilis-gDa。结果显示与 B.subtilis-PRV 相比,B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa能够显着增加肺泡涮洗液及阴道涮洗液中IgA抗体的水平（P<0.01或P<0.05）,其中B.subtilis-gDa组产生的IgA抗体水平显着高于B.subtilis-gCa组。通过对血清中和抗体的检测发现B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa能够显着增加血清中和抗体水平（P<0.01或P<0.05）,随后,我们通过CCK8检测发现,B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa可以刺激脾脏淋巴细胞增殖,进而我们利用流式检测术检测发现B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa刺激升高了 了脾脏CD3+,CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。实时荧光定量PCR检测发现B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa能够刺激提高肺部和阴道处的IFN-γ和IL-10表达量。最后,我们对血清IgG抗体的检测发现B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa同样升高了血清IgG水平,激活提高了系统性免疫反应。综上所述,我们发现重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa能够有效诱导产生高水平的黏膜免疫和系统性免疫反应,有望成为开发伪狂犬鼻腔疫苗的潜在选择。
霍宇娟[5]（2019）在《HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估》文中研究说明目的经鼻腔黏膜免疫途径给予小鼠二价人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗,通过与皮下疫苗组比较,来评估鼻黏膜免疫途径的免疫效果。方法选用45只6-8周龄雌性BALB/c小鼠（18-20g）,随机分成3组,分别为鼻腔生理盐水对照组（A）、鼻腔疫苗实验组（B）、皮下疫苗实验组（C）。分别于0周,2周,4周对以上三组小鼠进行免疫,第六周处死小鼠并通过眼球取血的方式收集血清样本,ELISA法检测血清中特异性抗体Ig G含量;然后,无菌取脾制备脾细胞悬液,分离脾淋巴细胞进行培养,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的特异性增殖情况。最后,通过ELISA法分别检测HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白刺激后小鼠脾淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-4的释放。另外,收集肺灌洗液,鼻灌洗液以及阴道灌洗液,用ELISA法检测灌洗液中特异性s Ig A抗体的含量。结果ELISA法结果显示,用二价HPV疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,可有效诱导和增强黏膜免疫应答,小鼠鼻灌洗液中针对HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组、皮下疫苗组相比差异均有统计学意义（P<0.05）;小鼠肺灌洗液中针对HPV16 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,鼻腔疫苗组与皮下疫苗组相比差异有统计学意义（P<0.05）。小鼠肺灌洗液中针对HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,鼻腔疫苗组与皮下疫苗组相比差异有统计学意义（P<0.001）;小鼠阴道灌洗液中针对HPV16 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,小鼠阴道灌洗液中针对HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）。与鼻腔生理盐水组相比,鼻腔疫苗组小鼠血清中针对HPV16 L1蛋白的特异性Ig G抗体明显增加,且差异有统计学差异（P<0.05）,鼻腔疫苗组小鼠血清中针对HPV18 L1蛋白的特异性Ig G抗体明显增加,且差异有统计学差异（P<0.01）。MTT法显示,经HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白刺激后鼻腔疫苗组、皮下疫苗组的刺激指数明显增加,脾淋巴细胞增殖水平大大提高。经HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白共刺激后,鼻腔疫苗组、皮下疫苗组的脾细胞培养上清中IFN-γ释放均显着增加。结论二价HPV疫苗对小鼠进行鼻腔黏膜免疫后可以在血清中产生特异性Ig G抗体,有效诱导体液免疫应答。此外,还可以诱导鼻,肺,阴道等处的局部黏膜免疫应答,并产生特异性黏膜抗体s Ig A。因此鼻黏膜免疫途径可以在不久的将来可作为黏膜疫苗的接种方式之一。
李乙江[6]（2018）在《O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌诱导牛鼻腔免疫应答的研究及推广应用》文中认为口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染偶蹄动物引起的急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫传染性强,发病率100%。FMDV主要通过呼吸道进行传播,如果切断口蹄疫病毒进入动物体内的途径,这将能更有效的预防口蹄疫的感染和传播。目前我国预防口蹄疫以皮下或肌肉注射口蹄疫灭活疫苗为主,但这种传统的免疫方式只能诱导机体产生系统免疫,对口蹄疫病毒的入侵部位（黏膜）不产生免疫保护作用。最近研究发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）是一种良好的免疫增强剂,能提高机体免疫力,且具有促生长作用。因而,本研究选用枯草芽孢杆菌配合口蹄疫灭活病毒鼻腔免疫牛。虽然,口蹄疫鼻腔疫苗取得了一定的研究进展,但鼻腔疫苗在不同种属动物之间差异较大,这就需要先了解牛呼吸道中黏膜免疫应答重要成分的分布,包括黏膜免疫活性细胞和Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）的分布。呼吸道中的黏膜免疫活性细胞是发挥黏膜免疫应答的关键,CD3+淋巴细胞作为抗感染黏膜免疫的基础,IgA是黏膜免疫的主要效应因子在防止病毒粘附和入侵中起关键作用,产生IgA的IgA分泌细胞数量在一定程度上可反映局部黏膜SIgA（Secreory immunoglobulinA,SIgA）抗体水平。TLRs中的TLR7可识别单链RNA病毒包括口蹄疫等病毒,在连接先天性免疫反应和适应性免疫反应中起重要作用。然而,目前有关牛呼吸道中黏膜免疫活性细胞和TLR7的分布尚未报道,为此本研究首先对其分布进行了详细了解。同时,本研究讨论了除了鼻相关淋巴组织（Nasal-associated lymphoid tissues,NALTs）以外,最先与外界接触的舌扁桃体是否也是有效的黏膜免疫诱导位点。随后,进一步研究了口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌气雾喷鼻免疫牛后呼吸道黏膜免疫和系统免疫以及先天性免疫反应水平。最后,将此临床应用于半岁健康小牛,发现口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌气雾喷鼻免疫牛,不仅免疫效果好而且可增加体重具有生产应用可行性,为口蹄疫灭活病毒鼻腔免疫提供理论基础和应用前景。本研究内容分为以下三部分:1.黄牛呼吸道黏膜免疫活性细胞和TLR7分布的研究本试验运用免疫组织化学技术和组织学技术对5头7岁健康婆罗门牛的鼻黏膜、气管、肺内支气管、肺组织和舌扁桃体中的黏膜免疫活性细胞（包括CD3+淋巴细胞和IgA分泌细胞）和TLR7的分布进行了详细研究。试验结果显示,黄牛的鼻黏膜、气管、肺内支气管和肺中均分布有黏膜免疫活性细胞和TLR7,CD3+淋巴细胞主要分布于黏膜上皮间及其下方固有层中以及腺体周围,其数量在鼻黏膜和肺中分布最多,气管、肺内支气管次之;IgA分泌细胞主要分布于黏膜上皮下以及腺体周围,其数量在鼻黏膜中最多,气管次之,肺内支气管和肺中较少;TLR7主要分布于黏膜上皮及其下方固有层中的淋巴细胞和IgA分泌细胞以及腺体中,其表达量在气管黏膜中最多,其次为鼻黏膜和肺内支气管黏膜,肺最少。此外,从鼻黏膜到肺内支气管黏膜下均分布有较多的淋巴组织。牛舌扁桃体分布有大量TLR7、CD3+淋巴细胞和少量IgA分泌细胞,虽然参与局部黏膜免疫反应,但不是有效的黏膜免疫诱导位点。该结果明确了CD3+淋巴细胞、IgA分泌细胞和TLR7在黄牛呼吸道中的分布,表明了黄牛鼻腔黏膜是较好的黏膜免疫诱导位点。2.口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫对牛呼吸道黏膜免疫和系统免疫的影响本试验应用1×107 LD50/mL O型口蹄疫灭活病毒与1×109/mL B.subtilis OKB1 05菌液按1:1体积配制通过气雾喷鼻免疫牛,采用免疫组织化学和ELISA的方法探讨对牛呼吸道黏膜免疫与系统免疫的影响。免疫组化结果显示,与试验对照组相比,口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌喷鼻免疫牛后CD3+淋巴细胞、IgA分泌细胞的数量和TLR7的表达呈极显着增多（P<0.01）,而常规口蹄疫灭活疫苗对CD3+淋巴细胞、IgA分泌细胞的数量和TLR7的表达的影响不大（P>0.05）。ELISA结果显示,与试验对照组相比,口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌喷鼻免疫牛后鼻、气管、肺和肺内支气管中IL-12、TNF-α水平均显着增加（P<0.01,P<0.05）,尤其是在气管和肺内支气管中最为明显,但IL-4、IL-6和IL-10无明显差异（P>0.05）;常规口蹄疫灭活疫苗对牛呼吸道组织中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的影响都不大（P>0.05）。从免疫后第3天开始牛鼻液、唾液中O型口蹄疫特异性SIgA以及血清中O型口蹄疫病毒特异性抗体均显着增加（P<0.01,P<0.05）,且维持至3个月。本试验结果表明O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌喷鼻后可刺激牛呼吸道局部细胞免疫反应和体液免疫反应,提高呼吸道先天免疫力,同时还可诱导全身系统免疫应答。3.口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫牛的临床推广应用为了进一步验证口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌气雾喷鼻使用的有效性和安全性,分别在云南省德宏州芒市和陇川县的10个牛场进行了临床应用,共计186头半岁健康小牛。其中,口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫（A组）了 146头小牛,单独使用枯草芽孢杆菌组（B组）、常规疫苗组（C组）、单独使用灭活口蹄疫病毒组（D组）、空白对照组（E组）各处理了 10头小牛。免疫30天后,采用ELISA方法对A组随机采集的100份小牛血清样品和B、C、D、E四组各10份小牛血清样品进行O型口蹄疫病毒特异性抗体检测;同时,对A组选定的50头小牛和B、C、D、E四组的40头小牛进行了体重称量。ELISA结果显示:在A组中随机采集的100份小牛血清中,检测出血清特异性抗体阳性72份,抗体阳性率为72%,达国家口蹄疫强制免疫群体免疫抗体合格率70%以上的标准,与B、D、E三组相比呈差异极显着（P<0.01）,与C组相比无明显差异（P>0.05）,且无免疫应激反应出现,而B、D、E三组均未检测到血清特异性抗体。体重测量结果显示,A和B组小牛体重与C、D、E组相比,月增重呈差异显着增加（P<0.05）,而C、D、E组小牛月增重均为差异不显着（P>0.05）。结果表明,口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫牛在实际生产应用中具有可行性和安全性,并且产生了一定的经济效和社会效益。
杨倩[7]（2018）在《猪黏膜免疫:前景与挑战》文中提出呼吸道和消化道黏膜是大多数病原微生物入侵机体的门户。通过黏膜免疫建立局部免疫力可直接切断病原微生物的入侵途径。近几年由黏膜入侵引起的猪传染病越来越多,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。因此,猪黏膜免疫研究倍受关注。本文首先介绍了口服免疫和鼻腔免疫的特点和挑战,然后针对这些挑战对疫苗设计的进展进行了概述。应用免疫增强剂和抗原递送载体可有效提高口服抗原的效果,口服免疫和鼻腔免疫是预防猪传染病有效的免疫途径。本文为有效设计猪黏膜疫苗提供了合理的建议和策略。
秦涛[8]（2015）在《禽流感灭活病毒诱导鼻腔免疫应答机制的研究》文中认为禽流感（Aivan Influenza,AI）已给我国和世界上许多国家的养禽业造成了极大的经济损失。禽流感主要分为高致病性和低致病性禽流感。虽然低致病禽流感的发病和死亡率均较低,但宿主可以作为携带者传播病毒,为流感病毒变异重组提供了资源库。鼻腔是禽流感病毒进入机体的主要入口之一。研究表明经鼻腔免疫可以在局部建立有效的黏膜免疫应答,直接切断病毒的感染路径。然而,由于鼻腔黏膜屏障的阻碍,单独应用灭活流感病毒进行鼻腔免疫时不能有效地提升机体免疫力。近年来,CpG ODN（CpG Oligodeoxynucleotides）佐剂因其具有较强的免疫刺激作用,已受到广泛关注和研究。CpG ODN的主要作用机制是可以靶向并促进黏膜下树突状细胞（Dendritic cells,DCs）成熟,进而有效地增强黏膜和系统免疫应答。但是,在黏膜屏障存在的情况下,CpG ODN是否有助于禽流感灭活病毒颗粒的跨鼻腔黏膜递送至今不明确。因此,本研究首先确证CpG ODN配合H9N2禽流感灭活全病毒（H9N2 WIV）鼻腔免疫小鼠后局部黏膜免疫和系统免疫应答水平。再次,在体外试验中,CpG ODN配合H9N2 WIV直接与小鼠DCs（体外诱导培养）相互作用,应用流式细胞术、ELISA试验和混合淋巴细胞反应试验,分别评估DCs的表型成熟、细胞因子表达和促进CD4+T细胞增殖的能力。最后,在体外建立的DCs/Calu-3上皮细胞共培养模型和体内小鼠鼻腔灌注模型,应用流式细胞术和共聚焦显微镜等方法,探讨CpG诱导鼻腔黏膜下DCs跨上皮摄取H9N2 WIV并转运至引流淋巴结-颈淋巴结的能力,同时深入研究了DCs招募和树突形成的机制,也阐明了参与此过程的DCs亚型和捕获受体,以期为CpG ODN作为鼻腔黏膜免疫佐剂的研究和应用提供一定的理论依据。本研究内容分为以下三个部分:1、CpG ODN配合H9N2 WIV鼻腔免疫对小鼠呼吸道局部黏膜和全身系统免疫应答水平的影响本试验应用CpG ODN配合H9N2 WIV滴鼻免疫小鼠,通过检测鼻腔、气管和肺各呼吸道中IgA的特异性抗体水平;血清中IgG及其亚型抗体水平;中和HI水平;脾淋巴细胞的活化（CD69表达）、增殖和亚群变化的情况,评价小鼠局部黏膜和全身系统的免疫应答水平。结果发现:应用CpG ODN配合H9N2 WIV滴鼻免疫小鼠28天后,鼻腔、气管和肺涮洗液中IgA抗体水平、血清中IgG及其亚型抗体水平、中和HI水平均显着（p<0.05）高于单独H9N2 WIV免疫后的水平。此外,脾淋巴细胞活化和增殖能力显着提升,CD3+CD4+T细胞亚群比例也有大幅上升。然而,单独应用H9N2 WIV免疫后,以上指标均未显着上调（p>0.05）.结果表明:CpG ODN作为鼻腔黏膜佐剂,配合H9N2 WIV后可以有效地提升小鼠呼吸道局部黏膜及全身的系统免疫应答水平。2、CpG ODN配合H9N2 WIV对小鼠树突状细胞活化和成熟的影响DCs是连接天然免疫和获得性免疫的重要的纽带。DCs活化和成熟直接影响着下游免疫应答水平。因此,本试验首先从小鼠骨髓中分离骨髓前体细胞,并应用GM-CSF和IL-4联合诱导前体细胞分化为DCs,并通过形态学、纯度和功能进行鉴定。随后,应用CpG ODN配合H9N2 WIV体外刺激已培养成功的DCs 24 h,收集DCs和上清液,分别检测DCs的成熟表型标志和细胞因子的表达。此外,另一部分收集的DCs与异种的CD4+T细胞混合培养,检测CD4+T细胞的增殖情况。结果显示:CpG ODN配合H9N2 WIV后,与空白对照组相比,显着上调CD40和CD80的表达;同时,促进IL-12p70和IL-10分泌;在DCs与CD4+ T细胞的混合淋巴细胞反应试验中,CD4+ T细胞显着增殖。结果表明:CpG ODN配合H9N2 WIV后可以有效地促进DCs活化和成熟,可能是引起机体较好免疫应答水平的重要机制。3、CpG ODN对鼻腔黏膜下DCs跨上皮摄取H9N2 WIV的影响CpG ODN是否能够有效协助H9N2 WIV跨鼻腔黏膜递送,目前仍不清楚。在本研究中,通过体外DCs/Calu-3共培养模型试验和体内小鼠鼻腔灌注试验,发现CpG ODN能有效协助H9N2 WIV招募DCs至鼻腔黏膜下区域,并伸出跨上皮树突捕获腔侧的病毒粒子。其中,CD103+亚型DCs参与了以上过程,SIGN-R1是鼻腔黏膜DCs上重要的摄取H9N2 WIV的受体。鼻腔上皮细胞分泌的趋化因子CCL20在DCs招募和跨上皮树突形成的过程中发挥重要作用。摄取病毒的鼻腔黏膜DCs能够快速的向其引流淋巴结-颈淋巴结迁移并递呈抗原。此外,CpG ODN并没有影响上皮细胞自身的转运能力,即跨细胞途径和细胞旁通路。结果表明:CpG ODN配合H9N2 WIV后可以通过诱导黏膜下DCs形成跨上皮树突,进而有效地摄取H9N2 WIV,这可能是CpG ODN增强下游获得性免疫应答的新机制。
梁金逢[9]（2014）在《几种Toll样配体对禽流感灭活病毒鼻腔免疫效果的影响》文中指出禽流感病毒主要通过呼吸道进行传播,鼻腔免疫可直接切断病毒的传播途径,有效控制禽流感的发生。然而灭活全病毒单独滴鼻免疫,不足以有效激发机体的免疫应答,需选择合适的黏膜佐剂来增强疫苗的免疫原性,进而达到良好的免疫效果。最近利用Toll样受体（toll-like receptor, TLR）的配体作为疫苗佐剂(如枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞苷酸和人工合成的CpG-ODN已成为疫苗领域的一个研究热点。枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和人工合成的CpG-ODN作为有效的黏膜佐剂在哺乳动物上已有大量研究,但在禽类中其相关报道较少。因此本试验通过体外和体内试验研探讨这三种黏膜佐剂对禽流感灭活病毒鼻腔免疫的增强效果,进而筛选出对鸡具有高效佐剂效果及低成本的黏膜佐剂,为研究高致病性禽流感疫苗奠定基础。体外试验：研究枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞和鸡骨髓源树突状细胞的免疫刺激作用。体内试验：选取3日龄的海蓝蛋鸡240只,随机分为8组。10日龄鼻腔免疫雏鸡,17日龄时进行二次免疫。第1-4组分别为应用PBS和单独应用佐剂组（枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN组）；第5组为单独应用禽流感灭活病毒（IAIV）;第6-8组为应用IAIV分别配合枯草芽孢杆菌芽孢（5 x108个／鸡）、聚肌胞（50μg/鸡）、CpG-ODN（50μg/鸡）组。通过检测鼻腔、气管中IFN-γ mRNA、IL-6 mRNA和IL-12mRNA水平的变化来研究枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫局部细胞免疫水平的影响；通过间接ELISA法检测鸡气管和鼻腔刷洗液中禽流感特异性SIgA抗体的变化来探讨这三种佐剂对禽流感鼻腔免疫局部体液免疫水平的影响。通过检测血清中特异性HI的抗体及IgG抗体变化来探讨这三种佐剂对禽流感鼻腔免疫全身免疫水平的影响；通过荧光定量PCR方法检测管和鼻腔中TLRs mRNA的表达情况,探讨这三种佐剂对鸡免疫刺激活性的影响。1枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞的刺激增殖作用首先分别用不同浓度的枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN刺激鸡脾脏淋巴细胞72 h,WST-8 Cell Counting Kit-8 （CCK-8）检测不同浓度的佐剂对鸡脾脏淋巴细胞的增殖作用。结果发现：枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞对鸡脾脏淋巴细胞的刺激指数极显着上升（P<0.01）且存在剂量依赖性。CpG-ODN浓度在10-60 μg/mL时刺激指数值均高于阳性对照组和阴性对照组,浓度在100μg/mL时,刺激指数值反而低于阴性对照组。本试验结果显示出枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡脾脏淋巴细胞具有良好的免疫刺激作用。2枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡骨髓源树突状细胞的刺激作用鸡骨髓细胞体外分离培养至第6d时,加入LPS至终浓度200ng/mL,0.1个枯草芽孢杆菌芽孢/细胞,聚肌胞（20 μg/mL）及CpG-ODN(15μg/mL刺激培养24 h后,流式细胞术检测鸡细胞表面的共刺激分子或者进行鉴混合淋巴反应。结果发现：经枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN刺激后鸡骨髓源树突状细胞表面成熟分子标志CD40和CD86表达量均上调,其中枯草芽孢杆菌芽孢的上调幅度最大。同种异体混合淋巴细胞反应的结果显示：经枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN刺激成熟的树突状细胞能显着诱导同种异体幼稚T细胞增殖（P<0.01）,且枯草芽孢杆菌芽孢效果最佳。本试验结果枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN能够活化并促进鸡骨髓源树突状细胞成熟,其中枯草芽孢杆菌芽孢刺激鸡骨髓源树突状细胞成熟的能力最强。3枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫局部黏膜免疫的影响枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞、CpG-ODN分别配合IAIV二免24小时后,荧光定量PCR检测各组鸡鼻腔和气管中IFN-γ mRNA、IL-6 mRNA和IL-12 mRNA的表达情况。结果显示：应用枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞、CpG-ODN分别配合IAIV组中,鼻腔和气管IFN-γ mRNA、IL-6 mRNA和IL-12 mRNA的表达量与单独应用IAIV组的相比显着升高,其中应用IAIV配合枯草芽孢杆菌芽孢组,鼻腔和气管中IL-6和IL-12的水平均较高。本试验结果表明枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN能够显着增强IAIV鼻腔免疫局部细胞免疫水平,其中枯草芽孢杆菌芽孢效果最佳。应用间接ELISA法分别检测首免后3周、5周、7周各组鸡鼻腔和气管涮洗液中禽流感特异性IgA的水平。试验结果表现：首免后7周内,应用IAIV分别配合枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞或CpG-ODN,鸡鼻腔涮洗液和气管涮洗液中IgA抗体水平均得到极显着的提高。试验结果表明这三种佐剂配合禽流感灭活病毒滴鼻免疫后,均能有效的增强呼吸道局部体液免疫水平。试验结果还显示在这三种佐剂中用CpG-ODN配合IAIV鼻腔免疫雏鸡,鼻腔涮洗液和气管涮洗液中IgA抗体水平较高。以上两个试验显示枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN能有效增强禽流感灭活病毒鼻腔免疫的呼吸道局部黏膜免疫反应。4枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫全身免疫水平的影响应用血凝抑制（HI）试验法检测各组血清中禽流感HI抗体水平。血凝效价的变化如下：首免后7周内,单独应用IAIV和单独应用佐剂组,随着鸡日龄的增加始终呈下降的趋势,而佐剂配合IAIV组在首免后第3周呈现上升的趋势,且血清中禽流感特异性HI抗体水平较单独应用IAIV组有明显的提高。在首免后第4周,各佐剂配合IAIV组血清中禽流感HI抗体水平达到最高.应用间接ELISA法分别检测首免后3周、5周、7周各组禽流感特异性IgG抗体水平的变化。结果显示：首免后7周内,应用IAIV分别配合枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞、CpG-ODN组,血清中禽流感特异性IgG抗体水平极显着高于单独应用IAIV组（P<0.01）,其中应用IAIV配合CpG-ODN组血清中禽流感特异性IgG抗体较高。首免后7周内,单独应用IAIV组合单独应用佐剂组血清中禽流感特异性IgG抗体水平均较低,且抗体水平变化不大。以上两个试验结果表明枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN能够在一定程度上增强禽流感灭活病毒鼻腔免疫的全身免疫反应。5枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN配合禽流感灭活病毒鼻腔免疫对鸡TLRs mRNA表达的影响应用荧光定量PCR法检测各组鸡鼻腔和气管中相应识别受体TLRs的表达量。结果显示：应用IAIV分别配合聚肌胞和CpG-ODN鼻腔免疫雏鸡,鼻腔和气管中其相应的识别受体TLR3 mRNA及TLR21 mRNA的表达量较单独应用IAIV组显着上调。应用IAIV配合枯草芽孢杆菌芽孢组,鼻腔中相应的识别受体TLR2 mRNA的表达量极显着高于单独应用IAIV组,但气管中TLR2 mRNA的表达量与单独应用IAIV组得相比无明显差异。本试验表明枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN能够在一定程度上活化并上调其相应的识别受体TLR2、TLR3和TLR21 mRNA的表达。
周治东[10]（2013）在《生长抑素基因免疫肉牛的效果及其品种间差异和安全性研究》文中研究表明本研究应用细菌培养与发酵、酶联免疫测定、放射免疫测定等技术,利用现有的以减毒沙门氏菌为载体呈递pVGS/2SS-asd基因疫苗,鼻腔免疫40头青年公牛,旨在探讨生长抑素基因免疫对肉牛生长性能及安全性的影响,为促进该技术的推广应用奠定基础。1生长抑素基因免疫对青年牛血浆中生长抑素抗体水平的研究选择体型大小和年龄相近的19头（2岁）湖北松滋本地黄牛和21头西门塔尔杂交（1岁）牛,各品种随机分成4组,分别鼻饲剂量为5×1010CFU/ml、5×109CFU/ml、 5×108CFU/ml和0（对照组,用PBS稀释）的疫苗菌（n=5）。首次免疫后3周、9周采用相同剂量疫苗菌加强免疫两次。测定抗生长抑素抗体水平发现,各剂量组均能诱导试验牛发生免疫应答反应,在首次免疫3周后,高剂量生长抑素基因疫苗组诱导了较高的抗体水平,其次是中剂量与低剂量组,提示抗体水平呈现剂量依赖关系。然而,低剂量组却能较好诱导西门塔尔牛产生抗生长抑素抗体,提示抗体水平的高低与品种有关。2生长抑素基因免疫对青年牛日增重的研究在第一次加强免疫2周、5周和9周后,本地黄牛的平均日增重水优于对照组,加强免疫2周后高剂量组日增重水平显着高于对照组（p<0.05）。在加强免疫5周和9周后高剂量组和中剂量组日增重水平也显着高于对照组（p<0.05）。而相对于西门塔尔杂交牛,初次免疫及第一次加强免疫后,低剂量组日增重水平一直优于对照组但差异不显着（p>0.05）。试验后期加强肉牛的营养水平,进行第二次加强免疫,所有牛只日增重水平明显提高,在加强免疫4周和8周后,西门塔尔杂交牛各个试验组的日增重水平都高于对照组水平,但差异不显着（p>0.05）。3生长抑素基因免疫对青年牛生长激素分泌水平的影响初次免疫3周后,与免疫前血清中生长激素水平相比,其分泌水平提高,在加强免疫5周后,高剂量组本地黄牛的生长激素水平与其他试验组相比显着降低（p<0.05）,在加强免疫9周后,本地黄牛免疫组生长激素水平均高于对照组（p>0.05）,西门塔尔杂交牛在加强免疫9周后,试验组激素水平与对照组相比显着增高（p<0.05）。4安全性研究本研究从一般临床表现、体温、心率、血液指标等方面探讨疫苗菌免疫后对青年牛安全性的影响。结果表明,基因疫苗免疫接种后,所有试验牛在采食、饮水、精神状态、粪便情况一切正常。免疫后Id、2d、3d、4d和5d,试验组与对照组的体温,心率变化均在正常范围内波动,西门塔尔牛与湖北本地黄牛之间也均无显着性差异（P>0.05）。免疫后第3周和5周,不同剂量的疫苗菌对牛血常规指标（WBC、 RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW）无明显影响,各组间与对照组相比均无显着差异（P>0.05）,说明基因疫苗对牛是安全的。
二、鼻腔免疫研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻腔免疫研究进展（论文提纲范文）
（1）基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 疫苗与佐剂简述 |
| 1.1.1 疫苗的作用 |
| 1.1.2 疫苗的分类 |
| 1.1.3 佐剂的作用 |
| 1.1.4 佐剂的分类 |
| 1.2 具有免疫调节活性的两亲分子 |
| 1.2.1 普通表面活性剂 |
| 1.2.2 生物表面活性剂 |
| 1.2.3 肺表面活性物质 |
| 1.2.4 皂苷 |
| 1.2.5 单磷酞脂A |
| 1.3 胶束佐剂系统 |
| 1.3.1 γ-PGA |
| 1.3.2 两亲性聚酸酐 |
| 1.3.3 阳离子两亲性聚合物 |
| 1.3.4 POE-POP-POE |
| 1.3.5 其它两亲性聚合物 |
| 1.3.6 混合胶束 |
| 1.4 基于两亲分子的鼻腔黏膜佐剂系统 |
| 1.4.1 两亲分子 |
| 1.4.2 胶束 |
| 1.4.3 囊泡 |
| 1.4.4 乳液 |
| 1.4.5 凝胶 |
| 1.5 鼻腔黏膜免疫佐剂活性的优化 |
| 1.5.1 尺寸 |
| 1.5.2 形态 |
| 1.5.3 表面电性 |
| 1.5.4 表面亲疏水性 |
| 1.6 含硒物质的保健、免疫调节功能和抗菌活性 |
| 1.6.1 含硒物质的保健、免疫调节功能 |
| 1.6.2 含硒材料的抗菌活性 |
| 1.7 本论文选题依据、研究内容与创新点 |
| 第2章 Tween 80/Brij 30复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 T80/B30复配体系和OVA模型疫苗的制备 |
| 2.2.3 表面张力和接触角 |
| 2.2.4 荧光光谱 |
| 2.2.5 等温滴定量热 |
| 2.2.6 三元相图的绘制 |
| 2.2.7 粒径的测定 |
| 2.2.8 冷冻蚀刻电镜 |
| 2.2.9 圆二色光谱 |
| 2.2.10 溶血活性 |
| 2.2.11 免疫和样本采集 |
| 2.2.12 ELISA检测OVA特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a和sIgA |
| 2.2.13 体外细胞摄取 |
| 2.2.14 淋巴结内树突状细胞摄取抗原 |
| 2.2.15 鼻腔的组织学分析 |
| 2.2.16 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 T80/B30复配体系与OVA的相互作用 |
| 2.3.2 T80/B30复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 2.3.3 T80/B30复配体系的溶血活性 |
| 2.3.4 T80/B30复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 2.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 2.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 2.3.7 T80/B30囊泡的免疫机理探讨 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Tween 80/聚氧乙烯-9-月桂醚复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 T80/P9LE复配体系与OVA的相互作用 |
| 3.3.2 T80/P9LE复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 3.3.3 T80/P9LE复配体系的溶血活性 |
| 3.3.4 T80/P9LE复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 3.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 3.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 3.3.7 T80/P9LE混合胶束的免疫机理探讨 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Tween 80/氯化十六烷基吡啶复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 T80/CPC复配体系与OVA的相互作用 |
| 4.3.2 T80/CPC复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 4.3.3 T80/CPC复配体系的溶血活性 |
| 4.3.4 T80/CPC复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 4.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 4.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 4.3.7 T80/CPC混合胶束的免疫机理探讨 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 Tween 80/PN320复配体系的鼻腔黏膜免疫活性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和实验动物 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 T80/PN320复配体系与OVA的相互作用 |
| 5.3.2 T80/PN320复配体系的物理化学性质研究及佐剂组成的优化选择 |
| 5.3.3 T80/PN320复配体系的溶血活性 |
| 5.3.4 T80/PN320复配体系的鼻腔黏膜免疫活性 |
| 5.3.5 抗原的体外和体内细胞摄取 |
| 5.3.6 鼻腔的组织学分析 |
| 5.3.7 T80/PN320混合胶束的免疫机理探讨 |
| 5.3.8 不同Tween 80复配体系鼻腔黏膜免疫活性的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 Tween 80复配体系与含硒物质鼻腔黏膜免疫的协同效应研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Se/C的合成与表征 |
| 6.3.2 T80复配体系与Se/C鼻腔黏膜免疫的协同效应 |
| 6.3.3 免疫调节剂DDSe的合成与表征 |
| 6.3.4 T80复配体系与DDSe鼻腔黏膜免疫的协同效应 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的研究成果 |
| 致谢 |
（2）CS-IONzyme作为催化佐剂提高H1N1流感黏膜疫苗免疫效果机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇 综述 |
| 第1章 H1N1流感病毒和鼻腔黏膜DCs的研究进展 |
| 1.1 H1N1流感病毒 |
| 1.1.1 流感病毒的结构 |
| 1.1.2 流感病毒的危害 |
| 1.1.3 流感黏膜疫苗 |
| 1.1.3.1 流感减毒活疫苗 |
| 1.1.3.2 灭活流感疫苗 |
| 1.1.4 流感疫苗目前存在的问题 |
| 1.2 鼻腔黏膜DCs |
| 1.2.1 鼻腔黏膜DCs的分类 |
| 1.2.2 鼻腔黏膜DCs的功能 |
| 参考文献 |
| 第2章 纳米材料作为黏膜免疫增强剂的研究进展 |
| 2.1 两亲性聚氨基酸纳米粒子 |
| 2.2 聚合物纳米颗粒 |
| 2.3 金纳米颗粒 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验部分 |
| 第3章 CS-IONzyme对H1N1 WIV黏附鼻腔上皮细胞和DCs募集的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 病毒荧光标记 |
| 3.1.4 CS-IONzyme荧光标记 |
| 3.1.5 CS-IONzyme连接灭活H1N1流感病毒 |
| 3.1.6 共聚焦显微镜检测H1N1 WIV黏附鼻腔黏膜上皮的情况 |
| 3.1.7 共聚焦显微镜检测鼻腔黏膜下方DCs的募集和上皮CCL20的分泌情况 |
| 3.1.8 流式检测鼻腔黏膜上皮细胞TLR和CCL20/5的表达情况 |
| 3.1.9 流式检测颈淋巴结中摄取病毒的DCspo数量 |
| 3.1.10 数据分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 电镜观察CS-IONzyme及其CS-IONzyme的过氧化物酶活 |
| 3.2.2 CS-IONzyme连接H1N1 WIV |
| 3.2.3 CS-IONzyme对H1N1 WIV黏附鼻腔黏膜的影响 |
| 3.2.4 CS-IONzyme对鼻腔黏膜下方DCs募集和TEDs数目的影响 |
| 3.2.5 CS-IONzyme对鼻腔黏膜上皮趋化因子分泌及摄取H1N1 WIV的DCs数量的影响 |
| 3.2.6 CS-IONzyme对颈淋巴结中摄取病毒的DCs的影响 |
| 3.2.7 CS-IONzyme对迁移至颈淋巴结中摄取病毒的DCs数量的影响 |
| 3.2.8 CS-IONzyme对鼻腔黏膜上皮TLR表达的影响 |
| 3.2.9 TLR2和TLR4阻断试验 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 CS-IONzyme对小鼠树突状细胞天然免疫应答水平的影响 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 试验试剂 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 小鼠DCs的原代诱导培养 |
| 4.1.4 流式检测DCs表型和活化标志 |
| 4.1.5 ELISA检测DCs分泌细胞因子 |
| 4.1.6 DCs迁移试验 |
| 4.1.6.1 流式检测DCs迁移标志CCR7 |
| 4.1.6.2 Transwell小室检测DCs迁移能力 |
| 4.1.7 混合淋巴细胞反应 |
| 4.1.8 流式检测DCs吞噬FITC-Dextran |
| 4.1.9 CS-IONzyme在DCs中的定位 |
| 4.1.9.1 透射电镜观察CS-IONzyme在DCs中的定位 |
| 4.1.9.2 共聚焦观察CS-IONzyme在DCs中的定位 |
| 4.1.10 流式检测DCs中ROS |
| 4.1.11 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CS-IONzyme对DCs表型标志的影响 |
| 4.2.2 CS-IONzyme对DCs分泌细胞因子的影响 |
| 4.2.3 CS-IONzyme对DCs迁移能力的影响 |
| 4.2.4 混合淋巴细胞反应 |
| 4.2.5 DCs吞噬FITC-Dextran的能力 |
| 4.2.6 CS-IONzyme在DCs中的定位 |
| 4.2.7 CS-IONzyme对DCs ROS水平的影响 |
| 4.2.8 ROS抑制剂对CS-IONzyme诱导DCs ROS水平的影响 |
| 4.2.9 ROS抑制剂对CS-IONzyme诱导DCs表型标志的影响 |
| 4.2.10 ROS抑制剂对CS-IONzyme诱导DCs分泌细胞因子的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔黏膜递送疫苗的免疫保护效力评价 |
| 5.1 材料和仪器 |
| 5.1.1 试验动物和病毒株 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 攻毒保护试验 |
| 5.1.4 肺脏组织切片制备及组织病理学观察 |
| 5.1.5 肺脏病毒滴度测定 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 体重和存活率统计 |
| 5.2.2 肺脏病理变化 |
| 5.2.3 肺脏中病毒载量 |
| 5.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）鼻腔免疫疫苗的前景和未来面临的挑战（论文提纲范文）
| 1 鼻腔黏膜免疫系统 |
| 1.1 鼻腔黏膜的物理屏障系统 |
| 1.2 鼻腔黏膜活化的免疫系统 |
| 1.3 鼻腔黏膜的免疫抗体免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA) |
| 2 鼻腔免疫系统的主要结构及作用 |
| 3 现有的鼻腔疫苗制品 |
| 3.1 预防性鼻腔免疫疫苗 |
| 3.1.1 使用于人类的鼻腔疫苗 |
| 3.1.2 使用于动物的鼻腔疫苗 |
| 3.2 治疗性鼻腔免疫疫苗 |
| 4 鼻腔疫苗免疫的前景 |
| 4.1 鼻腔免疫系统活跃，提升免疫效率的潜力大 |
| 4.2 鼻腔疫苗免疫可降低接种成本 |
| 4.3 鼻腔疫苗的免疫效率高 |
| 5 鼻腔免疫疫苗面临的挑战 |
| 5.1 科学合理的鼻腔疫苗剂型 |
| 5.1.1 溶液制剂 |
| 5.1.2 固体制剂 |
| 5.1.3 粉末制剂 |
| 5.1.4 颗粒制剂 |
| 5.2 有效的疫苗佐剂 |
| 5.3 大动物鼻腔疫苗的推广普及 |
| 6 小结与展望 |
（4）表达伪狂犬蛋白的枯草芽孢杆菌构建及其鼻腔免疫效力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 伪狂犬病及其疫苗的研究进展 |
| 1 伪狂犬病的流行概况 |
| 2 伪狂犬病毒的结构与特性 |
| 3 伪狂犬疫苗的研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌增强鼻腔黏膜免疫的研究进展 |
| 1 鼻腔黏膜免疫概述 |
| 2 鼻腔疫苗的发展 |
| 3 枯草芽孢杆菌递送抗原系统 |
| 参考文献 |
| 第三章 伪狂犬蛋白优势抗原表位的分析及表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 PK-15细胞的复苏和传代 |
| 1.6 伪狂犬病毒的接种与保存 |
| 1.7 伪狂犬基因组的提取 |
| 1.8 伪狂犬病毒gC和gD蛋白结构分析及优势抗原表位预测 |
| 1.9 伪狂犬优势抗原表位gCa与gDa基因的克隆 |
| 1.9.1 gC和gD蛋白基因的克隆 |
| 1.9.2 优势抗原区gCa和gDa蛋白基因的克隆 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 gC和gD蛋白质序列的跨膜区分析 |
| 2.2 gC和gD优势抗原表位分析 |
| 2.3 优势抗原区gCa和gDa蛋白基因的克隆 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 表达伪狂犬优势抗原表位的重组枯草芽孢杆菌构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 重组质粒的构建 |
| 1.5.1 增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的克隆 |
| 1.5.2 融合克隆gCa和gDa与EGFP片段 |
| 1.5.3 质粒p43NMK的转化及提取 |
| 1.5.4 质粒p43NMK的线性化 |
| 1.5.5 重组质粒的构建 |
| 1.6 电击转化枯草芽孢杆菌WB800菌株 |
| 1.6.1 枯草芽孢杆菌WB800感受态制备 |
| 1.6.2 电击转化重组质粒进入枯草芽孢杆菌WB800感受态 |
| 1.7 重组枯草芽孢杆菌验证 |
| 1.7.1 硫酸卡那霉素抗性筛选 |
| 1.7.2 提取阳性菌落质粒测序验证 |
| 1.7.3 Western-blot验证重组蛋白 |
| 1.7.4 共聚焦显微镜观察荧光 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2 电击转化枯草芽孢杆菌WB800 |
| 2.3 重组枯草芽孢杆菌验证 |
| 2.3.1 Western-blot验证重组蛋白 |
| 2.3.2 共聚焦荧光显微镜观察荧光 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组枯草芽孢杆菌对小鼠鼻腔免疫水平的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 免疫程序及分组 |
| 1.6 ELISA检测特异性SIgA和IgG水平 |
| 1.7 流式细胞术检测脾脏淋巴表分型 |
| 1.8 CCK8法检测脾脏淋巴细胞增殖 |
| 1.9 实时荧光定量PCR检测黏膜处细胞因子 |
| 1.10 空斑形成抑制试验检测血清中和抗体 |
| 1.11 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 肺泡及阴道涮洗液中特异性SIgA和血清IgG水平 |
| 2.2 脾脏中CD3~+,CD4~+,CD8~+分型变化 |
| 2.3 脾脏中淋巴细胞增殖变化 |
| 2.4 黏膜处细胞因子变化 |
| 2.5 血清中和抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（5）HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌诱导牛鼻腔免疫应答的研究及推广应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛口蹄疫研究进展 |
| 1 病原学特征 |
| 2 发病机制 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 传染源 |
| 3.2 易感动物 |
| 3.3 传播途径 |
| 3.4 流行现状 |
| 4 防控措施 |
| 参考文献 |
| 第二章 呼吸道黏膜免疫系统 |
| 1 呼吸道黏膜免疫系统的组成 |
| 1.1 呼吸道黏膜 |
| 1.2 呼吸道黏膜相关淋巴组织 |
| 2 呼吸道黏膜免疫 |
| 2.1 呼吸道黏膜先天性免疫 |
| 2.2 呼吸道黏膜适应性免疫 |
| 参考文献 |
| 第三章 口蹄疫鼻腔疫苗研究进展 |
| 1 口蹄疫黏膜疫苗研究进展 |
| 2 黏膜免疫增强剂研究进展 |
| 3 应用与展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 黄牛呼吸道中黏膜免疫活性细胞和TLR7分布的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 样品采集与处理 |
| 1.4 HE染色显示淋巴组织 |
| 1.5 免疫组织化学方法显示CD3+淋巴细胞、IgA分泌细胞和TLR7 |
| 1.6 组织学观察与数据处理 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 呼吸道中黏膜免疫活性细胞和TLR7的分布 |
| 2.2 黏膜免疫活性细胞和TLR7在黄牛呼吸道中的分布规律 |
| 2.3 黄牛舌扁桃体黏膜免疫活性细胞和TLR7的分布 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫对牛呼吸道黏膜免疫与系统免疫的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物分组与免疫方法 |
| 2.2 样品采集与处理 |
| 2.3 免疫组织化学方法显示黏膜免疫活性细胞和TLR7 |
| 2.4 组织学观察与数据处理 |
| 2.5 ELISA方法检测鼻液和唾液中口蹄疫特异性SIgA |
| 2.6 ELISA方法检测血清中O型口蹄疫病毒特异性抗体 |
| 2.7 ELISA方法检测组织中细胞因子 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 对牛呼吸道细胞免疫的影响 |
| 3.2 对牛呼吸道局部体液免疫的影响 |
| 3.3 对牛全身体液免疫的影响 |
| 3.4 对牛呼吸道TLR7的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌鼻腔免疫的临床推广应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验动物分组与免疫方法 |
| 2.2 样品采集与处理 |
| 2.3 ELISA方法检测血清中O型口蹄疫病毒特异性抗体 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清O型口蹄疫病毒特异性抗体的检测 |
| 3.2 体重的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）猪黏膜免疫:前景与挑战（论文提纲范文）
| 1 猪口服免疫与消化道免疫 |
| 2 猪鼻腔免疫与呼吸道免疫 |
| 3 猪黏膜免疫应用前景 |
（8）禽流感灭活病毒诱导鼻腔免疫应答机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 呼吸道黏膜免疫及黏膜树突状细胞的重要作用 |
| 1 呼吸道黏膜 |
| 2 呼吸道黏膜相关淋巴组织 |
| 2.1 鼻腔相关淋巴组织 |
| 2.2 支气管相关淋巴组织 |
| 3 呼吸道引流淋巴结 |
| 3.1 颈淋巴结 |
| 3.2 支气管淋巴结/纵膈淋巴结 |
| 4 参与呼吸道黏膜免疫相关的树突状细胞 |
| 4.1 呼吸道树突状细胞类型 |
| 4.2 呼吸道树突状细胞亚群及主要免疫分子 |
| 4.3 呼吸道树突状细胞的功能 |
| 参考文献 |
| 第二章 疫苗佐剂CpG ODN的研究进展 |
| 1 CpG ODN的概念 |
| 2 CpG ODN的分类 |
| 3 CpG ODN作用机制 |
| 3.1 胞内信号和基因表达 |
| 3.2 CpG ODN与免疫细胞相互作用 |
| 4 CpG ODN安全性 |
| 5 CpG ODN作为疫苗佐剂的应用进展 |
| 5.1 CpG ODN在黏膜疫苗中的应用 |
| 5.2 CpG ODN在临床注射疫苗中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 CpG ODN配合H9N2 WIV鼻腔免疫对小鼠呼吸道局部黏膜和全身免疫水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.4 体内免疫程序 |
| 1.5 材料收集 |
| 1.6 ELISA方法检测呼吸道各黏膜IgA抗体水平 |
| 1.7 ELISA方法检测血清总IgG及亚型抗体水平 |
| 1.8 血凝抑制试验检测中和HI水平 |
| 1.9 流式细胞术检测脾淋巴细胞CD69的表达水平 |
| 1.10 CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力 |
| 1.11 流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例 |
| 1.12 数据统计 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 鼻腔、气管和肺H9N2 WIV特异性IgA抗体水平 |
| 2.2 血清中H9N2 WIV特异性IgG及其亚型抗体水平 |
| 2.3 血清中中和HI水平 |
| 2.4 脾淋巴细胞的活化水平 |
| 2.5 脾淋巴细胞的增殖水平 |
| 2.6 脾淋巴细胞亚群比例的变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CpG ODN配合H9N2 WIV对小鼠树突状细胞活化和成熟的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 试验试剂和耗材 |
| 1.4 小鼠树突状细胞的原代诱导培养 |
| 1.5 流式细胞术鉴定树突状型细胞纯度和成熟水平 |
| 1.6 激光共聚焦显微镜检测树突状型细胞的CD11c表达水平 |
| 1.7 H9N2亚型禽流感病毒的纯化及灭活 |
| 1.8 流式细胞术检测树突状细胞表型成熟水平 |
| 1.9 ELISA检测树突状细胞分泌细胞因子水平 |
| 1.10 免疫磁珠法分选CD4~+T细胞 |
| 1.11 混合淋巴细胞反应试验检测检测淋巴细胞增殖水平 |
| 1.12 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠树突状细胞的鉴定 |
| 2.2 CpG ODN配合H9N2 WIV对小鼠树突状细胞活化和成熟的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CpG ODN对鼻腔黏膜下树突状细胞跨上皮 摄取H9N2 WIV的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及细胞系 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 试验试剂和耗材 |
| 1.4 Calu-3细胞的极性培养 |
| 1.5 小鼠骨髓源树突状细胞的原代培养 |
| 1.6 CpG ODN对Calu-3细胞和DCs的细胞毒性 |
| 1.7 DC/Calu-3体外共培养系统的建立 |
| 1.8 禽流感病毒的荧光标记 |
| 1.9 小鼠鼻腔灌注试验 |
| 1.10 流式细胞术检测黏膜下DCs摄取病毒的能力 |
| 1.11 流式细胞术检测共培养系统中DCs的表型成熟能力 |
| 1.12 ELISA法检测共培养系统中DCs分泌细胞因子水平 |
| 1.13 共培养系统中混合淋巴细胞反应试验 |
| 1.14 免疫荧光试验 |
| 1.15 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 Calu-3细胞的极化培养特征 |
| 2.2 CpG ODN对上皮细胞Calu-3活力的影响 |
| 2.3 共培养系统中CpG ODN配合H9N2 WIV对黏膜下树突状细胞成熟能力的影响 |
| 2.4 共培养系统中CpG ODN对黏膜下树突状细胞摄取游离侧H9N2 WIV能力的影响 |
| 2.5 上皮细胞对H9N2 WIV跨上皮转运的影响 |
| 2.6 体内外试验中CpG ODN对树突状细胞跨上皮树突形成的影响 |
| 2.7 体内外试验中跨上皮树突对腔侧H9N2 WIV的摄取能力 |
| 2.8 体内外试验中SIGN-R1受体在鼻黏膜树突状细胞的表达情况及捕获H9N2 WIV能力 |
| 2.9 Calu-3细胞和树突状细胞对CpG ODN的摄取能力 |
| 2.10 趋化因子CCL20和TLR9信号通路对鼻黏膜树突状细胞招募和跨上皮树突形成的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）几种Toll样配体对禽流感灭活病毒鼻腔免疫效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 上篇 第一章 文献综述 |
| 1.1 Toll样受体与及其相关黏膜佐剂研究进展 |
| 1.1.1 Toll样受体的分布及其免疫应答机制 |
| 1.1.2 Toll样受体与其配体佐剂 |
| 1.1.3 小结与展望 |
| 1.2 禽类树突状细胞的研究进展 |
| 1.2.1 禽类树突细胞的生物学亚群及特征 |
| 1.2.2 禽类树突状细胞的来源及分化成熟 |
| 1.2.3 禽类树突状细胞上Toll样受体的表达 |
| 1.2.4 禽类树突状细胞在免疫应答中的作用 |
| 1.2.5 小结和展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验部分 |
| 第二章 不同Toll样配体对鸡脾脏细胞的刺激作用 |
| 试验一 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡脾脏细胞的刺激作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 不同Toll样配体对鸡骨髓来源树突状细胞促进成熟的影响 |
| 试验二 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对鸡骨髓来源树突状细胞的促进成熟作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 不同Toll样配体对禽流感灭活病毒鼻腔免疫局部黏膜免疫水平的影响 |
| 试验三 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫雏鸡局部细胞免疫水平的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 试验四 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫局部体液免疫水平的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 不同Toll样配体对禽流感灭活病毒鼻腔免疫全身免疫水平的影响 |
| 试验五 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫血清中禽流感HI抗体水平的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 试验六 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN对禽流感灭活病毒鼻腔免疫血清中禽流感特异性IgG抗体水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 不同Toll样配体配合禽流感灭活病毒鼻腔免疫对鸡TLRs mRNA表达水平的影响 |
| 试验七 枯草芽孢杆菌芽孢、聚肌胞和CpG-ODN配合禽流感灭活病毒鼻腔免疫对鸡TLRsmRNA表达水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）生长抑素基因免疫肉牛的效果及其品种间差异和安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 影响肉牛生长性能的因素 |
| 1.1 品种与品种间杂交 |
| 1.2 营养水平与饲养管理 |
| 1.3 性别与年龄 |
| 2 生长抑素与动物生长的关系 |
| 2.1 主动免疫 |
| 2.2 被动免疫 |
| 2.3 半胱胺耗竭SS |
| 2.4 基因工程疫苗 |
| 3 SS基因疫苗的研究进展 |
| 3.1 SS基因免疫对草鱼及家禽生长的影响 |
| 3.2 SS基因免疫对单胃动物生长的影响 |
| 3.3 SS基因免疫对反刍动物生长的影响 |
| 4 鼻腔免疫研究概况 |
| 5 疫苗的安全性研究 |
| 6 SS基因疫苗存在问题与前景 |
| 研究目的和意义 |
| 试验部分 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、细菌 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pVGS/2SS-asd质粒转化asd/crp双缺失C500菌 |
| 2.2.2 质粒的小量提取 |
| 2.2.3 免疫用质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.4 疫苗制备 |
| 2.2.5 动物的分组及免疫程序 |
| 2.2.6 血样的采集 |
| 2.2.7 抗体检测 |
| 2.2.8 激素测定 |
| 2.3 疫苗对牛的安全性评价 |
| 2.3.1 观察各组牛的一般情况和死亡率 |
| 2.3.2 免疫后实验牛的体温心率的测定 |
| 2.3.3 血常规检测 |
| 2.4 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2 不同剂量组牛的SS抗体效价 |
| 3.3 不同剂量组牛抗SS抗体阳性牛比例 |
| 3.4 免疫后牛体重变化 |
| 3.5 免疫后牛血中GH水平 |
| 3.6 疫苗的安全性评估 |
| 3.6.1 免疫后牛行为观察及对牛死亡率和腹泻率的影响 |
| 3.6.2 免疫后对牛体温的影响 |
| 3.6.3 免疫后对牛心率的影响 |
| 3.6.4 免疫后牛血液指标检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于免疫应答反应的品种差异 |
| 4.2 关于品种间基因免疫对生长性能的影响差异 |
| 4.3 关于基因免疫对GH分泌的影响的品种差异 |
| 4.4 生长抑素基因免疫对牛行为的影响 |
| 4.5 生长抑素基因免疫对牛体温和心率的影响 |
| 4.6 生长抑素基因免疫对牛血液指标的影响 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、鼻腔免疫研究进展（论文参考文献）
- [1]基于Tween 80复配体系的鼻腔黏膜免疫佐剂研究[D]. 曹洪恩. 扬州大学, 2021
- [2]CS-IONzyme作为催化佐剂提高H1N1流感黏膜疫苗免疫效果机制的研究[D]. 马尚. 扬州大学, 2020(04)
- [3]鼻腔免疫疫苗的前景和未来面临的挑战[J]. 袁丽英,王娟,邓胜朝,李菲,王贵平,贾爱卿. 中国动物传染病学报, 2021(02)
- [4]表达伪狂犬蛋白的枯草芽孢杆菌构建及其鼻腔免疫效力研究[D]. 王佳璐. 南京农业大学, 2019
- [5]HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估[D]. 霍宇娟. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [6]O型口蹄疫灭活病毒配合枯草芽孢杆菌诱导牛鼻腔免疫应答的研究及推广应用[D]. 李乙江. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]猪黏膜免疫:前景与挑战[J]. 杨倩. 南京农业大学学报, 2018(02)
- [8]禽流感灭活病毒诱导鼻腔免疫应答机制的研究[D]. 秦涛. 南京农业大学, 2015(05)
- [9]几种Toll样配体对禽流感灭活病毒鼻腔免疫效果的影响[D]. 梁金逢. 南京农业大学, 2014(08)
- [10]生长抑素基因免疫肉牛的效果及其品种间差异和安全性研究[D]. 周治东. 华中农业大学, 2013(02)