一、真核细胞核仁中rDNA的分布定位和rRNA转录发生位置的研究进展(论文文献综述)
张文静[1](2020)在《rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生》文中研究表明研究目的血管平滑肌细胞衰老(senescence)在多种血管疾病的发病机制中可能占有重要位置。动脉瘤(Aneurysm)是由血管壁退行性变引起的血管管腔病理性扩张。临床上常见的动脉瘤是腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm,AAA)。AAA破裂及其相关并发症引起的总死亡率超过80%。最新研究发现,血管平滑肌细胞衰老与AAA的发生发展亦密切相关。细胞衰老是多种应激条件下慢性损伤的结果,例如氧化应激、基因毒性应激和复制应激等。核仁是发生核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)转录和核糖体生物合成的场所。抑制真核细胞中RNA聚合酶Ⅰ(RNA polymerase Ⅰ,PoI Ⅰ)介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应,称为核仁应激(也称为核糖体应激)。我们课题组前期研究发现在血管平滑肌细胞中抑制rDNA转录、诱导核仁应激能够引起G2/M细胞周期阻滞,并且某些细胞衰老的标志物表达上调。本课题中我们对这一现象进行更深入的研究。我们提出以下科学假说:干扰rDNA转录过程诱导细胞核仁应激能够诱发血管平滑肌细胞出现衰老的表型,并且能够加速动脉管壁出现动脉瘤样的退行性病理改变。为了验证这一假说,我们主要关注了以下三个方面的科学问题:(1)人AAA组织和小鼠AAA模型中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达是否发生变化;(2)用平滑肌特异性敲除TIF-IA(Pol Ⅰ转录复合体关键组分之一)的小鼠及特异性Pol Ⅰ抑制剂(CX-5461)为手段,研究干扰rDNA转录、诱导细胞核仁应激是否能加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展;(3)在细胞水平阐明干扰rDNA转录诱发核仁应激反应是否加速血管平滑肌细胞出现衰老表型,探索可能的机制,并进一步验证在AAA组织中是否存在以上这些细胞学改变。研究方法一、动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响1.动物模型及分组选用8周龄ApoE-/-雄性小鼠建立Ang Ⅱ诱导的AAA模型;选用8周龄C57BL/6雄性小鼠建立CaCl2/PBS(Ca/P)诱导的AAA模型。ApoE-/-小鼠被随机分为2组,假手术组和Ang Ⅱ模型组,每组12只。在第7天及第28天取材。将C57BL/6小鼠随机分为2组,PBS对照组和Ca/P模型组,每组12只。在第7天及第28天取材。在药物干预实验中,C57BL/6小鼠被随机分为3组,每组10只,分别为 PBS 组、Ca/P 组和 Ca/P+CX-5461 处理组(CX+Ca/P)。2.Ang Ⅱ诱导的AAA模型将Ang Ⅱ按照1000ng/min/kg的剂量灌入渗透泵中,假手术(Sham)组灌入等量生理盐水。ApoE-/-小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40mg/kg)溶液进行麻醉后,小鼠取俯卧位,颈后部备皮后取一长约1cm的横切口,用眼科剪钝性分离背部皮肤与皮下组织,按照分组将渗透泵埋于皮下,将渗透泵置于皮下,逐层缝合切口。待小鼠苏醒后放回鼠笼,给予普通饮食。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43(Pol Ⅰ与TIF-IA连接的亚基)mRNA的表达变化。3.Ca/P诱导的AAA模型C57BL/6小鼠用小动物麻醉机吸入异氟烷气体进行麻醉,备皮后取下腹部正中切口,找到腹主动脉,仔细分离周围结缔组织,暴露出肾下腹主动脉段(近心端至肾动脉分叉处,远心端至髂动脉分叉处)。将充分浸润CaCl2溶液(0.5M)的棉条覆盖在腹主动脉表面,敷育10分钟。然后换成浸润无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的棉条继续敷育5分钟。敷育完毕后用生理盐水冲洗腹腔,用无菌棉球将冲洗液吸干。PBS对照组只敷育浸润PBS的棉条15分钟。逐层缝合组织,待小鼠苏醒后放回鼠笼,术后给予美洛昔康(1mg/kg)镇痛处理。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43 mRNA的表达变化。药物干预实验:CX+Ca/P组在敷育棉条的部位滴加50μL含CX-5461(终浓度10μM)的Pluronic F127凝胶。PBS组和Ca/P组滴加等量不含药物的Pluronic F127凝胶。待F127凝胶凝固后将肠管复位。术后4周取材,观察腹主动脉血管有无明显膨出并测量其最大直径,对组织切片进行弹性纤维染色(Verhoeff’s van gieson染色,简称EVG染色)和苏木素-伊红(HE)染色,对血管弹力层的破坏进行评分并作比较。4.smTIF-IA-/-小鼠的繁育及表型检测将雌性TIF-IAflox/flox小鼠和雄性平滑肌细胞骨架蛋白(SMA)启动子驱动的Cre表达小鼠(SMA-Cre)交配繁殖,得到TIF-IA+/-Cre小鼠,再将雌雄TIF-IA+/-Cre小鼠交配繁殖得到平滑肌特异性敲除TIF-IA基因(smTIF-IA-/-小鼠。取同窝出生的TIF-IA+/+小鼠作为野生型对照。观察小鼠状态、体重,检测并记录小鼠血压。取不同周龄小鼠进行解剖取材,将小鼠主动脉血管进行HE染色及EVG染色并统计血管中膜的平均厚度、观察弹力层形态改变、免疫组化检测平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、以及巨噬细胞标记物F4/80的表达。5.人腹主动脉瘤组织标本收集及处理收集2016年10月至2018年9月于山东大学齐鲁医院行腹主动脉瘤切除加人工血管置换术的患者组织标本。收集2016年11月至2018年3月于山东大学齐鲁医院器官移植中心进行肾脏移植术时部分残留的正常腹主动脉组织作为正常对照。用qPCR检测组织中UBF、TBP、TIF-IA mRNA的表达及pre-rRNA/18S rRNA的比值。Western blot检测组织中TBP、TIF-IA的蛋白表达。二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系1.Pol I抑制剂对血管平滑肌细胞衰老表型的影响分别用两种Pol I抑制剂CX-5461和BMH-21处理小鼠平滑肌细胞系(MOVAS)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)。用SA-β-Gal(衰老相关β半乳糖苷酶)染色实验检测衰老细胞的比例,用qPCR检测衰老相关标志物p21CiPⅠ、P16INK4a和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达,以及衰老相关分泌因子白介素(IL)-6和IL-8的表达。2.TIF-IA基因沉默对血管平滑肌细胞衰老表型的影响用表达shRNA的慢病毒载体敲低MOVAS细胞中TIF-IA基因的表达,用qPCR和Western blot检测慢病毒干扰效率。用qPCR检测敲低TIF-IA基因对rDNA转录复合体关键因子UBF、polr-1A(编码Pol Ⅰ最大的亚基)和RPA43表达的影响;检测其对p21Cip1、PAI-1、IL-6及IL-8表达的影响。用Cell Counting Kit-8(CCK-8)和流式细胞术分别检测TIF-IA基因沉默对细胞增殖和细胞周期的影响。3.TIF-IA基因沉默对平滑肌细胞DNA损伤反应的影响敲低TIF-IA基因后,用细胞免疫荧光检测MOVAS细胞中核仁磷蛋白(nucleophosmin,NPM)在细胞核中的分布,用Western blot和/或免疫荧光检测p53蛋白及其磷酸化水平以及ATM、ATR的磷酸化水平。用细胞免疫荧光检测敲低TIF-IA对MOVAS细胞核中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和DNA依赖蛋白酶的催化亚单位(DNA-PKCs)水平的影响。用碱性彗星电泳实验检测敲低TIF-IA基因对DNA链断裂的影响。4.AAA组织中核仁应激、细胞衰老及DNA损伤反应的变化用qPCR检测人AAA组织中p21Cip1、PAI-1、MMP-2和MMP-9的表达。用免疫组化/免疫荧光检测人AAA中膜组织中DNA损伤通路相关的p53、ATR及ATM/ATR底物S/T*Q的磷酸化水平,检测γH2AX的表达变化并用免疫荧光双标法将γH2AX与α-SMA共定位。为了明确AAA中DNA损伤是否与核仁应激增加有关,对NPM进行了免疫荧光染色,并将NPM和γH2AX进行共定位,对共定位情况进行分析。在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜组织中,用免疫组化检测p53及ATR磷酸化水平。用SA-β-Gal染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验检测smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞的衰老和凋亡情况。用免疫组化检测组织中PAI-1及IL-8的表达变化。结果一、动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响1.人腹主动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化qPCR检测结果显示,与正常主动脉组织相比,人AAA组织中TIF-IA mRNA表达水平下调,而TBP mRNA表达上调,UBF的表达没有显着改变。Western blot检测结果显示TIF-IA蛋白表达降低,TBP蛋白表达升高。qPCR检测结果显示45S pre-rRNA与成熟18S rRNA的比率下降。2.Ang Ⅱ诱导的AAA组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化多普勒超声检测显示,Ang Ⅱ诱导的AAA模型中第7天腹主动脉最大直径增大50%,第28天最大直径增大140%。qPCR结果显示,第7天时UBF、TBP和RPA43的表达水平没有显着改变,而TIF-IA的水平降低。第28天时UBF、TIF-IA的表达水平均降低,而TBP和RPA43表达没有明显变化。3.Ca/P诱导的AAA组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化HE染色结果显示,Ca/P诱导的AAA模型于第7天开始出现中膜弹性纤维破坏和炎症细胞浸润;第28天中膜弹性纤维破坏加重、出现明显弹力层断裂及炎症细胞浸润。qPCR结果显示,UBF的表达在第7天没有变化,但在第28天显着下降。TIF-IA的表达在第7天和第28天均显着下调。TBP的表达在第7天上调,而在第28天没有明显变化。相比之下,RPA43在两个时间点的表达均无明显变化。4.SsmTIF-IA-/-小鼠主动脉壁自发出现动脉瘤样退行性病变smTIF-IA-/-、鼠在出生时可以存活,但表现出生长迟缓,体重比野生型小鼠约轻1 0-20%。在4~10周龄时发生自发性死亡,死亡发生前无明显的行为异常。对死亡小鼠进行尸检,未发现腹腔或胸腔出血。组织病理学检查显示,100%的smTIF-IA-/-小鼠在胸、腹主动脉均有广泛的动脉瘤样退行性病变。组织病理学检查显示血管病变表现为弹力层的紊乱和断裂,平滑肌细胞减少,主动脉血管壁平均厚度降低。免疫组化结果显示,smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜MMP-2和MMP-9表达水平升高。此外,smTIF-IA-/-小鼠主动脉血管周围区域巨噬细胞浸润增加。5.特异性Pol Ⅰ抑制剂CX-5461加重Ca/P诱导的AAA形成为了进一步阐明干扰rDNA转录是否在动脉瘤形成中起致病作用,我们在Ca/P模型中腹主动脉周围局部应用CX-5461干预。结果显示,CX-5461增加了Ca/P诱导的AAA发生率。经CX-5461处理的腹主动脉的平均直径明显大于对单纯造模组。组织病理学分析显示,CX-5461处理的腹主动脉中膜弹力层断裂和丢失更为明显。对小鼠血管中膜弹性纤维组织分级统计发现,CX+Ca/P组腹主动脉中膜弹性纤维分级高于Ca/P组(评分越高组织破坏越显着)。二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系1.抑制rDNA转录诱导平滑肌细胞出现衰老样表型SA-β-Gal染色显示CX-5461(0.5μM)处理MOVAS细胞后衰老细胞比例升高。qPCR结果显示,CX-5461和另外一个Pol Ⅰ抑制剂BMH-21(0.5μM)处理后细胞衰老相关基因p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平与对照组相比均显着升高,同时衰老相关分泌因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平也高于对照组。用BMH-21(5μM)处理HASMC细胞同样增加SA-β-Gal阳性衰老细胞的比例。qPCR 结果显示,CX-5461(0.5μM)和 BMH-21 处理 HASMC 后p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平均显着上调。Western blot结果显示,BMH-21处理的HASMC中p21Cip1蛋白表达增加。2.TIF-IA基因沉默诱导MOVAS细胞出现类似衰老的表型MOVAS细胞中沉默TIF-IA基因表达48小时后,qPCR和Wstern blot检测均显示TIF-IA基因敲低效率大于90%,而Pol Ⅰ复合体其它组分UBF、Polr-1A和RPA43的水平均无明显变化。CCK-8实验结果显示TIF-IA基因敲低后细胞增殖速率减慢。流式细胞术检测结果显示TIF-IA基因敲低诱导细胞出现G2/M期阻滞和S期时相延长。TIF-IA基因敲低组细胞中p21Cip1、PAI-1、IL-6和IL-8的表达水平显着高于对照组。3.干扰rDNA转录引起平滑肌细胞核仁应激及p53通路激活细胞免疫荧光结果显示,敲低TIF-IA基因使MOVAS细胞核仁蛋白NPM在核仁/核质中的比例下降,提示NPM出现核仁向核质的弥散。核仁形态改变,出现了核仁帽结构,提示细胞出现核仁应激反应。Western blot和细胞免疫荧光检测发现TIF-IA基因沉默显着增加了 p53(Ser15位)的磷酸化水平,而总的p53蛋白水平没有明显变化。4.干扰rDNA转录引起的p53磷酸化可能与激活非典型的DNA损伤反应有关细胞免疫荧光检测结果显示MOVAS细胞中敲低TIF-IA显着增加ATM/ATR的磷酸化水平,同时增加γH2AX和DNA-PKCs阳性细胞的比例。然而用碱性彗星电泳实验检测发现干扰rDNA转录并没有引起广泛的DNA链断裂,提示干扰rDNA转录在血管平滑肌细胞中引起的p53磷酸化可能与激活一种非典型性的DNA损伤反应有关。5.细胞核仁应激、DNA损伤反应、衰老与动脉瘤病变的关系qPCR结果显示人AAA组织中PAI-1、p21Cip1、MMP-2和MMP-9的表达均上调,表明细胞衰老水平增加。根据α-SMA免疫组化结果选取中膜富含平滑肌细胞的区域进行观察,NPM免疫荧光染色显示AAA组织中核仁形态异常(表现为NPM荧光信号弥散)的细胞数量增加。免疫组化结果显示p53磷酸化(Ser15)水平在AAA组织中显着升高。在AAA组织中,细胞核中γH2AX染色阳性细胞的比例显着增加。免疫荧光结果显示phospho-ATR阳性细胞比例比对照血管组升高。此外,ATM/ATR底物功能域S/T*Q的磷酸化水平在AAA组织中也呈增加趋势。深入分析γH2AX和NPM免疫荧光双标结果发现,一半以上的γH2AX阳性细胞中γH2AX与弥散的NPM呈现共定位。没有γH2AX-NPM共定位的γH2AX 阳性细胞中,大部分核仁结构完好(没有核仁应激现象))。这些结果提示在AAA组织中细胞p53磷酸化水平增加伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加,而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内,提示可能与rDNA有关。为进一步验证以上结果,我们在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中进行观察,SA-β-Gal染色显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中衰老细胞数量增多。免疫组化结果显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞p-p53和p-ATR 阳性细胞比例增高,同时IL-8和PAI-1表达增多。相反,TUNEL染色结果显示与野生型小鼠相比,smTIF-I A-/-小鼠主动脉中膜中细胞凋亡没有发生明显改变。结论动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达水平出现差异性改变。整体情况下干扰平滑肌细胞rDNA转录过程加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展。在体外,干扰平滑肌细胞rDNA转录过程,诱导细胞核仁应激,可能通过触发非典型性DNA损伤反应激活p53通路,进一步导致平滑肌细胞出现衰老样表型。在人AAA组织中膜中细胞p53磷酸化水平增加,并伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加,而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内,提示可能与rDNA有关。创新性及意义1.首次揭示了 rDNA转录障碍可能参与动脉瘤的发生发展。2.构建的平滑肌细胞特异性TIF-IA基因敲除小鼠可能作为研究动脉瘤样病变发生的新型动物模型。局限性1.在体内实验中尚未完成针对细胞衰老进行的干预实验。2.在体外实验中没有观察抑制DNA损伤反应对平滑肌细胞衰老的影响,不能确立诱发的非典型性DNA损伤反应与细胞衰老之间的因果联系。
陈鸿[2](2020)在《斑马鱼核仁蛋白Bms1l的催化活性和磷酸化修饰研究》文中研究说明核仁是核糖体生成和核糖体组装的场所,核糖体生成和组装对于细胞的生长、增殖、分化、代谢和应激反应等方面至关重要,而细胞的正常生长、增殖、分化等决定了畜牧动物能否健康生长,以及畜牧生产的长期性。因此,研究核仁在细胞生长和器官发育中的调控对于畜牧生产具有指导作用。Bms1-Rcl1复合物是核糖体小亚基(SSU)加工体的重要组成成分。在酵母中,Bms1是一个GTPase,并作为一种负载因子,将Rcl1递送至核糖体前体细胞中,为核糖体前体颗粒的组装提供能量。蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用,它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。其中磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程。目前,对于Bms1的催化活性以及其可能具有的蛋白翻译后修饰在更高等生物中的研究较少。本论文综合运用遗传学、分子生物学,发育生物学和生物信息学等研究手段,以斑马鱼为模式生物,进一步探究了核仁蛋白Bms1l更广泛的生物学功能,特别是Bms1l催化活性的深入研究以及其磷酸化修饰的新发现。首先本论文通过Bms1l分段蛋白的细胞免疫沉淀实验,发现Bms1l上第611氨基酸到第730氨基酸是Rcl1结合区域。接着通过在真核细胞进行免疫沉淀的方法来富集和纯化带HA标签的野生型Bms1l蛋白和突变型Bms1l蛋白(Bms1l基因的第5个外显子碱基突变)并进行体外GTP酶活实验,发现Bms1具有GTP酶活性,并且与野生型Bms1l蛋白相比,突变型Bms1l蛋白的GTP酶活显着降低,但并没有完全丧失GTP酶活活性,且在同一反应时间内,野生型Bms1l蛋白和突变型Bms1l蛋白的酶量都与GTP酶活呈正相关关系。其次,选取斑马鱼成鱼以及小鱼两个时间点的胚胎蛋白,并通过免疫沉淀和质谱检测手段,得到了与Bms1l特异性互作蛋白的质谱数据。通过对这两个特异性与Bms1l结合蛋白的质谱数据结果进行GO功能以及KEGG功能注释分析,发现Bms1l确实具有GTP酶活功能,并参与核糖体组装,以及细胞周期调控过程,另外还可能具有磷酸化功能。最后通过质谱检测磷酸化位点技术,发现了 Bms1l具有T401、T405两个苏氨酸磷酸化位点和S638丝氨酸磷酸化位点,值得注意的是S638磷酸化位点位于其与Rcl结合区域。丝氨酸磷酸化的主要作用是调节蛋白质结构并激活蛋白质的活性,这预示着此位点的磷酸化可能影响Bms1l的GTP酶活以及与Rcl1的结合。综上所述,本论文深入研究了Bms1l的GTP酶活活性和Rcl1的结合区域,发现磷酸化修饰并确定了其磷酸化位点,结果有助于阐明Bms1l修饰与其功能的相关性,为揭示Bms1l在细胞生长和器官发育调控中的作用奠定基础,从而为人类疾病的治疗和调控家禽家畜生长发育提供基础理论。
李科[3](2020)在《拟南芥MDN1调控核糖体合成和植物生长发育的研究》文中指出核糖体合成非常复杂,需要许多核糖体组装因子(Ribosomal biogenesis factors,RBFs)协助完成。在拟南芥中,通过生物信息学分析鉴定到约75%的酵母同源RBFs,但是目前只有少部分拟南芥同源RBFs得到验证。在酵母细胞中,AAA-ATPase Midasin 1(MDN1)参与60S核糖体大亚基前体(pre-60S)的合成,但是拟南芥MDN1(AtMDN1)在核糖体合成中的分子功能尚待研究。本研究利用多种实验手段对该问题进行了深入探究。核糖体合成需要占用细胞内大量的基因转录活动和能量,因此核糖体合成不仅能驱动植物细胞生长,而且可能参与植物生长发育的调控。核糖体合成缺陷突变体通常会表现出典型的生长缺陷表型(如主根变短、胚胎发育异常等),表明植物的生长发育过程可能对核糖体合成过程敏感,并受核糖体合成的调控,但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷调控这些表型形成的分子机理。拟南芥mdn1-1突变体具有主根变短、叶脉发育异常、叶片狭长且有收敛点以及对生长素处理不敏感等生长素缺陷相关表型,还具有种子败育和开花时间提前的表型。为了探究核糖体合成对植物生长发育的调控作用,本研究以mdn1-1突变体为主要材料,系统分析因MDN1突变导致的核糖体合成缺陷与生长素响应、胚胎发育和开花时间调控之间的联系。拟南芥核糖体蛋白(Ribosomal proteins,RPs)都由多个基因编码,而且同一个RP家族的不同成员可以同时表达并组装至不同的核糖体中。但是,特定RP和包含特定RP的核糖体是否具有特异的功能尚待研究。本研究通过过量表达RPs来提高特定RP的蛋白剂量和包含特定RP核糖体所占比例的方式,对这一问题进行深入研究。高效的植物胚性愈伤诱导和芽再生体系的建立,是利用转基因的手段进行作物遗传改良的关键。本研究利用糖皮质激素受体-地塞米松(Glucocorticoid Receptor-Dexamethasone,GR-DEX)诱导系统,对共表达胚性转录因子基因LEC2和细胞分裂素合成酶基因IPTs在胚性愈伤诱导和芽再生体系建立中的作用进行了探究。1.AtMDN1调控60S核糖体合成。AtMDN1在细胞分裂旺盛的组织中表达量高。mdn1-1突变体是单碱基突变突变体,具有明显的表型缺陷但是能够存活;mdn1-2突变体为T-DNA插入突变体,导致MDN1功能缺失,纯合致死。斑点印记杂交实验表明,AtMDN1定位于细胞核,在mdn1-1突变体中,部分AtMDN1出现在细胞质中。观察核糖体大亚基融合蛋白(RPL16D-GFP)和小亚基融合蛋白(RPS13A-GFP)的荧光分布,发现在mdn1-1突变体中pre-60S的核输出异常。检测 rRNA 前体(pre-rRNA)的积累,发现 35S、27SB 和 20S pre-rRNA在mdn1-1突变体中的积累量增加,表明pre-rRNA主要的加工途径可能被改变。蛋白互作验证表明,AtMDN1与拟南芥中的另外两个酵母RBFs同源蛋白(PESCADILLO2/PES2和NOCHELESS/NLE)相互作用。mdn1-1突变体对放线菌酮(蛋白翻译抑制剂)处理敏感,表明mdn1-1突变体的翻译效率下降。上所述结果表明,拟南芥MDN1参与60S核糖体的合成。2.核糖体合成与生长素构成反馈调节环调控植物生长发育。核糖体合成缺陷突变体通常表现出生长素缺陷相关表型,但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷与生长素之间的联系。使用生长素响应DR5:GUS和DR5rev:GFP报告株系进行观察,发现mdn1-1突变体子叶、主根和叶片边缘的生长素响应和响应分布异常。使用流式细胞仪对主根进行检测,发现处于G0/G1期的根细胞数量在mdn1-1突变体中显着增加。在mdn1-1突变体中,生长素合成基因(YUC3、YUC5、YUC7、YUC8、YUC9和TAA1)的表达量下降,生长素极性运输载体AUX1和PIN1的蛋白积累量下降,PIN3和PIN7的基因表达量下降,而PIN2的蛋白积累量增加。转录组分析结果表明,mdn1-1突变体主根中生长素合成、信号转导和生长素响应相关基因的表达量下降。在mdn1-1突变体中,根生长调控因子PLT1和PLT2的基因表达量下降,SCR和SHR的蛋白积累量增加。生长素能激活MDN1的表达,酵母单杂交实验显示ARFs可能直接与MDN1启动子结合。在mdn1-1突变体中,MDN1的表达量下降。上述结果表明,核糖体合成与生长素可以形成反馈调节环调控植物的生长发育。3.AtMDN1调控胚胎发育。mdn1-1突变体果荚变短,成熟种子数量减少且存在败育的种子,表明AtMDN1突变导致胚胎发育异常,但是目前尚不清楚其具体机理。mdn1-2突变体纯合植株致死,在mdn1-2/+杂合突变体的果荚中发现停止发育的胚珠,其胚胎发育停滞在早期球形胚时期,进一步表明AtMDN1可能参与拟南芥早期胚胎发育的调控。观察mdn1-1突变体胚胎发育的过程,发现mdn1-1突变体胚胎发育迟缓,而且在球形胚时期存在4种形态异常的胚胎。AtPES2和AtNLE分别在核仁和核质中与AtMDN1相互作用。拟南芥pes2-1和n1e-1突变体分别为AtPES2和AtNLE的T-DNA插入突变体,导致AtPES2和AtNLE功能缺失,纯合植株致死。在杂合突变体pes2-1/+和nle-1/+的果荚中也存在败育的种子,其胚胎同样在早期球形胚时期发育停滞。上述结果表明,AtPES2和AtNLE与AtMDN1类似,也可能在拟南芥早期胚胎发育中发挥重要的作用。球形胚时期胚胎发育异常可能与该时期胚胎的发育需要大量的核糖体来满足快速的细胞分裂对蛋白质的需求有关。利用生长素响应DR5rev:GFP报告株系,发现球形胚时期的生长素稳态和生长素响应在mdn1-1突变体中受到明显影响,表明AtMDN1可能在维持球形胚时期生长素的稳态和生长素响应方面也发挥重要作用。4.AtMDN1调控拟南芥开花。RP和RBFs突变通常会导致植物生长迟缓和开花延迟,但是目前尚不清楚核糖体突变如何调控开花时间提前。本研究发现,mdn1-1突变体在长日照(LD)和短日照(SD)条件下开花时间提前。转录组分析结果表明,自主途径相关基因和ABI5的基因表达量上调以及FLC的表达量下调可能在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1 flk和mdn1-1 fve-4双突变体能够抑制mdn1-1突变体的早花表型,表明FLC表达量下降在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1 flk和mdn1-1 fve-4双突变体能够显着恢复flk和fve-4突变体的晚花表明,表明MDN1突变同时产生了 FLC-independent的调控变化。mdn1-1 fc-3双突变体开花时间晚于flc-3和mdn1-1突变体,表明FLC在mdn1-1的花期调控中发挥重要的作用,FLC突变后,其它信号途径可能不足以调控mdn1-1的早花表型。mdn1-1 abi 5双突变体开花时间晚于野生型和mdn1-1,表明ABI5在MDN1突变导致的核糖体合成缺陷对植物花期的调控中发挥重要的作用。mdn1-1 clf-28开花时间早于mdn1-1而晚于clf-28,可能与mdn1-1中FT的表达量下降有关,在mdn1-1中提高FT的表达量能进一步促进其开花时间。mdn1-1 co和mdn1-1ft-10双突变体抑制mdn1-1突变体的早花表型,表明光周期途径影响mdn1-1的开花时间。5.RPL16D平衡植物的生长和抗病性。拟南芥过表达RPL16D(L16D-OEs)导致植物在营养生长后期(21 DAG开始)叶片卷曲、叶柄变短。莲座叶的转录组和蛋白质组分析结果表明,调控植物生长相关蛋白(如固醇和BR合成、细胞壁合成蛋白)的积累量在L16D-OEs中显着下降;同时,抗病相关基因的表达量和蛋白的积累量显着上调,暗示L1 6D-OEs的抗病性提高。假单胞杆菌(Pst DC3000)的侵染实验表明L16D-OEs的抗病性显着提高。上述结果显示,过表达RPL16D会减缓植物的生长,同时赋予植物更强的抗病性,表明RPL1 6D可能在平衡植物生长和植物抗病方面发挥重要作用。因此,通过转基因的方法适量提高RPL16D的蛋白剂量,可能在作物的遗传改良中具有很好的应用前景。6.创新与应用——创建简单高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系。LEAFY COTYLEDON 2(LEC2)在整个胚胎发育阶段发挥维持细胞胚性特性的作用。我们前期的研究表明,在烟草(N.tabacum)中,通过DEX诱导AtLEC2-GR向细胞核的转运,可以在幼苗茎尖产生胚性愈伤,但是胚性愈伤的芽再生效率较低。细胞分裂素可以诱导芽的再生,因此本研究探究在AtLEC2-GR烟草中过表达拟南芥细胞分裂素合成酶(Isopenteny1 Transferase,IPT)基因(AtIPT3、AtIPT7和AtIPT9)对芽再生效率的影响。AtIPT7-OEALEC2-GR和AtIPT9-OEAtLEC2-GR幼苗在DEX诱导下可以在茎尖产生胚性愈伤,而且在不含激素的培养基中,芽再生效率分别比AtLEC2-GR提高2倍和3.5倍。本研究利用GR-DEX诱导表达系统,构建了一个高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系,该体系可以不依赖外源激素,在含有DEX的培养基中诱导胚性愈伤的产生,在不含有DEX的培养基中显着提高胚性愈伤的芽再生数量。
祝岩清[4](2020)在《Bms1与Ttf1在rDNA区域互作调控细胞周期进程的功能研究》文中研究指明核仁的主要功能是负责核糖体RNA(rRNA)合成、加工成熟,以及核糖体大小亚基生成和组装。Bms1蛋白是核糖体小亚基组装复合体中的重要组成,它作为一个GTP酶,与Rc11蛋白形成复合体参与rRNA前体A2位点的剪切。之前的研究发现在斑马鱼bms1l突变体中存在肝脏发育缺陷,在人类中也报道了由于BMS1蛋白变异而导致的先天皮肤发育不全,这些组织器官的异常发育都是由于细胞周期受阻导致的。然而目前对于Bms1的研究大多关注于其参与核糖体小亚基生成的功能,对Bms1如何调控细胞周期的了解十分有限。完整的细胞周期受到细胞周期检查点的调控,包括G1到S期,S到G2期,G2到M期,中期到后期四个检查点。这些检查点受到复杂而精密的调控,从而保证细胞增殖有序而高效的进行。rDNA基因在基因组上有上百个串联重复的位点,RNA聚合酶Ⅰ负责rRNA前体的转录,即使在S期rRNA也大量转录,这会导致转录与复制在rDNA位点的时空冲突。位于rDNA转录末尾的复制叉阻滞点(replication fork barrier,简称RFB)可以避免该冲突。酵母中的Fob1蛋白,人类和小鼠中的TTF1蛋白均能与RFB区域的DNA结合,在协调rDNA转录与复制冲突过程中扮演重要角色。由此我们推测TTF1蛋白与RFB区域的结合和解离可能参与了细胞周期的调控,然而目前没有任何有关TTF1蛋白是如何从RFB位点解离的报道。本论文综合运用了分子生物学、遗传学、发育生物学、细胞生物学和生物信息学手段,以斑马鱼和人类细胞系为模型探究核仁蛋白Bms1,特别是其与Ttf1在rDNA区域的互作在调控细胞周期进程中的新功能。本论文研究发现在斑马鱼5号染色体上存在两个ttf1同源基因,我们将其命名为ttf1a和ttf1b。染色体免疫共沉淀技术分析发现斑马鱼Ttf1能与rDNA基因的3’-末尾4个串联重复区域结合,由此确定了斑马鱼rDNA区域的RFB位点。通过体外结合实验我们发现,Ttf1a蛋白与rDNA区域的RFB位点依赖于GTP。进一步的研究发现内源Ttf1的蛋白水平在GTP酶活缺陷突变体bms1lsq163和CRISPR-Cas9技术获得的bms1l=jul突变体核仁中大量累积,且富集在突变体rDNA区域的RFB位点。通过一系列细胞系及内源免疫共沉淀实验发现,Bms11蛋白能同时与Ttf1a和Ttf1b互作,且GTP酶活缺陷的Bms11sq163突变蛋白也能与Ttf1蛋白互作。体外生化试验发现野生型Bms1蛋白能解离Ttf1与RFB位点的结合,而GTP酶活缺陷的Bms11sq163突变蛋白(酶活丧失50%左右)的解离能力几乎丧失,由此可以解释为何在bms1lsq163突变体中Ttf1在核仁中异常累积。Ttf1在核仁中的异常累积导致rDNA区域的复制压力,该压力诱导整个基因组DNA的过度复制,由此导致细胞内DNA含量异常,并进而激活DNA损伤响应,最终导致bms1lsq163突变体中细胞周期被阻滞在S期,并表现为肝脏等内胚层器官发育受阻。在人类细胞系中敲减BMS1也导致与斑马鱼bms1l突变体类似的S期受阻表型,提示了 Bms1的功能在不同物种中的保守性。基于已有实验结果,我们提出了细胞周期S期检查点的假设:在正常S期情况下,Ttf1与RFB位点结合终止rRNA转录,随后Bms1与Ttf1互作并利用Bms1的GTPase酶活将Ttf1从RFB位点解离,DNA复制叉顺利通过RFB位点。在Bms1功能丧失或减弱的情况下,Ttf1滞留在RFB位点阻止了复制叉的前进,由此导致的复制压力诱导了基因组的过度复制,进而激活DNA损伤响应,最终导致细胞周期被阻滞在S期。本研究成果揭示了核仁蛋白在调控细胞增殖过程中的新功能,加深了对核仁因子调控内胚层器官发育分子机理的认识,且有可能为人类疾病的诊治提供理论依据。
王乐烽[5](2020)在《NOP2核仁蛋白在哺乳动物着床前胚胎发育中的功能及其机制研究》文中研究说明高产奶牛繁殖力低下是当今奶业面临的重大问题,由基因表达调控异常导致的奶牛早期胚胎损失是影响奶牛繁殖的重要因素。NOP2核仁蛋白(NOP2 nucleolar protein,Nop2)是一种rRNA甲基转移酶,被证实是小鼠胚胎囊胚形成所必需的,其缺失会导致胚胎发育停滞并最终发生凋亡。然而,Nop2影响小鼠胚胎囊胚形成的具体机制尚不明确,在其他哺乳动物早期胚胎发育中的作用也有待发现。在本项研究中,我们首次报道了Nop2基因在奶牛着床前胚胎发育中的作用,发现其缺失会显着降低奶牛胚胎的囊胚发育率。同时,通过对小鼠胚胎的深入研究,我们确认Nop2的表达严格定位于核仁中,证实其缺失会导致胚胎发育停滞且无法形成囊胚,但在囊胚前胚胎中无明显凋亡迹象。我们发现Nop2的缺失会导致胚胎细胞谱系分化受损和DN A甲基化水平的上调,但对胚胎mRNA转录的影响有限。进一步的研究表明,Nop2的缺失会抑制胚胎核仁前体转换和核糖体生物合成,使rRNA和核糖体蛋白的表达下调。我们还对Nop2的rRNA甲基转移酶功能进行了研究,发现其失活突变不影响小鼠胚胎的正常发育。最后,我们在奶牛胚胎中证实了Nop2缺失同样会导致rRNA表达下调,验证了Nop2在哺乳动物胚胎发育中的保守性。通过本项研究,我们揭示了Nop2在哺乳动物着床前胚胎发育中的重要作用,初步阐明了Nop2影响胚胎发育的机制,为减少奶牛早期胚胎损失,从而提高奶牛繁殖力提供了一定的理论依据。
周子龙[6](2019)在《PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究》文中指出抑制素2(Prohibitin 2,PHB2)是一种进化上高度保守的蛋白,其在真核细胞中广泛表达,通常与PHB1结合形成复合体,负责维持线粒体结构与功能,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为。目前,已有研究显示PHB2与肿瘤的发生、发展有关,但PHB2在肿瘤中的作用及分子机制还未完全阐明。横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RMS)是最常见的小儿软组织肿瘤之一,起源于原始间叶细胞,发病率约占小儿软组织肉瘤的50%。横纹肌肉瘤表达肌源性促分化转录因子,但却不能完成终末分化。我们的前期研究表明PHB2负调控肌肉促分化转录因子(如MyoD和MEF2)的活性,从而对成肌细胞的分化进程具有明显的抑制作用,那么PHB2是否在横纹肌肉瘤发生、发展中发挥一定的作用?鉴于此,本文对PHB2在横纹肌肉瘤细胞中的功能及作用机制进行了系统研究。此外,我们的初步研究结果表明PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中可能存在着亚细胞定位和生物学作用上的差异,为了进一步探讨这种差异,我们利用肝癌和正常肝细胞系对PHB2在正常细胞和癌变细胞中的生物学作用进行了初步的对比研究。为了研究PHB2在横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程中的作用,我们采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制内源性PHB2的表达,以分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞增殖及分化的调控作用,并探讨其中的作用机制。首先,我们采用MTT法检测干扰PHB2表达对横纹肌肉瘤细胞系的细胞活力的影响,结果发现PHB2表达下调明显降低了横纹肌肉瘤细胞的细胞活力。为了进一步明确横纹肌肉瘤细胞细胞活力的下降是否与细胞增殖受到抑制有关,我们分别采用BrdU掺入法检测了细胞的DNA合成能力,免疫荧光染色法检测了细胞增殖标志物Ki67的阳性率以及分析了细胞的平板克隆形成能力。结果表明PHB2表达下调明显降低横纹肌肉瘤细胞DNA合成能力,并导致Ki67阳性细胞数显着减少及克隆形成能力下降。以上结果提示PHB2表达下调可明显抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力。为了进一步研究PHB2表达下调是否影响横纹肌肉瘤细胞的细胞周期及诱导细胞发生凋亡,我们采用流式细胞术和免疫印迹法分别分析了肿瘤细胞的细胞周期和凋亡以及周期蛋白的表达水平,结果发现PHB2表达下调导致横纹肌肉瘤细胞系RD细胞出现G1期阻滞,同时抑制了周期蛋白E(Cyclin E)的表达,并引起少量细胞凋亡。为了进一步分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞分化的影响,我们采用免疫印迹及免疫荧光染色的方法检测了骨骼肌细胞分化标志分子成肌因子(myogenin)的表达,结果表明PHB2表达下调提高了横纹肌肉瘤细胞myogenin的表达水平及myogenin阳性细胞数,说明PHB2表达下调促进了横纹肌肉瘤细胞的分化。以上结果说明PHB2参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化状态。为了进一步探究PHB2参与调节横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程的分子机制,我们首先对之前发现的部分PHB2疑似细胞核核仁定位进行了确认。通过对横纹肌肉瘤细胞中的PHB2和核磷蛋白(nucleophosmin,NPM)进行免疫荧光共定位检测,我们发现,不同组织类型来源的多种横纹肌肉瘤细胞系中均有部分PHB2与NPM共定位于核仁,但在大鼠正常成肌细胞L6细胞中却未观察到PHB2的核仁定位。为了进一步研究PHB2核仁定位的普遍性和特异性,我们对人肝细胞癌细胞系HepG2、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人卵巢癌细胞系A2780及人正常肝细胞系L02细胞进行了PHB2免疫荧光染色分析,结果发现MDA-MB-231细胞和A2780细胞中均未出现PHB2的核仁定位,而值得关注的是,PHB2在HepG2细胞中出现了核仁定位,在L02细胞中则无核仁定位。以上结果说明PHB2至少在包括横纹肌肉瘤及肝癌等在内的部分肿瘤细胞中存在着特异的细胞核核仁定位。鉴于部分PHB2明显定位于横纹肌肉瘤细胞的核仁中,而核仁的结构与功能与肿瘤的发生、发展密切相关,其介导的rRNA合成功能的增强是肿瘤细胞增殖的重要标志,因此接下来我们探究了PHB2表达下调对横纹肌肉瘤细胞核仁结构和功能的影响。透射电子显微镜观察横纹肌肉瘤细胞超微结构的结果显示,与对照组相比,PHB2表达下调后,横纹肌肉瘤细胞表现出核仁小且致密、边界不清,海绵状核仁消失等特征。同时采用实时定量PCR检测45S核糖体RNA(45S rRNA)和18S核糖体RNA(18S rRNA)的转录水平以分析核仁的功能,结果表明PHB2表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞45S rRNA和18S rRNA的合成,说明PHB2参与调控核糖体DNA(rDNA)转录。有研究表明,转录因子Myc和肌肉特异性促分化转录因子成肌分化蛋白(Myoblast determination protein 1,MyoD)分别正或负调控rDNA的转录从而促进细胞增殖(Myc)或促进细胞分化(MyoD)。为了进一步揭示PHB2对rDNA转录的调节作用是否与这两种转录因子的活性有关,我们采用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测PHB2表达下调是否影响转录因子Myc和MyoD与rDNA的结合,结果表明,PHB2表达下调明显抑制Myc与rDNA的结合,同时促进MyoD与rDNA的结合,这一结果与PHB2表达下调抑制rRNA合成的结果相一致,提示PHB2通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞的rRNA合成。由于PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中存在着核仁定位的差异,为了明确这种定位上的差异是否导致PHB2在肿瘤细胞和正常细胞中发挥不同的生物学作用,我们选用人肝细胞癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02开展了对比研究。首先对比分析PHB2对正常肝细胞和肝细胞癌细胞活力的影响,MTT实验结果显示PHB2表达下调明显抑制了HepG2细胞的细胞活力,但对正常肝细胞L02则无明显影响。BrdU掺入实验亦显示PHB2表达下调降低了HepG2细胞的DNA合成能力,而对正常细胞L02无明显影响。细胞周期蛋白表达水平的免疫印迹分析显示PHB2表达下调可以抑制HepG2细胞而非L02细胞中细胞周期蛋白Cyclin E的表达,同时初步发现PHB2表达下调可以促进HepG2细胞中p27和p53的表达。这些结果说明PHB2在正常细胞和肿瘤细胞的增殖过程中可能发挥着不同的作用。进一步透射电镜分析超微结构显示PHB2表达下调导致HepG2细胞的核仁体积明显变小,而L02细胞的核仁结构则无明显改变。实时定量PCR分析rRNA水平亦显示PHB2表达下调可明显抑制HepG2细胞的rRNA合成,但对L02细胞的rRNA合成则无抑制作用,说明PHB2特异地对肝细胞癌细胞的rRNA合成至关重要。PHB2的线粒体定位普遍存在于几乎所有细胞,因此我们又对比分析了PHB2下调对正常肝细胞和肝细胞癌细胞ATP合成能力的影响,结果我们发现PHB2表达下调对HepG2细胞ATP合成的抑制作用高于L02细胞,但这仅是我们初步的研究结果,还需要进一步的研究进行确认。总之,在本研究中,我们首次确定部分PHB2特异地定位于部分肿瘤细胞的核仁,并参与维持核仁的结构,调控核仁的功能。在横纹肌肉瘤细胞中,PHB2具有促进细胞增殖,抑制细胞分化的作用,并参与维持横纹肌肉瘤细胞的核仁结构,及通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞中rRNA合成,提示PHB2对核仁结构与功能的调节作用是其参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化的分子机制之一。在肝细胞癌细胞与正常肝细胞的对比研究中,我们亦发现PHB2特异地定位于肝细胞癌细胞而非正常肝细胞的核仁中,且具有促进肿瘤细胞而非正常细胞增殖以及能量代谢的作用,参与调控肿瘤细胞而非正常细胞的核仁功能。本研究提供了PHB2参与肿瘤发生发展过程的新证据并提出其发挥作用的新机制。
李定丰[7](2019)在《神经元活性依赖的lncRNA LoNA调控蛋白质翻译的机制研究》文中研究指明目前研究表明,神经元活动调节蛋白质合成可以通过多种机制,包括磷酸化关键转录因子E2F,mRNA和rRNA加工和成熟过程以及通过控制核仁的数量。核仁的数量多少在许多生物学事件中凸显出十分重要的角色。例如,核仁的数量随着神经元的发育而变化,这提示着神经元需求的变化通过调节核仁的组装来适应蛋白质的合成。另外,核糖体的RNA组分rRNA在所有生物体蛋白质翻译过程中至关重要。神经元在活性条件刺激下将增加rRNA的产生,相反,神经元中rRNA的合成减少和核仁破坏也是神经元对衰老和神经退行性疾病信号的细胞应激反应。这些研究结果表明核仁以及核糖体RNA在生物体学习和记忆中的重要作用,同时它们在神经系统疾病也发挥着重要的作用。神经细胞体中的蛋白质合成的重要性不言而喻。与此同时,许多研究结果表明神经元突触的蛋白质翻译过程在神经突触发育和可塑性中至关重要。先前研究证明大量的mRNA,包括编码信号分子,支架和受体的mRNA被运输到树突和神经突触中。此外,神经元突触定位的多聚核糖体在学习记忆增强活动中显着增加,这凸显出学习记忆过程中对蛋白质合成的需求,同时也表明神经元突触的翻译在功能上对神经元突触的可塑性是不可或缺的。非编码RNA(ncRNA)是蛋白质翻译调控的关键调节因子,并可能通过mRNA的转录以及表观遗传的方式对蛋白质的翻译产生影响。神经元突触中调节mRNA的稳定性和蛋白质翻译对于突触可塑性至关重要,尤其是ncRNAs的调节。例如,大脑细胞质ncRNA BC1/BC200与FMRP共同作用抑制神经元树突中的蛋白翻译过程。但是,这些ncRNA定位于神经元的树突和突触中,主要发挥着在神经元远端的调控作用,神经元胞体相对于神经突触而言研究报道的ncRNA在蛋白翻译过程却知之甚少。在本研究中,我们鉴定核仁特异性lncRNA(LoNA),其RNA5’端部分结合并干扰核仁蛋白NCL功能以抑制rRNA的转录,RNA 3’末端存在类似于snoRNA的BoxC/D结构,募集并降低纤维蛋白FBL活性以调控rRNA甲基化水平。LoNA具有神经元活性的依赖性,神经元活化后,LoNA水平的降低导致rRNA和核糖体水平升高,mRNA与多核糖体结合比例增加,最终增强蛋白质翻译。此外,LoNA促进核糖体向突触的转运,导致AMPA/NMDA受体水平增加,突触可塑性增强,这提升了长时程学习记忆能力。值得一提的是,海马区域LoNA水平降低后不仅增强了WT小鼠的长期记忆,而且还缓解了APP/PS1转基因小鼠的记忆功能受损的症状。总之,这些发现揭示了LoNA在调节核糖体生物发生中的多方面作用,以此满足长时程记忆过程中对蛋白质翻译的需求。
张珏[8](2019)在《核仁蛋白DCAF13在卵母细胞发育及减数分裂成熟中的功能和调节机制研究》文中提出在临床上,卵巢早衰是造成女性不孕的重要原因之一,卵子和卵泡发育的质是决定女性生育能力的关键因素。然而,对于维持卵泡发育和存活的分子机制还有很大的探索空间。在本研究中,我们利用在卵母细胞中特异性表达的Cre将Dcaf13在卵母细胞中敲除,研究了其在卵子发生和减数分裂中的功能,以探索维持卵母细胞蛋白合成的分子机制。在哺乳动物卵母细胞生长的过程中,染色质构象自NSN向SN转换对于调节基因表达、提高卵母细胞减数分裂及受精后胚胎发育的潜能都至关重要,但关于该转变的机制还存在许多值得探索的问题。在本研究中,我们发现一种核仁蛋白DCAF13作为rRNA剪切加工复合体中的重要组成,参与了小鼠卵母细胞NSN-SN核型转换调节。卵母细胞中特异性敲除Dcaf13小鼠将导致卵母细胞核型停留在NSN阶段,卵泡发育受阻,一段时间后造成卵巢早衰、雌性不孕。DCAF13的缺失虽然没有影响mRNA水平。但是却造成卵母细胞中pre-rRNA积累。我们进一步研究发现,DCAF13参与了正在生长的卵母细胞中18S rRNA的剪切加工过程,而Dcaf13敲除导致18S rRNA的减少使得核糖体组装紊乱,最终使得卵母细胞整体蛋白积累水平下降。DCAF13可以与box C/D核糖核蛋白的核心蛋白fibrillarin等相互作用,这些蛋白直接参与了早期pre-rRNA的加工过程。我们在体外使初级卵泡卵母细胞中的fibrillarin水平下降,也将导致卵泡发育阻滞,这说明rRNA加工过程损伤确实会阻碍卵泡发育,且影响NSN-SN转换。我们已经证明了 DCAF13作为一个核仁蛋白影响了卵子发生过程,也发现其作为CRL4复合体的底物识别亚基,在早期胚胎发育过程中发挥功能,接下来我们利用Dcaf13敲除的卵母细胞,对于其在减数分裂成熟过程中的功能进行了细致的探索。Dcaf13在卵母细胞中敲除将降低其MPF活性,使得部分卵母细胞不能恢复减数分裂、发生GVBD,同时会造成染色体浓缩障碍,导致其染色体不能整齐地排列在纺锤体赤道板上,纺锤体检验点蛋白持续激活,最终使得细胞周期阻滞在第一次分裂前中期。再者,CDC20蛋白水平不足抑制了APC的活性,阻碍了卵母细胞中期向后期转换。我们还发现,在减数分裂恢复的过程中,CRL4BDCAF13 E3泛素连接酶可以识别并泛素化降解PTEN,因此保障了卵母细胞中AKT的活性,从而促进CDK1的激活,推动减数分裂恢复。通过本研究,我们不仅揭示了核仁蛋白DCAF13对于卵母细胞胞质成熟过程中蛋白质积累的重要作用,同时了探索了其作为CRL4 E3泛素连接酶底物识别亚基对于减数分裂过程的调控作用,为探索rRNA加工机制提供了生理证明,同时也为临床上研究卵巢早衰的机理和治疗方法提供了理论支持。
祝琴芳[9](2019)在《核仁蛋白Rcl1在斑马鱼肝脏发育过程中的功能研究》文中进行了进一步梳理Rcl1是一个在酵母中首次被发现并研究的核仁蛋白,在真核生物中具有较高保守性,并作为SSU组装复合体的组份,参与rRNA的加工过程。此外,在人细胞系中也证实RCL1的缺失影响了 rRNA的加工过程。本课题以斑马鱼作为模式生物,对Rcl1在脊椎动物中的功能进行研究。斑马鱼rcl1基因是一个母源基因。在卵子发育时大量储存于成熟的卵细胞中,并在受精后表达水平下降,随着胚胎发育出现一个全身性的表达小高峰,之后伴随表达水平下降表现出消化器官组织特异性的表达模式。在消化器官如肝脏中,Rcl1定位于核仁中。我们运用两个独立的rcl1突变体品系:假性逆转录病毒插入导致的rcl1lacZ突变体以及利用CRISPR/Cas9基因编辑系统产生移码突变的rcl1cas9突变体,检测Rcl1缺失对斑马鱼早期胚胎发育的影响。发现由于Rcl1的缺失,源自内胚层的肝脏、肠道、胰腺、胆囊、鱼鳔以及下颚咽弓软骨的生长发育受到严重阻滞。此外,其他胚层来源的器官发育也受到Rcl1缺失的影响,但没有内胚层器官严重。同时,确认Rcl1在肝脏、胰腺等芽基生长、扩张中具有重要作用。当缺乏Rcl1时,肝实质细胞无法顺利从G2期晚期进入M期的,导致细胞周期受到阻滞。此外,我们发现斑马鱼Rcl1的缺失影响18S rRNA的加工和成熟过程。在47S pre-rRNA的加工过程中,经A2/2位置的内切作用产生的18S rRNA前体由于Rcl1的缺失,无法对其5’ETS碱基进行移除,使得这一异常产物在rcl1突变体中大量积累,并最终导致18S rRNA大量减少。其作用机理需要进一步的实验进行探索验证。最后,我们通过转录组学分析rcl1突变体中异常表达基因,发现上调的基因主要富集于rRNA的合成和加工、核糖体蛋白复合物的形成以及核糖体细胞器的形成等。这可能是由于Rcl1表达不足导致核糖体生成受影响,从而通过负反馈上调参与核糖体形成的其他基因的表达量。而下调的基因影响了各种代谢反应,与消化器官发育不全表型一致。同时,rcl1基因的缺失导致了 429个基因发生了共计549件可变剪切事件。其中,429个基因中的387个基因的表达量均未发生显着变化。这些剪切异常基因未发现明显功能富集。
赵纾奕[10](2018)在《Sas10和Mpp10的稳定性及其在斑马鱼肝脏发育过程中生物学作用研究》文中认为核糖体对生命至关重要,它产生生命生长所需的所有蛋白质。在真核细胞中,核糖体生物合成所消耗的能量占细胞总能耗的60%以上,这个过程包括rRNA前体的转录,18S、5.8S和28S rRNA的成熟,核糖体蛋白和rRNA加工过程中所需要的非核糖体蛋白的翻译,以及核糖体大小亚基的组装等。核糖体小亚基的形成围绕着18S rRNA的加工成熟开始,47S rRNA前体经过逐步剪切修饰形成成熟的18S rRNA,这个重要的加工过程是逐步进行的并且被精确调控的。核糖体小亚基组装复合体通过对47SrRNA前体上的A0、A1、A2位点的剪切介导18S rRNA的成熟。在核仁中,Mpp10(M Phase Phosphoprotein 10)与 Imp3(Interacting with Mpp10 protein 3)、Imp4(Interacting with Mpp10 protein 4)和 Sas 10(Something About Silencing10)蛋白互作。已有报道显示Mpp10-Imp3-Imp4复合体是核糖体小亚基组装复合体的核心成分,并已通过结构分析成功定位,然而Mpp10是否有除此以外的功能并未有相关报道。有意思的是,结构分析并未成功定位Sas10,因而Mpp10-Sas10复合体的生物学功能仍然是个谜。实验室先前成果报道Def(Digestive-organ expansion factor)通过招募半胱氨酸蛋白酶CAPN3进入核仁使CAPN3降解核仁中的蛋白底物,如抑癌因子p53蛋白。但是核仁中是否存在其他Def-CAPN3降解底物仍未可知。本研究中,我们首先证明斑马鱼Mpp10和Sas10均是保守的核仁蛋白。为了进一步了解这两个蛋白在斑马鱼中的功能,我们通过CRISPR-cas9技术构建了sas10和mpp10突变的斑马鱼。我们发现Sas10和Mpp10缺失的突变体具有小眼睛、心包水肿、没有鱼鳔等一系列表征,其消化器官的发育更是受到严重影响,并且在缺失这两个蛋白中的任何一个后,突变体斑马鱼胚胎致死。同时,我们也发现Sas10和Mpp10的缺失导致突变体18S rRNA的成熟受到严重影响,从而证明这两个蛋白参与18S rRNA加工过程的功能在脊椎动物中是保守的。在已有报道Mpp10和Sas10互作的基础上,我们发现斑马鱼Mpp10和Sas10在胚胎发育早期就开始形成稳定的复合体,并且首次发现这两个蛋白稳定性互相依赖。此外,我们还发现Mpp10是核仁中Def-CAPN3蛋白降解途径的底物,而Sas10却不是。我们推测Def通过与Sas10互作形成的Def-Sas10-Mpp10复合体可能促进了 CAPN3对Mpp10的降解。同时我们发现Sas10通过与Mpp10结合遮蔽Mpp10上CAPN3的识别位点从而保护Mpp10不被CAPN3降解。因此,在高等的真核生物中,Mpp10-Imp3-Imp4、Mpp10-Sas10和Mpp10-Sas10-Def蛋白复合体通过调控Mpp10来调控核糖体的生物合成。研究成果拓展了人们对核仁蛋白Sas10和Mpp10蛋白功能的认知,为后续进一步研究核仁蛋白的功能及其调控提供了新的思路。
二、真核细胞核仁中rDNA的分布定位和rRNA转录发生位置的研究进展(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、真核细胞核仁中rDNA的分布定位和rRNA转录发生位置的研究进展(论文提纲范文)
(1)rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
符号说明 |
文献综述 |
腹主动脉瘤 |
rDNA转录与核仁应激反应 |
DNA损伤反应与细胞衰老 |
平滑肌细胞衰老与心血管疾病 |
第一章 动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
第二章 干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系 |
前言 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
小结 |
总结 |
参考文献 |
致谢 |
攻读博士期间主要科研成果及获得奖励 |
英文论文 |
Western blot原始结果 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(2)斑马鱼核仁蛋白Bms1l的催化活性和磷酸化修饰研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表(List of Abbreviations) |
第1章 前言 |
1.1 核仁简介 |
1.1.1 核仁研究的历史近程 |
1.1.2 核仁结构以及功能 |
1.1.3 核仁的多功能性 |
1.2 核糖体组装 |
1.2.1 核糖体简介 |
1.2.2 核糖体小亚基的组装 |
1.2.3 Bms1/Rcl1复合物相关研究 |
1.2.4 bms1l~(sq163)突变体概述 |
1.3 GTPase简介 |
1.3.1 Ras GTPase超家族简介 |
1.3.2 Ras蛋白简介 |
1.4 磷酸化修饰 |
1.4.1 蛋白质翻译后加工概述 |
1.4.2 蛋白质磷酸化修饰简介 |
1.4.3 磷酸化蛋白的检测方法 |
1.5 研究目的和意义 |
第2章 实验材料和方法 |
2.1 DNA、RNA以及蛋白的相关实验方法 |
2.1.1 DNA相关实验技术 |
2.1.2 RNA相关实验方法 |
2.1.3 蛋白相关实验技术 |
2.2 细胞系及其相关实验操作 |
2.2.1 细胞系及其培养条件 |
2.2.2 细胞瞬时转染与稳定转染 |
2.3 GTPase酶活检测 |
2.3.1 HA标签蛋白的纯化 |
2.3.2 GTPase酶活检测 |
2.4 血清制备抗体 |
2.5 斑马鱼品系及饲养条件 |
2.6 常用溶液及培养基 |
2.7 本课题中所用到的抗体以及引物的序列 |
2.7.1 实验中所用抗体列表 |
2.7.2 实验中所用引物列表 |
第3章 Bms1l生物学功能研究 |
3.1 Bms1l与Rcl互作的功能研究 |
3.1.1 Rcl1血清抗体的制备 |
3.1.2 Bms1l上第611氨基酸到第730氨基酸是Rcl1结合区域 |
3.2 Bms1l具有GTP酶活 |
3.2.1 稳定体外GTPase酶活操作系统的建立 |
3.2.2 野生型Bms1l蛋白以及突变的163蛋白的体外GTP酶活检测 |
3.3 Bms1l与rDNA转录终止因子Ttf1的互作关系 |
第4章 Bms1l的蛋白质后翻译修饰 |
4.1 Bms1l互作蛋白的质谱数据分析 |
4.2 Bms1l的磷酸化修饰研究 |
4.2.1 Bms1l具有磷酸化修饰 |
4.2.2 Bms1l的磷酸化位点 |
第5章 总论与讨论 |
5.1 总结 |
5.2 创新点 |
5.3 讨论 |
参考文献(References) |
作者简介 |
攻读硕士学位期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(3)拟南芥MDN1调控核糖体合成和植物生长发育的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
1 前言 |
1.1 真核生物核糖体概述 |
1.1.1 细胞质核糖体的构成 |
1.1.2 45S rDNA的结构 |
1.2 核糖体的合成 |
1.2.1 45S rRNA的转录 |
1.2.2 45S pre-rRNA的早期剪切事件 |
1.2.3 pre-rRNA加工:两条交替的途径 |
1.2.4 pre-rRNA加工因子 |
1.2.5 90S/SSU加工体的组装和pre-40S核糖体亚基的合成 |
1.2.6 pre-60S核糖体亚基的合成 |
1.3 核糖体缺陷响应 |
1.4 植物核糖体合成的特点与研究展望 |
1.5 本研究的目的和意义 |
2 材料和方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 植物材料及培养条件 |
2.1.2 菌株与质粒 |
2.1.3 转基因株系的构建 |
2.1.4 PCR引物 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 探针合成 |
2.2.2 Northern Blot |
2.2.3 Northern blot化学发光检测 |
2.2.4 cRT-PCR |
2.2.5 胚胎观察 |
2.2.6 蔗糖梯度离心 |
2.2.7 激光共聚焦显微镜 |
2.2.8 流式细胞仪检测 |
2.2.9 免疫共沉淀实验 |
2.2.10 酵母双杂交 |
2.2.11 蛋白纯化与Pull-down实验 |
2.2.12 酵母单杂交 |
2.2.13 双分子荧光互补 |
2.2.14 qRT-PCR |
2.2.15 GUS染色 |
3 结果分析 |
3.1 拟南芥MDN1调控60S核糖体合成 |
3.1.1 拟南芥MDN1的表达模式和突变体的获得 |
3.1.2 MDN1在不同物种中蛋白结构保守 |
3.1.3 拟南芥MDN1定位于细胞核 |
3.1.4 md1-1突变体60S核糖体核输出异常 |
3.1.5 mdn1-1突变体pre-rRNA剪切缺陷 |
3.1.6 拟南芥MDN1与PES2、NLE相互作用 |
3.1.7 mdn1-1突变体对放线菌酮处理敏感 |
3.1.8 mdn1-1突变体对葡萄糖处理敏感 |
3.2 核糖体合成和生长素形成反馈环调控植物生长和发育 |
3.2.1 mdn1-1突变体表现出生长素缺陷表型 |
3.2.2 mdn1-1突变体生长素响应分布异常 |
3.2.3 mdn1-1突变体主根生长素合成基因的表达量降低 |
3.2.4 mdn1-1突变体主根生长素极性运输异常 |
3.2.5 转录组分析mdn1-1突变体主根基因表达变化 |
3.2.6 mdn1-1突变体主根生长调控因子的表达量降低 |
3.2.7 生长素激活MDN1的表达 |
3.3 拟南芥MDN1调控胚胎发育 |
3.3.1 mdn1-1突变体果荚半不育 |
3.3.2 mdn1-1突变体胚胎发育迟缓且部分发育异常 |
3.3.3 拟南芥NLE和PES2突变导致胚胎发育停滞 |
3.3.4 mdn1-1突变体球形胚时期生长素响应分布异常 |
3.4 拟南芥MDN1调控开花时间 |
3.4.1 mdn1-1突变体开花时间提前 |
3.4.2 转录组分析mdn1-1突变体提前开花的机制 |
3.4.3 mdn1-1突变体提前开花依赖于FLC |
3.4.4 ABI5在调控mdn1-1提前开花中发挥重要作用 |
3.4.5 光周期途径影响mdn1-1开花时间 |
3.5 RPL16D平衡植物的生长发育和抗病性 |
3.5.1 RPL16D过表达导致叶柄变短、叶片卷曲 |
3.5.2 RPL16D的进化和表达分析 |
3.5.3 RPL16D-GFP组装至核糖体中 |
3.5.4 叶片卷曲与RPL16D的蛋白剂量呈正相关 |
3.5.5 转录组和蛋白质组分析L16D-OEs叶片基因表达变化 |
3.5.6 L16D-OEs的抗病能力提高 |
3.6 创建简单、高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系 |
3.6.1 构建AtLEC2-GR和AtIPTs共表达株系 |
3.6.2 DEX诱导AtLEC2-GR AtIPTs-OE产生胚性愈伤 |
3.6.3 AtLEC2-GR和AtIPTs胚性愈伤的芽再生效率提高 |
4 讨论 |
4.1 拟南芥MDN1调控pre-60S合成 |
4.2 核糖体合成与生长素构成反馈调节环 |
4.3 拟南芥MDN1调控胚胎发育 |
4.4 拟南芥MDN1调控开花时间 |
4.5 RPL16D平衡植物的生长发育和抗病性 |
4.6 创建简单、高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系 |
5 结论 |
附表1 核糖体小亚基蛋白 |
附表2 核糖体大亚基蛋白 |
附表3 核糖体大亚基RBFs |
附表4 核糖体小亚基RBFs |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表论文情况 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(4)Bms1与Ttf1在rDNA区域互作调控细胞周期进程的功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 细胞周期检查点 |
1.1.1 G1/S期检查点 |
1.1.2 S期检查点 |
1.1.3 G2/M期检查点 |
1.2 转录-复制冲突位点(TRCs) |
1.2.1 DNA复制压力与TRCs |
1.2.2 TRCs分类 |
1.2.3 TRCs的保护机制 |
1.2.3.1 复制叉阻滞点(Replication fork barrier) |
1.2.3.2 R-loop结构 |
1.2.3.3 S期检查点 |
1.3 rDNA区域复制叉阻滞点 |
1.3.1 rDNA区域复制叉阻滞点(RFB) |
1.3.2 酵母中RFB调控 |
1.3.3 线虫中RFB调控 |
1.3.4 哺乳动物中RFB调控 |
1.4 核仁的结构和功能 |
1.4.1 核仁的结构及功能 |
1.4.2 核糖体小亚基组装复合体 |
1.4.3 Bms1l/Rcl1复合体 |
1.5 斑马鱼bms1l研究背景 |
1.5.1 模式生物斑马鱼的研究历史与优势 |
1.5.2 斑马鱼肝脏发育过程 |
1.5.3 斑马鱼bms1l突变体的获得 |
1.5.4 bms1l突变体中rDNA转录水平增加 |
1.5.5 bms1l突变体中rDNA的复制受阻滞 |
1.6 本研究的内容、目的和意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 斑马鱼 |
2.1.1 斑马鱼伦理 |
2.1.2 斑马鱼饲养及繁育 |
2.1.3 斑马鱼的交配及受精卵的收集 |
2.1.4 斑马鱼品系 |
2.2 细胞系及细胞操作 |
2.2.1 本课题所用细胞系 |
2.2.2 细胞培养和传代 |
2.2.3 细胞转染 |
2.3 抗体 |
2.4 DNA相关操作方法 |
2.4.1 基因克隆 |
2.4.2 点突变或短片段突变 |
2.4.3 酶切与连接 |
2.4.4 基因组DNA的抽提 |
2.5 大肠杆菌操作 |
2.5.1 菌株 |
2.5.2 热激法转化感受态细胞及大肠杆菌培养 |
2.5.3 质粒抽提 |
2.6 蛋白质相关操作 |
2.6.1 蛋白免疫印迹(Western blot) |
2.6.1.1 蛋白样品的制备 |
2.6.1.2 SDS-PAGE蛋白胶的配制 |
2.6.1.3 凝胶电泳和转膜 |
2.6.1.4 目的条带检测 |
2.6.2 免疫共沉淀(Co-IP) |
2.6.2.1 细胞系过表达Co-IP |
2.6.2.2 斑马鱼内源性Co-IP |
2.6.3 抗体制备 |
2.6.4 蛋白的纯化 |
2.6.5 抗体免疫荧光染色 |
2.6.5.1 人类细胞系免疫荧光染色 |
2.6.5.2 斑马鱼胚胎或组织的冷冻切片及免疫荧光染色 |
2.7 GTPase酶活性检测 |
2.8 体外酶活实验 |
2.9 流式计数分析 |
2.9.1 BrdU/PI双荧光流式计数分析 |
2.9.2 斑马鱼胚胎肝脏细胞周期流式分析 |
2.10 免疫电镜(Immuno-Transmission Electron Microscopy) |
2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP-Seq) |
2.12 斑马鱼Morpholino显微注射 |
2.13 本研究所用Morpholino、siRNA及引物序列 |
2.14 本实验所用化学试剂配方 |
第三章 Bms1失活导致Ttf1在核仁中特异性累积 |
3.1 bms1l~(sq163)突变体肝脏核仁区域存在复制压力 |
3.2 bms1l~(sq163)突变体肝脏细胞中DNA含量大于4n |
3.3 斑马鱼ttf1基因的相关信息 |
3.3.1 斑马鱼ttf1a与ttf1b |
3.3.2 Ttf1的蛋白结构域与保守性分析 |
3.4 斑马鱼Ttf1抗体制备 |
3.4.1 Ttf1抗原表达 |
3.4.2 Ttf1抗体特异性检测 |
3.5 Ttf1蛋白的时空表达 |
3.6 Ttf1蛋白在bms1l突变体细胞核仁中累积 |
3.7 bms1l突变体细胞中Ttf1与RPA2在核仁共定位 |
第四章 斑马鱼Ttf1与rDNA末尾RFB区域结合 |
4.1 Ttf1染色体免疫共沉淀质量分析 |
4.2 Ttf1染色体免疫共沉淀检峰(Peak Calling)分析 |
4.3 Ttf1与28S rDNA末尾RFB区域结合 |
4.4 Ttf1在bms1l突变体的RFB区域富集 |
第五章 斑马鱼Bms1l与Ttf1为互作蛋白 |
5.1 过表达的斑马鱼Bms1l与Ttf1互作 |
5.2 斑马鱼内源Bms1l与Ttf1互作 |
5.3 斑马鱼Bms1l~(sq163)突变体蛋白与Ttf1互作 |
5.4 斑马鱼Bms1l与TTF1直接互作 |
第六章 Bms1l蛋白GTPase酶活分析 |
6.1 Bms1l蛋白GTPase酶活中心分析 |
6.2 构建GTPase酶活中心突变的bms1l-X质粒 |
6.3 Bms1l及其突变体蛋白纯化 |
6.4 bms1l及其突变体GTPase酶活力检测 |
6.4.1 酶活反应预检测及标准曲线绘制 |
6.4.2 Bms1l野生型及其突变蛋白的GTPase酶活力检测 |
第七章 Bms1l的GTPase酶活性调控Ttf1与RFB区域的结合 |
7.1 Ttf1与RFB区域结合的分子机制 |
7.1.1 peak3与Ttf1结合效率高于其他3个peak |
7.1.2 Ttf1与RFB区域体外结合体系构建 |
7.1.3 Ttf1与RFB的结合依赖GTP与Mg~(2+) |
7.2 建立体外Bms1-Ttf1-peak3结合反应体系 |
7.2.1 体外Bms1-Ttf1-peak3结合反应体系示意图 |
7.2.2 体外结合反应体系时间点确定 |
7.3 Bms1l的GTPase酶活性调控Ttf1与RFB区域的结合 |
第八章 bms1在斑马鱼和人类中具有保守的功能 |
8.1 BMS1敲减导致细胞周期阻滞 |
8.2 BMS1敲减导致DNA过度复制 |
8.3 BMS1敲减导致RPA2在核仁累积 |
8.4 BMS1敲减后拯救实验 |
8.5 BMS1与TTF1为互作蛋白 |
第九章 总结与讨论 |
9.1 总结 |
9.2 讨论 |
9.2.1 BMS1与TTF1双敲减后拯救实验 |
9.2.2 Bms1蛋白的生物学功能 |
9.2.3 Bms1l/Ttf1蛋白作为S期检查点的分子机制 |
9.2.4 Ttf1蛋白在基因组上其他结合位点 |
9.2.5 BMS1/TTF1蛋白与人类疾病 |
References |
作者简介 |
致谢 |
(5)NOP2核仁蛋白在哺乳动物着床前胚胎发育中的功能及其机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词表 |
1 引言 |
1.1 奶牛生产与繁殖 |
1.1.1 泌乳奶牛生产现状 |
1.1.2 高产奶牛繁殖力低下 |
1.1.3 影响奶牛繁殖力的因素 |
1.2 哺乳动物胚胎发育与调控 |
1.2.1 着床前胚胎发育 |
1.2.2 母源-合子转换与合子基因组激活 |
1.2.3 细胞谱系分化与囊胚形成 |
1.3 核仁与核糖体 |
1.3.1 核仁的结构与功能 |
1.3.2 核糖体的结构与功能 |
1.3.3 核糖体生物合成 |
1.3.4 胚胎发育中的核仁前体 |
1.4 NOP2核仁蛋白 |
1.5 展望 |
2 材料与方法 |
2.1 仪器设备 |
2.2 试剂耗材 |
2.2.1 生化试剂 |
2.2.2 试剂配制 |
2.3 基因信息 |
2.4 引物序列 |
2.4.1 siRNA序列 |
2.4.2 PCR引物 |
2.4.3 qPCR引物 |
2.4.4 FISH探针 |
2.5 抗体信息 |
2.6 牛源胚胎 |
2.6.1 卵母细胞的获取与体外成熟 |
2.6.2 体外受精与胚胎培养 |
2.7 小鼠胚胎 |
2.7.1 小鼠繁育 |
2.7.2 胚胎的获取与培养 |
2.8 实验方法 |
2.8.1 Nop2表达载体构建 |
2.8.2 mRNA体外转录(IVT) |
2.8.3 胚胎显微注射 |
2.8.4 转录组测序(RNA-seq) |
2.8.5 免疫荧光染色(IF) |
2.8.6 TUNEL细胞凋亡检测 |
2.8.7 EU RNA转录活性检测 |
2.8.8 实时荧光定量PCR (qPCR) |
2.8.9 荧光原位杂交(FISH) |
2.8.10 透射电镜(TEM) |
2.9 数据分析 |
3 实验结果 |
3.1 Nop2影响奶牛着床前胚胎囊胚形成 |
3.1.1 Nop2在胚胎中的表达谱 |
3.1.2 Nop2敲低体系的构建 |
3.1.3 Nop2敲低导致胚胎囊胚率下降 |
3.2 Nop2影响小鼠着床前胚胎发育调控 |
3.2.1 Nop2敲低体系的构建 |
3.2.2 Nop2敲低导致胚胎囊胚前发育停滞 |
3.2.3 Nop2敲低导致胚胎DNA甲基化水平上升 |
3.3 Nop2敲低对小鼠胚胎转录组影响有限 |
3.3.1 Nop2敲低影响胚胎mRNA表达 |
3.3.2 Nop2敲低对胚胎RNA转录无显着影响 |
3.4 Nop2敲低导致胚胎细胞谱系分化受损 |
3.5 Nop2参与小鼠胚胎核仁成熟与核糖体生物合成 |
3.5.1 Nop2敲低抑制胚胎核仁结构转换 |
3.5.2 Nop2敲低导致胚胎rRNA表达下调 |
3.5.3 Nop2敲低影响胚胎核糖体蛋白表达 |
3.6 Nop2甲基转移酶失活不影响小鼠胚胎发育 |
3.6.1 Nop2过表达/突变体系的构建 |
3.6.2 Nop2突变对胚胎着床前发育无显着影响 |
3.6.3 Nop2突变对rRNA表达无显着影响 |
3.7 Nop2敲低导致奶牛胚胎rRNA表达下调 |
4 讨论与总结 |
4.1 讨论 |
4.1.1 奶牛胚胎与小鼠胚胎的异同 |
4.1.2 Nop2在胚胎核仁中的表达定位 |
4.1.3 Nop2在核糖体生物合成中的作用 |
4.1.4 Nop2作为甲基转移酶的功能 |
4.1.5 Nop2敲低影响胚胎发育的机制 |
4.1.6 Nop2在提高奶牛繁殖力中的应用 |
4.2 总结 |
4.3 创新点 |
参考文献 |
附录 |
作者简历 |
(6)PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 横纹肌肉瘤 |
1.1.1 横纹肌肉瘤概述 |
1.1.2 横纹肌肉瘤组织学分型及遗传学分析 |
1.1.3 横纹肌肉瘤与骨骼肌分化 |
1.2 肝细胞癌 |
1.2.1 肝细胞癌概述 |
1.2.2 肝细胞癌发病机制研究进展 |
1.3 核仁在肿瘤发生发展中的作用 |
1.3.1 核仁的结构 |
1.3.2 核仁核糖体生成与肿瘤 |
1.3.3 核仁非核糖体生成功能与肿瘤 |
1.4 PHB2 蛋白与肿瘤 |
1.4.1 PHB2 蛋白简介 |
1.4.2 PHB2 蛋白的定位与功能 |
1.4.3 PHB2 蛋白在肿瘤发生发展中的作用 |
1.5 本研究的目的与意义 |
第二章 PHB2 蛋白对横纹肌肉瘤细胞生物学行为的影响及定位于核仁的确认 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 实验方法 |
2.2 实验结果 |
2.2.1 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞活力 |
2.2.2 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力 |
2.2.3 PHB2 表达下调诱导RD细胞凋亡 |
2.2.4 PHB2 表达下调促进RD细胞分化 |
2.2.5 部分PHB2 蛋白定位于肿瘤细胞的核仁 |
2.2.6 PHB2 表达下调改变横纹肌肉瘤细胞的超微结构 |
2.2.7 PHB2 表达下调抑制RD细胞r RNA的合成 |
2.2.8 PHB2 调控r RNA合成的分子机制 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第三章 PHB2 蛋白在正常肝细胞和肝细胞癌细胞中生物学作用的对比研究 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 实验方法 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的细胞活力 |
3.2.2 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的增殖 |
3.2.3 PHB2 表达下调对Hep G2和L02 细胞超微结构的影响 |
3.2.4 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的r DNA转录 |
3.2.5 PHB2 表达下调抑制HepG2 细胞的ATP合成能力 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
在校期间公开发表论文及着作情况 |
(7)神经元活性依赖的lncRNA LoNA调控蛋白质翻译的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 绪论 |
1.1 长链非编码RNA概述 |
1.1.1 lncRNA的发现 |
1.1.2 lncRNA的产生、加工成熟机制 |
1.1.3 lncRNA的广义功能作用机制 |
1.1.4 lncRNA的定位 |
1.1.5 lncRNA的降解方式 |
1.2 学习记忆与蛋白质翻译 |
1.2.1 学习记忆假说 |
1.2.2 蛋白质翻译概述 |
1.2.3 蛋白质翻译在学习记忆中作用 |
1.3 LncRNA通过调控蛋白质翻译参与学习记忆 |
1.3.1 lncRNA与脑功能 |
1.3.2 lncRNA在学习记忆障碍中的作用 |
1.3.3 lncRNA在学习记忆中作用 |
1.3.4 lncRNA在蛋白质翻译中作用 |
1.3.5 lncRNA通过调控蛋白质翻译参与学习记忆 |
第二章 实验材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验所用小鼠品系 |
2.1.2 实验所需细胞系 |
2.1.3 质粒信息 |
2.1.4 实验试剂 |
2.1.5 实验耗材 |
2.1.6 实验仪器 |
2.2 实验试剂配制 |
2.2.1 大肠肝菌培养试剂(LB) |
2.2.2 PBS溶液 |
2.2.3 免疫印迹试验相关溶液 |
2.2.4 高尔基染色相关溶液 |
2.2.5 RNA分子杂交实验试剂配制 |
2.2.6 Northern blot相关试剂配制 |
2.2.7 核仁分离相关试剂配制 |
2.2.8 Nuclear Run On实验相关试剂配制 |
2.2.9 Oligo (dT) Pull-Down实验相关试剂配制 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 质粒大量提取实验 |
2.3.2 RNA提取 |
2.3.3 PCR产物纯化实验(上海生工) |
2.3.4 胶回收实验(上海生工) |
2.3.5 质粒转化实验 |
2.3.6 细胞复苏实验 |
2.3.7 细胞冻存实验 |
2.3.8 细胞转染实验 |
2.3.9 小鼠初代神经元分离培养实验 |
2.3.10 RNA原位杂交实验和免疫荧光实验 |
2.3.11 Northern blot实验 |
2.3.12 Western blot实验 |
2.3.13 RNA结合蛋白免疫沉淀实验 |
2.3.14 Nuclear Run-On实验 |
2.3.15 核仁分离实验 |
2.3.16 荧光素酶报告实验 |
2.3.17 m7 -GTP/TMG (m2,2,7G)实验 |
2.3.18 Oligo (dT) Pull-Down实验 |
2.3.19 蛋白质银染实验 |
2.3.20 生物素标记RNA沉淀实验 |
2.3.21 Puromycin标记蛋白实验 |
2.3.22 S35标记蛋白实验 |
2.3.23 多聚核糖体分析实验 |
2.3.24 染色体免疫沉淀实验 |
2.3.25 紫外交联免疫沉淀实验 |
2.3.26 rRNA甲基化水平半定量实验 |
2.3.27 AAV病毒纯化实验 |
2.3.28 小鼠海马区病毒注射实验 |
2.3.29 小鼠水迷宫实验 |
2.3.30 小鼠条件性恐惧实验 |
2.3.31 小鼠新物体识别实验 |
2.3.32 小鼠脑神经突触纯化实验 |
2.3.33 高尔基染色实验 |
2.3.34 统计学显着性差异分析 |
第三章 结果与讨论 |
3.1 引言 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 鉴定核仁中lncRNA的数目与种类 |
3.2.2 LoNA调控rRNA转录与蛋白质翻译 |
3.2.3 LoNA通过结合NCL调控rRNA转录 |
3.2.4 LoNA通过结合FBL蛋白来调控rRNA甲基化水平 |
3.2.5 LoNA调控多聚核糖体的分布以及突触可塑性 |
3.2.6 LoNA水平缺失导致学习记忆能力提升 |
3.3 小结与讨论 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
攻读博士期间主要成果 |
(8)核仁蛋白DCAF13在卵母细胞发育及减数分裂成熟中的功能和调节机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 卵泡发育与卵母细胞减数分裂成熟 |
1.1.1 卵泡发育 |
1.1.2 卵母细胞减数分裂恢复 |
1.1.3 卵母细胞染色体正确分离的调节 |
1.2 核仁特征与功能 |
1.2.1 体细胞核仁结构与功能 |
1.2.2 卵母细胞核仁特征 |
1.2.3 核仁中rRNA的合成和剪切加工 |
1.3 CRL4泛素连接酶家族 |
1.3.1 CRL4 E3泛素连接酶 |
1.3.2 CUL4 E3泛素连接酶在雌性生殖力维持中的作用 |
1.4 卵母细胞中PI3K信号通路的功能 |
1.4.1 PI3K信号通路在卵子发生过程中的功能 |
1.4.2 PI3K对减数分裂成熟的影响 |
第二章 材料与方法 |
2.1 实验仪器与材料 |
2.1.1 实验仪器 |
2.1.2 实验耗材 |
2.1.3 常用试剂 |
2.1.4 常用试剂配方 |
2.2 动物实验 |
2.2.1 条件敲除小鼠的获得 |
2.2.2 雌鼠生殖力测试 |
2.2.3 小鼠超数排卵 |
2.3 形态学实验 |
2.3.1 石蜡包埋切片 |
2.3.2 苏木精-伊红染色 |
2.3.3 卵泡计数 |
2.3.4 免疫组化染色 |
2.3.5 免疫荧光染色 |
2.3.6 卵母细胞染色体铺片和计数 |
2.4 卵母细胞及卵泡实验 |
2.4.1 卵母细胞的获取和培养 |
2.4.2 显微注射 |
2.4.3 HPG分析 |
2.4.4 EU分析 |
2.4.5 卵泡的获取和培养 |
2.4.6 活细胞 |
2.5 分子生物学实验 |
2.5.1 小鼠基因型鉴定 |
2.5.2 少量卵母细胞RNA逆转录和荧光实时定量PCR |
2.5.3 微量RNA测序(RNA-Seq) |
2.5.4 点突变 |
2.6 细胞实验 |
2.6.1 细胞培养 |
2.6.2 转染 |
2.6.3 RNA干扰 |
2.7 生化实验 |
2.7.1 免疫印迹(Western blot) |
2.7.2 Northern blot |
2.7.3 免疫共沉淀 |
2.7.4 泛素化分析 |
2.7.5 卵母细胞原位杂交(FISH) |
第三章 DCAF13维持卵泡发育 |
3.1 引言 |
3.2 DCAF13卵母细胞中的定位与表达模式 |
3.3 DCAF13在卵母细胞中的敲除效率 |
3.4 DCAF13保障卵泡发育 |
3.5 DCAF13促进核仁成熟 |
3.6 DCAF13的缺失造成蛋白合成障碍 |
3.7 DCAF13的缺失抑制rRNA合成 |
3.8 DCAF13参与18S rRNA合成 |
3.9 rRNA合成损伤将抑制卵母细胞核仁发育 |
3.10 小结与讨论 |
第四章 DCAF13维持卵母细胞减数分裂成熟 |
4.1 引言 |
4.2 DCAF13保障卵母细胞减数分裂成熟 |
4.3 DCAF13对卵母细胞成熟的影响来自于整个卵母细胞生长过程 |
4.4 持续激活CDK1能挽救DCAF13缺失所造成的减数分裂恢复障碍 |
4.5 CRL4~(DCAF13)可通过泛素化途径降解PTEN而调节AKT的活性 |
4.6 由CRL4B~(DCAF13)复合物介导的PTEN降解对减数分裂恢复及蛋白积累至关重要 |
4.7 DCAF13保证MI期纺锤体组装与染色体浓缩 |
4.8 DCAF13缺失的卵母细胞中染色体排列混乱导致纺锤体检验点蛋白持续激活 |
4.9 小结与讨论 |
第五章 总结与讨论 |
5.1 总结 |
5.2 讨论 |
第六章 文献综述 卵母细胞发育和减数分裂成熟的蛋白翻译调节 |
6.1 snoRNAs参与调节核糖体发生 |
6.2 母源mRNA的翻译激活 |
6.2.1 在果蝇和爪蟾中母源mRNA的翻译调控机制 |
6.2.2 在哺乳动物中母源mRNA的翻译调控机制 |
6.3 卵母细胞中ERK1/2对蛋白合成的调节 |
6.3.1 ERK1/2参与卵母细胞减数分裂调节 |
6.3.2 ERK1/2调节翻译起始 |
6.3.3 ERK1/2参与3'-UTR翻译调节 |
6.4 PI3K/mTOR信号通路对蛋白合成的调节 |
参考文献 |
附录 |
附录一 抗体信息 |
附录二 基因型鉴定引物序列 |
附录三 RT-PCR引物序列 |
附录四 siRNA序列 |
附录五 RNA探针序列 |
作者简历 |
(9)核仁蛋白Rcl1在斑马鱼肝脏发育过程中的功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第1章 绪论 |
1.1 模式生物斑马鱼 |
1.1.1 模式生物斑马鱼简介 |
1.1.2 斑马鱼遗传学突变技术简介 |
1.1.3 斑马鱼肝脏发育 |
1.2 核仁及rRNA的加工 |
1.2.1 核仁结构及其功能 |
1.2.2 核糖体大小亚基 |
1.2.3 rRNA加工在酵母和人中的差异 |
1.3 rcl1基因研究进展 |
第2章 材料与方法 |
2.1 斑马鱼实验 |
2.1.1 斑马鱼饲养与繁殖 |
2.1.2 斑马鱼品系 |
2.1.3 斑马鱼胚胎显微注射(microinjection) |
2.2 常规生化试剂及其配制 |
2.3 DNA相关实验方法 |
2.3.1 斑马鱼基因组DNA制备 |
2.3.2 基因克隆 |
2.3.3 细胞凋亡实验 |
2.4 RNA相关实验方法 |
2.4.1 总RNA提取 |
2.4.2 DNase I去除RNA样品中的DNA |
2.4.3 逆转录实验 |
2.4.4 实时荧光定量PCR |
2.4.5 mRNA体外转录实验 |
2.4.6 RACE实验 |
2.4.7 转录组学分析 |
2.4.8 Northern印迹法(Northern blot) |
2.4.9 整胚原位杂交(WISH) |
2.5 蛋白质相关实验方法 |
2.5.1 蛋白样品的制备 |
2.5.2 蛋白质印迹法(Western Blot) |
2.5.3 蛋白免疫荧光技术(Immunofluorescence technique) |
第3章 斑马鱼rcl1基因及其转录本研究 |
3.1 rcl1基因产物同源性比较 |
3.2 斑马鱼rcl1基因概述 |
3.3 斑马鱼rcl1转录本在胚胎期的表达研究 |
第4章 斑马鱼Rcl1蛋白的抗体制备及其蛋白表达研究 |
4.1 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的制备 |
4.2 斑马鱼Rcl1蛋白抗体的检测 |
4.3 斑马鱼Rcl1蛋白在胚胎期的表达研究 |
第5章 斑马鱼rcl1~(lacZ)和rcl1~(cas9)突变体的获得及其表型的描述 |
5.1 斑马鱼rcl1~(lacZ)突变体的获得 |
5.2 斑马鱼rcl1~(cas9)突变体的获得 |
5.3 斑马鱼rcl1突变体中rcl1基因转录水平及Rcl1蛋白水平的验证 |
5.4 斑马鱼rcl1突变体中消化器官生长发育受到阻滞 |
5.5 斑马鱼rcl1突变体中其他器官的发育受到一定影响 |
第6章 斑马鱼rcl1突变体细胞增殖受阻导致小肝脏表型 |
6.1 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞的细胞周期受到阻滞 |
6.2 斑马鱼rcl1突变体肝实质细胞无异常凋亡现象 |
第7章 斑马鱼Rcl1的缺失影响18S rRNA的加工和成熟过程 |
7.1 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA大量减少 |
7.2 斑马鱼rcl1突变体中18S rRNA前体剪切出现异常 |
7.3 体外酶活实验探究Rcl1的内切酶活性 |
第8章 斑马鱼rcl1~(cas9)突变体转录组学分析 |
8.1 测序样品的选定及其制备 |
8.2 测序数据质量评估 |
8.3 转录组基因表达量计算及差异表达基因分析 |
8.4 通过qRT-PCR实验对测序结果进行验证 |
8.5 GO功能分析 |
8.6 代谢通路分析 |
8.7 可变剪切分析 |
第9章 斑马鱼bms1基因的相关研究 |
9.1 斑马鱼bms1l~(zjul)突变体的获得 |
9.2 斑马鱼Bms11蛋白抗体的制备 |
9.3 斑马鱼Bms11蛋白抗体的检测 |
9.4 Bms11蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理论分子量的差异研究 |
第10章 结论与讨论 |
10.1 结论 |
10.2 讨论 |
第11章 参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
(10)Sas10和Mpp10的稳定性及其在斑马鱼肝脏发育过程中生物学作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 斑马鱼作为模式动物的优势 |
1.1.1 斑马鱼简介 |
1.1.2 斑马鱼作为模式动物的优势 |
1.2 斑马鱼肝脏发育过程 |
1.2.1 斑马鱼肝脏形态发生过程 |
1.2.2 斑马鱼肝细胞的来源与标记 |
1.2.3 核仁因子突变影响肝脏发育 |
1.3 核仁结构与功能 |
1.3.1 核仁的结构 |
1.3.2 核仁的功能 |
1.4 SSU组装复合体的组成与功能 |
1.4.1 SSU组装复合体的组成 |
1.4.2 SSU组装复合体的功能 |
1.5 核仁蛋白Mpp10和Sas10 |
1.5.1 Mpp10当前研究进展 |
1.5.2 Sas10当前研究进展 |
1.5.3 Sas10与Mpp10互作的研究进展 |
1.6 Def-CAPN3介导核仁蛋白降解 |
1.6.1 核仁蛋白Def |
1.6.2 半胱氨酸蛋白酶Calpain3(CAPN3) |
1.6.3 Def介导CAPN3降解p53 |
1.7 本研究的内容、目的和意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 斑马鱼实验 |
2.1.1 斑马鱼品系及饲养 |
2.1.2 斑马鱼伦理 |
2.1.3 斑马鱼的交配及受精卵的获得 |
2.2 人类细胞系实验 |
2.2.1 细胞培养与冻存 |
2.2.2 细胞转染 |
2.3 大肠杆菌实验 |
2.3.1 大肠杆菌菌株 |
2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的转化及培养 |
2.3.3 菌液冻存 |
2.4 常用化学试剂及培养基 |
2.4.1 常用化学试剂配方 |
2.4.2 培养基配方 |
2.5 抗体 |
2.6 DNA相关实验 |
2.6.1 斑马鱼基因组DNA提取 |
2.6.2 基因克隆 |
2.6.3 酶切与连接 |
2.6.4 菌落PCR |
2.6.5 大肠杆菌质粒抽提 |
2.7 RNA相关实验 |
2.7.1 总RNA提取 |
2.7.2 RNA纯化 |
2.7.3 mRNA的体外合成 |
2.7.4 Norther Blot实验 |
2.7.5 整胚原位杂交实验(WISH) |
2.8 蛋白质相关实验 |
2.8.1 蛋白样品的提取 |
2.8.2 斑马鱼成鱼肝脏核仁分离 |
2.8.3 Western Blot实验 |
2.8.4 免疫共沉淀实验(Co-IP) |
2.8.5 斑马鱼免疫荧光实验 |
2.8.6 抗体的制备与纯化 |
2.8.7 体外酶活实验 |
2.9 斑马鱼显微注射 |
2.10 斑马鱼细胞凋亡分析(TUNEL) |
2.11 酵母双杂交 |
2.11.1 目的质粒的构建 |
2.11.2 酵母感受态细胞的制备与转化 |
2.11.3 酵母双杂交 |
2.12 CRISPR/Cas9系统构建突变体斑马鱼 |
2.12.1 gRNA与Cas9蛋白mRNA体外合成 |
2.12.2 gRNA与Cas9蛋白mRNA的显微共注射及效率检测 |
2.12.3 可遗传突变体品系的筛选 |
2.13 本研究所用引物序列 |
第三章 斑马鱼Sas10和Mpp10是核仁蛋白 |
3.1 sas10和mpp10基因的相关信息 |
3.1.1 sas10基因的相关信息 |
3.1.2 mpp10基因的相关信息 |
3.2 sas10和mpp10的转录本检测 |
3.2.1 sas10 mRNA水平的检测 |
3.2.2 mpp10 mRNA水平的检测 |
3.3 Sas10和Mpp10蛋白水平的检测 |
3.3.1 Sas10多克隆兔抗的检测 |
3.3.2 Sas10单克隆鼠抗的检测 |
3.3.3 Sas10蛋白水平的检测 |
3.3.4 Mpp10抗体的检测 |
3.3.5 Mpp10蛋白水平的检测 |
3.4 Sas10和Mpp10是核仁蛋白 |
3.4.1 Sas10和Mpp10在核仁富集 |
3.4.2 Sas10和Mpp10共定位于核仁 |
第四章 Sas10或Mpp10的缺失影响斑马鱼消化器官发育 |
4.1 Sas10缺失影响斑马鱼消化器官发育 |
4.1.1 Sas10缺失突变体的获得与鉴定 |
4.1.2 Sas10缺失突变体的表型 |
4.1.3 Sas10的缺失引起内胚层发育而来的消化器官发育异常 |
4.2 Mpp10缺失影响斑马鱼消化器官发育 |
4.2.1 Mpp10缺失突变体的获得与鉴定 |
4.2.2 Mpp10缺失突变体的表型 |
4.2.3 Mpp10的缺失引起内胚层发育而来的消化器官发育异常 |
4.3 Sas10或Mpp10的缺失引起肝脏细胞周期阻滞 |
4.3.1 s~(△2)和m~(△10)突变体的肝脏发育异常无关细胞凋亡 |
4.3.2 s~(△2)和m~(△10)突变体的肝脏细胞增殖受到影响 |
4.3.3 Sas10或Mpp10的缺失引起视网膜细胞凋亡 |
4.4 突变体小肝脏表型拯救实验 |
4.4.1 过表达Sas10部分拯救s~(△2)突变体小肝脏表型 |
4.4.2 过表达Mpp10部分拯救m~(△10)突变体小肝脏表型 |
第五章 Sas10和Mpp10参与18S rRNA加工成熟 |
5.1 Sas10和Mpp10的缺失影响18S rRNA成熟 |
5.2 Sas10和Mpp10的缺失影响rRNA前体剪切 |
5.3 Sas10和Mpp10的缺失影响核仁形态 |
第六章 Sas10和Mpp10形成复合体 |
6.1 斑马鱼Sas10和Mpp10互作 |
6.1.1 过表达的斑马鱼Sas10和Mpp10互作 |
6.1.2 斑马鱼内源的Sas10和Mpp10互作 |
6.1.3 斑马鱼Sas10和Mpp10直接互作 |
6.2 Sas10的C1D/Sas10家族结构域参与Mpp10结合 |
6.3 Mpp10的N端对其与Sas10的稳固结合必不可少 |
第七章 Mpp10是CAPN3的底物 |
7.1 Mpp10通过Sas10与Def形成Mpp10-Sas10-Def复合体 |
7.2 Mpp10是CAPN3的底物 |
7.3 Mpp10和Sas10在def突变体中上调 |
第八章 Sas10和Mpp10稳定性互相依赖 |
8.1 Sas10和Mpp10稳定性互相依赖 |
8.1.1 过表达的Sas10和Mpp10稳定性相互依赖 |
8.1.2 Sas10和Mpp10的缺失会引起彼此蛋白的不稳定 |
8.2 Sas10保护Mpp10不被CAPN3识别 |
8.2.1 Sas10保护Mpp10不被CAPN3降解 |
8.2.2 CAPN3通过识别第211-220aa降解Mpp10 |
8.2.3 删除CAPN3识别序列的Mpp10稳定性增强 |
8.2.4 Sas10通过遮蔽CAPN3识别位点保护Mpp10 |
第九章 结论与讨论 |
9.1 结论 |
9.2 讨论 |
9.2.1 Sas10和Mpp10在斑马鱼中的生物学功能 |
9.2.2 Sas10和Mpp10的分子机制研究 |
参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
四、真核细胞核仁中rDNA的分布定位和rRNA转录发生位置的研究进展(论文参考文献)
- [1]rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生[D]. 张文静. 山东大学, 2020(04)
- [2]斑马鱼核仁蛋白Bms1l的催化活性和磷酸化修饰研究[D]. 陈鸿. 浙江大学, 2020(01)
- [3]拟南芥MDN1调控核糖体合成和植物生长发育的研究[D]. 李科. 山东大学, 2020(04)
- [4]Bms1与Ttf1在rDNA区域互作调控细胞周期进程的功能研究[D]. 祝岩清. 浙江大学, 2020(01)
- [5]NOP2核仁蛋白在哺乳动物着床前胚胎发育中的功能及其机制研究[D]. 王乐烽. 浙江大学, 2020(01)
- [6]PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究[D]. 周子龙. 东北师范大学, 2019(04)
- [7]神经元活性依赖的lncRNA LoNA调控蛋白质翻译的机制研究[D]. 李定丰. 中国科学技术大学, 2019(08)
- [8]核仁蛋白DCAF13在卵母细胞发育及减数分裂成熟中的功能和调节机制研究[D]. 张珏. 浙江大学, 2019(03)
- [9]核仁蛋白Rcl1在斑马鱼肝脏发育过程中的功能研究[D]. 祝琴芳. 浙江大学, 2019(01)
- [10]Sas10和Mpp10的稳定性及其在斑马鱼肝脏发育过程中生物学作用研究[D]. 赵纾奕. 浙江大学, 2018(01)