一、实验动物胚胎和合子的低温保存（论文文献综述）
蔡光雨[1]（2020）在《谷氨酸对体外培养小鼠胚胎阻滞阶段的抗氧化水平及后续发育的影响》文中指出胚胎体外培养过程中,容易受到各种外源性和内源性因素的影响并产生过量的活性氧。因为无法完全模拟胚胎体内发育环境,缺少体内抗氧化系统的保护使部分胚胎受到氧化损伤,不能正常发育。哺乳动物胚胎发育过程中均存在胚胎阻滞现象,活性氧的大量积累使早期胚胎停滞在某一阶段不能继续发育,导致胚胎死亡。因此为解决这一问题,通常在其体外培养液中添加抗氧化剂等物质来保护早期胚胎的正常发育。谷氨酸是一种重要且较为常见的功能性氨基酸,在保护细胞新陈代谢和对细胞内信号调节发挥着不可替代的作用。本研究旨在探讨谷氨酸对小鼠早期胚胎体外培养的影响。试验分为谷氨酸处理组和M16对照组,通过对昆明小鼠（发育阻滞品系）2-细胞期、4-细胞期及囊胚期的胚胎进行胚胎内活性氧含量,谷胱甘肽水平以及线粒体膜电位的检测及分析。然后对胚胎阻滞阶段,2-细胞期和4-细胞期胚胎内的GPx基因和Nrf2及其相关基因的mRNA以及细胞周期相关基因的表达水平进行了检测。试验结果表明,浓度为6 mmol/L的谷氨酸处理组与对照组相比,显着提高了 2-细胞向4-细胞过渡率（P<0.05）及囊胚率（P<0.05）。同时谷氨酸显着降低了 2-细胞期、4-细胞期及囊胚期胚胎内的活性氧含量（P<0.05）,并显着提高了 2-细胞期、4-细胞期及囊胚期胚胎内的谷胱甘肽水平和线粒体膜电位水平（P<0.05）。在小鼠早期胚胎培养中添加谷氨酸后,2-细胞、4-细胞胚胎内谷胱甘肽相关酶（GPx1、GPx2）、Nrf2及其相关基因（HO-1、GCLC、CAT、SOD1）的mRNA表达上调。此外,还提高了 2-细胞期细胞周期相关基因（cyclin B、CDK1）的mRNA表达。这些结果表明,谷氨酸通过降低小鼠早期胚胎氧化应激水平和改善线粒体水平提高了抗氧化水平进而有效降低胚胎发育阻滞的风险,提高了胚胎发育能力。
李家恒[2]（2019）在《长链非编码RNA 9130024F11Rik在小鼠脑发育过程中的作用初探》文中进行了进一步梳理近年的研究表明,人类基因组当中仅有1/5的转录与蛋白质编码相关,而其余大部分为非编码RNA。其中一类长度大于200核苷酸（nucleotide,nt）的非编码RNA,被称作长链非编码RNA（LncRNA,long non-coding RNA）。由于其具有调节基因表达的功能,引起了不少科研工作者的关注。同时,随着各个国家、地区的“脑计划”被纷纷提出,针对大脑发育过程的相关研究也层出不穷。大量现有研究表明,多种LncRNA参与到了脑发育过程中,包括神经元的分化、迁移,神经突触的建立,神经细胞的再生过程中。这些功能,也与大脑的正常发育过程息息相关。大脑的发育过程受到了多种因素共同精密调控。其中,SATB2蛋白作为一种能结合到核基质附着区的转录因子,在大脑发育过程中起到了十分重要的作用。SATB2蛋白可以使轴突延伸至胼胝体,确保大脑半球间神经冲动信号得以协同传递。同时,SATB2蛋白也参与到味觉形成以及长期记忆形成过程中。种种迹象表明,SATB2在大脑发育过程中具有十分重要的地位。在前期工作中,本课题组发现在小鼠Satb2基因上游的相反方向上,存在着一个名为9130024F11Rik的LncRNA。该LncRNA紧贴Satb2基因上游,且二者部分序列出现重叠。“艾伦大脑数据库（Allen Brain Atlas）”中的结果表明,该LncRNA在小鼠大脑、小脑以及肠中特异性表达。为了探究该LncRNA是否会在小鼠大脑发育过程中起到一定作用,本课题设计并构建了一个9130024F11Rik敲除鼠品系。最终,我们成功获得了该LncRNA的敲除鼠,并且经过初步检测,该敲除鼠的构建成功。之后,我们对敲除鼠形态学以及基因表达水平的检测,最终检测结果表明该LncRNA纯合子敲除鼠的9130024F11Rik以及Satb2基因转录水平相比野生型以及杂合子敲除鼠出现了降低的情况。并且,在小鼠出生后14天,成功检测到了小鼠大脑尺寸的变化。在此基础上,我们对LncRNA 9130024F11Rik在小鼠脑发育过程中的功能做出了一些推测。于此同时,通过观察P14时期小鼠全脑纵切切片,我们意外地发现在P14时期纯合子敲除鼠小脑中,外颗粒层几乎不存在。这一结果表明敲除鼠的小脑发育也存在一定的异常。由于之前没有SATB2蛋白在小鼠小脑中表达的相关报道,针对这一结果仍需更多实验进行探究。经过本课题的研究,我们成功构建了一个9130024F11Rik敲除鼠品系。在纯合子敲除鼠中,本课题成功观察到了小鼠大脑尺寸在出生后第14天变大的情况。通过切片以及尼氏染色,本课题还发现在敲除鼠小脑当中也存在发育过程上的异常。之后,通过对RNA转录水平检测,本课题也发现在敲除鼠中9130024F11Rik以及Satb2基因表达水平降低。结合这些观察到的现象,我们认为LncRNA9130024F11Rik在小鼠脑发育过程中起到了一定的作用。
邵安良[3]（2019）在《动物源性生物材料免疫原性检测与评价技术研究》文中研究指明[目的]α-Gal抗原是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原,动物源性生物材料经脱抗原工艺处理后仍然残留α-Gal抗原。本研究旨在建立动物源性生物材料α-Gal抗原特异性的免疫原性检测与评价技术。[方法]1、动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法的建立与应用采用人工合成的Gal-BSA结合Gal抗原阴性生物材料裂解上清液作为标准曲线样品,以Gal抗原阳性生物材料（猪肝脏来源）与Gal抗原阴性生物材料（人胎盘组织来源）监测实验体系的敏感性和特异性,利用Gal抗原特异性抗体（M86）,建立酶联免疫抑制方法。采用建立的标准方法定量检测脱细胞基质类生物材料（如牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片、脱细胞猪结膜）的Gal抗原残留量;同时考察以猪肝脏为原料制备的Gal抗原阳性生物材料参考品的均一性及稳定性;以协作标定的方式对Gal抗原阳性生物材料参考品的Gal抗原含量进行赋值。2、GGTA1基因敲除小鼠的制备、免疫学特性及应用研究利用细菌染色体同源重组技术制备GGTA1基因敲除（KO）小鼠。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取GGTA1 KO小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定GGTA1 KO小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量检测标准化方法检测GGTA1 KO小鼠的主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞（外来抗原）免疫刺激GGTA1 KO小鼠,考察小鼠体内总抗体以及抗Gal抗体表达水平的变化。采用GGTA1 KO小鼠皮下植入的方式,从总抗体表达水平,抗Gal抗体表达水平,细胞因子表达水平,淋巴细胞活化水平或亚型分析与局部材料组织病理综合评价动物源生物材料（如:牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片与脱细胞猪结膜）的免疫原性。通过上述应用研究,考察GGTA1 KO小鼠评价动物源性生物材料免疫原性的可行性。3、iGb3S基因敲除小鼠的制备和免疫学特性研究利用细菌染色体同源重组技术制备iGb3S基因敲除（KO）小鼠。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取iGb3SKO小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定iGb3S KO小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量标准化检测方法检测iGb3S KO小鼠的主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞（外来抗原）免疫刺激iGb3S KO小鼠,考察小鼠体内总抗体及其亚型,以及抗Gal抗体表达水平的变化。4、GGTA1/iGb3S双基因敲除小鼠的制备及免疫学特性研究通过将GGTA1 KO小鼠与iGb3S KO小鼠进行交配,筛选GGTA1/iGb3S双基因敲除（DKO）小鼠的纯合子。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量检测标准化方法检测纯合子GGTA1/iGb3SDKO小鼠主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞（外来抗原）免疫刺激GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠,通过比较两种小鼠体内抗Gal抗体表达水平、细胞因子表达水平与淋巴细胞亚型的变化,考察两种Gal抗原缺失小鼠的免疫学特性差异,评价GGTA1/iGb3SDKO小鼠的应用前景。[结果]1、建立了动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法（YY/T 1561-2017）。研制了均一性及稳定性良好的Gal抗原阳性生物材料参考品的国家标准物质（编号380001-201701）。利用标准化方法检测牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片与脱细胞猪结膜的Gal抗原含量分别为（3.61±0.33）×1012个/mg（干重）、（1.13±0.44）×1014个/mg（干重）、（1.85±0.09）×1013 个/mg（干重）;相应的Gal抗原清除率（相对于原材料）分别为55.6%,82.4%与99.8%。Gal抗原阳性生物材料参考品的定值为:（1.733±0.437）×1014个/mg。2、成功构建了 GGTA1 KO小鼠,并建立了种群,完成了保种。证实了 GGTA1基因是调控合成Gal抗原的主要基因,引起Gal抗原表达下降约97%～99%。GGTA1 KO小鼠在兔血红细胞（外来抗原）刺激后,特异性抗Gal抗体水平显着升高,证明GGTA1 KO小鼠是评价Gal抗原为主的异种抗原特异性免疫学反应的敏感模型。应用研究结果显示:GGTA1 KO模型小鼠分别皮下植入去除抗原后的动物源生物材料及其未去除抗原的原材料后,主要引起了小鼠体内抗Gal抗体和/或部分细胞因子表达水平的特异性升高,未去除抗原的原材料组显着高于去除抗原组,说明GGTA1 KO小鼠能够敏感地反映动物源材料中残留Gal抗原的剩余免疫原性风险。3、成功构建了 iGb3S KO小鼠,并建立了种群,完成了保种。在国际上首次证实了 iGb3S基因参与了小鼠Gal抗原的合成,引起Gal抗原表达下降约5%～21%;iGb3S KO小鼠在兔血红细胞（外来抗原）刺激后,总抗体及抗Gal抗体水平未见显着升高,没有引起免疫学反应的变化。4、获得了 GGTA1/iGb3S DKO小鼠,检测其主要脏器的Gal抗原均未见表达,GGTA1与iGb3S是Gal抗原合成的两个调控基因,两个基因同时敲除可以实现Gal抗原100%的消失。GGTA1/iGb3S DKO小鼠和GGTA1 KO小鼠的对比研究结果显示:在兔血红细胞刺激2次后,抗Gal抗体表达水平均显着升高,淋巴细胞亚型及细胞因子表达水平均未见明显变化;未见GGTA1/iGb3S DKO小鼠较GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞的刺激更敏感。说明GGTA1/iGb3S DKO小鼠和GGTA1 KO小鼠都是评价Gal抗原为主的异种抗原反应和剩余异种免疫排斥风险的敏感模型。[结论]1、本研究建立了动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法,同时成功研制Gal抗原阳性生物材料参考品及Gal抗原阴性生物材料参考品。2、本研究成功构建了 GGTA1 KO小鼠,证实了 GGTA1基因是参与调控小鼠Gal抗原合成的主要基因,GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激表现出很强的敏感性。证实了 GGTA1 KO模型小鼠可用于评价动物源性生物材料的免疫原性风险,其中抗Gal抗体与细胞因子可作为特异性评价指标。3、本研究成功构建了 iGb3S KO小鼠,证实了 iGb3S基因是参与调控小鼠Gal抗原合成的次要基因,iGb3S KO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激不敏感。4、成功获得了 GGTA1与iGb3S双基因敲除小鼠,证实了 GGTA1与iGb3S同时敲除可引起小鼠主要脏器Gal抗原表达的完全缺失。GGTA1/iGb3S DKO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激表现出很强的敏感性,是评价动物源性生物材料免疫原性风险的合适动物模型,但未见GGTA1/iGb3S DKO小鼠较GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞的刺激更敏感。
刘宇[4]（2019）在《谷氨酸对小鼠MZT期胚胎发育阻滞及相关基因表达影响的研究》文中研究说明哺乳动物胚胎体外培养体系处于次优化水平,胚胎常面临发育迟缓的风险。活性氧（Reactive oxygen species,ROS）物质生产与清除能力的失衡,将导致小鼠胚胎2-细胞期发育阻滞等问题。本论文想要从发育阻滞的分子层面进行研究,旨在探究谷氨酸在小鼠MZT期胚胎体外培养过程中能否起到克服发育阻滞的作用,以期为从根本上解决因发育阻滞导致的低生产率等问题提供一定理论基础。本试验设计了两个不同的试验组（谷氨酸处理组,M16对照组）,通过对发育阻滞品系昆明小鼠2-细胞早期、2-细胞中期及2-细胞晚期时期的胚胎进行对比,利用DCFH-DA测定小鼠胚胎内部活性氧含量,利用CMF2HC测定小鼠胚胎内部GSH含量,最后对GPx基因即GPx1,4和ZGA标记基因即Eif-1α,Muervl,Zscan4d和Hsp70.1的mRNA表达水平进行分析检测。试验结果表明:1、6mmol/L谷氨酸处理组小鼠MZT期胚胎的2-细胞向4-细胞过渡率,显着高于M16对照组和其余各浓度谷氨酸处理组;2、谷氨酸处理组小鼠MZT各时期胚胎内ROS和GSH含量均无显着差异,其中ROS水平显着低于M16对照组,GSH水平均显着高于M16对照组;3、谷氨酸处理组诱导小鼠MZT期胚胎内各GPx基因表达上调;4、谷氨酸处理组诱导小鼠MZT期胚胎内ZGA标记基因表达上调,尤其在MZT中期和晚期显着升高;综上所述,浓度为6mmol/L谷氨酸可通过刺激GPx1和GPx4酶活性维持GSH与ROS含量动态平衡,间接参与清除ROS的抗氧化过程;通过提高ZGA标记基因表达水平及维持其时序性高表达模式,直接参与ZGA启动过程;最终有效降低发育阻滞风险,确保MZT顺利完成。
彭旭,张晓梅,何学令,刘艳[5]（2020）在《冷冻生殖细胞和组织用于保存实验动物遗传资源》文中指出动物生殖细胞（卵子、胚胎、精子）冷冻保存技术在畜牧生产、临床医学及生物技术等领域发挥了重要作用。利用超低温冷冻保存方法,将珍稀濒危动物和转基因动物生殖细胞保存起来,可实现动物种质资源的长期保存;但是精子和胚胎冷冻技术在疾病模型动物资源保存应用上仍存在许多问题。该文针对拟保存的动物品系生殖细胞和组织在低温冷冻保存中的实际问题及选择进行阐述,以期推进冷冻保存技术在动物资源保存中的应用。
马媛[6]（2019）在《玻璃化冷冻技术对小鼠胎儿和胎盘印记基因的影响及其调控机制研究》文中提出自第一例冷冻胚胎解冻移植的试管婴儿出生,30年间,胚胎冷冻保存技术已取得巨大的进步。目前,胚胎低温保存在辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）实验室已经成为常规技术,部分生殖医学中心甚至会对特殊患者采用全胚冷冻治疗方案。但在胚胎的原始生殖干细胞、配子发生和植入前胚胎阶段,会发生全基因组的表观遗传重编程。表观遗传对植入前胚胎发育具有重要影响,这个阶段产生的表观遗传改变,可能会影响子代的整个生命过程。而ART技术正是在这个敏感时期对胚胎进行操作,包括胚胎的玻璃化冷冻解冻。既往研究中发现,胚胎玻璃化冷冻解冻移植后子代表观遗传模式出现异常,这提示我们玻璃化冷冻可能增加表观遗传紊乱的风险从而影响子代长时程的健康。临床流行病学调查也发现,冻胚移植可以增加多囊卵巢综合征妇女妊娠期子痫的发生,出生子代中,冻胚移植后子代巨大儿的发生率明显增加。所以这项技术的安全性及其风险仍然需要进一步的临床和基础研究进行评估,需要更多的临床和基础研究揭示玻璃化冷冻技术对表观遗传的影响及其调控机制。本研究中,我们利用小鼠模型,研究玻璃化冷冻技术对胎儿和胎盘组织的表观遗传影响及印记基因改变,并探索其相关调控机制。第一部分:玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿生长发育的影响目的:建立玻璃化冷冻解冻胚胎移植小鼠模型,探讨8细胞期小鼠胚胎进行玻璃化冷冻解冻后移植,小鼠孕9.5天胎儿生长发育的情况。方法:实验分为三组,自然妊娠（Natural conception,NC）组,胚胎体外培养（In vitro culture,IVC）组和胚胎玻璃化冷冻解冻（Vitrified embryo transfer,VET）组。分析三组小鼠孕9.5天的胎儿存活率并比较三组孕母鼠在孕9.5天胎儿的头臀径。结果:（1）存活率分析显示,NC组胎儿全部存活（100%）,而IVC组和VET组的胎儿存活率分别为40.2%和37.5%,与NC组相比,差异均具有统计学意义（P<0.05）;IVC组与VET组两组比较,胎儿存活率未发现统计学差异（P>0.05）;（2）比较三组胎儿的头臀径,与NC组相比（0.288±0.083 mm）,IVC组（0.210±0.059 mm）和VET组（0.205±0.048 mm）胎儿的头臀径显着减小,差异具有统计学意义（P<0.05）,但IVC组和VET组之间比较没有显着性差异（P>0.05）。结论:玻璃化冷冻技术可影响胚胎的发育潜能,导致孕早中期胎儿存活率显着下降;玻璃化冷冻技术也可影响胎儿的宫内生长发育,导致孕早中期出现胎儿宫内生长发育迟缓的现象。第二部分:玻璃化冷冻技术对小鼠胎儿和胎盘印记基因表达的影响及其甲基化调控机制研究目的:建立玻璃化冷冻解冻胚胎移植小鼠模型,研究胚胎的玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿及胎盘印记基因表达其印记调控区甲基化水平影响。方法:实验分为三组,自然妊娠（NC）组,胚胎体外培养（IVC）组和胚胎玻璃化冷冻解冻（VET）组,在孕母鼠孕9.5天收集小鼠胎儿及胎盘,荧光定量聚合酶链反应法检测三组胎儿和胎盘中9个父源表达印记基因（Dlk1,Igf2,Kcnq1ot1,Me st,Ndn,Peg3,Plagl1,Sgce,Snrpn）和15个母源表达印记基因（Cd81,Cdkn1c,Dcn,Gatm,Gnas,Grb10,Gtl2,H19,Igf2r,Mash2,Osbpl5,Phlda2,Slc22a18,Ube3a,Zim1）的表达水平;并利用焦磷酸测序法检测印记基因H19和Kcnq1ot1的ICR调控区的甲基化水平。结果:（1）胚胎的玻璃化冷冻对小鼠胎儿组织父源表达印记基因表达的影响。与N C组相比,IVC组Peg3表达上调（NC:0.746±0.233;IVC:1.396±0.592）,VET组Igf2（NC:1.223±0.299;VET:2.048±0.537）,Peg3（NC:0.746±0.233;VET:1.981±0.238）表达上调,VET组的Ndn（NC:1.198±0.229;VET:0.699±0.227）,Sgc e（NC:1.112±0.147;VET:0.694±0.187）表达下调,以上差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎盘组织父源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组Mest表达下调（NC:0.894±0.257;IVC:0.511±0.251）,VET组Igf2（NC:1.063±0.19;VET:0.686±0.177）,Ndn（NC:0.986±0.092;VET:0.627±0.291）,Sgce（NC:0.943±0.133;VET:0.589±0.177）的表达下调,Kcnq1ot1（NC:1.127±0.357;VET:5.242±2.737）的表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿组织母源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组共有10个基因的表达上调（Cd81,Gatm,Gnas,Grb10,H19,Igf2r,Mash2,Obspl5,Slc22a18,Ube3a）,1个基因表达下调（Cdkn1c）;VET组共有9个基因表达上调（Gnas,Grb10,Gtl2,H19,Igf2r,Mash2,Obspl5,Phlda2,Slc22a18）,2个基因表达下调（Cdkn1c,Dcn）,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎盘组织母源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组Slc22a18（NC:0.964±0.071;IVC:0.426±0.093）,Ube3a（NC:1.049±0.098;IVC:0.583±0.116）的表达下调,VET组Cdkn1c（NC:0.916±0.118;VET:0.590±0.245）,Gnas（N C:0.911±0.269;VET:0.562±0.257）,Slc22a18（NC:0.964±0.071;VET:0.376±0.080）,Ube3a（NC:1.049±0.098;VET:0.362±0.171）的表达下调,差异具有统计学意义（P<0.051）。（5）胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿和胎盘组织印记基因H19的ICR调控区甲基化水平的影响。无论在小鼠胎儿还是胎盘组织,三组H19基因的ICR调控区甲基化水平均未发现统计学差异（P>0.05）。（6）胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿和胎盘组织印记基因Kcnq1ot1的ICR调控区KvDMR1区甲基化水平的影响。在胎鼠组织中,相比于NC组,IVC组和VET组KvDMR1区的甲基化水平无统计学差异（P>0.05）,但是,相比于IVC组（0.364±0.129）,VET组KvDMR1区的甲基化水平（0.464±0.109）上升,差异具有统计学意义（P<0.05）。在胎盘组织中,相比于NC组（0.425±0.062）,IVC组（0.358±0.114）和VET组（0.343±0.094）KvDMR1区的甲基化水平均下降,差异具有统计学差异（P<0.05）。结论:首先,相比于NC组,IVC组和VET组小鼠胎儿发生宫内生长发育迟缓,且IVC组和VET组小鼠胎儿组织出现大量母源表达印记基因表达水平显着上调,根据父母印记冲突学说,母源表达印记基因限制胎儿宫内生长,以尽量保存母体资源,提示IVC组和VET组小鼠胎儿组织母源表达印记基因的紊乱可能是导致胎鼠宫内生长发育迟缓的潜在机制之一。其次,相对于NC组,IVC组和VET组的胎盘组织印记基因Kcnq1ot1表达上调,而该表达异常可能与Kcnq1ot1的ICR调控区即KvDMR1区域的甲基化水平改变有关,并且我们发现,在胎盘组织中印记基因Kcnq1ot1所调控的一系列下游母源表达印记基因包括Osbp15,Phlda2,Slc22a18,Cdkn1c和Cd81均有下降,鉴于此区域对胎盘发育和功能具有重要作用,因此需关注此区域印记基因表达改变对胎盘后期功能及表型的影响。第三部分:玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿和胎盘总甲基化水平的影响及其调控机制研究目的:探究玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿及胎盘总甲基化水平的影响及其调控机制。方法:实验分为三组,自然妊娠（NC）组,胚胎体外培养（IVC）组和胚胎玻璃化冷冻解冻（VET）组,在孕母鼠孕9.5天收集小鼠胎儿和胎盘,利用酶联免疫法检测三组小鼠胎儿和胎盘中总DNA甲基化水平;并利用荧光定量聚合酶链反应检测三组小鼠胎儿和胎盘中甲基化转移酶Dnmts和去甲基化酶Tets的表达水平。结果:（1）在小鼠胎儿组织中,相对于NC组（0.0324±0.0185）,IVC组的全基因组DNA甲基化水平显着下降（0.0146±0.0144,P<0.05）,而经过玻璃化冷冻解冻步骤之后,VET组的总甲基化水平转而上升至与NC组无显着性差异（0.0321±0.0209,P>0.05）。相比于IVC组（0.0146±0.0144）,VET组（0.0321±0.0209）的总甲基化水平显着性升高（P<0.05）。在胎盘组织中,相比于NC组（0.0292±0.0221）,IVC组（0.0049±0.0033）和VET组（0.0117±0.0073）的总甲基化水平均下降,且差异具有统计学意义（P<0.05）。相比于IVC组（0.0049±0.0033）,VET组（0.0117±0.0073）的总甲基化水平显着性升高（P<0.05）。（2）在小鼠胎儿组织中,相比于NC组,IVC组和VET组的Dnmt1（NC:0.637±0.267;IVC:3.343±1.037;VET:14.337±6.373）和Dnmt3b（NC:0.898±0.218;IVC:2.625±1.168;VET:5.825±2.456）表达均上调,VET组的Tet2（NC:0.941±0.133;VET:0.334±0.104）,Tet3（NC:0.958±0.088;VET:0.300±0.056）的表达均下调,差异均具有显着性意义（P<0.05）。胎盘组织中,相比于NC组,VET组的Dnmt1（NC:1.105±0.604;VET:3.928±1.236）表达显着性上调（P<0.05）。结论:玻璃化冷冻技术致小鼠胎儿和胎盘的甲基化模式改变,这种改变,可能与甲基化转移酶和去甲基化酶的表达水平改变相关。第四部分:玻璃化冷冻技术对植入前小鼠胚胎发育的影响及其机制研究目的:探究玻璃化冷冻技术对小鼠植入前胚胎的发育影响及其机制。方法:实验分为三组,自然妊娠（NC）组,胚胎体外培养（IVC）组和胚胎玻璃化冷冻解冻（VET）组,收集三组8细胞期和囊胚期胚胎。分析IVC组和VET组小鼠胚胎的囊胚发育率和囊胚孵出率;并利用荧光定量聚合酶链反应检测三组胚胎中多潜能因子和胚胎早期细胞命运决定因子的表达水平。结果:（1）IVC组的囊胚形成率为89.02%（73/82）,略高于VET组的囊胚形成率80%（68/80）,但是二者差异没有统计学意义（P>0.05）。IVC的囊胚孵出率为93.15%（68/73）,显着高于VET组的囊胚孵出率80.88%（55/68）,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）比较NC组,IVC组和VET组8细胞期的胚胎中多项潜能因子Nanog,Pou5f1和Lif的转录水平表达情况,结果显示:与NC组相比,VET组Nanog的表达水平明显上调（NC:0.315±0.119;IVC:1.004±0.267）,IVC组和VET组的Lif的表达水平明显下调（NC:1.390±0.353;IVC:0.667±0.194;VET:0.101±0.020）,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）比较NC组,IVC组和VET组囊胚期的胚胎中多潜能因子和早期细胞命运分化因子的表达水平。相比于NC组,IVC组和VET组的多项潜能因子Pou5f1,Nanog和Sox2表达不同程度的下降。滋养层细胞分化基因Tead4在IVC组中显着上调,在VET组中显着下降（P<0.05）。滋养层细胞分化基因Cdx2,Eomes和Elf5在IVC组和VET组的表达均显着下降（P<0.05）。调控原始外胚层分化的基因Gata6,Sox17,Fgfr2以及Fgfr4在IVC组和VET组的表达也有不同程度的下降。Lif支持卵裂期细胞和囊胚发育,促进胚胎着床能力,相比于NC组,该基因也在IVC组和VET组显着下降（P<0.05）。结论:体外培养和玻璃化冷冻技术均可导致小鼠囊胚孵出率显着下降,而玻璃化冷冻技术对其影响更大。相对于NC组,IVC组和VET组的胚胎多潜能因子及早期胚胎命运决定基因表达水平显着下调,这可能是IVC和VET导致囊胚孵出率下降及胚胎早期发育潜能受损的原因。
吴延庆[7]（2017）在《蛇类卵胎生繁殖模式选择劣势的生理和遗传补偿机制》文中研究指明多数爬行动物的繁殖模式为卵生,即胚胎在母体体内发育到一定阶段,以卵的形式被排出母体体外,在外界环境中继续完成胚胎发育。多数卵生爬行动物的新生卵内的胚胎已经完成了全程约1/3的发育。有鳞类爬行动物约有20%的物种具卵胎生繁殖模式,即胚胎的发育在母体体内完成,最终以新生幼体的形式被排出体外。卵胎生繁殖模式在有鳞类中至少发生了 1 15次进化,在各分类阶元中都有发生,其进化支系远多于其他脊椎动物的总和。因此,有鳞类是研究爬行动物卵胎生进化的理想材料。由于卵胎生物种的整个胚胎发育阶段是在母体体内进行,所以胚胎发育将面临输卵管内的低氧可得性的问题。另外,部分卵生物种将卵排出体外后,其胚胎仍然会面临低氧环境,例如地下巢穴或者雨季巢穴被淹没时胚胎需经历低氧环境。作者推测胚胎在一定程度上可以忍受低氧环境,通过不同氧浓度下孵化虎斑颈槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）蛇卵检验相关假设,发现:（1）低氧对胚胎的发育有强烈的制约作用,低氧条件下的幼体孵化期延长、新生幼体的个体大小显着减小;（2）孵化期前5天的短期低氧暴露对胚胎的发育没有显着影响,这提示卵生物种的胚胎在母体体内可以进行短时间的滞留。但持续低氧暴露会影响新生幼体形态及孵化率;（3）胚胎初期的需氧量较低,随着胚胎的发育,其需氧量不断增大。实验结果提示胎生物种存在某种生理机制以满足体内胚胎发育后期的氧需求。爬行动物新生幼体体内的剩余卵黄在不可预测的孵化环境中对胚胎发育起到缓冲作用。然而负载过多卵黄的母体运动能力下降从而增加了母体妊娠期的生存风险。作者据此推测卵生蛇类与卵胎生蛇类在卵黄分配策略上存在差异,即卵胎生物种以较少的卵黄作为亲本哺育后代的资本。实验收集了 20种蛇类（其中12种卵生物种,8种卵胎生物种）新生幼体剩余卵黄的数据并发现卵胎生蛇类新生幼体的剩余卵黄干重所占总干重比的均值要显着小于卵生物种,但卵胎生蛇类新生幼体的剩余卵黄比重不总是小于卵生蛇类,在赤链华游蛇（Sinonatrix annularis）中其剩余卵黄比重大于其他物种卵生物种（三索颌腔蛇Coelognathus radiatus、灰鼠蛇Ptyas korro、滑鼠蛇P.mucosus、渔游蛇Xenochrophis piscator和乌梢蛇Zaocys dhumnades）。另外,本研究通过基于谱系关系的线性回归分析发现蛇类新生幼体的躯干干重和脂肪体干重与剩余卵黄干重呈正相关关系并具有谱系相关性。实验结果提示蛇类新生幼体剩余卵黄的差异具谱系依赖性,与繁殖模式无关。不同繁殖模式的蛇类其母体妊娠期长短具有显着差异,故孕期母体代谢水平的变化在不同繁殖模式间也会具有显着差异。实验比较了赤链蛇Dinodon rufozonatum和赤链华游蛇繁殖前后的呼吸代谢水平并分析母体繁殖输出与孕期代谢成本的相关性,结果显示两种蛇类的产前代谢水平均高于产后代谢水平。以后代胚胎总重为协变量比较母体孕期的代谢水平发现,卵生蛇类的代谢水平显着高于卵胎生蛇类,这可能是由于卵生物种中卵壳腺的分泌活动和卵壳的合成过程需要消耗部分能量。本研究对母体后代繁殖输出和繁殖代谢增长率进行线性回归分析并通过AIC值比较发现其相对繁殖输出能更好的解释孕期母体代谢变化。卵胎生母体的妊娠期长,其年交配和繁殖频次均显着低于卵生物种,因而可能降低其后代遗传多样性。作者据此推测卵胎生物种应具有更高的同窝后代多父本发生率以补偿其较低的后代遗传多样性。本研究比较分析了 2010年来实验室所收集的18种蛇类（11种卵生物种、7种卵胎生物种）多父本结果,数据显示蛇类的繁殖模式对多父本发生率、每窝平均父权数没有显着影响。但每窝父权个数与后代窝卵/仔数呈显着正相关关系。这提示多父本发生率在蛇类中具普遍现象,多父本格局在一定程度上暗示该种群的发展趋势。导致爬行动物多父本现象有两个关键因素:其一,精子储存;其二,交配与排卵在时间上的解耦联。在蛇类的交配期与排卵期之间,母体参与的多次交配有利于其交配后性选择,因此多父本格局会受到母本隐秘选择的影响。实验通过解剖赤链华游蛇孕期母体并记录胚胎位置鉴定其输卵管内父权格局来阐明蛇类在排卵期对输卵管内部的精子使用模式。结果发现赤链华游蛇在排卵前将精子进行混合,这有利于不同父权精子的竞争。另外高的父权偏斜提示雌性的隐秘选择作用,这进一步提高了用于授精的精子质量。多父本在蛇类中具普遍性,但这种婚配制度的选择利益尚未明确,实验通过同园实验饲养王锦蛇（Elaphe carinata）后代并检测其生长情况,试从后代适合度方面探讨多父本的生态学适应意义。实验数据显示:（1）同窝具多父本的后代与单父本的后代在形态上没有显着差异;（2）优势父权后代与其他父权后代之间也无显着差异;（3）父权偏斜与父权个数和后代适合度均呈负相关关系。这提示多次交配增加后代父权个数有利于提高窝后代平均适合度,这可能是蛇类多父本普遍存在的间接利益。
陈平[8]（2017）在《IGF、EGF和LIF调控牦牛IVF和PA胚胎发育及COCs冷冻适应性研究》文中认为牦牛作为青藏高原地区重要经济物种资源,生存环境长期受到高寒环境的严峻挑战,通过辅助繁殖技术可以改善并促进青藏高原地区畜牧业的发展。为了提高牦牛体外胚胎发育质量,本研究探索不同生长因子调控牦牛体外胚胎代谢及凋亡机制,通过改善成熟卵母细胞玻璃化冷冻后的培养方法,减少玻璃化冷冻对体外胚胎发育所造成的伤害,本研究进行了以下实验:（1）收集和培养牦牛成熟COCs,采用CT法对其进行玻璃化冷冻,成熟COCs经冷冻-解冻后经过IVF,在IVF胚胎培养过程中加入不同浓度的IGFI,分析不同处理组体外受精胚胎发育能力,统计胚胎卵裂率和囊胚率,采用间接免疫荧光染色的方法统计囊胚中ICM细胞数、细胞总数及ICM细胞所占比例,运用Real-time PCR、间接免疫荧光技术,检测不同处理组AQP3、Bax、Bcl-2基因表达水平与AQP3蛋白表达水平。研究发现玻璃化冷冻可显着降低牦牛囊胚中AQP3基因和蛋白表达水平（P<0.05）,100 ng/m L IGF-I处理组可抵消玻璃化冷冻对AQP3表达所产生的影响,其表达量与无冷冻无IGF-I添加对照组差异不显着（P>0.05）;同时经玻璃化冷冻后100 ng/mL IGF-I处理组相对于冷冻后0 ng/m L IGF-I处理组其Bax基因表达量下调,Bcl-2基因表达量上调,与对照组差异不显着（P>0.05）。无玻璃化冷冻对照组和冷冻后100 ng/m L IGF-I处理组中平均每个牦牛囊胚中的细胞总数无显着性差异（P>0.05）,且均高于其他处理组,5组ICM所占百分比无显着性差异（P>0.05）。100 ng/m L IGF-I处理组与对照组的卵裂率与囊胚率无显着性差异（P>0.05）。这两组胚胎的卵裂率和囊胚率显着高于0 ng/mL IGF-I,50 ng/m L IGF-I和200 ng/m L IGF-I处理组（P<0.05）。结果表明100 ng/m L浓度IGF-I是牦牛COCs解冻后恢复发育的最佳浓度,调控囊胚中AQP3表达量,其表达量上升可能改善细胞膜的渗透性及囊胚腔的形成能力;同时调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2,缓解冷冻后对胚胎发育所造成的影响。（2）收集和培养牦牛COCs,成熟后进行IVF培养,牦牛未成熟COCs随机分为4组:IVF胚胎培养时分别添加0、50、100、200 ng/m L IGF-I。0 ng/m L IGF-I作为实验对照组。采用Real-time PCR、间接免疫荧光技术检测4组囊胚中Glut-1,Bax,Bcl-2基因相对表达量以及统计4组胚胎卵裂率、囊胚率以及平均每个囊胚中细胞总数和ICM数目所占比例,以此评估IGF-I对牦牛体外胚胎发育的调控。结果显示:Bax基因在100 ng/mL IGF-I处理组中表达量最低,在0 ng/m L和50 ng/m L处理组中表达量最高且差异不显着（P>0.05）,在200ng/mL IGF-I处理组的表达量略高于100 ng/mL处理组。而Bcl-2基因在100ng/mL IGF-I处理组的相对表达量最高,50 ng/mL和200 ng/m L处理组Bcl-2基因相对表达量高于对照组,且二者差异不显着（P>0.05）。Glut-1基因的相对表达量在100 ng/mL IGF-I和200 ng/m L IGF-I处理组中显着高于对照组（P<0.05）,Glut-1表达量的升高可有效为牦牛体外胚胎发育提供能量支持,50ng/mL IGF-I处理组Glut-1基因的表达量显着高于对照组,但表达量显着低于上两组（P<0.05）,因此IGF-I处理胚胎可显着提高胚胎中Glut-1基因表达量。100 ng/mL IGF-I处理组卵裂率及囊胚率显着高于其余3组,囊胚中细胞总量及ICM所占百分比也明显提升。结果表明牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中IGF-I作为重要的自分泌或旁分泌因子,调控Bax、Bcl-2、Glut-1等凋亡与代谢相关基因的表达提高牦牛体外受精胚胎的发育能力。（3）收集和培养牦牛COCs,成熟后进行PA培养,牦牛未成熟COCs随机分为4组:未成熟COCs和PA胚胎培养时分别添加0、50、100、200 ng/m L EGF。0 ng/m L EGF作为实验对照组。采用Real-time PCR、间接免疫荧光技术检测4组囊胚中Cx43和HSP90基因相对表达量。根据孤雌激活时第一极体排出数量统计4组卵母细胞成熟率,并统计后续胚胎发育时卵裂率及囊胚率。结果显示:EGF处理COCs可显着提高COCs成熟率及PA胚胎卵裂率囊胚率及发育质量（P<0.01）,最佳的作用浓度为100 ng/mL。EGF也可显着提高牦牛囊胚中Cx43和HSP90基因的表达,EGF对Cx43和HSP90基因的最佳作用浓度分别为50 ng/m L和100 ng/m L,100 ng/m L EGF也可显着提高Cx43表达量。综合分析结果表明:EGF可通过调控HSP90和Cx43等凋亡和发育相关基因的表达显着提高牦牛孤雌胚胎发育能力。（4）收集和培养牦牛COCs,成熟后进行IVF培养,随机进行分组,生长因子LIF 200 ng/mL剂量作用于牦牛COCs及IVF胚胎,0 ng/m L LIF作为对照处理组。采用Real-time PCR检测牦牛未成熟COCs、成熟COCs、2细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚、囊胚中STAT3基因表达水平;采用间接免疫荧光染色方法观察STAT3蛋白在COCs及胚胎各个阶段表达,并统计不同组胚胎在各个阶段发育率。结果显示:LIF可显着提高牦牛IVF胚胎的囊胚中STAT3基因表达（P<0.01）,对牦牛未成熟COCs、成熟COCs、2细胞胚胎、8细胞胚胎及桑椹胚发育阶段STAT3表达水平无显着作用。LIF对牦牛IVF胚胎前期发育率无显着影响,但可显着提高牦牛桑椹胚到囊胚阶段发育率（P<0.01）。此外,STAT3在成熟COCs和囊胚中的表达显着高于未成熟COCs和前期发育胚胎。结果表明:生长因子LIF通过调控牦牛胚胎中转录相关基因STAT3,同时显着提高牦牛胚胎囊胚率。本研究为促进牦牛胚胎体外发育提供一定的理论依据。本研究从牦牛卵母细胞体外成熟、体外胚胎发育、卵母细胞玻璃化冷冻等生物学过程研究了IGF、EGF及LIF对牦牛IVF及PA胚胎发育的作用机制:1.生长因子IGF-I在牦牛成熟卵母细胞CT玻璃化冷冻及解冻后对牦牛胚胎发育产生一定影响,通过解冻后调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2以及AQP3基因和蛋白,以此提高牦牛IVF胚胎发育能力,减少玻璃化冷冻对牦牛胚胎发育的伤害。2.生长因子IGF-I调控牦牛体外IVF胚胎糖代谢相关基因Glut-1的表达,同时抑制胚胎细胞凋亡。3.生长因子EGF调控牦牛PA胚胎Cx43表达水平,提高胚胎相邻细胞间连接与交流,同时调控HSP90基因,以适应体外培养应激环境。4.生长因子LIF通过调控STAT3基因调节牦牛IVF胚胎发育过程中转录相关因子,从而提高胚胎发育能力。
谭静[9]（2017）在《精氨酸对小鼠DDK综合症的影响及其修饰基因定位研究》文中研究说明DDK综合症是一种以小鼠早期胚胎死亡为表型的繁殖现象,其主要表现为:当DDK品系雌鼠与同亚种内其他品系雄鼠杂交时,胚胎因形成胚泡障碍不能着床而死亡;而DDK雄鼠与其他品系雌鼠杂交时胚胎则均能正常发育。小鼠卵子突变基因（Ovum mutant,Om）被认为是导致该综合症的突变基因,然而该基因序列及作用机制目前仍不清楚。本研究旨在通过在小鼠日粮中添加不同浓度的精氨酸观察其对DDK综合症胚胎的影响,以及精氨酸代谢与DDK综合症间的关系;同时研究中通过寻找DDK综合症的修饰基因,以揭示Om基因位点杂合雌鼠与C57BL/6（B6）回交后胚胎死亡率偏离半数致死的原因。本研究通过营养和基因两个方面共同探讨对DDK综合症胚胎的影响,为最终解释DDK综合症的机理奠定基础。本研究共分三部分进行:第一部分研究小鼠日粮中添加不同浓度精氨酸对DDK综合症的影响。实验采用单因素完全随机设计,选用120只F1（B6♀×DDK♂）代雌鼠,随机分为3组,分别饲喂精氨酸含量为1.10%、1.34%和1.59%的日粮。妊娠12天解剖,观察存活胎子数和着床数,检测子宫胎盘内一氧化氮含量。实验结果表明,饲喂1.34%的精氨酸组其着床数显着高于1.10%和1.59%组（P<0.05）。同时,1.34%组的存活胎子数最高,但与其他两组相比,均未达到显着性差异（P>0.05）。子宫胎盘内一氧化氮检测结果显示,小鼠日粮中添加1.34%和1.59%的精氨酸其一氧化氮含量均显着高于1.10%组（P<0.05）。该实验结果表明,小鼠日粮中添加1.34%精氨酸对提高DDK综合症胚胎的成活率有一定帮助,但差异不显着;子宫胎盘内一氧化氮的检出,表明DDK综合症胚胎死亡和精氨酸缺乏及一氧化氮代谢障碍间无直接关系。第二部分初步定位DDK综合症的修饰基因。实验利用与Om基因紧密连锁的D11Mit36、D11Mit66和D11Mit247三个微卫星分子标记,筛选杂合型N2雌鼠构建修饰基因定位群体。同时,采用凝胶电泳法筛选在DDK和B6品系间具有多态性的微卫星分子标记,利用筛选到的分子标记对作图全体进行全基因扫描。收集杂合型N2雌鼠妊娠12天的存活胎仔数和胚胎着床数作为表型数据。最后采用WinQTLCart2.5软件中的复合区间作图法结合全基因扫描结果和表型数据进行QTL定位分析,初步寻找加重DDK综合症的修饰基因。实验结果显示,本研究共筛选到289只N2杂合型雌鼠构建作图群体,其筛选比例为23.94%。筛选到67条具有多态性的微卫星引物,筛选比例为25.97%,平均每条染色体上有3.53个标记,标记间平均距离为18.56cM。收集到的表型数据显示存活胎子数平均为2.57只,而着床数平均为3.59只,且均符合正态分布。结合19363个全基因扫描结果和表型数据进行QTL分析后发现,存活胎子数在第九号染色体上有一个明显高峰,其最大LOD值为3.5,超过了2.9的显着性LOD值,因此认为该位点是一个主效修饰基因位点,并将其命名为Amom1,该位点位于小鼠第九号染色体上的38.9-51.9cM区间。而着床数虽然也在第九号染色体上也有一个高峰,但其最大LOD值为2.3,未达到显着性LOD值2.5的水平,因此,认为该位点不是一个显着性修饰基因位点。该实验结果表明,在B6品系遗传背景中定位到一个主效修饰基因位点,该位点可以加重DDK综合症,使得胚胎成活率进一步降低。该实验结果解释了Om位点杂合雌鼠与B6品系回交胚胎死亡偏离半数致死的原因。第三部分对Amom1修饰基因位点进行精细定位。本研究在初步定位的基础上通过扩大定位群体,增加高密度分子标记等方法,以进一步精细定位Amom1位点。在精细定位后,结合小鼠资源库及生物信息学方法,寻找Amom1位点内的候选基因,为最终克隆DDK综合症修饰基因奠定基础。实验结果显示,本研究在小鼠第九号染色体上筛选到高密度分子标记28个,筛选率为21.88%,Amom1位点内分子标记间距为0.93cM。增加了56个有效样本,使作图群体达到了345只。利用作图群体的存活胎子数表型数据进行QTL分析,并采用1.5 LOD-drop的方法进行置信区间估测。QTL分析结果表明,Amom1位点置信区间为47.7-49.1cM间,大约1.4cM。该位点的贡献率为10.56%,加性效应为-1.46,显性效应为12.72。通过NCBI和MGI数据库分析该区间对应90700-94500Mb,包含有效基因19个,其中12个为未知基因,4个为Plscr家族基因,2个为Zic家族基因和1个Plod家族基因。下一步的研究需要对19个基因进行更进一步的筛选,并对筛选出来的候选基因进行功能性验证。综合以上研究结果,小鼠日粮中添加1.34%的精氨酸对DDK综合症略有缓解,DDK综合症胚胎死亡与日粮中精氨酸代谢无直接关系,而与B6品系遗传背景中的修饰基因位点Amom1有直接关系。该修饰基因位点通过对Om基因的调节,可促进DDK胚胎死亡的进一步增加,即加重DDK综合症。该研究揭示了日粮中精氨酸与DDK综合症胚胎死亡间的关系,同时定位到的加重DDK综合症的修饰基因为全面解释DDK综合症的机理奠定了基础。
李伟[10]（2016）在《小鼠早期卵裂胚胎玻璃化冷冻与批量冻存技术研究》文中提出随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时依旧存在很多问题,如冷冻效率不高,存在潜在的冷冻损伤等。本研究在已有的尼龙网玻璃化冷冻法的基础上,对小鼠早期卵裂阶段胚胎的玻璃化冷冻保存技术进行进一步优化,进行小鼠2-细胞胚胎的玻璃化冷冻保存研究,并进行大规模的批量化冻存小鼠2-细胞胚胎样本的探索,使每片尼龙网上冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎达到100枚左右,以满足哺乳动物胚胎空间发育试验对早期卵裂阶段胚胎的批量需求。将玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎批量冻存／解冻后,再在实验室已经建立的密闭培养体系（地面模拟空间胚胎发育试验的培养条件）下培养,与新鲜胚胎密闭培养的结果进行综合比较,评估批量玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎的发育能力,探讨其是否可以满足哺乳动物空间胚胎发育试验的需要。为了更准确的评估批量玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的质量,本研究还从胚胎细胞膜完整性、细胞骨架、线粒体分布、水通道蛋白的表达与分布等方面,探讨导致玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎体外发育率降低的原因。研究内容和结果如下：1.采用尼龙网玻璃化冷冻法,以EFS40作为玻璃化冷冻保护液——包含乙二醇（ethylene glycol,EG） （V/V） 40%,蔗糖（sucrose） 0.5 M和聚蔗糖（Ficoll 70） （W/V）25%,小鼠2-细胞胚胎在玻璃化冷冻保护液液中处理后,迅速加载到尼龙网上,然后浸没于装有液氮的冻存管中,置于液氮罐中冻存,每片尼龙网上加载约100枚胚胎。解冻时依次在0.5 M,0.25 M,0.125 M,0M的蔗糖溶液中处理,每个浓度的蔗糖溶液中平衡5 min,快速地脱除冷冻保护剂。解冻后小鼠2-细胞存活率为96.22±2.74%（1791/1857）,其中完整胚胎（intact embryos, IEs）约占89.88±4.32%（1669/1857）,部分完整胚胎（partial embryos, PEs）约占6.95±3.44%（122/1857）。因此,本研究采用的玻璃化冷冻方法可以用于批量冻存并获得批量存活的小鼠2-细胞阶段冷冻胚胎。2.小鼠2-细胞胚胎解冻后,将存活胚胎在常规微滴条件和密闭培养条件下体外培养,结果显示：玻璃化冷冻胚胎在不同培养体系条件下培养72 h、96h囊胚发育率,96h囊胚孵化率均低于新鲜胚胎组。其中玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养72 h的囊胚发育率（90.86±1.43%）低于新鲜胚胎-密闭培养组（94.10±0.89%）,但差异不显着；玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养96h的囊胚发育率和囊胚孵化率（91.38±0.29%,32.02±2.30%）显着低于新鲜胚胎-密闭培养组（93.72±0.95%,39.02±2.99%）（P<0.05）。囊胚细胞计数结果显示,新鲜2-细胞胚胎体外培养72 h和96h后,囊胚细胞数与玻璃化冷冻胚胎体外发育到囊胚的细胞数之间差异不显着（P>0.05）。密闭培养的囊胚细胞数与常规微滴培养囊胚细胞数之间也无显着差异（P>0.05）。结果表明,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎能够在密闭培养条件下正常发育到囊胚阶段,冷冻胚胎能够满足空间胚胎发育试验要求。3.尼龙网玻璃化冷冻的早期卵裂阶段小鼠胚胎体外发育率降低,可能是由于玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成了潜在损伤。因此,本研究从细胞膜完整性,细胞骨架,线粒体分布三个方面分析玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成的损伤。结果表明,相比于新鲜2-细胞胚胎,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整性未受到明显影响。冷冻-解冻后的胚胎,微丝骨架发生了变化,并且这种变化未能在体外培养中短时间恢复,但随着胚胎发育的进行,微丝骨架逐步得到恢复,微丝分布与新鲜胚胎基本一致；冷冻-解冻后的胚胎中纺锤体未见明显异常,与新鲜胚胎中的纺锤体形态结构一致。使用罗丹明123（Rhodamine123）检测冷冻-解冻胚胎线粒体分布时发现,部分解冻后的胚胎线粒体分布发生变化,在胚胎细胞的胞质中散乱分布,呈现无规则聚集状态；而新鲜胚胎中,线粒体均匀分布于胚胎细胞的胞质中,在细胞核周围呈现环绕聚集。这些结果证明,线粒体分布变化可能是导致胚胎发育率降低的主要原因,并因此推测早期卵裂阶段胚胎玻璃化冷冻-解冻过程可能导致胚胎细胞线粒体功能异常。4.为了进一步探讨卵裂阶段小鼠胚胎的玻璃化冷冻是否造成胚胎的其他损伤,本研究检测了小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后水通道蛋白3（aquaporin3, AQP3）和水通道蛋白7（aquaporin7, AQP7）在胚胎细胞的分布与表达。RT-PCR （reverse transcription-polymerase chain reaction）检测结果显示,小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后均表达AQP3和AQP7基因。qRT-PCR （quantitative real time polymerase chain reaction）结果显示,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎中AQP3 mRNA和AQP7 mRNA相对表达量相比于新鲜胚胎的表达量之间没有显着性差异（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,玻璃化冷冻前后小鼠胚胎AQP3蛋白主要分布于细胞质、细胞膜、核膜,这与新鲜2-细胞胚胎AQP3蛋白分布情况一致；AQP7蛋白主要分布在细胞质、细胞膜,玻璃化冷冻前后AQP7的分布未发生明显变化。蛋白质免疫印迹（Western Blot）结果也验证了上述结果,这两种水通道蛋白在蛋白质水平表达量未受到玻璃化冷冻-解冻的影响。
二、实验动物胚胎和合子的低温保存（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验动物胚胎和合子的低温保存（论文提纲范文）
（1）谷氨酸对体外培养小鼠胚胎阻滞阶段的抗氧化水平及后续发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 活性氧在早期胚胎发育中的影响 |
| 1.2 胚胎发育阻滞 |
| 1.3 胚胎抗氧化体系 |
| 1.4 本试验的研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 试验设计 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.6 数据统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 谷氨酸对小鼠体外培养胚胎发育的检测 |
| 3.2 小鼠胚胎阻滞阶段及囊胚胚胎内部GSH和ROS含量检测 |
| 3.3 线粒体膜电位的检测及量化分析 |
| 3.4 TUNEL的检测及量化分析 |
| 3.5 小鼠胚胎阻滞阶段胚胎内谷胱甘肽相关基因的表达分析 |
| 3.6 小鼠胚胎阻滞阶段胚胎内Nrf2及其相关基因的表达分析 |
| 3.7 小鼠胚胎阻滞阶段胚胎细胞周期相关基因的表达分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 谷氨酸提高小鼠早期胚胎发育率 |
| 4.2 谷氨酸对小鼠早期胚胎内部活性氧含量的影响 |
| 4.3 谷氨酸对小鼠早期胚胎内部谷胱甘肽含量的影响 |
| 4.4 谷氨酸对小鼠早期胚胎内部线粒体膜电位水平的影响 |
| 4.5 谷氨酸对小鼠囊胚细胞凋亡的影响 |
| 4.6 谷氨酸对小鼠2-细胞、4-细胞期氧化还原基因表达的影响 |
| 4.7 谷氨酸对小鼠2-细胞、4-细胞期细胞周期基因表达的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA 9130024F11Rik在小鼠脑发育过程中的作用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 长链非编码RNA简介 |
| 1.2 Lnc RNA在神经系统中的作用 |
| 1.2.1 大脑皮层发育过程简介 |
| 1.2.2 Lnc RNA调控神经系统生长发育 |
| 1.2.3 Lnc RNA参与神经系统功能的行使 |
| 1.2.4 Lnc RNA在神经损伤修复过程中的作用 |
| 1.3 Satb2简介 |
| 1.3.1 Satb2在神经系统发育之外的作用 |
| 1.3.2 Satb2在神经系统发育中的作用 |
| 1.4 Lnc RNA 9130024F11Rik简介 |
| 1.5 小脑皮层发育简介 |
| 1.6 课题由来 |
| 第2章 实验材料及方法 |
| 2.1 仪器与设备 |
| 2.2 药品与材料 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.3.1 1M Tris-Cl（p H=8.0） |
| 2.3.2 0.5M EDTA（p H=8.0） |
| 2.3.3 5M Na Cl |
| 2.3.4 3M Na Ac（p H=5.2） |
| 2.3.5 20% SDS |
| 2.3.6 细胞裂解液（Buffer Salting-out） |
| 2.3.7 蛋白酶K（10mg/m L） |
| 2.3.8 4% 多聚甲醛 |
| 2.3.9 30% 蔗糖溶液 |
| 2.3.10 0.25% 焦油紫 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠基因组抽提 |
| 2.4.2 小鼠基因型PCR鉴定 |
| 2.4.3 小鼠组织RNA提取 |
| 2.4.4 小鼠脑组织固定包埋 |
| 2.4.5 组织切片尼氏染色 |
| 2.4.6 RNA逆转录 |
| 2.4.7 定量PCR |
| 第3章 9130024F11Rik基因敲除鼠构建 |
| 3.1 9130024F11Rik基因敲除鼠的设计 |
| 3.1.1 敲除策略 |
| 3.1.2 位点选择 |
| 3.1.3 Cre-Lox P重组系统 |
| 3.2 基因敲除鼠的构建 |
| 3.3 基因敲除鼠品系繁殖 |
| 3.3.1 交配策略 |
| 3.3.2 基因型检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基因敲除鼠检测 |
| 4.1 敲除鼠脑组织形态学观察 |
| 4.1.1 脑组织收集 |
| 4.1.2 脑组织形态学检测 |
| 4.1.3 脑组织切片及染色 |
| 4.1.4 脑组织形态学观察小结 |
| 4.2 敲除鼠脑基因表达检测 |
| 4.2.1 RNA表达初步检测 |
| 4.2.2 RNA表达定量检测 |
| 4.2.3 RNA检测结果小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）动物源性生物材料免疫原性检测与评价技术研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Gal抗原含量检测标准化方法的建立与应用 |
| 引言 |
| 第一章 Gal抗原含量检测标准化方法的建立与应用 |
| 引言 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第二章 Gal抗原生物材料参考品的研制 |
| 引言 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、结果及数据分析 |
| 4、量值溯源 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GGTA1基因敲除小鼠的制备、免疫学特性及应用研究 |
| 引言 |
| 第一章 GGTA1基因敲除小鼠的制备及其免疫学特性研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第二章 采用GGTA1 KO小鼠评价牛源生物骨修复材料的免疫原性应用研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料与方案 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第三章 采用GGTA1 KO小鼠评价牛心包来源组织修复补片的免疫原性应用研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料与方案 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 第四章 采用GGTA1 KO小鼠评价脱细胞猪结膜的免疫原性应用研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料与方案 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 iGb3S基因敲除小鼠的制备及其免疫学特性研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 GGTA1/iGb3S双基因敲除小鼠的制备及其免疫学特性研究 |
| 引言 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 5、小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及专利 |
| 致谢 |
（4）谷氨酸对小鼠MZT期胚胎发育阻滞及相关基因表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 早期胚胎发育阻滞的影响因素 |
| 1.2 发育阻滞研究进展 |
| 1.3 活性氧参与发育阻滞机制 |
| 1.4 活性氧与胚胎抗氧化体系 |
| 1.5 本试验的研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 试验设计 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.6 数据统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 谷氨酸对小鼠MZT期胚胎发育阻滞的检测 |
| 3.2 小鼠MZT时期胚胎内部谷胱甘肽和活性氧含量检测 |
| 3.3 小鼠MZT期胚胎内谷胱甘肽氧化还原系统基因的表达分析 |
| 3.4 小鼠MZT期胚胎内合子基因的表达分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 6 mmol/L谷氨酸对小鼠MZT期胚胎发育阻滞的影响 |
| 4.2 谷氨酸对小鼠MZT期胚胎内部活性氧含量的影响 |
| 4.3 谷氨酸对小鼠MZT期胚胎内部谷胱甘肽含量的影响 |
| 4.4 谷氨酸对小鼠MZT期谷胱甘肽氧化还原系统基因表达的影响 |
| 4.5 谷氨酸对小鼠MZT期合子基因表达的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）玻璃化冷冻技术对小鼠胎儿和胎盘印记基因的影响及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿生长发育的影响 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿和胎盘印记基因表达的影响及其甲基化调控机制 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿和胎盘总甲基化水平的影响及其调控机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 玻璃化冷冻技术对植入前小鼠胚胎发育的影响及其机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）蛇类卵胎生繁殖模式选择劣势的生理和遗传补偿机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 氧影响羊膜动物演化的研究进展 |
| 1.1.1 氧浓度对羊膜动物卵孵化和胚胎发育的影响 |
| 1.1.2 氧浓度对胚胎心血管系统和幼体智力的影响 |
| 1.1.3 氧浓度对羊膜动物幼体表型和后期生长的影响 |
| 1.1.4 氧浓度与温度的交互作用对羊膜卵动物的影响 |
| 1.2 爬行动物的比较生理学研究进展 |
| 1.2.1 呼吸系统的结构与功能 |
| 1.2.2 卵滞留与胚胎滞育策略 |
| 1.2.3 卵黄的结构与功能 |
| 1.2.4 爬行动物的呼吸代谢 |
| 1.3 爬行动物的繁殖策略 |
| 1.3.1 胎盘演化与繁殖模式 |
| 1.3.2 性选择与精子竞争 |
| 1.3.3 婚配制度与多父本 |
| 参考文献1 |
| 研究目标和拟解决的关键科学问题 |
| 一、研究目标 |
| 二、拟解决的关键问题 |
| 第二章 低氧环境对虎斑颈槽蛇卵滞留的生理制约 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 动物的采集和饲养 |
| 2.2.2 蛇卵的收集和孵化 |
| 2.2.3 蛇卵的解剖 |
| 2.2.4 新生幼体的测量 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 低氧孵化对新生幼体表型的影响 |
| 2.3.2 低氧暴露时长对胚胎及新生幼体的影响 |
| 2.3.3 短期低氧暴露对胚胎及新生幼体的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 低氧如何抑制胚胎生长发育 |
| 2.4.2 低氧如何影响新生幼体表征 |
| 2.4.3 探讨卵滞留引起的低氧效应 |
| 2.4.4 探讨胚胎不同发育阶段对低氧的敏感性 |
| 参考文献2 |
| 第三章 蛇类卵黄分配策略与其繁殖模式相关性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 幼体的收集与测量 |
| 3.2.2 幼体组分的分离 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 新生幼体形态及卵黄组分的两性差异 |
| 3.3.2 繁殖模式间卵黄分配策略的差异 |
| 3.3.3 卵黄分配策略的谱系依赖性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 剩余卵黄的生物学功能 |
| 3.4.2 卵胎生蛇是否产生更加发育完善的后代 |
| 3.4.3 探讨新生幼体卵黄组分间的相关性是否具谱系依赖性 |
| 参考文献3 |
| 第四章 不同繁殖模式蛇类的能量代谢比较 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 动物的采集与饲养 |
| 4.2.2 实验设计和数据获取 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 繁殖前后两种蛇的代谢水平比较 |
| 4.3.2 两种蛇的孕期代谢成本比较 |
| 4.3.3 代谢增长率相关模型的拟合度检验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 探讨卵生物种代谢水平较高的原因 |
| 4.4.2 探究影响母体孕期代谢变化的关键因素 |
| 参考文献4 |
| 第五章 不同繁殖模式蛇类同窝后代父权格局的比较 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物与样本收集 |
| 5.2.2 微卫星筛选及引物设计 |
| 5.2.2.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.2.2 磁珠富集法筛选微卫星序列 |
| 5.2.2.3 高通量测序获取微卫星序列 |
| 5.2.2.4 引物设计与荧光PCR |
| 5.2.3 基因分型与父权鉴定 |
| 5.2.4 统计分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 18种蛇类多父本格局 |
| 5.3.2 不同繁殖模式蛇类后代多父本格局的差异性检验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 探讨同窝多父本现象普遍存在的原因 |
| 5.4.2 探讨雌性参与多次交配的选择利益 |
| 参考文献5 |
| 第六章 赤链华游蛇输卵管内的父权格局 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 动物的采集和饲养 |
| 6.2.3 胚胎定位与父权鉴定 |
| 6.2.4 统计分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 24窝赤链华游蛇胚胎多父本格局 |
| 6.3.2 输卵管内父权顺序与父权数的相关性检验 |
| 6.3.3 窝内父权数与父权偏斜指数的相关性检验 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 蛇类输卵管的生物学功能 |
| 6.4.2 探讨父权数与后代个数呈正相关关系的原因 |
| 6.4.3 探讨赤链华游蛇的精子使用模式 |
| 参考文献6 |
| 第七章 同窝多父权对王锦蛇后代适合度的影响 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 动物收集与产卵 |
| 7.2.2 卵孵化与幼体饲养 |
| 7.2.3 组织样本和核型分析 |
| 7.2.4 父权鉴定和后代遗传多样性评估 |
| 7.2.5 统计分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 单父本后代与多父本后代间的差异性检验 |
| 7.3.2 优势父权后代与其他父权后代的差异性检验 |
| 7.3.3 检验后代适合度与父权格局间的关系 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 优势父权后代是否具有更大的表型特征 |
| 7.4.2 探讨后代父权偏斜与后代适合度的关系 |
| 7.4.3 探讨同窝多父本和同窝单父本后代的适合度差异 |
| 参考文献7 |
| 结论与展望 |
| 论文的特色与创新之处 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（8）IGF、EGF和LIF调控牦牛IVF和PA胚胎发育及COCs冷冻适应性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物辅助繁殖技术 |
| 1. 人工授精 |
| 1.1 人工授精背景 |
| 1.2 人工授精原因 |
| 2. 体外受精-胚胎移植 |
| 2.1 体外受精-胚胎移植背景 |
| 2.2 意义 |
| 3. 胞浆内精子注射技术 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 影响ICSI产生胚胎发育能力因素 |
| 3.2.1 精子影响ICSI合子发育因素 |
| 3.2.2 卵母细胞影响ICSI合子发育因素 |
| 3.3 家畜ICSI研究前景 |
| 4. 表观遗传学 |
| 4.1 基因组印记与DNA甲基化 |
| 4.2 X染色体失活 |
| 5. 玻璃化冷冻 |
| 5.1 玻璃化冷冻保护剂的选择 |
| 5.2 卵母细胞冻存原理 |
| 5.3 玻璃化冷冻方法研究进展 |
| 5.4 玻璃化冷冻的应用 |
| 6. 胚胎及子宫内膜外泌体在辅助生殖技术中的作用 |
| 6.1 胞外膜泡与植入概述 |
| 6.2 胚胎起源EV对胚胎的影响 |
| 6.3 子宫内膜及胚胎促进胞外囊泡分泌 |
| 第二章 生长因子调节哺乳动物体外胚胎发育 |
| 1. 哺乳动物体外胚胎附植前发育 |
| 2. 生长因子和动物附植前胚胎发育 |
| 3. 生长因子和人类胚胎发育 |
| 4. 结论 |
| 第三章 细胞凋亡在胚胎发育中的作用 |
| 1. 附植前胚胎凋亡的生理学特征 |
| 2. 凋亡与母体环境的关系 |
| 3. 总结 |
| 实验研究 |
| 实验一 IGF-I通过调控AQP3及凋亡相关基因提高牦牛IVF胚胎发育能力及COCs冷冻适应性 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 牦牛卵巢采集及卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养 |
| 1.3 玻璃化冷冻与解冻 |
| 1.4 恢复培养 |
| 1.5 体外受精 |
| 1.6 胚胎发育 |
| 1.7 胚胎发育评估 |
| 1.8 胚胎不同染色方法及细胞计数 |
| 1.9 免疫荧光染色检测囊胚中AQP3蛋白表达 |
| 1.10 AQP3蛋白表达分析 |
| 1.11 基因表达分析 |
| 1.11.1 引物设计 |
| 1.11.2 RNA的提取及cDNA合成 |
| 1.11.3 Real-time PCR检测Bax、Bcl-2、AQP3的表达 |
| 1.12 实验设计 |
| 2. 结果 |
| 2.1 牦牛囊胚中AQP3基因表达水平 |
| 2.2 牦牛囊胚中AQP3蛋白表达水平 |
| 2.3 牦牛囊胚中Bax和Bcl-2 基因表达水平 |
| 2.4 囊胚中ICM和TE分布及细胞计数。 |
| 2.5 不同组牦牛囊胚发育能力 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 实验二 IGF-I通过调控Glut-1及凋亡相关基因提高牦牛IVF胚胎发育能力 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 牦牛卵巢采集及卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养 |
| 1.3 体外受精 |
| 1.4 体外胚胎培养 |
| 1.5 胚胎不同染色方法及细胞计数 |
| 1.6 基因表达分析 |
| 1.6.1 引物设计 |
| 1.6.2 RNA提取和cDNA合成 |
| 1.6.3 Real-time PCR检测Bax，Bcl-2，GLUT-1的表达 |
| 1.7 实验设计 |
| 1.8 数据分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 牦牛胚胎中凋亡相关基因表达 |
| 2.2 牦牛胚胎中Glut-1基因表达 |
| 2.3 囊胚中ICM和TE分布及细胞计数。 |
| 2.4 不同组牦牛囊胚发育能力 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 实验三 EGF通过调控Cx43和HSP90基因提高牦牛孤雌胚胎发育能力 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 牦牛卵巢采集及卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养 |
| 1.3 孤雌激活 |
| 1.4 体外胚胎培养 |
| 1.5 基因表达分析 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 RNA提取和cDNA合成 |
| 1.5.3 Real-time PCR检测Cx43、HSP90的表达 |
| 1.6 实验设计 |
| 1.7 数据分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 不同处理组卵母细胞成熟率统计 |
| 2.2 不同处理组牦牛胚胎发育 |
| 2.3 不同组牦牛孤雌激活胚胎中Cx43基因表达 |
| 2.4 不同组牦牛孤雌激活胚胎中HSP90基因表达 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 实验四 LIF通过调控STAT3基因提高牦牛IVF胚胎发育能力 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 牦牛卵巢采集及卵丘卵母细胞复合体体外成熟培养 |
| 1.3 体外受精 |
| 1.4 体外胚胎培养 |
| 1.5 基因表达分析 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.5.3 Real-time PCR检测STAT3表达 |
| 1.6 免疫荧光染色检测卵母细胞和胚胎中STAT3蛋白表达 |
| 1.7 实验设计与数据分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 STAT3 mRNA在牦牛COCs和胚胎各时期发育中的表达 |
| 2.3 LIF对牦牛卵母细胞及移植前胚胎发育的影响 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）精氨酸对小鼠DDK综合症的影响及其修饰基因定位研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小鼠早期胚胎发育规律 |
| 1.1.1 小鼠早期胚胎发育一般规律 |
| 1.1.2 小鼠早期胚胎发育基因表达规律 |
| 1.1.2.1 小鼠早期胚胎母源型基因表达 |
| 1.1.2.2 小鼠早期胚胎基因的调控过渡 |
| 1.1.2.3 小鼠早期胚胎合子型基因的表达 |
| 1.2 精氨酸对早期胚胎发育的影响研究进展 |
| 1.2.1 精氨酸对早期胚胎发育的影响 |
| 1.2.2 精氨酸对早期胚胎着床的影响 |
| 1.3 DDK综合症的研究进展 |
| 1.3.1 DDK综合症与Om基因的发现 |
| 1.3.2 Om基因的定位 |
| 1.3.3 Om基因主导的精卵亲和性研究 |
| 1.3.4 Om基因可能的作用机制 |
| 1.3.5 Om基因位点杂合型雌鼠卵子细胞质物质形成机制假说 |
| 1.4 Om基因修饰基因的研究进展 |
| 1.4.1 修饰基因研究的历史及现状 |
| 1.4.2 修饰基因的作用方式及研究方法 |
| 1.4.3 Om基因修饰基因的发现 |
| 1.4.4 Om基因修饰基因的定位 |
| 1.5 QTL定位的原理及方法 |
| 1.5.1 QTL定位原理 |
| 1.5.2 QTL定位方法 |
| 1.5.2.1 单标记作图法 |
| 1.5.2.2 区间作图法 |
| 1.5.2.3 复合区间作图法 |
| 1.5.2.4 多重区间作图法 |
| 1.5.3 QTL定位的策略 |
| 1.5.3.1 候选基因法 |
| 1.5.3.2 全基因组扫描法 |
| 1.5.4 QTL精细定位 |
| 1.5.5 影响QTL定位效果的因素 |
| 1.5.5.1 定位群体 |
| 1.5.5.2 标记密度 |
| 1.5.5.3 表型鉴定 |
| 1.5.5.4 方法算法 |
| 1.5.6 QTL定位面临的挑战及展望 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 1.7 研究内容及技术路线 |
| 第二章 精氨酸对DDK综合症的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物及分组 |
| 2.2.2 实验日粮 |
| 2.2.3 实验数据收集 |
| 2.2.4 实验仪器设备 |
| 2.2.5 实验试剂 |
| 2.2.6 实验方法 |
| 2.2.7 技术路线 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 小鼠日粮中添加精氨酸对存活胎子数的影响 |
| 2.3.2 小鼠日粮中添加精氨酸对子宫胎盘NO含量的影响 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 2.4.1 小鼠日粮中添加精氨酸对存活胎子数的影响 |
| 2.4.2 小鼠日粮中添加精氨酸对子宫胎盘NO含量的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 加重DDK综合症修饰基因的QTL定位 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 动物饲养管理 |
| 3.2.3 实验仪器及设备 |
| 3.2.5 技术路线 |
| 3.2.6 构建定位群体 |
| 3.2.7 小鼠DNA样本提取 |
| 3.2.8 PCR引物及扩增 |
| 3.2.9 PCR扩增结果判定 |
| 3.2.9.1 N_2雌鼠杂合型判定 |
| 3.2.9.2 微卫星标记多态性判定 |
| 3.2.10 表型数据收集 |
| 3.2.11 QTL定位分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 微卫星多态性引物筛选 |
| 3.3.2 N_2雌雄杂合子筛选 |
| 3.3.3 QTL定位分析 |
| 3.3.3.1 收集表型数据 |
| 3.3.3.2 QTL分析 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 3.4.1 微卫星多态性引物筛选 |
| 3.4.2 N_2雌性杂合子筛选 |
| 3.4.3 QTL定位分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Amom1基因位点的精细定位 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验仪器及设备 |
| 4.2.3 技术路线 |
| 4.2.4 高密度分子标记的筛选 |
| 4.2.5 QTL定位 |
| 4.2.6 生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 高密度分子标记筛选 |
| 4.3.2 第九号染色体上全基因扫描 |
| 4.3.3 Amom1位点QTL定位 |
| 4.3.4 Amom1位点遗传参数分析 |
| 4.3.5 识别Amom1位点内候选基因 |
| 4.3.6 Amom1位点内基因生物信息学分析 |
| 4.4 讨论与结论 |
| 4.4.1 Amom1位点的QTL定位 |
| 4.4.2 QTL定位置信区间的选择 |
| 4.4.3 Amom1位点遗传参数分析 |
| 4.4.4 Amom1位点内候选基因的选择 |
| 4.4.5 Om基因修饰基因研究展望 |
| 4.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点 |
| 下一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 附表1 |
| 附表2 |
| 附表3 |
| 附表4 |
| ABSTRACT |
（10）小鼠早期卵裂胚胎玻璃化冷冻与批量冻存技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 玻璃化冷冻保存技术的研究进展 |
| 1.1 玻璃化冷冻 |
| 1.1.1 玻璃化冷冻的含义 |
| 1.1.2 玻璃化冷冻保存的三因素 |
| 1.1.3 玻璃化冷冻的优点 |
| 1.2 玻璃化冷冻中的冷冻保护剂 |
| 1.2.1 渗透性冷冻保护剂 |
| 1.2.2 非渗透性冷冻保护剂 |
| 1.3 玻璃化冷冻和解冻过程 |
| 1.3.1 玻璃化冷冻过程 |
| 1.3.2 玻璃化冷冻的解冻过程 |
| 1.4 玻璃化冷冻方法 |
| 1.4.1 MSD法 |
| 1.4.2 Cryotop法 |
| 1.4.3 尼龙网法 |
| 1.4.4 OPS法和CPS法 |
| 1.5 不同发育时期胚胎的玻璃化冷冻 |
| 1.5.1 卵母细胞 |
| 1.5.2 原核期胚胎 |
| 1.5.3 卵裂期胚胎 |
| 1.5.4 囊胚 |
| 1.6 玻璃化冷冻技术目前存在的新的研究热点 |
| 1.7 小结 |
| 第二章 玻璃化冷冻的冷冻损伤 |
| 2.1 透明带损伤 |
| 2.2 细胞膜 |
| 2.3 胚胎细胞形态 |
| 2.4 细胞骨架 |
| 2.5 线粒体 |
| 2.6 内质网应激 |
| 2.7 染色质的完整性 |
| 2.8 水通道蛋白 |
| 2.9 转录因子和DNA甲基化 |
| 2.10 小结 |
| 试验部分 |
| 第三章 玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎的体外发育研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷-解冻后的存活率统计 |
| 3.2.2 解冻后存活的小鼠2-细胞胚胎在不同培养体系下的发育结果 |
| 3.2.3 胚胎细胞计数结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 尼龙网法玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的冷冻损伤研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎形态学比较 |
| 4.2.2 玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整性的检测 |
| 4.2.3 玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎细胞骨架的检测 |
| 4.2.4 玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎中线粒体分布 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎AQP3和AQP7的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 AQP3和AQP7在玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎中的表达情况 |
| 5.2.2 玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎中AQP3 mRNA的相对表达水平 |
| 5.2.3 玻璃化冷冻前后小鼠2-细胞胚胎中AQP7 mRNA的相对表达水平 |
| 5.2.4 蛋白免疫印迹结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、实验动物胚胎和合子的低温保存（论文参考文献）
- [1]谷氨酸对体外培养小鼠胚胎阻滞阶段的抗氧化水平及后续发育的影响[D]. 蔡光雨. 延边大学, 2020(05)
- [2]长链非编码RNA 9130024F11Rik在小鼠脑发育过程中的作用初探[D]. 李家恒. 华侨大学, 2019(01)
- [3]动物源性生物材料免疫原性检测与评价技术研究[D]. 邵安良. 中国人民解放军医学院, 2019(02)
- [4]谷氨酸对小鼠MZT期胚胎发育阻滞及相关基因表达影响的研究[D]. 刘宇. 延边大学, 2019(01)
- [5]冷冻生殖细胞和组织用于保存实验动物遗传资源[J]. 彭旭,张晓梅,何学令,刘艳. 实验科学与技术, 2020(02)
- [6]玻璃化冷冻技术对小鼠胎儿和胎盘印记基因的影响及其调控机制研究[D]. 马媛. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [7]蛇类卵胎生繁殖模式选择劣势的生理和遗传补偿机制[D]. 吴延庆. 南京师范大学, 2017(06)
- [8]IGF、EGF和LIF调控牦牛IVF和PA胚胎发育及COCs冷冻适应性研究[D]. 陈平. 甘肃农业大学, 2017(06)
- [9]精氨酸对小鼠DDK综合症的影响及其修饰基因定位研究[D]. 谭静. 河南农业大学, 2017(03)
- [10]小鼠早期卵裂胚胎玻璃化冷冻与批量冻存技术研究[D]. 李伟. 西北农林科技大学, 2016(02)