肾动脉高压大鼠血清一氧化氮、血管紧张素Ⅱ和超氧阴离子的变化

一、The changes of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and superoxide anion in renal artery hypertension rat（论文文献综述）

邵婉^[1]（2021）在《虾肽对RAW264.7细胞氧化损伤及溃疡性结肠炎的保护作用研究》文中进行了进一步梳理

王文俊^[2]（2021）在《腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究》文中提出研究背景急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）可能导致恶性心律失常、心源性休克、猝死等严重不良心血管事件,是威胁人类健康的主要原因之一。再灌注治疗,如溶栓和经皮冠状动脉介入治疗,能够开通堵塞的冠状动脉,恢复心脏组织血运,挽救缺血心脏组织,减少心肌梗死面积,改善患者预后。因此,再灌注治疗成为治疗AMI最有效的手段。然而,再灌注治疗本身也可对心脏组织产生损伤,即定义为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。MIRI主要表现为包括室性期前收缩、室性心动过速等在内的心律失常、心功能持续障碍、微血管阻塞和程序性心肌细胞死亡。在MIRI中程序性心肌细胞的死亡方式包括细胞凋亡、程序性坏死、焦亡、铁坏死等多种,其中以细胞凋亡和程序性坏死最为重要。已经证明再灌注引起的程序性心肌细胞的死亡可能会导致心肌梗死的面积最终增加近一倍。因此,减少再灌注引起的心肌细胞的死亡是减少缺血再灌注损伤的关键。但现仍未找到有效的减少心肌细胞死亡的方式。由此深入探讨心肌缺血再灌注损伤中细胞死亡发生与调节的机制,寻找有效的减轻缺血再灌注损伤的靶点和方法,是目前心肌保护领域的研究热点。腺苷激酶（Adenosinekinase,ADK）是人体内代谢腺苷的关键酶类之一。腺苷能够在缺血、低氧、创伤等条件下发挥细胞保护作用,有效防止缺血再灌注引起的心肌损伤。由于腺苷在体内半衰期很短等原因,因此腺苷至今仍未能有效地在临床用于预防心肌缺血再灌注损伤的治疗。ADK是哺乳动物细胞中表达量最多的核苷激酶之一,广泛表达在心脏、肝、脑等器官组织中。ADK可以将心肌细胞中大约90%的腺苷经转化为单磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate,AMP）,因此,ADK活性的高低决定了心肌中腺苷的浓度。除此之外,ADK还有调节炎性物质表达,以及潜在的磷酸化激酶的作用。已经有研究证明ADK在癫痫发作、脑缺血过程中发挥了重要的作用。腺苷激酶在MIRI中是如何变化的,以及发挥了怎样的作用,如何发挥作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.抑制ADK对于MIRI的保护作用。2.抑制ADK是否可以减少MIRI中的细胞死亡。3.抑制ADK如何影响MIRI中的细胞死亡。研究方法我们在小鼠心脏缺血再灌注模型中抑制ADK活性或减少ADK表达后,以探究ADK对MIRI后心脏损伤以及心功能的影响,之后又探究了抑制ADK后对MIRI中细胞程序性死亡的作用。使用H9c2（大鼠心肌细胞系）以及乳大鼠原代心肌细胞构建缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,围绕抑制ADK活性如何调节MIRI中细胞程序性死亡展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:方案一抑制ADK酶活性:将小鼠随机分为4组,分别为假手术组（sham组）,药物注射组（ABT702组）,缺血再灌注组（IR组）和缺血再灌注加药物注射组（ABT702+IR）。对于ABT702组和ABT702+IR组,在手术操作前半小时,给予ADK激酶抑制剂ABT702（2 mg/Kg）腹腔内注射。对于sham组和IR组在术前半小时给予同等剂量的DMSO。方案二减少ADK在体表达:将小鼠随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,病毒对照组（AAV9-GFP+IR）,病毒组（AAV9-shADK+IR）。对于病毒组在术前3周,给小鼠经尾静脉注射带有心脏特异性启动子的AAV9-shADK,病毒对照组注射AAV9-GFP。在实验方案中,依据不同研究目调整最后取材时间。于MIRI后2 h取血测量LDH指标。于MIRI后24h取材测量心功能。其他指标于MIRI后4h取材进行检测。2.小鼠MIRI模型建立:选取6-8周龄左右成年C57BL/6雄性小鼠,开胸暴露心脏后用结扎线结扎左前降支30 min后,打开活结。对于假手术组,仅将线穿过动脉,但并不结扎,其余操作相同。分别于再灌注2h、4h、24h后,用0.8%戊巴比妥钠再次麻醉小鼠并取材。3.心功能的检测:使用小动物心脏彩超评价心功能。在小鼠MIRI后24 h进行测定,在小动物心脏超声M超模式下进行测定,通过检测数据计算心脏左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和短轴缩短率（Left ventricular fraction shortening,LVFS）进行判断。4.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。5.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）和腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。6.电镜检测:小鼠MIRI后于缺血再灌注区域取1立方微米心肌组织后用戊二醛溶液进行固定后,在山东大学电子显微镜中心使用透射电镜进行检测。7.心肌细胞凋亡检测:在动物实验中,将心肌组织取材后首先将组织浸泡于4%多聚甲醛进行固定,之后用石蜡包埋、切片。采用TUNEL免疫组化染色的方法检测凋亡心肌细胞数量。8.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。9.蛋白检测:用心肌组织提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳进行分离、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.mRNA检测:提取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。11.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（Means±SEM）表示,应用GraphPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究ADK对于MIRI中细胞死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞和大鼠原代心肌细胞建立缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,通过TUNEL染色和细胞流式术检测凋亡和坏死的细胞,此外检测了凋亡通路和坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定ADK是否通过连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）来调节 MIRI 中的细胞死亡,我们使用XIAP蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞凋亡和程序性坏死比例以及凋亡和程序性坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定是通过腺苷通路上哪个受体发挥作用,首先通过PCR检测了 MIRI后受体的变化情况,之后用A2B受体的抑制剂,继而检测发生程序性坏死和凋亡的细胞数量。最后为了检测,ADK对MIRI中线粒体的影响,检测了线粒体膜电位,线粒体ROS产生以及线粒体通道转化孔的开放情况。2.细胞H/R处理:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）。将细胞放入缺氧培养箱培养12h后,放入正常培养箱后再培养1-4h,收取细胞。3.通过小干扰减少小鼠体内XIAP蛋白:通过对细胞转染XIAP小干扰,减少XIAP蛋白含量。4.线粒体活性氧的检测:使用MitoSOXRed检测线粒体ROS水平。5.线粒体膜电位检测:使用JC-1染色检测线粒体膜电位水平。6.细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。7.细胞凋亡检测:在细胞实验中,细胞爬片后,经过H/R刺激,用TUNEL免疫荧光方法进行H9c2心肌细胞的凋亡检测。8.ATP含量检测:细胞经相应处理后充分裂解并收集,使用ATP检测试剂盒对ATP进行检测,反应完成后使用多功能酶标仪对吸光度进行检测,并通过标准曲线标化后计算结果。9.线粒体通道转化孔检测:通过Calcein-AM和Cocl2共同染色检测线粒体通道转化孔开放的情况。10.蛋白、RNA检测:同动物实验步骤。11.统计分析:同动物实验步骤。研究结果1.在MIRI中抑制ADK活性可以减少心梗面积,改善心功能ADK在再灌注2-4 h一过性升高,在再灌注后6 h恢复正常。使用ADK激酶抑制剂ABT-702或干扰ADK体内表达可以明显减少MIRI后心肌梗死面积。ADK抑制剂同样可以减少血浆中LDH水平和改善心脏LVEF,LVFS指标。同样,电镜观察发现ADK抑制剂可以改善MIRI后肌节和线粒体损伤。此外我们也观察到,ADK抑制剂会减慢小鼠的心率,但对血压没有影响。2.抑制ADK活性可以减少小鼠MIRI中细胞凋亡和程序性坏死TUNEL染色发现,抑制ADK活性可以减少心脏组织缺血危险区凋亡细胞数量。此外抑制ADK活性可以减少caspase-8,caspase-9,caspase-3的增加,但对caspas-12没有影响。再者抑制ADK活性对Bax和Bcl-2的蛋白量没有调节作用,但是可以提高p-P38蛋白含量。EBD-CaV3染色发现ADK抑制剂使坏死细胞减少。且 ADK 抑制剂可以减少 RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII蛋白量,但是对RIP1,p-RIP1,CaMKⅡ蛋白量没有影响。3.抑制ADK活性可以减少H9c2 H/R模型中细胞凋亡和程序性坏死在细胞实验中我们同样可以观察到,抑制ADK活性可以减少凋亡细胞。且可以减少活化的caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白量。同样ADK抑制剂可以减少P38 MAPK的磷酸化,但对Bax,Bcl-2和MAPK的含量没有明显作用。细胞流式发现,ADK抑制剂减少了 H/R诱导的细胞程序性坏死,同时减少了程序性坏死通路的RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII蛋白量。4.抑制ADK活性对细胞凋亡和程序性坏死的调控是通过XIAP介导为了探讨ADK是如何调控细胞凋亡和坏死,实验结果发现,抑制ADK活性可以增加XIAP,p-XIAP的蛋白含量。此外ADK活性抑制可以增加p-AKT的蛋白含量。而使用AKT抑制剂MK-2206可以减少ADK抑制剂对XIAP,p-XIAP的作用。而使用siRNA干扰XIAP的表达后,也可以削弱ADK抑制剂对凋亡以及程序性坏死的调控。5.抑制ADK活性对于H/R诱导的细胞死亡的调节作用是由腺苷受体来介导使用腺苷受体抑制剂后可发现抑制ADK活性后对XIAP以及p-XIAP的调节作用消失。RT-qPCR检测小鼠组织和心肌细胞发现A2B的mRNA变化最为明显,其次为A1受体。使用A2B受体拮抗剂后发现抑制ADK活性后对XIAP和p-Akt、p-XIAP的调节作用以及对细胞凋亡和坏死的调节作用下降。6.抑制ADK活性可以改善H/R后线粒体功能,并且可以减少ROS的产生使用ADK活性抑制剂后可发现细胞H/R后线粒体膜电位的去极化减弱。Calcein-AM染色发现mPTP孔道的开放减少,此外线粒体ROS的生成减少,ATP的生成也可以被改善。电镜观察也可以发现抑制ADK活性可以改善心肌细胞处线粒体损伤和肿胀。研究结论1.抑制ADK激酶活性可以在MIRI中发挥保护心脏作用。2.抑制ADK减少MIRI中心肌细胞的凋亡和程序性坏死。3.抑制ADK可以通过腺苷受体A2B/Akt/XIAP发挥作用。4.ADK可以成为治疗MIRI的潜在靶点。研究背景由前述可知,再灌注治疗是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）最有效的治疗手段。然而再灌注本身也可导致心肌的损伤称为心脏缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）。针对 MIRI 进行治疗,对于改善AMI患者愈后,减少患者心衰的发生具有重要的意义。而心肌细胞程序性死亡是MIRI中重要的环节,针对MIRI中的心肌细胞程序性死亡对于减轻MIRI损伤具有重要意义,而程序性坏死又是心肌细胞程序性死亡的重要的方式之一。4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）是细胞内毒性最强的醛类物质之一。4-HNE是脂质过氧化的重要产物。具有超强的生物反应活性,生成后可以迅速和细胞内磷脂,核酸,蛋白发生加成反应,影响其生物功能。在生理状态下4-HNE的浓度为0.3-5 μM,并在多种生理功能中起到信号调节因子的作用。在氧化应激的情况下,4-HNE可以增加10-100倍,并通过抑制基因表达和修饰蛋白从而发挥细胞毒性作用。在MIRI损伤中,4-HNE可以增加为原来的6倍。已知.4-HNE对于MIRI中细胞凋亡、自噬都有着调节作用,但其对MIRI中细胞程序性坏死的调节作用以及如何发挥这种调节作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.在MIRI中程序性坏死和4-HNE的变化。2.4-HNE是否调节MIRI中程序性坏死。3.4-HNE通过何种机制调节MIRI中程序性坏死。研究方法我们采用小鼠心脏缺血再灌注模型以及离体心脏灌流模型研究了减少或增加4-HNE后对MIRI中细胞程序性坏死的影响;使用大鼠心肌细胞系H9c2,围绕提高4-HNE如何调节MIRI中细胞程序性坏死展开研究。（一）动物实验1.动物实验方案:在体小鼠心脏缺血再灌注模型:将6-8周C57BL/6小鼠（Wide type,WT）和乙醛脱氢酶过表达小鼠（ALDH2-transgenic,ALDH2-Tg）随机分为3组,分别为假手术组（sham组）,缺血再灌注组（I/R组）和乙醛脱氢酶过表达+缺血再灌组（ALDH2-Tg+I/R）。离体小鼠灌流模型:将6-8周C57BL/6小鼠随机分为2组,分别为假手术组（sham 组）,4-HNE 灌流组。2.小鼠心脏缺血再灌注模型的建立:同前构建小鼠缺血再灌注模型和假手术模型。在结扎后30 min,恢复冠脉血流,之后4 h用0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠并取材。3.离体小鼠心脏灌流模型:取6-8周成年雄性C57BL/6小鼠,注射戊巴比妥钠肝素溶液,将小鼠进行麻醉以及肝素化。小鼠固定后,由剑突下开胸并迅速分离心脏。将心脏置于4℃Krebs-Henseleit（KH）液中清洗并分离主动脉。将主动脉连接到Langendorff离体心脏灌流系统,以恒温（37℃）KH缓冲液进行灌流。切开左心耳,将充水的乳胶球囊插入,另一端连接压力转换器,并由Labchart对信号进行分析。将心脏固定到Langendorff离体心脏灌流系统后稳定20 min,继而根据分组不同用含有4-HNE或者安慰剂的KH液进行灌流。稳定灌流1 h后收集心脏。4.心功能的检测:用小动物心脏超声机检测小鼠心脏LVFS,LVEF指标,反应检测小鼠MIRI后24 h心功能情况。5.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝（Evansblue,EBD）和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。6.血浆乳酸盐脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。7.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白（Caveolin 3,CaV3）联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。8.免疫组化:心脏组织经石蜡包埋切片后,经烤片、梯度酒精脱蜡后,牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）封闭后,一抗、二抗孵育。最后3,3氮二氨基联苯胺盐酸盐（3,3N-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB）显色后苏木素染核。显微镜观察后拍照分析。9.蛋白检测:提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.免疫共沉淀:通过免疫共沉淀的方法检测蛋白-蛋白之间相互作用。通过正常步骤提取蛋白后,将蛋白先后和一抗、beads共同孵育。孵育结束后,离心弃上清,加入稀释好的1xloadingbuffer,加热后同上蛋白检测步骤进行检测。11.mRNA检测:取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。12.统计分析:计量资料数据以均数±标准误（MeanSEM）表示,应用GrapPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P<0.05为差异具有统计学意义。（二）细胞实验1.细胞实验方案:为了研究4-HNE对于MIRI中细胞程序性死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞并给予不同浓度和不同时间梯度的4-HNE刺激,检测了细胞程序性坏死以及程序性坏死通路相关蛋白的调节情况。为了确定4-HNE是否通过RIP1蛋白来调节MIRI中的细胞死亡,我们使用RIP1蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞坏死情况以及程序性坏死通路上相关蛋白的调节情况。之后为了明确,4-HNE是如何调节RIP1蛋白含量的,检测了 RIP1蛋白的mRNA水平以及蛋白代谢率还有其泛素化修饰情况。2.细胞4-HNE处理:细胞饥饿12 h后根据实验目的给予不同浓度4-HNE（20μM,40 μM,60 μM,80 μM）培养 1-6 h,收取细胞。3.细胞缺氧/复氧（H/R）模型建立:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱（气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气）进行缺氧处理。将细胞缺氧培养12 h后,在正常条件下再培养1-6h,收取细胞。4.心肌细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。5.通过小干扰减少小鼠体内RIP1蛋白:通过对细胞转染RIP1小干扰,减少RIP1蛋白含量。6.蛋白检测和免疫共沉淀:同动物实验。7.统计分析:同动物实验。研究结果1.MIRI增加了小鼠心脏中的细胞程序性坏死和4-HNE产生EBD-CaV3双染结果显示,MIRI后,心肌坏死面积增加。此外,体内体外结果显示坏死通路 RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII在MIRI后均升高。同时,我们用免疫印迹的方法和免疫组化的方法证明了 MIRI后心脏组织处4-HNE的上升。在细胞实验中也应证了这个结果。2.减少4-HNE水平可以减轻MIRI中的程序性坏死在ALDH2-Tg小鼠中,MIRI损伤后4-HNE含量下降。同时,ALDH2-Tg可以改善MIRI后心功能。此外,ALDH2过表达可以减少MIRI后心梗面积和血浆LDH含量。EBD-CaV3染色显示MIRI后心脏坏死面积在ALDH2-Tg小鼠中缩小。与此同时,RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII也在ALDH2-Tg小鼠中下降。免疫共沉淀显示,MIRI后坏死小体的形成也在ALDH2-Tg小鼠中下降。3.在离体灌流模型中,4-HNE刺激增加离体心脏中的细胞程序性坏死免疫组化以及免疫荧光显示在4-HNE灌流的心脏中,4-HNE的含量明显上升。此外,LVDP,dp/dt结果显示4-HNE灌流后心功能下降。同时,免疫印迹显示 4-HNE 灌流增加了心脏组织中RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和p-CaMKII的蛋白含量以及坏死小体的形成。4.4-HNE刺激增加H9c2细胞的程序性坏死细胞流式结果显示,4-HNE刺激后造成H9c2细胞坏死增加。同时不同时间梯度4-HNE进行刺激时,RIP1,p-RIP1,和p-RIP3呈梯度递增。而以不同浓度4-HNE 刺激时,RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和 p-CaMKII 呈梯度递增。5.4-HNE刺激对心肌程序性坏死的调节是通过RIP1介导的为了明确RIP1蛋白的作用,用RIP1小干扰减少RIP1蛋白表达。细胞流式术显示减少RIP1蛋白可以减低4-HNE刺激下细胞程序性坏死的发生。通过蛋白免疫印迹法也可发现4-HNE刺激下p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII等蛋白的上升可以被RIP1 siRNA减弱。6.4-HNE刺激可以减少RIP1蛋白的泛素依赖性降解RT-qPCR发现4-HNE刺激后RIP1 mRNA含量没有明显改变。用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）抑制DNA转录后发现4-HNE可以减少RIP1蛋白的降解。同时蛋白共沉淀检测RIP1蛋白的k-48多聚泛素化发现4-HNE可以减少RIP1的K-48多聚泛素化修饰。同时我们检测了 cIAP1,cIAP2E3泛素连接酶和RIP1蛋白的结合,发现4-HNE并不影响RIP1蛋白和泛素连接酶之间的结合。因此可以推断4-HNE可以减少RIP1和泛素之间的结合。同时,4-HNE可以使RIP1蛋白的羰基化修饰增加。研究结论1.4-HNE可以增加MIRI中细胞程序性坏死。2.4-HNE通过提高RIP1增加MIRI中细胞程序性坏死。3.4-HNE通过减少RIP1蛋白的K-48多聚泛素化依赖性途径降解,增加细胞程序性坏死。

徐芳芳^[3]（2021）在《高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理背景近年来,随着生活水平的提高和生活方式的改变,心脑血管疾病已成为严重危害人类健康的首要危险因素。而高盐饮食是心脑血管疾病的重要危险因素之一。因盐摄入过多,全球每年约有165万人群死于心血管疾病。越来越多的证据表明,高盐饮食会损害血管反应性,周围血管阻力的调节和一氧化氮（Nitric oxide,NO）的合成,其对心血管、脑血管、肾小球毛细血管、肠系膜阻力血管的损伤是近些年的研究热点。血小板反应蛋白（Thrombospondin-1,THBS1）最初被定义为第一个天然抗血管生成剂,近年来发现它也是一个分泌型的多功能糖蛋白。THBS1能够调节血管生成以及细胞的增殖,凋亡,迁移和黏附,参与维持血管系统和体内稳态。在多种生理和病理过程中均发挥重要作用,包括血栓形成,血管生成,肿瘤发生,炎症,细胞凋亡和纤维化。通过与细胞膜表面受体相互作用,THBS1抑制细胞内NO信号,比如抑制内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,e NOS）的活化和磷酸化,减少NO的生成。NO是血管内皮细胞（Endothelial cell,EC）分泌的重要血管舒张剂,由e NOS催化生成。NO具有多种重要功能,尤其在血管张力的维持,血压的调节和炎症反应的抑制等方面发挥重要作用。钙库操纵钙内流（Store-operated calcium entry,SOCE）是调节EC中钙离子浓度的重要途径。高盐刺激能诱导体内NO生物利用度下降,进而导致EC功能障碍,血管舒张功能减弱。然而,THBS1在高盐饮食诱导的EC功能障碍和血管损害的机制仍未完全阐明。基于以上背景,本课题拟探讨两个研究主题:1.关键蛋白及相关信号通路在高盐饮食对心血管疾病的损伤中的作用及机制;2.THBS1在高盐饮食大鼠内皮功能损伤中的作用及机制。目的1.探讨高盐饮食大鼠血清中关键的差异表达蛋白质（Differentially expressed proteins,DEPs）及其相关信号通路;2.验证高盐饮食诱导的THBS1的表达改变以及其在肠系膜血管内皮细胞（Mesenteric artery endothelial cells,MAECs）对高盐反应中的作用和机制,为高盐饮食引起的血管损伤提供一个新的潜在分子机制。方法1.血清收集对SD大鼠分为两组:对照组（普通饮食组,0.4%Na Cl）和高盐饮食组（4%Na Cl）,喂养4周。无菌条件下,抽取腹主静脉血,分离血清。2.蛋白质标记对照组肽段标记的是同种键标签113、114、115和116,而高盐饮食组为117、118、119和121。3.高p H的HPLC分级通过缓冲液A和缓冲液B（98%ACN,p H 10）形成的线性梯度以700μL/min的流速分离肽。4.液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析由流动相A（0.1%FA,H2O）和流动相B（0.08%FA,80%ACN）形成的线性梯度以600 n L/min的流速分离,随后将分离的肽放入质谱仪中检测。5.数据库检索和生物信息学分析我们使用Proteome Discover软件搜索uniprot-rattus+norvegicus.20180702＿36089.fasta数据库。随后进行基因本体论（Gene ontology,GO）分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）途径分析,以鉴定目标肽段富集的具有显着性统计学差异的信号通路。6.免疫组化和蛋白质免疫印迹实验检测THBS1,eNOS,转化生子因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）,Orai1,Orai2,Orai3的表达。7.肠系膜阻力动脉（Mesenteric resistance artery,MRA）张力测定分别用乙酰胆碱和硝普钠检测MRA内皮依赖性和内皮非依赖性舒张。8.原代MAECs培养和鉴定使用0.2%I型胶原酶消化、提取细胞,随后使用VWF（EC标记性蛋白）对原代培养的细胞进行鉴定。9.原代MAECs转染细胞被转染四种小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）序列,分别是scrambled si RNA,Thbs1 si RNA,Orai1 si RNA和Orai2 si RNA。10.MAECs中NO含量测定使用DAF-FM DA（NO荧光指示剂）检测各组细胞内NO含量,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光强度。11.激光共聚焦检测Smad4入核激光共聚焦显微镜观察Smad4在细胞内的分布情况。12.细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定用钙离子成像系统检测原代MAECs的钙库操纵钙内流（SOCE）情况。13.统计分析数据以均值±标准误表示。用Graph Pad Prism（v8.3.0.538）软件制作统计图。双因素方差分析或t检验等统计方法用于分析数据之间的差异。P<0.05被认为有统计学差异。结果1.高盐饮食组和普通饮食组大鼠之间有111种血清蛋白质的浓度存在显着差异:其中65个蛋白质明显上调,46个蛋白质明显下调;THBS1的差异倍数（Fold change,FC）为1.5,即表达显着上调。2.THBS1在高盐饮食大鼠血清和血管内皮中高表达;3.与对照组相比,高盐饮食大鼠的MRA内皮依赖性显着减弱,而对内皮非依赖性舒张无影响;4.高盐诱导MAECs中THBS1表达上调而e NOS表达下调;5.THBS1明显抑制MAECs中e NOS表达和NO生成,以及MRA的内皮依赖性舒张;6.THBS1是高盐环境中e NOS下调的原因;7.TGF-β1活化诱导Smad4入核,导致高盐环境中THBS1表达增多;8.THBS1抑制MAECs中Orai1和Orai2的蛋白表达,以及SOCE的大小,而且Orai1和Orai2的敲低能显着抑制e NOS蛋白表达,NO释放以及SOCE;9.高盐诱导MAECs中Orai1和Orai2表达下调,而对Orai3的蛋白表达无明显影响。结论本研究有效地使用了iTRAQ技术进行蛋白质鉴定和定量,筛选出与血管内皮功能障碍密切相关的蛋白质（比如THBS1）。随后,我们验证了高盐饮食会引起THBS1表达和分泌的升高,并且THBS1的变化与高盐饮食大鼠中内皮依赖性血管舒张功能受损有关。在体外实验,我们进一步证明了THBS1在MAECs对高盐刺激的反应中的重要作用,即通过激活TGF-β1和下游的Smad4入核,高盐上调细胞内THBS1的表达,而THBS1的改变又介导了Orai通道蛋白的表达下调和SOCE减弱,导致eNOS表达和NO生成减少,引起内皮细胞功能障碍。

Marwan SM Al-Nimer^[4]（2021）在《Is COVID-19-induced liver injury different from other RNA viruses?》文中研究表明Coronavirus disease 2019 is a pandemic disease caused by a novel RNA coronavirus, SARS coronavirus 2（SARS-CoV-2）, which is implicated in the respiratory system. SARS-CoV-2 also targets extrapulmonary systems, including the gastrointestinal tract, liver, central nervous system and others. SARS-CoV-2, like other RNA viruses, targets the liver and produces liver injury. This literature review showed that SARS-CoV-2-induced liver injury is different from other RNA viruses by a transient elevation of hepatic enzymes and does not progress to liver fibrosis or other unfavorable events. Moreover, SARS-CoV-2-induced liver injury usually occurs in the presence of risk factors, such as nonalcoholic liver fatty disease. This review highlights the important differences between RNA viruses inducing liver injury taking into consideration the clinical, biochemical, histopathological, postmortem findings and the chronicity of liver injury that ultimately leads to liver fibrosis and hepatocellular carcinoma.

王瑞钰^[5]（2020）在《TXNIP介导高血压血管内皮功能障碍的实验研究》文中提出第一部分高血压诱导血管内皮细胞TXNIP表达上调目的:高血压病程中伴随着明显的“氧化-抗氧化”失衡,氧化应激是导致血管内皮细胞功能障碍的重要原因之一。硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein,TXNIP）是体内重要的促氧化蛋白,在多种病理条件下可以被激活,进而促进组织细胞发生氧化性损伤。本部分主要探讨高血压状态下血管内皮细胞中TXNIP的表达变化及其影响机制。方法:使用“两肾一夹”（two-kidney and one-clip,2K1C）构建高血压大鼠动物模型,将30只雄性SD大鼠随机分为:正常对照组（control）、假手术组（sham）、高血压组（hypertension）,每组10只。使用无创尾动脉血压测量仪定期监测各组大鼠的血压和心率,排除建模不成功的大鼠。4周后收取各组大鼠心脏、主动脉和颈动脉进行苏木精-伊红染色、免疫组化和Western blot检测;同时使用酶联免疫吸附法检测大鼠血浆血管紧张素（angiotensin,Ang）Ⅱ的浓度。体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,外源性使用Ang Ⅱ刺激细胞,模拟高血压状态下的内皮损伤;检测不同浓度和时间Ang Ⅱ处理后HUVEC中TXNIP的表达变化。使用Losartan（AT-1R阻断剂）和Tempol（一种可透膜的抗氧化剂）预处理HUVEC后,分别使用Western blot和细胞免疫荧光检测Ang Ⅱ刺激状态下HUVEC中TXNIP的表达变化。结果:（1）建模后高血压组大鼠的血压逐渐升高,术后4W时,高血压组的收缩压（181±6 vs.120±5 mmHg;P<0.01）和舒张压（156±8 vs.105±3 mmHg;P<0.01）均明显高于假手术组,各组间心率无显着变化。（2）与假手术组相比,高血压大鼠的心脏质量指数（4.38±0.16vs.3.67±0.19;P<0.05）、心肌细胞面积（586±44 vs.353±27μm2;P<0.01）、颈动脉和主动脉中膜厚度（38.28±2.37 vs.23.64±1.68μm;82.04±2.52 vs.54.68±1.43μm;均P<0.05）均显着增加,血浆Ang Ⅱ的浓度也明显升高（556.18±9.14 vs.501.78±7.16 pg/mL,P<0.01）。（3）与假手术组相比,高血压大鼠颈动脉和主动脉血管组织中TXNIP的蛋白表达水平明显升高,免疫组化进一步显示血管内皮细胞中TXNIP的升高最为显着。（4）体外实验发现Ang Ⅱ可以上调HUVEC中TXNIP的蛋白表达,且具有一定的时间依赖性。（5）Losartan和Tempol均可显着抑制Ang Ⅱ诱导的TXNIP表达上调。结论:高血压状态下,血管内皮细胞中TXNIP的表达上调,这一现象可能与Ang Ⅱ诱导的细胞氧化应激有关。第二部分TXNIP对高血压大鼠血管内皮功能的影响目的:血管内皮是血液循环和血管壁之间的屏障,可以分泌多种血管活性物质,对于维持血管张力和血流动力学稳定具有重要意义。高血压可以导致血管内皮功能障碍,但具体的损伤机制目前仍未完全阐明,本部分主要探讨TXNIP对高血压大鼠血管内皮功能的影响。方法:将32只雄性SD大鼠随机分为以下4组（每组8只）:假手术组（sham）、假手术+TXNIP抑制剂组（sham+Resveratrol）、高血压组（hypertension）、高血压+TXNIP抑制剂组（hypertension+Resveratrol）。采用2K1C法构建高血压大鼠模型,建模后第二天予以Resveratrol（2mg/kg/d）或等体积的溶剂灌胃,连续给药4W后收取大鼠颈动脉、胸主动脉和血浆。血管张力测定仪检测大鼠胸主动脉的内皮依赖性舒张功能。Western blot检测大鼠血管组织中TXNIP、e NOS、p-e NOS（ser 1177）以及几种经典的氧化还原反应调节蛋白（NOX2、NOX4、SOD2、NRF2）的表达。通过检测血浆丙二醛（malondialdehyde,MDA）浓度、SOD活性以及主动脉二氢乙啶（dihydroethidium,DHE）染色评估全身及血管组织的氧化应激水平。结果:（1）Resveratrol可以明显抑制大鼠颈动脉和主动脉血管组织中TXNIP的表达。（2）与假手术组相比,高血压大鼠胸主动脉对乙酰胆碱诱导的血管舒张反应明显减退,同时血管组织中e NOS的蛋白表达和p-e NOS（ser 1177）/e NOS比率明显减低（均P<0.05）;抑制TXNIP可以显着改善高血压大鼠血管的舒张功能,同时上调血管组织中e NOS的蛋白表达和功能激活（均P<0.05）。（3）高血压大鼠全身及血管组织出现明显的氧化应激;与高血压大鼠相比,抑制TXNIP后高血压大鼠的血浆MDA浓度明显降低（9.39±1.11 vs.16.61±0.67μM;P<0.05）,SOD活性明显增加（68.65±6.37 vs.48.18±4.61 U/m L;P<0.05）;DHE染色显示抑制TXNIP可以有效减少高血压大鼠主动脉血管组织中ROS生成（P<0.01）;Western blot进一步显示抑制TXNIP可以上调高血压大鼠主动脉血管组织中抗氧化蛋白（SOD2和NRF2）的表达,抑制氧化酶（NOX4和NOX2）的表达。结论:高血压大鼠血管内皮依赖性舒张功能减退,抑制TXNIP可以显着改善高血压大鼠血管内皮功能,抑制全身及血管组织的氧化应激。第三部分TXNIP对人脐静脉内皮细胞功能的调控作用目的:高血压病程中,血液循环中升高的Ang Ⅱ是导致内皮功能障碍的主要病理刺激因素之一,Ang Ⅱ可以通过促进细胞氧化应激和凋亡等方式诱导血管内皮细胞功能损伤。本部分主要探索外源性Ang Ⅱ刺激下,TXNIP对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）功能的调节作用。方法:构建特异性TXNIP小干扰RNA（si RNA）和阴性对照（negative control,NC）RNA,体外转染HUVEC,随后使用Ang Ⅱ（10-6M）处理HUVEC。根据处理方式不同,分为以下5组:Control、Control+TXNIP-si RNA、Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+NC-si RNA和Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA。DCFH荧光染色检测细胞内ROS生成;Annexin V/PI染色、流式细胞仪检测细胞凋亡;DAF-FM荧光染色检测细胞内一氧化氮（nitric oxide,NO）的合成。Western blot检测AKT、p-AKT（ser 473）、e NOS、p-e NOS（ser 1177）以及其他氧化还原反应调节蛋白（NOX2、NOX4、SOD2、NRF2）和凋亡相关蛋白（ASK1、BCL2、BAX、cleaved-Caspase 3、Caspase 9）的表达变化。结果:（1）TXNIP-si RNA可以显着抑制HUVEC中TXNIP在m RNA和蛋白水平的表达（均P<0.01）,NC-si RNA对TXNIP的表达无明显影响（P>0.05）。（2）与Control组相比,Ang Ⅱ处理后HUVEC细胞内ROS生成增多,细胞凋亡率明显升高;同时e NOS的活性下调,细胞内NO的合成明显减少（均P<0.05）。（3）与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,敲减TXNIP可以明显减少Ang Ⅱ刺激下HUVEC中ROS的生成（P<0.01）,同时抑制NOX2和NOX4的蛋白表达,上调SOD2和NRF2的蛋白表达（均P<0.05）。（4）与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组中HUVEC的细胞凋亡率明显降低[（8.75±0.23）%vs.（14.23±1.60）%,P<0.05],ASK1、cleaved-Caspase 3和Caspase 9的蛋白表达也显着降低（均P<0.05）,而BCL2/BAX的比值升高（P<0.05）。（5）Ang Ⅱ刺激状态下,敲减TXNIP可以上调HUVEC中p-AKT（ser473）/AKT和p-e NOS（ser 1177）/e NOS的比值（均P<0.05）,并能部分恢复细胞内受损的NO合成（P<0.05）。结论:TXNIP参与并介导了Ang Ⅱ诱导的血管内皮细胞功能障碍,抑制TXNIP可以通过减轻氧化应激和细胞凋亡改善血管内皮细胞的生理功能。第四部分TXNIP调控血管内皮细胞功能的机制研究目的:TXNIP是体内主要的内源性硫氧还蛋白（thioredoxin,TRX）系统抑制蛋白。然而高血压状态下,TXNIP是否通过影响TRX系统的激活进而导致血管内皮细胞功能障碍目前仍不明确。本部分主要探索TXNIP调控血管内皮细胞功能的内在分子机制。方法:TXNIP-si RNA和NC-si RNA转染HUVEC后外源性使用Ang Ⅱ处理细胞,分组方式与第三部分相同。RT-q PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测各组细胞中TRX的表达;提取HUVEC核蛋白检测细胞核中TRX、AP-1、REF-1的表达;使用硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TRXR）试剂盒检测细胞中TRXR活性变化。随后使用PX-12（一种TRX的抑制剂）预处理HUVEC,根据处理方式不同,分为以下4组:Control组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组、Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA+PX-12组;检测各组细胞内ROS、细胞凋亡率以及e NOS和p-e NOS（ser 1177）的蛋白表达变化。以GV230为载体构建TRX过表达质粒（GV230-TRX）和阴性对照质粒（GV230-NC）,分别转染HUVEC,分别在正常或Ang Ⅱ刺激状态下,检测HUVEC中e NOS和p-e NOS（ser 1177）的蛋白表达及细胞内NO的合成变化。结果:（1）Ang Ⅱ可以代偿性激活HUVEC的TRX系统,与Control组相比,Ang Ⅱ组中TRX的m RNA和蛋白水平均有所升高（均P<0.05）,但TRXR活性无明显变化（P>0.05）。（2）与Ang Ⅱ+NC-si RNA组相比,Ang Ⅱ+TXNIP-si RNA组中TRX的蛋白和m RNA表达水平进一步增加,TRXR的活性显着增强（均P<0.05）。（3）Ang Ⅱ刺激状态下,敲减TXNIP可以促进HUVEC中TRX发生核转位,上调细胞核内转录因子AP-1和REF-1的蛋白表达（均P<0.05）。（4）TXNIP对HUVEC氧化应激、细胞凋亡和e NOS功能激活的调节作用可以被PX-12完全逆转。（5）Ang Ⅱ刺激状态下,过表达TRX可以显着上调HUVEC中p-e NOS（ser 1177）/e NOS的比值,并能促进细胞内NO的合成（均P<0.05）。结论:高血压状态下,TXNIP主要是通过负调控TRX系统的方式介导血管内皮功能障碍;维持TXNIP/TRX系统的稳态可能有助于减轻高血压对血管内皮细胞的损伤。

牛华伟^[6]（2020）在《多功能荧光探针的设计、合成及其生物应用研究》文中认为单一识别荧光探针只能识别一种分析物,无法用于研究多个活性物质之间的关联和协同作用机制。使用两个或多个单一识别的荧光探针进行多功能检测时有明显缺陷,例如:多个荧光探针同时用于监测时存在潜在串扰,由于它们的亚细胞器定位或光漂白速率不同会导致成像情况复杂。多功能荧光探针可以识别多个活性物质,在识别过程中伴随有荧光变化和溶液颜色变化,应用于细胞成像时一般能观察到多个通道的荧光响应。由于上述优点,近些年多功能荧光探针受到人们广泛关注,它们被用于一些结构相似的活性物质的同时识别、不同活性物质间的相互作用的可视化监测以及不同活性物质的作用机制研究。基于此,本论文发展了三个氧化还原响应类型的多功能荧光探针（探针NPCC、探针NPCF和探针NPCl A）和两个非氧化还原响应类型的多功能荧光探针（探针NPHSHNO和探针NPCysHS）,具体内容如下:（1）设计合成了首例用于连续检测Cys、GSH和ClO-的靶向内质网的双光子荧光探针NPCC。光谱性能研究表明,该探针选择性好、灵敏度高、毒性低,可动力学区分Cys和GSH。细胞成像研究表明,探针NPCC可用于细胞内ClO-的双光子成像,可定位到内质网,可用来监测内质网中的还原应激。此外,探针还可以区分癌细胞和正常细胞。该探针可用作研究RSS和ROS之间关系时的一种简单有效的工具。（2）设计合成了一种双位点响应的近红外荧光探针NPCF,该探针可在100%缓冲液中以“裸眼识别”的方式实现对二氧化硫衍生物和pH值的双识别。探针NPCF对HSO3-的检测具有很高的灵敏度（LOD为22.7 nM）和良好的选择性。当探针NPCF溶液的pH从9.21变为4.26时,可观察到610 nm处的荧光增强了885倍。NPCF成功应用于斑马鱼中HSO3-的检测,这表明探针NPCF在生物学中具有潜在应用价值。通过探针NPCF的细胞成像应用研究,我们发现SO2可用于缓解由LPS引起的炎症和酸化环境。在CCCP诱导的细胞损伤和凋亡的不同阶段,细胞内SO2的水平和pH值变化不同。在损伤和凋亡的初始阶段,SO2的量会逐步增加,而pH会逐渐降低;在严重损伤阶段,SO2的量会逐渐减少,而pH逐渐升高。本研究为了解细胞损伤机制提供了一种新思路和简单有效的工具。此外,通过应用NPCF监测细胞内SO2的水平和pH值变化可区分正常细胞和癌细胞,该探针有望成为癌症早期诊断的一种简便和实用的工具。（3）设计合成了一种双位点响应、三通道成像和靶向线粒体的双光子荧光探针NPCl A。该探针可以同时检测HSO3-和ClO-,并且具有“裸眼识别”、选择性好和灵敏度高的优点。运用该探针监测细胞内HSO3-和ClO-的水平可区分正常细胞和癌细胞,这表明探针NPClA在癌症的早期诊断方面具有潜在的应用价值。过量HSO3-和LPS诱导的线粒体应激实验表明,线粒体中SO2和ClO-处于动态平衡。此外,我们还进行了过量ClO-诱导的氧化应激的原位细胞成像实验,结果表明细胞应激产生了内源性的SO2,即应激产生抗氧化。该探针进一步解释了线粒体中SO2的氧化/抗氧化双重作用。该探针为监测线粒体应激过程中ROS/RSS的平衡和了解线粒体中SO2的氧化/抗氧化双重作用提供一种有用的检测工具。（4）设计合成了首例同时识别HS-和HNO的多功能荧光探针NPHSHNO,该探针由一个荧光团和两个识别位点组成,在识别过程中发生了PET机理和ICT机理。探针用于检测时伴随有明显的溶液颜色变化和荧光强度变化,探针对HS-和HNO的识别选择性好,检测限分别为1.02μM和0.67μM。探针的两个识别位点分别识别HS-和HNO,可以作为分子逻辑门的两个输入信号,只有同时存在HS-和HNO时,即发生“AND”型逻辑门信号释放,探针荧光才完全释放。探针NPHSHNO成功应用于细胞内H2S和HNO的检测。（5）设计合成了一种同时识别Cys和HS-的多功能荧光探针NPCysHS,该探针由一个荧光团和两个识别位点组成,“NBD-N-”作为特异性识别HS-的识别位点,可以在红色通道区分Cys和HS-,“NBD-O-”的引入,使得探针NPCysHS可以在绿色通道区分Cys和HS-。探针在识别过程中发生了PET机理和ICT机理,并且在用于检测时伴随有明显的溶液颜色变化和荧光强度变化。探针对Cys和HS-的识别选择性好,检测限分别为0.15μM和37.7 nM。探针NPCysHS成功应用于细胞内Cys和HS-的检测。

文艺^[7]（2020）在《腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究》文中认为研究背景和目的急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是由胰腺腺泡细胞内胰酶异常激活而导致胰腺实质自我消化引起的局部炎症反应,约20%轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis,MAP）可演变为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）。不同于具有自限性的MAP,SAP是以胰腺组织广泛的炎症反应和坏死为主要特征,具有复杂化和重症化的倾向,短时间内可由局部炎症迅速进展至全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）,常可造成心、肺、肾和肠道等损伤进而引发多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF）,病死率高达15-30%。其中,SAP相关的心肌损伤（SAP-associated cardiac injury,SACI）,又称为“胰心综合征”,是SAP重症化进程中最严重的并发症之一,可表现为心功能异常改变、中毒性心肌炎甚至心力衰竭。目前针对SACI预防和治疗尚无有效的手段,因此积极探索其发生机制以及寻找可靠的防治措施已成为亟待解决的临床问题。业已证实,在SAP病程中,机体炎症反应导致的氧化应激与SACI的发生、发展有着密切的关系。在SAP早期,胰腺腺泡细胞和激活的炎性细胞会释放大量心肌抑制因子（对心肌有毒性作用的一类细胞因子和炎症介质）,这些心肌抑制因子会促使心肌细胞释放大量氧自由基,当超过机体对自由基的清除能力时,细胞内的生物大分子（如脂质、蛋白质、DNA等）会迅速被氧化,造成心肌细胞结构和功能的损伤,进而导致心室重构及心功能异常。有学者发现,膜渗透性氧自由基清除剂（tempol）能有效减轻AP大鼠心肌损伤,进一步证实了SACI与氧化应激之间的关系。综上可见,若能减轻SAP机体全身炎症反应及其伴随的氧化应激程度有望成为治疗SACI的有效手段。在SAP早期,机体全身炎症反应可导致腹腔内积聚程度不等的胰腺炎相关性腹水（pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF）,针对PAAF,我中心前期做了大量的临床及基础研究,证实了通过腹腔穿刺引流（abdominal paracentesis drainage,APD）将PAAF及时引流至体外是SAP治疗过程中一个重要的环节。通过APD将富含多种炎症介质和有毒物质的PAAF及时清除,能够有效减轻机体炎症和氧化应激反应程度,延迟或避免出现多器官功能衰竭,发挥对重要脏器的保护作用。此外,动物实验也证实APD能显着减轻SAP相关的肺和肠粘膜损伤。基于此,我们推测SAP早期实施APD有望对SACI起到明显的治疗作用。研究表明,氧化应激与氧化激酶功能的异常密切相关。据报道,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶的过度激活不但是机体氧化应激水平升高的重要机制,同时也是病理状态下心血管系统活性氧（reactive oxide species,ROS）产生的主要来源,与心血管疾病的发生、发展密切相关。鉴于SACI与氧化应激之间的密切联系以及多种炎症介质对NADPH氧化酶均有激活作用这一事实,NADPH氧化酶的活化有可能也参与了SAP引起的心肌氧化损伤。因此,我们推测APD有可能通过减轻NADPH氧化酶的活化,减少氧自由基产生进而对心肌组织起到保护作用。如果此推测成立,那么APD又是通过何种途径来减轻NADPH氧化酶激活造成的心肌氧化损伤呢?澄清这些问题将为APD治疗SAP的机制提供新的理论依据。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）是一种高度保守的核蛋白,生理状态下主要与核内染色体结合。研究发现,在急性胰腺炎时HMGB1可通过坏死胰腺组织的被动释放以及浸润的单核/巨噬细胞主动分泌到细胞外,因此PAAF中常含有高浓度的HMGB1。而胞外HMGB1作为一种重要的损伤相关分子模式可直接参与胰腺炎炎症级联放大反应及重症化,在胰腺及远位器官损伤中发挥着重要的作用。业已证实,HMGB1能通过作用损伤相关分子模式受体激活NADPH氧化酶,引起细胞内ROS含量增加。而PAAF中高浓度的HMGB1,在被腹膜重吸收后会造成循环中HMGB1浓度的二次升高,进一步激活心肌组织NADPH氧化酶。因此,早期实施APD引流PAAF,是否可以通过减少HMGB1的重吸收降低其循环中的浓度,减轻HMGB1所介导的心肌组织NADPH氧化酶的活化进而发挥心脏保护作用呢?尚需进一步研究。针对以上问题,我们首先采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备SAP大鼠心肌损伤模型,并对SAP大鼠实施APD,旨在进行下列研究:1、APD对SACI是否有保护作用;2、NADPH氧化酶激活在SACI中的作用及相关分子机制;3、APD是否能够调控心肌组织NADPH氧化酶表达,减轻氧化应激损伤。此外,在成功建立轻型胰腺炎大鼠模型的基础上,分别将SAP大鼠的PAAF以及中和了HMGB1的PAAF注入轻型胰腺炎大鼠的腹腔内,旨在进一步验证PAAF中HMGB1在SAP病程中的作用,以及APD治疗SACI的相关机制。实验目的、方法与结果第一部分:APD对SAP相关心肌损伤（SACI）的保护作用研究目的:观察APD对SAP大鼠治疗效果及对心肌损伤的保护作用研究方法1.APD对SAP大鼠死亡率的影响采用SD雄性大鼠75只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组25只。通过细针穿刺胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型。在SAP造模成功后,于右下腹置入外接负压引流球的橡胶引流管,腹腔内留置约0.5厘米并于腹壁固定,常规消毒后关腹建立APD模型。假手术组大鼠开腹后翻动胰腺组织数次,并于腹腔内留置一根0.5厘米长橡胶引流管后关腹。术后24小时记录各组大鼠死亡率,收集腹水计量并统计。2.APD对SACI的保护作用采用SD大鼠45只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组15只,造模方法同前。造模后8小时检测心电图,24小时检测心脏超声和动脉血压,完成后处死大鼠,搜集腹水、血清、心脏组织,检测:HE染色观察心肌组织病理改变并做病理评分,计算心肌组织干湿重比,Elisa法检测血清心肌酶谱、TNF-α和IL-1β浓度,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:1.造模后24小时,SAP组大鼠死亡率为40.0%,平均腹水量为9.5±1.7ml;SAP+APD组大鼠死亡率为16.0%,平均腹水量为6.5±1.4ml,显着低于SAP组。2.SAP组大鼠心电图出现明显异常,而APD组大鼠心电图偶见异常。此外,与Sham组相比,SAP大鼠心功能明显受损,动脉血压也明显降低。而SAP+APD组与SAP组相比,大鼠心功能的受损情况有明显改善。3.与Sham组相比,SAP组大鼠血清心肌酶谱、淀粉酶活性、TNF-α和IL-1β浓度显着升高;SAP+APD组大鼠上述指标较SAP组明显降低。心肌组织病理学观察及评分:与Sham组相比,SAP组大鼠可见心肌细胞浊肿,伴部分溶解变性,局部区域可见单核细胞浸润,符合早期心肌炎改变,且病理评分和干湿重比值明显增高。SAP+APD组大鼠心肌组织病理改变较SAP组明显减轻,病理评分和干湿比值明显降低。4.SAP组大鼠心肌组织出现明显的细胞凋亡,Bax和Cleaved-caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。而SAP+APD组大鼠心肌组织细胞凋亡明显减少,促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的失衡明显改善。结论:通过牛磺胆酸钠逆行注射胰胆管的方法能较好的制备SAP大鼠心肌损伤模型。其次,通过实施APD能明显降低SAP大鼠死亡率,减轻心肌组织的病理损伤,改善心脏功能的异常。第二部分:NADPH氧化酶在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确NADPH氧化酶在SACI中的作用,证实APD通过调控NADPH氧化酶表达减轻心肌氧化损伤。1.NADPH氧化酶在SACI中的作用研究研究方法（1）体内实验,采用SD雄性大鼠60只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎夹竹桃麻素（apocynin）组（SAP-APO group）和apocynin对照组（APO-CON group）,每组15只。SAP-APO组和APO-CON组在造模前30分钟通过大鼠尾静脉注射用10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）溶解的apocynin（20 mg/kg）,而Sham组和SAP组大鼠注射相同体积的DMSO,其余造模方法同前。造模后24小时检测心脏超声,完成后处死大鼠,搜集血清、胰腺和心脏组织,检测:免疫组化和western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,比色法检测氧化应激相关指标,DHE染色检测心肌组织ROS含量,HE染色观察心肌组织和胰腺组织病理变化并做病理评分,Elisa法检测血清心肌酶谱、血清炎症因子和淀粉酶活性,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白表达和MAPK信号通路（ERK1/2、JNK、p38）的蛋白表达和磷酸化水平。（2）体外模拟实验,首先用含5%和10%正常大鼠血清或SAP大鼠血清的培养基培养H9C2心肌细胞,采用CCK-8法于干预后3、6、12、24小时检测细胞活力,确定血清的最佳干预浓度和干预时间。接着,将H9C2心肌细胞分为正常大鼠血清组（normal rat serum group,NS）、SAP大鼠血清组（SAP rat serum group,SS）、SAP大鼠血清加apocynin组（SAP rat serum plus apocynin group,SA）和正常大鼠血清加apocynin组（normal rat serum plus apocynin group,NA）。检测:DHE染色检测心肌细胞ROS含量,流式细胞技术检测心肌细胞凋亡,western blot法检测心肌细胞ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平。2.APD对SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶表达的影响采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集心脏组织,检测:western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,DHE染色心肌组织检测ROS含量,比色法检测氧化应激相关指标。结果:1.首先与Sham组相比,SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶蛋白表达和活性均明显增高。与SAP组比较,SAP-APO组大鼠心功能异常明显减轻,血清心肌酶谱浓度、心肌组织病理评分、ROS含量和氧化应激相关指标水平均明显降低,心肌细胞凋亡也明显减少。同时SAP-APO组大鼠与SAP组相比,心肌组织促凋亡蛋白表达明显减少,抗凋亡蛋白表达明显增加,MAPK信号通路ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显降低。而SAP-APO组大鼠胰腺组织病理评分与SAP组相比无显着差异,但血清炎症因子水平有一定程度降低。另外,Sham组与APO-CON组之间无统计学差异。2.在体外模拟实验中,确定用含10%SAP大鼠血清的培养基培养12小时为最佳干预条件。与NS组相比,SS组心肌细胞ROS含量明显升高,细胞凋亡比例明显增加,ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显升高。SA组与SS组相比,上述指标均有不同程度降低。SS组与NA组之间无显着差异。3.SAP+APD组大鼠心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达和活性较SAP组明显降低,ROS含量明显减少,氧化应激相关指标的水平也明显降低。结论:上述实验结果表明NADPH氧化酶过度激活在SACI中发挥着重要作用,早期实施APD能抑制SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶的异常激活,减轻心肌组织的氧化损伤。第三部分:HMGB1在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确APD通过调控HMGB1降低心肌组织NADPH氧化酶的表达研究方法1.采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组（Sham group）、重症急性胰腺炎组（SAP group）、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组（SAP+APD group）,每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集血清、腹水和胰腺组织,检测:Elisa法检测血清胰酶活性以及血清和腹水中HMGB1浓度,HE染色观察胰腺组织病理变化并做病理评分。2.采用SD雄性大鼠36只,通过腹腔连续注射雨蛙素的方法建立轻型胰腺炎大鼠模型,随机分为6组（每组6只）:（1）轻型胰腺炎对照组（control group,CN）;（2）PAAF注射组（PAAF injection group,PI）;（3）PAAF+抗HMGB1中和抗体50ug组（PAAF plus anti-HMGB1 neutralizing antibody 50μg injection group,PIH 50）;（4）PAAF+中和抗体100ug组（PIH 100 group）;（5）PAAF+中和抗体200ug组（PIH 200 group）;（6）PAAF+对照lgY蛋白200ug组（PAAF plus control lgY injection group,PIC）。注射后8小时搜集血清和心脏组织,检测:Elisa法检测血清HMGB1浓度,RT-PCR法检测心肌组织NADPH氧化酶mRNA水平,western blot法检测其蛋白表达。结果:1.与SAP组相比,APD治疗能显着减轻胰腺组织损伤,减少炎性细胞浸润,降低血清胰酶活性和HMGB1浓度。另外,在SAP组大鼠腹水中检测出高浓度HMGB1。2.通过对MAP大鼠腹腔注射PAAF后发现PI组血清HMGB1水平较CN组明显升高,伴Nox-2的m RNA和蛋白表达增高,Nox-4的mRNA表达增高。随着抗HMGB1中和抗体剂量逐渐增加,当中和抗体剂量达到200ug时大鼠血清HMGB1浓度明显降低,Nox-2的mRNA和蛋白表达以及Nox-4的m RNA表达也明显减少。另外,PIC组与PI组之间无明显差异。结论:早期实施APD能显着改善SAP大鼠胰腺的病理损伤,有效减少HMGB1的释放以及重吸收进入血液循环,从而抑制HMGB1介导的心肌组织NADPH氧化酶的表达。全文总结1.在SAP病程中,早期实施APD对SACI具有显着的保护作用。具体表现在降低机体血清心肌酶谱浓度,减轻心肌组织损伤程度,减少心肌细胞凋亡的发生,改善心功能的异常。2.NAPDH氧化酶的过度激活导致心肌组织产生过量ROS是SACI发生的重要机制。大量ROS的产生和堆积会引起心肌细胞凋亡以及MAPK信号通路的激活,造成心功能损害,而抑制NADPH氧化酶的活性能显着减轻SAP导致的心肌损伤程度。3.SAP时,PAAF中高浓度的HMGB1可以通过腹膜重吸收等途径进入机体的血液循环,上调心肌组织NADPH氧化酶的表达。在SAP早期实施APD,通过减少HMGB1释放以及重吸收降低其在循环中的浓度,进而可有效抑制HMGB1介导的NADPH氧化酶信号通路的激活,减轻心肌的氧化损伤,发挥对心肌保护作用（图1）。

张庆海^[8]（2019）在《去乙酰化酶SIRT3在造影剂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究》文中提出研究背景:随着含碘造影剂在临床诊疗过程中使用的普遍化,造影剂急性肾损伤（CIAKI,contrast-induced acute kidney injury）已成为最常见的医院获得性肾损伤之一。CIAKI是含碘造影剂在使用过程中的常见并发症,严重者可导致急性肾衰竭,病死率高,预后差。目前临床上对于CIAKI缺乏有效的诊断手段及治疗方法。CIAKI发病机制复杂,尚未完全阐明,目前多数观点集中在含碘造影剂对肾小管上皮细胞的直接损伤及肾脏髓质缺血缺氧等方面。活性氧自由基（ROS,reactive oxygen species）在CIAKI发生过程中占据重要地位,其在发病机制中的作用越来越受到重视,但ROS在该疾病过程中具体机制尚未完全阐明;含碘造影剂可通过激活一系列离子通道导致肾小管上皮细胞的直接损伤,诱发多种凋亡途径的激活进而导致肾小管上皮细胞出现凋亡。相关实验研究发现:CIAKI小鼠肾脏组织匀浆检测氧化应激相关的指标:丙二醛、黄嘌呤氧化酶活性显着升高;与此相反,抗氧化指标:超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性及数量都明显下降。目前的大量研究已经证实造影剂可通过多种途径产生大量ROS,从而导致病变组织内部氧自由基蓄积,造成局部组织的损伤。凋亡是极度保守的过程,该过程需要机体内部多种基因与生物酶的严密调控。Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2与Bax是一对具有相反功能的蛋白质,前者具有促进细胞凋亡的作用,后者抑制细胞凋亡的进程。Caspase3是整个凋亡过程中的关键酶,它对其底物进行有限不可逆地降解,细胞凋亡的过程就是该降解过程的级联放大反应,而Bcl-2对Caspases3的调控则是通过减少细胞色素C的释放来实现的。SIRT3是生物体内一种重要的去乙酰化酶,SIRT3的去乙酰化作用在提高线粒体抗氧化应激、减轻细胞凋亡与新陈代谢等重要生物学过程中发挥重要作用。目前的多项研究已经证实,SIRT3在诸多的生物过程中作为一个关键的调节因子而存在,它常常在蛋白质合成后的修饰阶段,通过调节各种底物的去乙酰化状态而在多种疾病中发挥作用。相关的诸多实验研究已经表明,沉默调节蛋白SIRT3参与了众多的细胞生物学过程,譬如生物体各种基因的转录过程、新陈代谢以及细胞电子信号链传递等重要的细胞活动。去乙酰化酶SIRT3可以在蛋白翻译后的修饰过程中,通过调节底物的去乙酰化状态而对多种疾病过程起到调节作用。肾脏是高能量代谢的器官,肾脏细胞尤其是肾小管上皮细胞内存有数量庞大的线粒体,以满足这高能量代谢需求;线粒体广泛参与能量代谢、脂肪酸氧化、大分子生物合成、氨基酸分解、电子传递与氧化磷酸化等生物学过程,而线粒体在参与这些过程的同时,也造成了严重的氧自由基的蓄积。去乙酰化酶SIRT3定位于线粒体当中,是NAD+依赖的去乙酰化蛋白,是线粒体调节上述生物学过程的关键酶,这些过程中许多酶活性的调节,都是通过其去乙酰化的修饰来完成的。烟酰胺核糖Nicotinamide riboside（NR）,是由核糖和烟酰胺两种物质组成的化合物,哺乳动物的乳汁、酵母菌以及常见的各种细菌中都有NR的存在。NR转运至细胞内后,由其激酶分解为单核苷酸,单核苷酸在其腺昔酰基转移酶降解为NAD+,提高了组织中NAD+水平,而发挥其在机体内的多种生物学活性。NAD+是SIRT3催化去乙酰化反应的重要辅助因子,NAD+水平高低直接对SIRT3的去乙酰化活性起到重要的限制作用。虽然在诸多疾病的病理进程中去乙酰化酶SIRT3发挥着不可或缺的作用,但是SIRT3在造影剂诱发的急性肾损伤中的作用以及其相关的作用机制仍不清楚。为此,本研究拟利用SIRT3-KO小鼠建立CIAKI小鼠模型后,初步探讨SIRT3在该病理过程中的作用及相关机制,为临床预防治疗CIAKI带来新的思路,为设计以SIRT3为作用靶点的新型药物提供理论支持及实验依据。研究目的:1.探讨SIRT3在造影剂急性肾损伤小鼠模型中表达的变化;2.探讨SIRT3对造影剂急性肾损伤小鼠模型氧化应激的影响;3.探讨SIRT3对造影剂急性肾损伤小鼠模型凋亡的影响。研究方法:1.实验动物及分组:129野生型小鼠（雄性,8周龄）购自北京大学实验动物研究所。SIRT3基因敲除小鼠（SIRT3-KO）购自美国Jackson实验室,其基因背景是129S6/SvEvTac。全部实验过程严格按照中华人民共和国卫生部实验动物管理规章制度（documentation No 55,2001）实施,并取得山大附属齐鲁医院伦理委员会对该动物实验研究的批准。体内实验的第一部分:随机选择129野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠各16只,两种小鼠均随机各分为对照组、CIAKI模型组,每组8只小鼠（n=8）。体内实验的第二部分:随机选择129野生型小鼠（8周龄）和SIRT3-KO小鼠（8周龄）各16只,构建CIAKI动物模型。为评估SIRT3激活剂Nicotinamide riboside（NR）在CIAKI中的作用,在构建CIAKI模型的基础上按照是否加入NR干预分为4组,WT+碘佛醇+Saline组,SIRT3-KO+碘佛醇+Saline 组,WT+碘佛醇+NR 组,SIRT3-KO+碘佛醇+NR 组。2.构建CIAKI动物模型:小鼠尾静脉注射吲哚美辛（10ug/g）;15分钟后注射Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME,10ug/g）;15分钟后按2mg Iodine/g剂量尾静脉注射碘佛醇（Ioversol,350mg Iodine/ml）。对照组尾静脉注射等体积生理盐水。于造模后24小时处死小鼠,小鼠心脏内取血进行肾功能生化指标检测,摘取小鼠双肾,对其肾脏皮质进行后续研究,造模24小时期间留取小鼠尿液。3.加入NR干预治疗:NR干预组小鼠,给予NR（1mg/g）尾静脉注射每日两次,对照组尾静脉注射等体积生理盐水,连续尾静脉注射5天后,小鼠安乐死,心脏内取血,进行肾功能生化指标检测,摘取小鼠双肾,对其肾脏皮质进行后续研究,造模5天期间留取小鼠尿液。4.组织染色:取材之后,肾脏组织石蜡包埋,切片后进行常规苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）,光镜下观察肾脏皮质组织损伤改变;免疫组化法检测氧化应激及凋亡相关蛋白的表达,应用图片分析软件（Image Pro Plus 6.0）进行统计分析。5.肾功能检测:将留存的小鼠尿液与血液离心,取上清,用ELISA法检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿肌酐以及尿蛋白等肾功能生化指标。6.蛋白质免疫印迹分析（Western-blot）:小鼠肾皮质组织充分研磨,裂解液裂解后离心,取上清,提取总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度,电泳之后,用湿膜转膜法将蛋白转移至PVDF膜上,浓度为5%的脱脂奶粉封闭2小时,分别孵育特异性一抗,4℃摇床过夜。次日二抗室温孵育1小时,利用AI600化学发光仪显影。7.细胞内超氧化物阴离子水平检测:Dihydroethidium（DHE）溶解于DMSO,配制成适当的母液。用含有2umol/l的DHE适量溶液与组织切片一起在37℃孵育30分钟,装载荧光探针,予以适当洗涤,荧光显微镜下镜检并统计分析。8.抗氧化应激酶活性检测:（1）先配制250mmol/l、5mmol/l H202溶液,再配制显色工作液。冰浴中溶解显色底物,适量分装后使用,按说明书做好样品准备,使用前用Catalase酶检测缓冲液稀释400倍后进行后续测定。先测定标准曲线后,再计算样品中Catalase酶活力。（2）做好样品准备,配制WST-8/酶工作液、反应启动工作液,37℃孵育30分钟,测A450值,计算总MnSOD活力。9.TUNEL染色:肾脏组织固定、包埋、切片、脱蜡至水,滴加20 μg/ml的蛋白酶K,作用30分钟,在样品上加50 μl TUNEL检测液,避光孵育60分钟,封片后荧光显微镜下镜检并统计分析。10.统计学处理:实验中全部计量资料均采用X±S表示,每组实验数据至少重复3次,应用GraphPad Prism 6软件分析所有实验数据。两组均数比较采用独立样本的t检验;单因素方差分析法（One way-ANOVA）分析多组间差异,P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.在CIAKI小鼠模型的肾脏皮质中SIRT3的表达水平升高蛋白质免疫印迹分析结果显示:与空白对照组小鼠相比较,CIAKI小鼠肾脏皮质中SIRT3表达升高。该结果提示,SIRT3可能在CIAKI过程中发挥潜在作用。2.内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠肾脏皮质病理学损伤组织染色显示两种小鼠（野生型和SIRT3-KO型）CIAKI模型组均发生了典型的肾脏病理学损伤,包括肾间质水肿、大片肾小管上皮细胞胞浆空泡样变、小管上皮细胞刷状缘脱落、蛋白管型的形成,而这种病理学损伤在SIRT3-KO小鼠模型组表现更为严重。上述结果提示:内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠肾脏皮质的病理学损伤。当应用SIRT3激活剂NR进行干预后,野生小鼠模型组肾脏皮质病理学改变明显减轻,而SIRT3-KO小鼠模型组变化不大,这些表现提示:通过激活剂上调SIRT3,能够减轻造影剂引起的小鼠急性肾损伤组织病理学改变。3.内源性SIRT3缺失加重小鼠CIAKI,NR干预可改善野生小鼠造影剂急性肾功能减低体内实验的第一部分:肾脏功能检测指标对比后发现:两种小鼠CIAKI模型组均出现明显的肾功能损伤;而SIRT3-KO小鼠肾功能损伤更加严重。上述结果提示:内源性SIRT3缺失加重了小鼠的CIAKI。体内实验的第二部分:肾脏功能检测指标对比后发现:（1）分别与其空白对照组相比,野生小鼠模型在加入NR刺激后,血清肌酐和尿素氮水平明显下降,而这种下降趋势在SIRT3-KO小鼠模型组没有出现;（2）在两组NR干预的小鼠中,野生型Cr、BUN水平明显低于SIRT3-KO小鼠。该结果提示通过激动剂上调SIRT3,在CIAKI病理过程中发挥了保护作用。4.内源性SIRT3缺失提高CIAKI小鼠肾脏皮质氧化应激水平用Dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测,肾脏皮质内超氧化物阴离子水平较高时,产生的ethidium较多,结果显示SIRT3-KO小鼠模型组切片红色荧光明显强于129野生小鼠模型组。这些表现提示:内源性SIRT3缺失提高了 CIAKI小鼠肾脏皮质氧化应激水平。5.SIRT3调节CIAKI过程中氧化应激相关蛋白的表达免疫组织化学染色结果显示:与野生小鼠模型组相比较,SIRT3-KO小鼠模型组Nox4表达水平显着升高,表明SIRT3基因敲除后体内氧化应激相关蛋白表达增高,提示体内的高ROS水平。同样的实验结果在Western blot法检测中也得到了证实。正常小鼠模型组用来标志SIRT3活性的Acetyl-MnSOD k68表达水平显着下降,表明SIRT3的活性是上升的,而Acetyl-MnSOD k68乙酰化水平在SIRT3-KO小鼠模型组未见明显变化。野生小鼠模型组在加入NR刺激后,通过激活剂上调SIRT3,Acetyl-MnSOD k68表达水平显着下降,而这种蛋白乙酰化水平下降趋势在SIRT3-KO小鼠模型组当中没有出现。上述结果提示:SIRT3调节小鼠CIAKI氧化应激相关蛋白的表达。6.内源性SIRT3缺失减低CIAKI过程中抗氧化应激酶活性两种小鼠（野生型和SIRT3-KO型）分别与其对照组相比较,造影剂的干预显着抑制了抗氧化应激酶Catalase与MnSOD的活性,SIRT3敲除进一步减低了抗氧化应激酶活性;当应用SIRT3激活剂Nicotinamide riboside进行干预时,野生小鼠模型组在加入NR刺激后,Catalase与MnSOD活性显着增强,而这种增强趋势在SIRT3-KO小鼠模型组当中没有出现。上述结果提示:内源性SIRT3缺失减低了抗氧化应激酶活性,导致其氧自由基清除能力下降;而SIRT3激活剂NR能使野生小鼠SIRT3上调,显着减轻了造影剂对抗氧化应激酶Catalase与MnSOD活性的抑制。7.内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠的细胞凋亡TUNEL染色结果显示,两种小鼠模型组分别与其对照组相比较,均出现了明显的细胞凋亡;而两组模型组之间比较,SIRT3-KO小鼠模型组细胞凋亡更加严重。这些表现提示:内源性SIRT3缺失加重CIAKI小鼠的细胞凋亡。8.SIRT3调节CIAKI过程中凋亡相关蛋白的表达免疫组织化学染色结果显示:与129野生小鼠模型组相比较,SIRT3-KO小鼠模型组促凋亡分子Bax表达明显上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降,同时凋亡过程中关键酶Caspase3的表达上调。在蛋白质免疫印迹分析结果同样显示,SIRT3-KO小鼠模型组促凋亡分子Bax表达上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降以及凋亡关键酶Caspase3表达的上调。上述结果表明:SIRT3调控CIAKI过程中凋亡相关蛋白的表达。结论:1.SIRT3在造影剂急性肾损伤小鼠模型中表达升高;2.内源性SIRT3缺失加重小鼠造影剂急性肾损伤;3.SIRT3可能通过调节氧化应激和凋亡调控造影剂急性肾损伤。研究背景:伴随各大医疗机构增强CT检查及动脉介入治疗等诊疗手段的迅猛发展,CIAKI已经发展成为院内获得性肾损伤主要病因之一。CIAKI发生后,不但延长患者的住院时间,提高了诊疗费用,而且显着增加了患者的病死率。截至目前,造影剂急性肾损伤发病机制仍未完全阐明,目前预防措施中除水化疗法之外,尚无有效的措施来预防和治疗CIAKI的发生。因此,造影剂急性肾损伤已经成为放射、心血管以及肾脏病领域相关专家共同关注的问题。CIAKI发病机制目前尚未完全阐明,多数观点认为其主要的发病机制包括活性氧自由基（ROS）、造影剂对肾小管上皮细胞的直接毒性以及肾缺血缺氧等。研究显示,造影剂能够抑制抗氧化应激酶的活性,直接导致氧自由基的大量产生,加重肾脏组织中氧自由基的蓄积,氧自由基的大量增加直接对肾小管上皮细胞产生毒性损害而导致肾脏损伤。实验研究已经表明,氧化应激可以通过影响线粒体通透性,诱导肾小管上皮细胞凋亡,这也强烈提示了氧化应激与凋亡之间的密切关系。凋亡作为组织细胞的一种基本生物学现象,是一个主动过程,它涉及到一系列基因的激活、表达以及调控,它是机体为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡进程。凋亡关键酶Caspase3是整个凋亡过程中的关键酶,对其底物产生有限不可逆地降解,细胞凋亡的过程就是该过程的级联放大反应。Bax是一种促进细胞凋亡的蛋白质,当其与Ku70稳定结合状态被打破时,能够激活凋亡关键酶Caspase3促进凋亡的发生。Bcl-2是一种重要的细胞凋亡负性调节因子,通过减少细胞色素C的释放,对凋亡关键酶Caspases3起到调控作用,进而产生抑制细胞凋亡的作用。NAD+依赖的SIRT3作为Sirtuins家族中目前实验研究最多的去乙酰化酶,在线粒体能量代谢以及线粒体功能中发挥着极其重要的作用。大量实验研究已经证实,SIRT3通过其去乙酰化活性,调节了许多线粒体活动,包括信息传递、抑制基因组变异、能量生成和细胞分化等,在线粒体的活动中扮演了重要的角色。SIRT3能去乙酰化Fox03 α导致抗氧化应激相关酶,如锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶表达的上调。已有研究证实,SIRT3可以保护应激状态心肌细胞,这种作用同样在顺铂导致的心肌损伤动物模型中被确认。在CIAKI发病机制中肾小管上皮细胞氧化应激以及凋亡占主导地位,而去乙酰化酶SIRT3能够影响线粒体氧化应激过程,进而影响细胞内众多的生物学进程。所以本课题通过探究去乙酰化酶SIRT3对造影剂急性损伤过程中HK-2（肾小管上皮细胞）氧化应激及凋亡中的作用,初步探讨SIRT3在该损伤过程HK-2中的作用及相关机制,为临床预防治疗CIAKI带来新的思路,为设计以SIRT3为作用靶点的新型药物提供理论支持及实验依据。研究目的:1.探讨SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达的变化;2.探讨SIRT3对造影剂介导的HK-2细胞氧化应激过程的影响;3.探讨SIRT3对造影剂介导的HK-2细胞凋亡的影响。研究方法:1.细胞培养、处理及分组:将复苏后的人肾小管上皮细胞株（HK-2）接种于低糖型DMEM培养基中,置于37℃C、5%C02细胞孵育箱常规培养,饥饿细胞12小时使细胞同步化,SIRT3小干扰RNA转染后,将细胞分为HK-2和SIRT3-siRNA HK-2细胞,按照是否加入碘佛醇分为:HK-2+Vehicle组、HK-2 siRNA+Vehicle组、HK-2+Ioversol组和HK-2 siRNA+Ioversol四组,其中干预组分别加入碘佛醇刺激30分钟换液后在细胞孵育箱继续孵育24小时。2.蛋白质免疫印迹分析（Western-blot）:HK-2细胞进行充分研磨,用裂解液裂解HK-2细胞后离心,取上清液,提取总蛋白,BCA法测定蛋白质的浓度,电泳之后,用湿膜转膜法将蛋白转移至PVDF膜上,浓度为5%的脱脂奶粉封闭2小时,分别孵育特异性一抗,4摄氏度摇床过夜。次日二抗室温孵育1小时,利用AI600化学发光仪显影。3.抗氧化应激酶活性检测:（1）先配制250mmol/l、5mmol/l H2O2溶液,再配制显色工作液。冰浴溶解显色底物,适当分装后使用,按说明书做好样品的准备,使用前用Catalase酶检测缓冲液稀释400倍后进行后续测定。先测定标准曲线后,再计算样品中Catalase酶活力。（2）按说明书做好样品的准备,配制WST-8/酶工作液、反应启动工作液,37℃孵育30分钟,测A450值,计算总MnSOD活力。4.DCFH-DA法测定HK-2细胞中ROS水平:按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA,去除细胞培养基,加入含终浓度为10umol/lDCFH-DA的无血清培养基1mL,37℃、5%CO2细胞孵育箱中培养20分钟。用无血清培养基洗涤细胞3次,用100mgI/ml的碘佛醇刺激30分钟后,弃去原培养基,用PBS清洗3遍后,放置于激光共聚焦显微镜下观察ROS的荧光强度并拍照统计分析。5.统计学处理:实验中全部计量资料均采用X±S表示,每组实验数据至少重复3次,应用GraphPad Prism 6软件分析所有实验数据。两组均数比较采用独立样本的t检验;单因素方差分析法（One way-ANOVA）分析多组间差异,P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达水平升高Western blot结果显示,与空白对照组相比较,HK-2细胞干预组的SIRT3表达水平明显升高。本实验结果提示:SIRT3可能在造影剂介导的HK-2细胞损伤中发挥潜在作用。2.SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞氧化应激相关蛋白的表达Westem blot结果显示,使用SiRNA转染抑制SIRT3表达后,造影剂干预导致HK-2细胞Nox4表达水平较对照组显着升高,导致细胞内ROS水平升高;在正常细胞干预组中,用来标志SIRT3活性Acetyl-MnSOD k68表达水平显着下降,SIRT3的活性是上升的,而这种蛋白乙酰化水平下降趋势在SIRT3抑制组没有出现。上述结果提示:SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞氧化应激相关蛋白的表达。3.SIRT3调控造影剂介导的HK-2细胞凋亡相关蛋白的表达蛋白质免疫印迹分析结果显示,SIRT3表达被抑制后,表现为促凋亡分子Bax表达上调和抗凋亡分子Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax比值下降以及关键酶Caspase3表达的上调。上述结果提示:SIRT3调控造影剂介导的HK-2细胞凋亡过程中相关蛋白表达。4.SIRT3低表达减低造影剂介导的HK-2细胞损伤中抗氧化应激酶活性与空白对照组相比较,造影剂的干预显着抑制了抗氧化应激酶Catalase与MnSOD的活性,在造影剂介导的HK-2细胞损伤中,SIRT3的表达下降进一步减低了抗氧化应激酶活性。上述结果提示:SIRT3低表达减低抗氧化应激酶活性,导致HK-2细胞氧自由基清除能力下降。5.SIRT3低表达提高造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平DCFH-DA法测定HK-2细胞中ROS水平,在造影剂介导的HK-2细胞损伤过程中,SIRT3低表达HK-2细胞的ROS水平显着高于正常HK-2细胞组。上述表现提示:SIRT3低表达提高了造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平。结论:1.SIRT3在造影剂介导的HK-2细胞损伤中表达升高;2.SIRT3低表达提高造影剂介导的HK-2细胞氧化应激水平;3.SIRT3调节造影剂介导的HK-2细胞凋亡相关蛋白的表达。

杨济宁^[9]（2019）在《白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究》文中提出背景我国心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）的患病人数高达2.9亿,死亡率居于首位,已成为重大的公共卫生问题,给国民经济带来沉重的负担。因此,寻找新的治疗靶点和干预措施来防治心血管疾病刻不容缓。生活方式和膳食模式的改变是近年来我国CVD发病率升高的重要原因。其中,由高脂膳食（high-fat diet,HFD）引起的血脂异常、肥胖、代谢紊乱等均是CVD的重要危险因素。当摄入的脂肪超过肝脏的代谢负荷后,可诱发血脂代谢紊乱,从而造成血管内皮细胞氧化应激损伤,并进展为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）,后者是CVD的病理基础。而AS进一步发展可产生冠状动脉堵塞,从而造成心肌细胞不可逆损伤甚至死亡。因此,通过膳食途径对代谢性疾病进行干预是一种经济且有效的手段。其中,白藜芦醇（resveratrol,RSV）是一种广泛存在于植物性食物中的多酚类植物化学物,可通过抗氧化应激、抗炎等作用有效改善CVD,但其中的机制尚未阐明。肝脏是脂肪代谢的核心器官,有脂肪蓄积引起的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是CVD的一项独立危险因素。本课题组前期研究提示RSV可通过蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）介导的通路改善HFD引起的多种代谢性疾病,因此,PKA可能成为RSV防治代谢性CVD的重要靶点。多项体外研究表明PKA密切参与到肝脏脂肪代谢调节中,然而,由于PKA的亚基种类较多,难以建立PKA完全敲除的动物模型,因而关于PKA对肝脏脂肪代谢的体内研究尚缺乏直接证据。此外,HFD引起的血管内皮细胞氧化应激是AS发生发展的关键因素,而血管内皮细胞线粒体动力学与细胞氧化还原稳态关系密切。我们前期发现RSV可以调节内皮细胞的氧化还原稳态,但RSV在调节内皮细胞线粒体动力学过程中的作用靶点仍有待研究。防治CVD的另一个重要方面是提高心肌细胞在病理性应激情况的存活能力。既往的研究提示在成年心室肌细胞中,单核心室肌细胞（mononucleated ventricular myocytes,MVMs）比双核心室肌细胞（binucleated ventricular myocytes,BVMs）分化程度更低,且具有一定的增殖潜力,因而受到广泛的关注。但受限于研究方法,MVMs与BVMs在基因层面的特征及对病理刺激因子的反应性一直未能得到全面的揭示。深入研究两种心肌细胞的差异对于理解心肌细胞的生理学特征、提高心肌细胞在病理条件下的存活率具有重要的意义。目的1.建立肝脏特异性PKA活性抑制性小鼠模型,研究PKA在体内对HFD的代谢反应及转录组变化,为PKA在脂肪代谢中的作用提供有效的体内研究模型,并探索PKA作为代谢性CVD防治靶点的潜力。2.阐明RSV在调节内皮细胞线粒体动力学和抗氧化应激中的作用及机制,为代谢性CVD的防治提供膳食营养干预策略。3.揭示MVM和BVM在基础状态下和受压状态下的转录组特征,并从转录组差异提示的结果出发深入研究MVM和BVM的病理生理学基础,及RSV分别对两种细胞在受压条件下的存活情况和抗氧化应激损伤的效应,完善RSV保护心肌细胞的作用和机制。方法1.利用转基因技术构建过表达“loxP-PKA抑制肽-绿色荧光蛋白（PKAi-GFP）-loxP”基因的小鼠,通过与Alb-cre工具鼠交配后得到在肝脏特异性过表达PKAi-GFP小鼠模型（PKAi小鼠）,并用蛋白免疫印记方法验证肝脏组织中PKAi-GFP表达,用RT-qPCR检测多种组织中PKAi-GFP的表达水平,用PKA活性检测试剂盒检测PKAi肝脏组织中PKA活性被抑制程度。分别研究普通饮食（chow diet,CD）和HFD诱导下PKAi小鼠与同窝对照小鼠的体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量,通过H&E染色观察肝脏组织病理学变化,油红O染色观察肝脏组织中脂滴聚集,并通过第二代RNA测序技术揭示转录组变化及生物信息学方法预测PKA在HFD刺激下改变的通路。2.利用棕榈酸（palmitic acid,PA）处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）建立氧化应激模型,通过细胞计数试剂盒8（cell counting kit8,CCK8）检测细胞活力并确定最适建模浓度和时间。利用流式细胞术和酶标仪检测DCFH-DA探针标记的细胞内ROS,用脂质过氧化和超氧化物歧化酶检测试剂盒检测RSV干预后HUVEC内氧化应激变化;用流式细胞术和酶标仪检测JC-1探针标记的线粒体膜电位;共聚焦显微镜和电子镜显微镜观察线粒体形态变化;利用蛋白印迹检测线粒体融合蛋白的表达;利用siRNA分别敲降TyrRS和PARP1后,检测TyrRS-PARP1通路在RSV调节线粒体动力学、氧化应激中的作用。3.通过RNA模板5’末端的转换机制测序技术（switching mechanism at 5’end of RNA template-sequencing,SMART-seq）检测基础状态下和异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）刺激下的MVM与BVM转录组,并利用生物信息学技术分析两者的差异性特征;利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）技术检测MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下的凋亡率;分别利用JC-1、DCFH-DA标记线粒体膜电位和细胞内ROS,激光共聚焦显微镜检测并分析MVM和BVM在基础状态和ISO刺激下荧光强度;利用DCFH-DA标记细胞内活性氧、Rhod-2标记线粒体钙,在共聚焦显微镜时间扫描模式下检测ISO刺激后MVM和BVM线粒体钙和ROS的变化。RSV预处理心肌细胞后,用台盼蓝标记死细胞,分别检测MVM和BVM的死亡率,共聚焦显微镜检测DCFH-DA标记的细胞内ROS。结果1.抑制肝脏内PKA活性可促进HFD诱导的肝脏内甘油三酯蓄积。1.1通过loxP/cre系统建立了肝脏内条件性PKA活性抑制小鼠模型（PKAi小鼠）,其肝脏中特异性表达有PKAi-GFP,且抑制了PKA 61%的活性。1.2小鼠肝脏中PKA活性被抑制后,在普通饮食喂养下,体重、肝脏指数、肝脏内甘油三酯的含量与对照小鼠无差异;而在HFD诱导8周后,与对照组比较:PKAi小鼠肝脏指数增加、肝脏内出现更严重的脂肪蓄积。1.3转录组研究显示:在基础饮食下,PKAi和对照小鼠差异表达基因富集分析提示PKA主要参与到了脂肪代谢。而两种小鼠在HFD诱导后:PKAi小鼠主要发生热休克蛋白相关的应激反应相关通路,而对照小鼠则主要体现在免疫系统应答的改变。2.RSV通过激活TyrRS-PARP1通路抗PA诱导的内皮细胞氧化应激。2.1 HUVEC在200μM PA处理24h后,细胞活力下降至对照组的47%,该处理方案用于该研究中建立HUVEC氧化应激模型。在该模型中,细胞活力下降,细胞内ROS升高、脂质过氧化产物增多、超氧化物歧化酶活性下降;而RSV可以抑制以上变化。2.2在HUVEC氧化应激模型中,线粒体膜电位下降,线粒体成碎片化形态,且线粒体融合相关蛋白（OPA1,MFN1和MFN2）表达下降,而RSV处理可减少线粒体碎片化程度,上调融合相关蛋白;但当TyrRS、PARP1被抑制后,RSV对线粒体膜电位、形态学及融合相关蛋白的调节作用消失。3.RSV通过减轻ISO诱导的BVM氧化应激降低心肌细胞死亡率。3.1 MVM和BVM基础状态下的转录组有显着的差异,其中MVM中高表达的基因主要集中在RNA合成、抗凋亡方面,而BVM中高表达的基因则主要集中在蛋白质分解和P53介导的凋亡通路。3.2在添加ISO作为病理刺激的情况下,BVM比MVM更容易发生凋亡,其机制与BVM比MVM在ISO刺激后产生的ROS更多、维持线粒体膜电位能力更弱、发生线粒体钙超载速度更快有关。RSV的干预可以通过抑制BVM中ROS的产生而增加BVM的存活率,但对MVM的ROS及存活率没有显着影响。3.3 ISO诱导后的MVM和BVM转录组变化也存在显着差异。MVM在ISO刺激后倾向于发生自噬、减少细胞内的合成类的代谢活动从而降低细胞功能;而ISO刺激后的BVM则倾向于发生合成代谢来代偿性使细胞的功能活跃。结论1.成功建立并验证了一种全新的基于loxP/cre系统的肝脏特异性PKA活性抑制转基因小鼠模型,该小鼠肝脏的转录组发生显着改变,且在HFD喂养后较快出现肝脏内甘油三酯的蓄积。2.RSV可以通过激活TyrRS-PARP1通路调节内皮细胞线粒体动力学变化,从而改善PA诱导的氧化应激损伤。3.MVM和BVM是在转录组层面和生理功能层面具有显着差异的两种心肌细胞亚群。在病理刺激下,MVM比BVM更易存活,两种细胞应对病理性刺激的反应方式不同,而RSV的干预可以通过减轻BVM氧化应激而提高其存活率。综上,本研究探索了膳食营养干预防治代谢性CVD的作用和新机制。RSV是代谢性心血管疾病的保护性因子,对其作用机理的揭示为防治CVD提供了新思路。

李宁荫^[10]（2019）在《血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞对绝经后高血压合并左心室肥厚心血管保护的相关研究》文中研究说明背景:绝经后女性高血压患者由于肾素血管紧张素系统（RAS）及性激素等相关指标水平的明显变化,其发生高血压相关器官损害的比率及程度远大于男性,左室质量指数（LVMI）在预测男性和女性发生心血管事件的风险中发挥重要作用,且女性左室肥厚（LVH）的相对风险大于男性。因此,逆转LVH被认为是治疗高血压及心脏损害的重要目标之一。目的:通过观察钙通道阻滞剂（CCB）联合较大剂量缬沙坦相对充分阻滞血管紧张素II（Ang II）的1型受体（AT1R）,及对RAS各组分的影响,探讨其对绝经后高血压合并LVH患者心脏和血管功能改善的作用。方法:本研究为前瞻性、开放的平行对照研究,随访时间为18个月,根据样本量计算公式计算可得,应纳入103例高血压合并LVH的患者,研究对象来源于兰州大学第二医院心血管内科门诊及住院患者。选择符合纳入标准的45-65岁高血压合并LVH的自然绝经后女性患者,根据血压达标与否将其分为两组,（1）A组:按照降压达标的原则,按4周随访的原则,在病人耐受的前提下,逐步调整该组患者缬沙坦剂量最大不超过320mg/d,即每日服用苯磺酸氨氯地平5mg+较大剂量缬沙坦。（2）B组:患者每日服用苯磺酸氨氯地平5mg+缬沙坦80mg,作为标准剂量组。治疗并随访18个月后,采用化学发光法分别测定治疗前后血清性激素水平,包括:黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、孕酮（PRGE）、雌激素（E2）、睾酮（T）及催乳激素（PRL）的水平,采用酶联免疫吸附法检测性激素结合球蛋白（SHBG）;采用酶联免疫吸附法检测RAS各组分水平,包括:血管紧张素II（Ang II）、血管紧张素（1-7）（Ang（1-7））、血管紧张素（1-9）（Ang（1-9））、血管紧张素转换酶（ACE）及血管紧张素转换酶2（ACE2）。同时采用采用酶联免疫吸附法测定心肌纤维化及氧化应激相关指标,包括:I型胶原（Col I）、III型胶原（Col III）、8羟基脱氧鸟苷（8-OHd G）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）及a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）等相关指标水平。通过主动脉脉搏分析仪及血压脉搏测量装置评估患者血管功能,指标包括:脉压（PP）、平均动脉压（MAP）、中心收缩压（CSBP）、中心舒张压（CDBP）、心率（HR）、动脉压（AP）、反射波增益指数（AIx）、经心率为75次每分调整后的反射波增益指数（AIx@75HR）及颈动脉-股动脉脉搏波速度（cf-PWV）等血管功能指标。采用动态血压监测（ABPM）法评估患者治疗前后血压特点,相关指标包括:24小时SBP与DBP的平均值、负荷值及变异系数,白天SBP与DBP的平均值、负荷值及变异系数,夜间SBP/DBP的平均值、负荷值及变异系数,以及动态动脉硬化指数（AASI）。运用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析。结果:A组患者每日服用苯磺酸氨氯地平5 mg+缬沙坦198.57±57.06 mg,B组患者每日服用苯磺酸氨氯地平5 mg+缬沙坦80 mg。（1）两组患者入组时基本临床特征无统计学差异（P>0.05）。（2）24小时ABPM显示,两组患者治疗前后各时段血压平均值、负荷及变异系数均无统计学差异（P>0.05）,但治疗后,A组患者AASI明显低于治疗前及B组治疗后的水平（P<0.05）。（3）RAS各指标水平,治疗后A组的ACE2显着高于B组（P<0.05）;与治疗前相比,A组的Ang（1-7）、Ang（1-9）及ACE2亦明显升高（P<0.05）,而ACE与Ang II的水平降低（P<0.05）。（4）血清氧化应激及心肌纤维化水平检测,两组患者组间及组内均未观察到统计学差异（P>0.05）。（5）性激素水平及SHBG变化,治疗后A组的SHBG水平高于B组,且显着高于其治疗前（P<0.05）。（6）心脏结构及功能的改变,A组治疗后的舒张期室间隔厚度（IVSDT）、E/Em及Em/Am得到了显着的改善（P<0.05）,但B组并未有同样的改变。（7）血管功能评估,治疗后A组患者的cf-PWV降低（P<0.05）。结论:CCB联合较大剂量ARB,可在一定程度上改善绝经后女性高血压合并LVH患者的心脏及血管功能,并呈剂量依赖性,而该作用可能与相对充分阻滞绝经后女性的AT1R并更显着的激活ACE2-Ang（1-7）-Mas R轴及Ang II-AT2R轴水平有一定关系。背景:卵巢切除术（OVX）是最经典的构造动物绝经模型的方法之一,双侧OVX引起的雌激素缺乏可导致高血压和心脏功能障碍,部分与血管紧张素转换酶（ACE）过度激活和血管紧张素II（Ang II）的1型受体（AT1R）表达增加有关。本团队前期临床研究证实,相对充分阻滞其AT1R,可有效的改善绝经后合并左室肥厚（LVH）高血压患者心脏及血管损害,但究其机制尚不明确。目的:构建OVX自发性高血压大鼠（SHR）模型,同时合并LVH,通过给予钙通道阻滞剂（CCB）联合较大剂量血管紧张素受体阻滞剂（ARB）缬沙坦相对充分阻滞其AT1R,检测肾素-血管紧张素系统（RAS）各组分的水平、受体活性修饰蛋白3（RAMP3）与相关G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达水平,以及血流动力学的变化,探讨阻滞AT1R对行OVX后SHR的LVH的逆转作用及相关机制。方法:本研究采用动物实验的方法,取72只12周龄雌性SHR,其中48只实施OVX构建模型,12只构建假手术（Sham）模型,12只未行OVX。术后4周检测OVX组大鼠的血清雌二醇（E2）水平,术后2周行阴道脱落细胞检查,确定模型构建成功后,将所有SHR分为6组:（1）治疗1组,给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦7.5mg/kg·d,（2）治疗2组,给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦15mg/kg·d,（3）治疗3组,给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦22.5mg/kg·d,（4）治疗4组,给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦30mg/kg·d,（5）Sham组,行假手术,并给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦30mg/kg·d,（6）未行OVX组,给予苯磺酸氨氯地平10mg/kg·d+缬沙坦30mg/kg·d。每组各12只大鼠,其中6只按照上述分组治疗12周,另6只治疗至第8周起,于皮下注射RAMP3抑制剂RU486,并持续上述干预4周。于干预前后分别采用酶联免疫吸附法测定各组RAS相关指标,包括血管紧张素II（Ang II）,血管紧张素（1-7）（Ang（1-7））,血管紧张素（1-9）（Ang（1-9））,血管紧张素转换酶（ACE）及血管紧张素转换酶2（ACE2）。采用酶联免疫吸附法测定氧化应激相关指标水平,包括:8羟基脱氧鸟苷（8-OHd G）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）及a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）。并通过化学发光法检测血清中各项性激素水平,如黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、孕酮（PRGE）、雌激素（E2）、睾酮（T）及催乳激素（PRL）的水平,采用酶联免疫吸附法测定性激素结合球蛋白（SHBG）。采用蛋白质免疫印迹法评估心肌组织中RAMP3与相关GPCRs蛋白表达水平,测量鼠尾收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MAP）及心率（HR）。并通过多媒体生物信号记录仪经右颈总动脉逆行插管至左心室,记录血流动力学相关参数,如左室收缩压峰值（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压最大上升速率（﹢d P/dtmax）、左室内压最大下降速率（﹣d P/dtmin）、左心室等容舒张压平均变化速率（IRP average d P/dt）及左心室松弛时间常数（Tau）等。采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。结果:（1）鼠尾压,干预12周后OVX组SHR的SBP略高于未行OVX组,但差异无统计学意义（P>0.05）,较大剂量干预后的三组SHR则亦无明显差别,加用RU486干预后上述趋势无变化（P>0.05）。（2）血流动力学,CCB联合较大剂量缬沙坦干预12周,组间LVSP、﹢d P/dtmax、﹣d P/dtmin、IRP average d P/dt及Tau逐渐升高,且均高于干预前各指标水平（P<0.05）;而LVEDP则逐渐降低（P<0.05）;而加用RU486后的LVEDP、﹢d P/dtmax、﹣d P/dtmin、IRP average d P/dt及Tau与不加用时有统计学差异（P<0.05）。（3）氧化应激水平及心肌纤维化程度,干预前OVX组及Sham组的α-SMA与8-OHd G高于未行OVX组,GSH与SOD低于未行OVX组。干预12周后,各组的α-SMA与8-OHd G逐渐降低,且CCB联合较大剂量干预的三组SHR的上述指标水平低于其0周水平;而GSH与SOD则呈相反的趋势（P<0.05）。（4）血清RAS各组分水平,干预前OVX组SHR的ACE及Ang II高于未行OVX组,Ang（1-9）及Ang（1-7）低于未行OVX组（P<0.05）,ACE2各组间相似;干预12周后,各组的ACE与Ang II较前下降,Ang（1-9）与CCB联合较大剂量三组SHR的Ang（1-7）较前升高（P<0.05）,加用RU486干预后,Ang II水平明显升高（P<0.05）。（5）血清性激素水平,干预前OVX组SHR的LH与FSH高于未行OVX组,PRGE、E2、T、PRL、SHBG、E2/T及E2/PRL低于未行OVX组（P<0.05）,干预后SHBG组间逐渐升高,且均大于0周时水平,同时,不同剂量干预的OVX组SHR加用RU486后,SHBG低于不加用的SHR（P<0.05）。（6）RAMP3及相关G蛋白偶联受体（GPCRs）水平,干预前未行OVX组的RAMP3及相关GPCRs的细胞总蛋白、细胞膜蛋白水平及其比值均高于OVX组;干预后,OVX各组的膜蛋白与总蛋白的比较前升高,且高于未行OVX组（P<0.05）;加用RU486后,OVX组与未行OVX组的膜蛋白水平均较前降低,但组间无差异（P>0.05）。结论:CCB联合相对充分阻滞AT1R可改善OVX后合并LVH的SHR的心脏舒张功能,而RAMP3及其转运至细胞膜的相关GPCRs可能发挥了重要的协同作用,且呈剂量依赖性。

二、The changes of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and superoxide anion in renal artery hypertension rat（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、The changes of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and superoxide anion in renal artery hypertension rat（论文提纲范文）

（2）腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究（论文提纲范文）

（3）高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（4）Is COVID-19-induced liver injury different from other RNA viruses?（论文提纲范文）

（5）TXNIP介导高血压血管内皮功能障碍的实验研究（论文提纲范文）

（6）多功能荧光探针的设计、合成及其生物应用研究（论文提纲范文）

（7）腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（8）去乙酰化酶SIRT3在造影剂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（9）白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（10）血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞对绝经后高血压合并左心室肥厚心血管保护的相关研究（论文提纲范文）

四、The changes of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and superoxide anion in renal artery hypertension rat（论文参考文献）

• [1]虾肽对RAW264.7细胞氧化损伤及溃疡性结肠炎的保护作用研究[D]. 邵婉. 浙江海洋大学, 2021
• [2]腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究[D]. 王文俊. 山东大学, 2021(11)
• [3]高盐饮食大鼠血清中THBS1的改变及其在内皮功能损伤中的作用和机制研究[D]. 徐芳芳. 安徽医科大学, 2021(01)
• [4]Is COVID-19-induced liver injury different from other RNA viruses?[J]. Marwan SM Al-Nimer. World Journal of Meta-Analysis, 2021(02)
• [5]TXNIP介导高血压血管内皮功能障碍的实验研究[D]. 王瑞钰. 重庆医科大学, 2020(01)
• [6]多功能荧光探针的设计、合成及其生物应用研究[D]. 牛华伟. 郑州大学, 2020(02)
• [7]腹腔穿刺引流对重症急性胰腺炎相关心肌损伤的保护作用及机制研究[D]. 文艺. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
• [8]去乙酰化酶SIRT3在造影剂诱导的急性肾损伤中的作用及机制研究[D]. 张庆海. 山东大学, 2019
• [9]白藜芦醇在代谢性心血管疾病防治中的作用和机制研究[D]. 杨济宁. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [10]血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞对绝经后高血压合并左心室肥厚心血管保护的相关研究[D]. 李宁荫. 兰州大学, 2019

标签：心肌细胞论文;  血清蛋白论文;  心肌损伤论文;  细胞坏死论文;  基因探针论文;