一、杭州九源基因工程有限公司简介（论文文献综述）
单剑峰,刘晓妮,戎亚雯,张昕,郭旺明,王同映[1]（2015）在《响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺》文中研究说明采用Plackett-Burman设计法对影响巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达重组人血清白蛋白-粒细胞集落刺激因子突变体（rmHSA-GCSF）的主要参数进行了摇瓶试验,选取到3种显着效应的因素:诱导pH、甲醇添加浓度和诱导时间。再利用响应曲面法（Response surface method）对这3种因素进行进一步研究,得到最佳培养条件:甲醇诱导浓度为2.45%,诱导pH为5.54,诱导时间为66.4 h。采用此优化参数,rm HSA-GCSF表达量的最大预测值达157.5 mg/L。此后,根据优化的培养条件,进行150 L发酵罐放大试验,rm HSA-GCSF表达量达到600 mg/L左右,成功实现rm HSA-GCSF的高效表达。
郭旺明[2]（2012）在《重组大肠杆菌工业生产三种蛋白药物过程中的关键技术》文中进行了进一步梳理本文围绕如何在大肠杆菌中生产药用蛋白的关键技术问题包括目的蛋白的高效表达、包涵体蛋白的复性、蛋白质的大规模分离纯化以及蛋白质药物的稳定性提高等开展研究,并以处于不同开发阶段的三个重组蛋白药物为研究对象,发展了满足实验室阶段、中试生产和已有成熟市场等特定时期迫切需要解决问题的关键技术。促红细胞生成素模拟肽（EMP1）是一种由20个氨基酸组成的环肽,氨基酸序列与EPO不存在同源性但其生物功能与EPO基本相同。本文首先通过二种不同的连接肽将两分子的EMP1串联构成了二串体,代替化学法的二聚体,然后与硫氧还蛋白或DsbA等融合在大肠杆菌中实现了可溶性高效表达。在最优诱导温度和IPTG浓度下,二串体融合蛋白的可溶性表达水平可达到0.83g/L,并可采用金属螯合层析和疏水作用层析获得较高纯度的目标融合蛋白,纯化收率约为6.3-7.8%。融合蛋白再经过肠激酶切割和反相作用层析可以获得EMP1二串体,两种不同长度连接肽的EMP1二串体与EMP1单体相比,生物活性提高了10倍,连接肽的长短对活性没有显着影响。重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）由114个氨基酸组成,其生物活性形式为同源二聚体或与BMP-7形成异二聚体,由于极强的疏水性,在大肠杆菌中包涵体形式表达的BMP-2复性率低下而且成本高,后分离困难。本文系统地研究了表达后处理包括包涵体的溶解条件和不同复性液组成对复性的影响,发现盐酸胍体系溶解包涵体更有效,目标蛋白回收率也更高。通过筛选获得了最佳复性液组成,建立了操作简便的可放大的稀释法复性方案,最佳条件下的复性率大于70%,复性液成本大大下降,复性液不需任何预处理就可以直接进行后续纯化。开发了新颖的利用疏水作用层析原理的纯化方法,筛选出N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作为添加剂并优化了添加浓度,发现5%的DMF具有最好的分离度；通过不同盐浓度下的操作模式的比较,建立了两步法、DMF辅助的疏水作用层析分离工艺,最后分离达到的rhBMP-2同二聚体不仅纯度高,而且生物活性与商业化的CHO细胞来源的rhBMP-2相比ALP活力相当,与Wyeth公司的rhBMP-2制剂][NDUCTOSTM相比异位成骨活性更高,平均收率达到每克包涵体湿重产出80mgrhBMP-2同二聚体。DMF可以通过透析和冻干从rhBMP-2产品中完全去除,残留量未检出。这一套有效的复性和纯化工艺在中试生产车间进行了放大验证。另外,还针对大肠杆菌来源的rhBMP-2产品初步建立了反相高效液相色谱法和分子筛高效液相色谱法的纯度测定方案,并与毛细管电泳法和SDS-PAGE电泳法进行相互验证。重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）是一类重要的已经成功实现产业化的细胞因子类重组蛋白药物,如何提升该产品的稳定性和质量水平具有重要的现实意义。本文建立了可靠的基于C4柱的反相HPLC纯度测定方法,经过方法学验证,分离度大于现有药典标准方法；通过37℃加速和4℃长期稳定性试验研究了生产过程三个关键环节对产品稳定性的影响,筛选了来自不同厂家的三类常见药品包材-安瓿瓶、西林瓶和预装针,通过制剂工艺条件的优化、确立和新处方优化,确立了稳定性最佳的三种不同内包材类型的rhG-CSF制剂工艺,使商品rhG-CSF的纯度和稳定性获得了显着的提高。总之,通过对处于不同研发和生产阶段的3种蛋白质药物的研究,不仅建立了多种蛋白质药物工业化生产的关键技术,而且实际上大大促进了这几种蛋白质药物从研究到大规模生产的转化,提升了生产效率和产品稳定性。
吴艳芳[3]（2012）在《低分子量肝素精细结构的分析研究》文中研究指明肝素是由糖醛酸和氨基葡萄糖以1→4糖苷键连接的二糖重复单元组成的线性多糖,其中糖醛酸残基包括L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸,氨基葡萄糖为D-葡萄糖胺。肝素具有许多生理活性,参与细胞分化、细胞迁移、免疫等重要生理过程。由于硫酸化修饰的差异,使肝素成份非常复杂,组成成份的定量分析对于了解其生物活性、质量控制具有重要意义。低分子量肝素作为一种新型抗凝血药物被广泛用于预防和治疗术后血栓栓塞性疾病。低分子量肝素在碱性条件下发生p-消除反应降解引起特殊化学键的断裂生成1,6-成环衍生物,因此低分子量肝素与普通肝素相比结构更为复杂。然而,对于低分子量肝素类药物而言,低分子量肝素精细结构的分析研究是一项具有挑战性的工作。本论文主要从以下分为三部分研究低分子量肝素的精细结构,其具体内容和结果如下：1、本部分建立了一种新的基于毛细管电泳法测定低分子量肝素精细结构的分析方法。低分子量肝素在肝素酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ完全酶解的条件下可以得到相应的低聚糖。在120 mmol/L甲酸（pH=3.4）缓冲液条件下,这些低聚糖可以得到非常有效的分离。在缓冲液中添加1%（w/v） PEG （10000）和2 mmol/L CaCl2可以有效提高核质比非常接近低聚糖的分离度。在最佳的缓冲体系中,几乎所有低聚糖都能达到基线分离和定量测定。低聚糖的电解迁移率与其核质比呈线性关系,这有利于利用保留时间指认出色谱图上各个色谱峰。该方法重复性好,定量准确。毛细管电泳法和离子交换色谱进行比较,毛细管电泳分析低分子量肝素精细结构分辨率更高。2、本部分建立了用于分离并定量测定低分子量肝素中不同糖链长度的各个组份分布比例的体积排阻色谱方法。系统考察了流动相的组成、离子强度和pH值、流速、柱温等因素对分离的影响,确定的最佳分离条件为：两根色谱柱TSK-GEL G2000SWxl （7.8 mm×300 mm）串联,流动相100 mmol/L NH4Ac（pH=7.0）,流速0.5 mL/min,柱温35℃,进样量5μL,样品浓度10 mg/mL。对方法的重现性和稳定性进行了验证,一天之内和天与天之间低分子硫酸化多糖各组成成份迁移时间和峰高的相对标准偏差分别0.1%-1.5%和0.2%-6.9%。在最佳的分离条件下,可以将低分子量肝素样品中不同糖链长度的各个组份分离并对各个组份的分布进行了定量分析。用该方法对美国药标准品（USP）、商品和杭州九源基因有限公司制备的低分子量肝素糖链长度分布进行了定量对比。证明该方法可用于低分子量肝素类药物的组成成份的质量控制。3、本部分基于低分子量肝素各糖链组成成份分布的基础上,对每个色谱峰进行指认,制备低分子量肝素中糖链长度为十糖的化合物,经过除盐、纯化得到相对纯度较高的十糖。
郭旺明,陈海红,王同映,李辉,黄磊,蔡谨,徐志南,岑沛霖[4]（2011）在《精确测定rhG-CSF产品化学稳定性的RP-HPLC新方法》文中研究指明研究重组人粒细胞集落刺激因子的化学稳定性,需要寻找一种可靠的分析方法用于纯度测定,特别是用于准确测定其氧化产物。采用两种反相色谱柱C4柱和C18柱,探索出了一种新方法,并与《中国药典》2010版和《欧洲药典》EP6.3版,EP6.8版中的有关物质分析方法进行比较研究,通过对不同储藏条件下的样品进行检测,确定了新方法的最佳操作条件,包括柱温60℃、上样体积2050μL和柱长15 cm,虽然柱长25 cm具有更高的氧化产物检出灵敏度,但是分离度有所下降。C4柱与C18柱相比,具有更好的灵敏度和分离度。还对新RP-HPLC方法进行了方法学验证,如检测限,专属性和耐用性等,该方法优于现行的《中国药典》2010版和《欧洲药典》EP6.8版的有关物质分析方法。
张金玲,马南佳,汪军远,方井晋,刘晓妮[5]（2010）在《聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的纯化与分析》文中研究说明目的获得高活性的聚乙二醇定点单修饰的产物PEG-rmhG-CSF-Cys176。方法用聚乙二醇马来酰亚胺基和高活性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）的半胱氨酸（Cys）基团特异性结合,并用离子交换层析分离纯化修饰产物,通过高效凝胶过滤色谱检测纯度,MTT法检测体外的生物活性。结果蛋白纯度为97%,体外生物活性为0.8×108IU·mg-1。结论半胱氨酸反应性PEG和游离Cys的结合是在rmhG-CSF活性区以外的位置C末端,修饰后的蛋白活性基本未受影响。
林斌,刘龙孝,马国昌,黄岩山,周金宝[6]（2008）在《pH对HSA-IFNα 2β稳定性的影响》文中研究说明目的考察不同pH值对一类新药HSA-IFNα 2β稳定性的影响。方法采用SDS-PAGE电泳法测定溶液中HSA-IFN α2β的纯度,研究了不同pH值对HSA-IFNα 2β稳定性作用。方法HSA-IFNα 2β在pH6.5（10mmol）的磷酸缓冲体系中相对最稳定。
徐向荣,马国昌,王昌梅,单剑峰,沈玲,黄岩山,周金宝[7]（2008）在《层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素》文中指出用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素。所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱。采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量;并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度,求出每毫克蛋白的内毒素含量。结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用,最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg,去除率达到99.9%。因而生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素,所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。
黄岩山,金荣,刘晓妮,王昌梅,戎亚雯,陈智[8]（2007）在《聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究》文中指出研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF150%以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐（mPEG-Mal）修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体（PEG-rmhG-CSF）。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95%,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF,NeulastaR○）,药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。
王昌梅,王同映,杨志愉,单剑峰,刘晓妮,马国昌,戎亚雯,方井晋,黄岩山,周金宝[9]（2006）在《重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达》文中研究说明为了延长G-CSF半衰期,利用甲醇酵母表达重组人血清白蛋白融合的集落细胞刺激因子（rHSA-G-CSF）。用PCR方法从人胎肝cDNA文库扩增出HSAcDNA序列,hG-CSFcDNA序列从大肠表达载体中酶切获取。将HSA和hG-CSF两片段连接后,克隆到酵母分泌型表达载体pGENYK中,酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合。工程菌经发酵罐培养表达,层析法分离纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western印迹分析表明具有HSA和G-CSF的免疫原性,体外生物学活性分析表明,同等尔数的融合表达产物的活性为E.coli表达G-CSF单体的活性的50%以上。体内动物实验研究表明,经HSA融合的G-CSF的半衰期为G-CSF单体的1520倍。甲醇酵母表达的融合HSA的G-CSF具有比G-CSF更长的半衰期,有良好的临床应用前景。
鲁桂芳,徐领城[10]（2006）在《我院2003年2005年基因工程药物临床利用分析》文中研究表明目的:了解基因工程药物的临床使用现状和发展趋势,为临床合理使用提供参考。方法:对我院2003年2005年基因工程药物的品种、数量、金额等进行统计并比较分析,并结合文献对其应用前景予以展望。结果:基因工程药物的消耗金额呈逐年上升的趋势,其中G-CSF用量较大占四成左右的份额。国产品种和企业在各年的消耗金额前10的排名中,均呈每年上升的势头。结论:我国的基因工程药物具有较大的发展前景,对于我国的制药企业来说是个机遇。
二、杭州九源基因工程有限公司简介（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、杭州九源基因工程有限公司简介（论文提纲范文）
（1）响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种及试剂 |
| 1.2 培养基配方 |
| 1.2.1种子培养基 |
| 1.2.2 发酵培养基 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 摇瓶工艺方法 |
| 1.3.2 发酵工艺方法 |
| 1.3.3 分析方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 Plackett-Burman 设计法[7] |
| 2.2 响应曲面分析优化各影响因子 |
| 2.3 150 L 发酵罐工艺验证结果 |
| 3 小结 |
（2）重组大肠杆菌工业生产三种蛋白药物过程中的关键技术（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 前言 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 基因工程药物 |
| 1.2 基因工程药物研究开发中的若干关键问题 |
| 1.2.1 蛋白质的重组表达技术 |
| 1.2.1.1 重组蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达策略 |
| 1.2.1.2 重组蛋白质的高水平表达-包涵体 |
| 1.2.2 蛋白质复性 |
| 1.2.2.1 蛋白质的折叠机理 |
| 1.2.2.2 包涵体蛋白复性方法 |
| 1.2.2.3 影响复性的因素 |
| 1.2.2.4 提高复性效率的策略 |
| 1.2.2.5 复性效果的检测方法 |
| 1.2.3 蛋白质的分离纯化技术 |
| 1.2.4 蛋白质稳定性研究 |
| 1.2.4.1 引起蛋白质类药物不稳定的原因 |
| 1.2.4.2 蛋白质的化学不稳定性 |
| 1.2.4.2.1 蛋白质氧化及作用机制 |
| 1.2.4.2.2 蛋白质脱酰胺反应及作用机制 |
| 1.2.4.2.3 还原作用与二硫键的错配 |
| 1.2.4.2.4 β-消除和消旋化反应 |
| 1.2.4.2.5 水解作用 |
| 1.2.4.2.6 形成DKP(Diketopiperazine,二酮哌嗪或环缩二氨酸) |
| 1.2.4.2.7 形成焦谷氨酸(PyroGlu Formation) |
| 1.2.4.2.8 蛋白质的糖化(Glycation of Proteins) |
| 1.2.4.3 蛋白质的物理不稳定性 |
| 1.2.4.4 提高蛋白质稳定性的策略 |
| 1.2.4.4.1 添加蛋白质稳定剂 |
| 1.2.4.4.2 干燥法 |
| 1.2.4.4.3 蛋白质工程 |
| 1.2.4.4.4 蛋白质的化学修饰 |
| 1.3 促红细胞生成素模拟肽(EMP1) |
| 1.3.1 促红细胞生成素模拟肽的发现 |
| 1.3.2 EMP1研究进展 |
| 1.3.2.1 EMP1的关键序列 |
| 1.3.2.3 二聚化或四聚化等提高EMP1的生物活性 |
| 1.3.2.4 EMP1生产方法 |
| 1.4 骨形态发生蛋白-2 |
| 1.4.1 骨形态发生蛋白-2简介 |
| 1.4.2 BMP-2的研究进展 |
| 1.5 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的产品稳定性 |
| 1.5.1 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF) |
| 1.5.2 rhG-CSF稳定性研究进展 |
| 1.5.2.1 rhG-CSF的制剂开发 |
| 1.5.2.2 rhG-CSF的质量标准研究 |
| 1.5.2.3 rhG-CSF的稳定性评价 |
| 1.5.2.4 提高rhG-CSF的稳定性的策略 |
| 1.6 本论文的研究目的和主要研究内容 |
| 第二章 促红细胞生成素模拟肽(EMP1)在大肠杆菌中的可溶性表达和活性测定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 质粒 |
| 2.2.1.2 菌种 |
| 2.2.1.3 工具酶及试剂盒 |
| 2.2.1.4 培养基 |
| 2.2.1.5 化学试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 EMP-1基因的获得 |
| 2.2.2.2 分子克隆相关实验 |
| 2.2.2.3 EMP1的可溶性表达 |
| 2.2.2.4 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取 |
| 2.2.2.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.2.2.6 EMP1二串体的制备和分离 |
| 2.2.2.7 蛋白浓度测定 |
| 2.2.2.8 大肠杆菌菌体浓度测定 |
| 2.2.2.9 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.2.10 EMP-1的细胞活性测定法(MTT法) |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 EMP1工程菌的构建 |
| 2.3.2 EMP1融合蛋白的表达 |
| 2.3.3 EMP1融合蛋白的纯化和EMP1的制备 |
| 2.3.4 EMP1融合蛋白及EMP1的生物活性比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组人骨形态发生蛋白-2的复性和纯化工艺研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 rhBMP-2包涵体 |
| 3.2.1.2 化学试剂及仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 rhBMP-2的表达和包涵体制备 |
| 3.2.2.2 rhBMP-2包涵体的溶解(裂解) |
| 3.2.2.3 rhBMP-2的复性 |
| 3.2.2.4 rhBMP-2复性液的纯化及条件优化 |
| 3.2.2.5 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.2.6 SDS-PAGE法测定rhBMP-2纯度 |
| 3.2.2.7 毛细管电泳法测定rhBMP-2纯度 |
| 3.2.2.8 碱性磷酸酶生物活性测定(ALP) |
| 3.2.2.9 成骨活性测定(Ectopic bone formation) |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 rhBMP-2的表达和包涵体制备 |
| 3.3.2 不同变性剂体系对rhBMP-2包涵体提取效果的比较 |
| 3.3.3 复性液组成对rhBMP-2复性效果的比较 |
| 3.3.4 rhBMP-2复性液的初步纯化 |
| 3.3.5 rhBMP-2的精制工艺优化 |
| 3.3.5.1 有机溶剂和尿素对纯化的影响 |
| 3.3.5.2 N,N-二甲基甲酰胺浓度的优化 |
| 3.3.5.3 尿素浓度的优化 |
| 3.3.6 rhBMP-2复性液提纯的两步法工艺 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 重组人骨形态发生蛋白-2的复性和纯化工艺的放大 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 rhBMP-2包涵体 |
| 4.2.1.2 化学试剂及仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 rhBMP-2包涵体的溶解(裂解) |
| 4.2.2.2 rhBMP-2的复性 |
| 4.2.2.3 rhBMP-2的两步法纯化 |
| 4.2.2.4 rhBMP-2的后续处理 |
| 4.2.2.5 蛋白浓度的测定 |
| 4.2.2.6 rhBMP-2终产品的DMF残留检测 |
| 4.2.2.7 rhBMP-2的电泳法纯度测定(SDS-PAGE) |
| 4.2.2.8 rhBMP-2的毛细管电泳法纯度测定 |
| 4.2.2.9 反相HPLC法测定rhBMP-2的纯度 |
| 4.2.2.10 SEC HPLC法测定rhBMP-2的纯度 |
| 4.2.2.11 碱性磷酸酶生物活性测定(ALP) |
| 4.2.2.12 成骨活性测定(Ectopic bone formation) |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 rhBMP-2的复性 |
| 4.3.2 rhBMP-2的纯化及纯度分析 |
| 4.3.3 rhBMP-2中的DMF残留验证 |
| 4.3.4 rhBMP-2的生物活性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的稳定性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 rhG-CSF包涵体 |
| 5.2.1.2 化学试剂及仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 复性方法 |
| 5.2.2.2 纯化方法 |
| 5.2.2.3 制剂灌封试验 |
| 5.2.2.4 反相HPLC法 |
| 5.2.2.5 反相HPLC法测定rhG-CSF及其氧化产物条件的优化 |
| 5.2.2.5.1 柱温的优化 |
| 5.2.2.5.2 上样量的影响 |
| 5.2.2.5.3 柱长对检测结果的影响 |
| 5.2.2.6 反相HPLC法测定rhG-CSF及其氧化产物的方法学研究 |
| 5.2.2.6.1 检测限的确定 |
| 5.2.2.6.2 专属性 |
| 5.2.2.6.3 耐用性 |
| 5.2.2.7 SDS-PAGE法纯度分析 |
| 5.2.2.8 毛细管电泳法纯度分析 |
| 5.2.2.9 蛋白质含量测定 |
| 5.2.2.10 细菌内毒素检验法 |
| 5.2.2.11 生物活性测定法 |
| 5.2.2.12 pH值测定法 |
| 5.2.2.13 37℃加速和4℃长期稳定性试验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 复性工艺对rhG-CSF稳定性的影响 |
| 5.3.2 纯化工艺对rhG-CSF产品稳定性的影响 |
| 5.3.3 制剂工艺对稳定性的影响 |
| 5.3.3.1 包装材料的影响 |
| 5.3.3.2 不同过渡态金属离子对安瓿瓶制剂的影响 |
| 5.3.3.3 不同厂家来源的安瓿瓶对制剂稳定性的影响 |
| 5.3.3.4 不同厂家来源的胶塞对西林瓶制剂稳定性的影响 |
| 5.3.3.5 预装针制剂的稳定性试验 |
| 5.3.3.6 制剂原辅料及环境对rhG-CSF稳定性的影响 |
| 5.3.4 工艺改进对稳定性的影响 |
| 5.3.5 工艺改进后产品稳定性的评价 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论和建议 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 建议 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 作者简介 |
| 博士期间己发表/录用的文章 |
（3）低分子量肝素精细结构的分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 肝素及低分子肝素的结构及功能 |
| 1.3 肝素的理化性质 |
| 1.3.1 物理性质 |
| 1.3.2 化学性质 |
| 1.3.3 低分子量肝素的药动力学 |
| 1.3.4 低分子量肝素的药理作用 |
| 1.4 低分子量肝素的制备 |
| 1.4.1 化学解聚法 |
| 1.4.2 肝素酶降解法 |
| 1.5 肝素结构分析 |
| 1.5.1 肝素中的单糖残基 |
| 1.5.2 主要的二糖单元 |
| 1.5.3 低硫酸化序列 |
| 1.6 低分子量肝素分子量及抗凝效价的测定方法 |
| 1.6.1 低分子量肝素分子量的测定方法 |
| 1.6.2 肝素抗凝效价的测定 |
| 1.7 本课题研究内容 |
| 1.8 本课题的创新点和研究意义 |
| 第二章 构成低分子量肝素特殊基团分析方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 低分子量肝素完全酶解生成1,6-脱水成环原理 |
| 2.1.2 低分子量肝素完全酶解产物中低聚糖组分分析 |
| 2.1.3 肝素酶的性质 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 磷酸二氢钾pH 7.0溶液的配制 |
| 2.2.4 肝素酶溶液的配制 |
| 2.2.5 醋酸钠/醋酸钙pH 7.0缓冲液的配制 |
| 2.2.6 样品的配制 |
| 2.2.7 低分子量肝素完全酶解反应 |
| 2.2.8 毛细管电泳条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 低分子量肝素酶解时肝素酶(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)用量的研究 |
| 2.3.2 低分子量肝素完全酶解时间的确定 |
| 2.3.3 毛细管电泳法分离低分子量肝素完全酶解产物的色谱条件进一步优化 |
| 2.3.4 低分子量肝素完全酶解生成1,6-成环率定量方法验证 |
| 2.3.5 毛细管电泳法的重复性验证 |
| 2.3.6 低分子量肝素完全酶解产物中△IS的标准曲线 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 低分子量肝素体积排阻色谱法分离及组成成份定量分析研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 低分子量肝素常用的分离方法及原理 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 流动相的配制 |
| 3.2.2 低分子量肝素样品的配制 |
| 3.2.3 低分子量肝素各组成成份糖链分离建立的色谱条件 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 分离模式的选择 |
| 3.3.2 体积排阻色谱法固定相对低分子量肝素分离度的影响 |
| 3.3.3 流动相的选择 |
| 3.3.4 流动相的离子强度的影响 |
| 3.3.5 流动相pH的优化 |
| 3.3.6 流速对分离效果的影响 |
| 3.3.7 柱温对分离的影响 |
| 3.3.8 检测器的选择 |
| 3.3.9 方法重复性验证 |
| 3.3.10 方法应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 十糖制备 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 流动相的配制 |
| 4.2.2 样品的配制 |
| 4.2.3 低分子量肝素中十糖制备的色谱条件 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 低分子量肝素中十糖制备 |
| 4.3.2 去除制备十糖单元中的盐 |
| 4.3.3 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪测定十糖单元结构 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（4）精确测定rhG-CSF产品化学稳定性的RP-HPLC新方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结 果 |
| 2.1 5种分析方法对过氧化氢氧化前后的纯度测定 |
| 2.2 方法B检测条件的优化 |
| 2.2.1 柱温对纯度测定的影响 |
| 2.2.2 上样量的影响 |
| 2.2.3 柱长对检测结果的影响 |
| 2.3 新方法B的方法学验证 |
| 2.3.1 检测限的确定 |
| 2.3.2 专属性 |
| 2.3.3 耐用性 |
| 2.4 反相色谱法B与SDS-PAGE及毛细管电泳法的比较 |
| 3 讨 论 |
（5）聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的纯化与分析（论文提纲范文）
| 1 实验部分 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法与结果 |
| 1.2.1 重组rmh G-CSF-Cys176菌株的表达 |
| 1.2.2 rmh G-CSF-Cys176的纯化 |
| 1.2.3 rmh G-CSF-Cys176的修饰 |
| 1.2.4 mPEG-rmhG-CSF-Cys176的分离纯化 |
| 1.2.5 SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.6 高效凝胶过滤的色谱条件 |
| 1.2.7 体外生物活性的测定 |
| 2 讨论 |
（9）重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1. 1 材料 |
| 1.1.1 菌株、细胞株和质粒 |
| 1.1.2 酶和试剂 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1. 2 方 法 |
| 1.2.1 基因扩增及表达菌株构建 |
| 1.2.2 转化及筛选 |
| 1.2.3 诱导表达 |
| 1.2.4 表达产物的分析 |
| 1.2.5 表达产物的纯化制备和分析 |
| 1.2.6 体外生物活性检测 |
| 1.2.7 药代动力学试验 |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组HSA/G-CSF酵母表达载体的构建 |
| 2.2 重组转化子筛选 |
| 2.2.1 转化筛选 |
| 2.2.2 PCR验证及拷贝数估计 |
| 2.3 rHSA-G-CSF在毕氏酵母中的表达 |
| 2.4 表达产物的纯化和分析 |
| 2.5 生物学活性分析 |
| 2.6 rhHSA-G-CSF的体内药代动力学实验 |
| 3 讨 论 |
（10）我院2003年2005年基因工程药物临床利用分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 销售金额 |
| 2.2 各类基因工程药物的金额数及比例 |
| 2.3 消耗金额品种排序 |
| 2.4 消耗金额的生产厂家排序 |
| 3 讨论 |
| 3.1 干扰素 |
| 3.2 rhG-CSF和rhGM-CSF |
| 3.3 EPO |
| 3.4 GH |
| 3.5 IL-Ⅱ |
| 3.6 基因工程药物的趋势预测 |
四、杭州九源基因工程有限公司简介（论文参考文献）
- [1]响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺[J]. 单剑峰,刘晓妮,戎亚雯,张昕,郭旺明,王同映. 发酵科技通讯, 2015(02)
- [2]重组大肠杆菌工业生产三种蛋白药物过程中的关键技术[D]. 郭旺明. 浙江大学, 2012(11)
- [3]低分子量肝素精细结构的分析研究[D]. 吴艳芳. 东华大学, 2012(07)
- [4]精确测定rhG-CSF产品化学稳定性的RP-HPLC新方法[J]. 郭旺明,陈海红,王同映,李辉,黄磊,蔡谨,徐志南,岑沛霖. 药物生物技术, 2011(02)
- [5]聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的纯化与分析[J]. 张金玲,马南佳,汪军远,方井晋,刘晓妮. 华西药学杂志, 2010(02)
- [6]pH对HSA-IFNα 2β稳定性的影响[J]. 林斌,刘龙孝,马国昌,黄岩山,周金宝. 海峡药学, 2008(02)
- [7]层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素[J]. 徐向荣,马国昌,王昌梅,单剑峰,沈玲,黄岩山,周金宝. 生物工程学报, 2008(01)
- [8]聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究[J]. 黄岩山,金荣,刘晓妮,王昌梅,戎亚雯,陈智. 生物工程学报, 2007(05)
- [9]重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J]. 王昌梅,王同映,杨志愉,单剑峰,刘晓妮,马国昌,戎亚雯,方井晋,黄岩山,周金宝. 中国生物工程杂志, 2006(12)
- [10]我院2003年2005年基因工程药物临床利用分析[J]. 鲁桂芳,徐领城. 中国医院用药评价与分析, 2006(06)