一、慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染复制与干扰素治疗反应（论文文献综述）
湛梦茹[1]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中提出背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
王婧雯[2]（2021）在《MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究》文中研究表明第一部分慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究研究背景乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）持续的感染是世界性的公共卫生问题,全球至少有2.57亿人有慢性HBV感染。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）会对肝脏造成损伤,随着疾病的发展会导致肝硬化甚至是肝癌,因此对CHB进行及时有效的治疗显得尤为重要。Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）是治疗CHB的一线药物。Ⅰ型IFN与细胞膜表面的Ⅰ型干扰素受体（type Ⅰ interferon receptor,IFNAR）的亚基IFNAR1和IFNAR2结合,形成异二聚体配体受体复合物,激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子1（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 1,JAK/STAT1）信号通路,产生抗病毒蛋白发挥抗病毒作用。Ⅰ型IFN还可以通过STAT1使MDM2转录下调来诱导p53蛋白的稳定以发挥抗病毒的作用。STAT1既是Ⅰ型IFN信号转导所必需的,同时也可以负调控鼠双微体2（mouse double minute-2,MDM2）,p53的降解和反式激活受到MDM2调控,抑制了 p53的表达作用。JAK/STAT1途径激活后,STAT1表达升高抑制了 MDM2的表达,p53表达增加增强了 Ⅰ型IFN抗病毒信号并促进HBV病毒感染细胞的凋亡,抑制HBV在细胞中的复制,发挥p53的先天抗病毒免疫作用。表观遗传学中有一类是DNA甲基化,是一种对DNA的化学修饰。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶作用下获得甲基基团,进而在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。氧化应激是机体氧化状态和抗氧化状态的动态平衡被打破,更倾向于氧化状态。有研究指出氧化应激会引起表观遗传学改变,这可能与CHB的发生和发展有关。现在尚未有关于CHB患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态及与氧化应激关系的研究。研究目的1.明确 CHB 患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs 中 IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。2.明确CHB患者和HCs的PBMCs中IFNAR mRNA和MDM2 mRNA表达水平。3.研究CHB患者PBMCs中的INFAR启动子甲基化对MDM2 mRNA相对表达量的影响。4.研究CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化与氧化应激之间的关系。研究方法本研究共纳入169例研究对象,其中CHB患者148例,HCs 21例,于2014年1月到2016年10月在山东大学齐鲁医院肝病科入组。CHB的纳入标准按照 2009 年美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的《乙型肝炎指南》,乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性时间至少6个月。甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）被用来检测 PBMCs 中IFNAR和MDM2启动子甲基化状态。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测 IFNAR mRNA 及 MDM2 mRNA 的相对表达量。酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血浆中丙二醛（malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平。统计分析采用 SPSS 22.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 5.0 软件（San Diego,CA,USA）。连续变量的组间差异比较使用Mann-Whitney U检验。使用卡方检验来比较分类变量的组间差异。变量间的相关性使用的是Spearman等级相关检验。当p<0.05时,认为差异具有统计学的意义。研究结果1.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化的频率明显低于HCs（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p<0.001）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 启动子甲基化频率与HCs相比无明显差异（p>0.05）。2.CHB患者PBMCs中IFNAR mRNA表达量相较于HCs明显升高（IFNAR1:p=0.031;IFNAR2:p=0.027）。CHB 患者 PBMCs 中 MDM2 mRNA 表达量与HCs相比无明显差异（p>0.05）。3.CHB患者中IFNAR启动子甲基化组IFNAR mRNA表达量相较于非甲基化组明显降低（IFNAR1:p=0.023;IFNAR2:p=0.044）。4.CHB患者中存在IFANR启动子甲基化的患者,其MDM2 mRNA相对表达量是明显高于IFNAR启动子非甲基化组中患者的相对表达量（IFNAR1:p=0.001,IFNAR2:p=0.008）。5.CHB患者血浆中的MDA是明显高于HCs,而GSH是低于HCs（MDA:p<0.001;GSH:p<0.001）。在CHB患者中IFNAR启动子甲基化组的MDA是明显高于非甲基化组（IFNAR1:p=0.018;IFNAR2:p=0.041）,GSH则是明显低于非甲基化组的（IFNAR1:p=0.030;IFNAR2:p=0.029）。研究结论1.CHB患者PBMCs中IFNAR启动子是存在甲基化异常的,同时IFNAR启动子甲基化的频率是低于HCs。CHB患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的水平与HCs相比是没有差异的。2.CHB患者PBMCs中的IFNAR发生甲基化后,导致IFNAR mRNA相对表达量降低并伴有MDM2 mRNA表达量升高,提示IFNAR甲基化可能影响MDM2 mRNA的表达,两者可能共同影响Ⅰ型IFN抗病毒的效果。3.CHB患者PBMCs中的IFNAR启动子甲基化可能是与氧化应激有关系的,这或许为CHB中氧化应激诱导的表观遗传调控提供了新见解。第二部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究研究背景原发性肝癌中大约有90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HCC是世界上最常见的癌症之一,其发病率在癌症的发病率中排第五位,在癌症死亡率中排第三位。在中国每年因肝癌死亡的约有38.3万人,约占到全球肝癌死亡人数的51%。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、酒精性肝病、慢性丙型肝炎病毒感染及非酒精性脂肪性肝炎等是导致HCC发生的主要的危险因素。在中国,慢性乙型肝炎病毒感染导致的乙肝相关HCC最为常见。虽然现在的医疗技术不断发展、诊断水平得以提高、影像学检查手段更加完善,但由于HCC通常起病隐匿,发现时一般已处于中晚期,而手术切除和肝移植适用于治疗早期发现的HCC,大部分HCC患者会错过治疗的最佳时机。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是最常用于诊断HCC的标志物,但是大约40%的HCC患者血清中AFP的水平并不升高,因此寻找更加灵敏且无创的生物标志物显得尤为重要。肿瘤发生发展的重要原因之一是DNA甲基化,虽然DNA的序列没有发生改变但是对基因表达的影响是可遗传的。DNA甲基化对基因表达非常重要,同时也会对细胞产生不良后果。DNA甲基化包括DNA高甲基化和DNA低甲基化,两者都是常见的表观遗传学特征。目前关于DNA低甲基化对机体产生的影响很少有研究。在大多数情况下,DNA低甲基化是指与“正常”甲基化水平相比有所降低,如和正常细胞或者组织进行比较,与基因表达的增加有关。DNA低甲基化在肿瘤中较为常见,如肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌等。基因的低甲基化可作为诊断肿瘤的生物标志物。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）可以对p53肿瘤抑制因子进行负调控,可以泛素化降解p53,也可以结合p53的转录激活域以调节p53的表达。通常情况下,MDM2与p53之间存在可以自我调节的负反馈回路,以确保它们之间的动态平衡。然而,在肿瘤中该负反馈环通常被破坏。尤其是MDM2的过表达与多种肿瘤有关,如肉瘤、肝癌和胃癌。无论p53处于何种状态,过表达的癌蛋白MDM2不仅与p53结合并负调控p53,而且还有助于HCC的发生和进展。但是目前关于乙肝相关HCC患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中 MDM2 启动子甲基化状态以及诊断价值尚未有研究。研究目的本研究的主要目的是探讨乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态,以及对乙肝相关HCC的诊断价值。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的患者,包括100例乙肝HCC患者,31例肝硬化（liver cirrhosis,LC）患者以及37例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者,入组时间为2016年6月至2018年2月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发表的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且要求乙肝表面抗原阳性大于6个月。LC患者的入组条件根据《2015年日本胃肠病学会肝硬化循证医学临床实践指南》。2018年,AASLD中《慢性乙型肝炎的预防、诊断、治疗更新:AASLD 2018乙型肝炎指南》作为CHB患者的筛选标准。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA 的 相对表达量。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）、GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）和 MedCalc 软件（MedCalc,Ostend,Belgium）。使用Mann-Whitney U检验或者Kruskal-Wallis H检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。通过二分类logistic回归分析寻找影响MDM2启动子甲基化状态的危险因素。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理特征的相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。通过受试者工作特征曲线下面积（the area under the receiver operating characteristic curve,AUC）来评估MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合应用对于提高乙肝相关HCC诊断的价值。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.CHB患者中,PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率为72.97%（27/37）,在LC患者中的为64.52%（20/31）,在乙肝相关HCC患者中的为30.00%（30/100）。发现,乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化频率低于CHB（p=0.000）和LC（p=0.001）患者。MDM2启动子甲基化频率在CHB和LC患者是没有统计学差异的（p>0.05）。2.在乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的状态是与远处转移（p=0.040）、TNM 分期（p=0.035）及 BCLC 分期（p=0.044）有明显相关,而与性别、年龄、AFP、血管侵犯、淋巴结转移、肿瘤数量、肿瘤大小之间无相关性（p>0.05）。通过二分类logistic回归分析,结果显示各临床病理特征均不是MDM2启动子甲基化的危险因素（p>0.05）。3.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2 mRNA相对表达量明显高于LC（p=0.010）和 CHB（p=0.003）患者,CHB 和 LC 患者之间 MDM2 mRNA 相对表达水平是没有统计学差异的（p>0.05）。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.024）。4.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2 mRNA相对表达水平是与HBV DNA（p=0.009）、谷丙转氨酶（p=0.016）、谷草转氨酶（p=0.024）有显着相关性的,但是与总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间没有相关性（p>0.05）。5.区分乙肝相关HCC和CHB患者时,PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.756;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.639;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.715。区分乙肝相关HCC与LC患者时,MDM2启动子甲基化状态和血清中的AFP水平,当二者联合诊断时的灵敏度是89.00%,ROC曲线下面积是0.735;血清AFP的诊断灵敏度是52.00%,ROC曲线下面积是0.634;MDM2启动子甲基化状态的诊断灵敏度是70.00%,ROC曲线下面积是0.673。可见PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。研究结论乙肝相关HCC患者PMBCs中MDM2启动子低甲基化,并且PBMCs中MDM2启动子甲基化状态与血清AFP水平联合使用可以提高对乙肝相关HCC的诊断效率。第三部分乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究研究背景肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种世界范围的发病率高和死亡率高的原发性肝癌。HCC的病因包括肝炎病毒感染（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）、饮酒、代谢性肝病（尤其是非酒精性脂肪肝）。在中国,感染了慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）导致的乙肝相关HCC更为普遍。DNA低甲基化会导致癌基因的激活,是癌症发生和发展的主要危险因素。鼠双微体2（murine double minute-2,MDM2）作为癌基因,在乙肝相关HCC患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中存在MDM2启动子低甲基化且MDM2表达量升高,但是导致MDM2启动子低甲基化的原因并不清楚。许多研究表明,氧化应激会导致基因表观遗传学的改变,其中就包括DNA甲基化状态的改变。氧化应激是机体氧化和抗氧化之间的动态平衡被打破,更倾向于氧化。通过对血浆中氧化剂和抗氧化剂的定量检测及检测相关代谢产物的代谢组学来评估氧化应激。代谢组学被定义为“对内源性代谢物的详尽分析”,已经在寻找疾病生物标志物、探讨癌症发生发展机制中得到广泛应用。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能更好的反映生物系统的病理生理状态的变化。目前关于乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子低甲基化和氧化应激的关系尚且没有研究。研究目的1.明确乙肝相关HCC患者和健康志愿者（healthy controls,HCs）PBMCs中的MDM2启动子甲基化状态。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化状态和氧化应激的关系。研究方法研究对象为山东大学齐鲁医院肝病科的117例乙肝相关HCC患者,和招募的26例HCs,入组时间为2016年6月至2019年8月。乙肝相关HCC根据美国肝病研究协会（American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）发布的并且在2010年更新的《肝细胞癌临床指南》进行筛选,并且乙肝表面抗原阳性大于6个月。通过甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）检测MDM2启动子甲基化状态。使用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测 MDM2 mRNA的相对表达量。血浆中氧化参数丙二醛（malondialdehyde,MDA）和抗氧化参数超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）使用酶联免疫吸附剂试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定。统计分析采用 SPSS 19.0 软件（SPSS,Chicago,IL,USA）和 GraphPad Prism 6.0 软件（San Diego,CA,USA）。使用Mann-Whitney U检验比较连续变量的组间差异。使用卡方检验比较分类变量之间的组间差异。MDM2 mRNA相对表达量和临床病理参数相关性采用Spearman等级相关进行显着性检验。选取研究对象中的36例乙肝相关HCC患者和11例HCs,通过超高液相色谱-质谱（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测血浆中代谢物改变。代谢组学得到的数据通过SIMCA软件（V16.0.2,Umea,Sweden）进行处理,分别获得了主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA）。差异代谢物的筛选标准为OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance for the projection,VIP）>1,p<0.05,组间物质定量比值（fold change）>2 或<0.5。p<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.乙肝相关HCC患者PBMCs中MDM2启动子甲基化的频率是明显低于HCs（p<0.001）。对于乙肝相关HCC患者,MDM2启动子甲基化的状态是与TNM分期相关的（p=0.037）,但与性别、年龄、AFP、肿瘤数量、肿瘤大小、血管之间无明显相关性。2.在乙肝相关HCC患者中MDM2 mRNA表达量明显高于HCs（p<0.001）。通过分析发现,乙肝相关HCC患者MDM2 mRNA水平与HBV DNA（p=0.017）和 ALT（p=0.018）以及 AST（p=0.034）表现为正相关,但与 TBIL（p=0.072）、ALB（p=0.596）和PT（p=0.762）没有相关性。并且,在乙肝相关HCC患者中MDM2启动子甲基化组的MDM2 mRNA表达量明显低于非甲基化组（p=0.027）。3.乙肝相关HCC患者血浆中氧化剂MDA水平明显高于HCs（p<0.001）,抗氧化剂SOD和GSH水平明显低于HCs（SOD:p=0.009;GSH:p=0.040）。同时,在乙肝相关HCC患者中,MDM2启动子非甲基化组氧化剂MDA水平明显高于甲基化组（p=0.027）,而抗氧化剂SOD和GSH水平低于甲基化组（SOD:p<0.001;GSH:p=0.017）。4.乙肝相关HCC患者血浆中代谢物的改变和HCs存在显着差异,差异代谢物共有216种。其中正离子模式中检测到的差异代谢物包含了 144种,上调的差异代谢物包含了 88种,下调的差异代谢物包含了 56种;负离子模式中检测到的差异代谢物包含了 72种,上调的差异代谢物包含了 51种,下调的差异代谢物包含了 21种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,胆汁酸,脂肪酸类,磷脂,糖类,有机酸类和有机杂环化合物及其他类化合物。5.乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组的差异代谢物是有明显区别的,差异代谢物包含了 81种。正离子模式包含有52种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有33种,降低的差异代谢物有19种;负离子模式中包含有29种差异代谢物,其中升高的差异代谢物有19种,降低的差异代谢物有10种。这些差异代谢物分别属于氨基酸,脂肪酸类,磷脂,胆汁酸,有机酸和其他类化合物。并且我们发现,在MDM2启动子甲基化组具有抗氧化作用的代谢物消退素D1、亮氨酸等明显高于MDM2启动子非甲基化组（p<0.05）,同时可以提供甲基的S-腺苷甲硫氨酸水平明显高于非甲基化组（p=0.029）,而与氧化损伤有关的代谢物吲哚硫酸盐、硫酸对甲酚等明显低于非甲基化组（p<0.05）。6.乙肝相关HCC患者和HCs血浆差异代谢物相比,发现主要涉及到了精氨酸和脯氨酸的代谢、精氨酸和鸟氨酸的代谢、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氮代谢。乙肝相关HCC患者MDM2启动子甲基化组和非甲基化组血浆差异代谢物相比,发现差异代谢物主要涉及到半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢、组氨酸的代谢、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸的代谢。其中半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是与乙肝相关HCC患者的MDM2启动子甲基化组和非甲基化组差异代谢物相关性最显着的代谢通路。研究结论1.MDM2启动子甲基化频率在乙肝相关HCC患者的PBMCs中是明显低于HCs。2.乙肝相关HCC患者PBMCs中的MDM2启动子低甲基化状态与氧化应激有关,半胱氨酸和甲硫氨酸代谢可能在其中发挥重要作用。
马赛[3]（2021）在《血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制》文中研究说明研究背景:血小板减少是慢性病毒性肝炎的常见并发症之一,临床上尤其在慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）和慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）中发生率较高。未进展至肝硬化的慢性病毒性肝炎阶段患者通常表现为轻至中度的血小板减少（血小板数50-150×109/L）,严重血小板减少（血小板数小于50×109/L）者可出现皮肤黏膜出血、甚至内脏出血等,影响抗病毒治疗的进行,与预后不良相关。免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）可分为原发性和继发性。在许多情况下,原发性和继发性ITP的治疗方法相似。但是,继发于潜在疾病如丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）感染等,则治疗应更侧重于病毒感染本身。但严重的血小板减少会阻碍或延迟抗病毒药物的使用,因此对于慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的治疗原则主要包括两方面:即基于病原学的抗病毒治疗和基于继发血小板减少的治疗。Ⅰ型干扰素（Interferon,IFN）是抗病毒免疫反应的重要效应分子,通过结合Ⅰ型干扰素受体（Interferon alpha receptor,IFNAR）,激活下游Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路,诱导多种干扰素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes,ISGs）表达,从而发挥抗病毒作用。因此,聚乙二醇干扰素α（Pegylatedinterferonalpha,Peg-IFNα）作为国内外指南推荐的的一线药物广泛应用于慢性病毒性肝炎（CHC和CHB）的抗病毒治疗。对于不存在肝硬化或肝硬化处于代偿期的慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的患者,目前国内参考ITP的治疗共识,采用糖皮质激素联合抗病毒治疗。然而,糖皮质激素有激活肝炎病毒复制进而加重病情的危险,临床应用具有局限性。鉴于此,迫切需要安全有效的新一代疗法,以增加慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症患者的血小板计数。艾曲泊帕（Eltrombopag）是血小板生成素受体（Thrombopoietin receptor,TPO-R）激动剂,目前已成为ITP二线治疗药物。而且,艾曲泊帕也已应用于CHC患者血小板减少症的治疗,使血小板计数低的CHC患者可以启动并维持以干扰素为基础的肝病标准疗法。艾曲泊帕的作用机制类似于内源性血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）,通过与TPO-R结合进而刺激血小板生成。除此之外,艾曲泊帕还有一个重要特征就是具有铁离子螯合作用,通过降低细胞内铁离子含量影响造血干细胞的功能。单核细胞可分化为巨噬细胞或树突状细胞,参与肝炎病毒的抗原递呈,有效响应病毒性肝炎的免疫治疗。然而,艾曲泊帕作为慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的潜在治疗药物是否影响单核细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答及其机制尚不清楚。此研究对于系统认识艾曲泊帕在慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的治疗中的作用具有参考价值。研究目的:1.探究艾曲泊帕对IFN-α介导的抗病毒免疫反应的影响。2.揭示艾曲泊帕影响单核细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答的分子机制。方法与结果:1.艾曲泊帕可通过TPO-R非依赖形式抑制Ⅰ型干扰素通路。1.1艾曲泊帕差异性调控人髓系白血病单核细胞系THP-1细胞和人单核细胞内ISGs活化。收集健康志愿者的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。再用 CD14 阳选免疫磁珠从PBMCs中分选出CD14阳性单核细胞,流式细胞术检测纯度>95%。用艾曲泊帕刺激CD14阳性单核细胞以及THP-1细胞,CCK-8检测不同浓度的艾曲泊帕对两种细胞活性的影响。结果发现10μM的艾曲泊帕不会影响THP-1细胞和人单核细胞的活性。多项临床试验中检测的艾曲泊帕血药浓度高于10μM,说明本实验中选取的艾曲泊帕作用浓度符合临床药理学。收集体外艾曲泊帕处理后的THP-1细胞,提取RNA后反转录得到cDNA,实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测ISGs表达水平变化。结果显示艾曲泊帕显着增加THP-1细胞内IFN-α诱导的ISGs（CXCL10、IFIT1、IFIT2、ISG15和MX2）表达。同时,收集在体外使用艾曲泊帕处理后的CD14阳性单核细胞,提取RNA,qPCR检测ISGs表达水平变化。结果显示艾曲泊帕在人单核细胞内抑制ISGs表达,与THP-1细胞中作用相反。1.2艾曲泊帕调控ISGs活化水平与TPO-R有关。鉴于艾曲泊帕TPO-R激动剂的经典功能,为探究其对于THP-1细胞及人单核细胞ISGs调控存在差异的原因,分别提取THP-1细胞和人单核细胞的总蛋白,使用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测TPO-R表达水平,结果发现TPO-R在两种细胞中存在显着差异。将含有小干扰RNA（Small interfering RNAs,siRNAs）和转染试剂的转染复合物加入THP-1细胞内,48小时后收集细胞,Western blotting检测干扰效率。使用siRNA转染将THP-1细胞中TPOR基因下调后,qPCR检测艾曲泊帕处理后THP-1细胞内ISGs表达水平变化。结果发现TPOR基因下调显着抑制艾曲泊帕对THP-1细胞中ISGs表达的增强作用。以上结果说明,艾曲泊帕差异性调控THP-1细胞和人单核细胞内ISGs的活化水平可能与TPO-R的表达水平有关。1.3艾曲泊帕可通过TPO-R非依赖形式抑制IFN-α诱导的ISGs表达。由于艾曲泊帕无法激活小鼠的TPO-R,因此小鼠是研究艾曲泊帕TPO-R非依赖作用的理想模型。收集野生型C57BL/6J小鼠骨髓细胞,用小鼠骨髓单核细胞分离液试剂盒提取单核细胞层,种板后2-4小时内贴壁的为单核细胞。收集不同浓度或不同时间的艾曲泊帕处理的小鼠骨髓单核细胞（Bone marrow mononuclearcells,BM-MNCs）,qPCR检测结果显示艾曲泊帕对小鼠BM-MNCs内ISGs表达的抑制呈剂量依赖性和时间依赖性。用艾曲泊帕体外处理小鼠BM-MNCs后,Western blotting检测发现艾曲泊帕抑制小鼠BM-MNCs内IFN-α下游STAT1磷酸化。与艾曲泊帕不同,重组人血小板生成素（Recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO）和另外一种血小板生成素受体激动剂罗米斯汀（Romiplostim）均可以与小鼠的TPO-R结合。qPCR和Western blotting检测发现,rhTPO和Romi对小鼠BM-MNCs内IFN-α下游STAT1磷酸化和ISGs表达无明显影响。因此,可以明确艾曲泊帕可通过不依赖于TPO-R的途径抑制Ⅰ型干扰素通路。2.艾曲泊帕通过螯合细胞内铁离子抑制Ⅰ型干扰素通路。2.1艾曲泊帕体外刺激CHB伴血小板减少症患者的单核细胞进行转录组差异基因分析,发现铁代谢在其中具有重要作用。收集CHB伴血小板减少症患者的外周血,免疫磁珠分选出CD14阳性单核细胞后,体外加艾曲泊帕处理。收集细胞,提取RNA,进行转录组测序技术（RNA-seq）测序。使用R及RStudio软件将测序结果进行配对分析,得到矫正后p值小于 0.05 的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）91 个,其中铁代谢相关基因BOLA2在艾曲泊帕加药组显着下调。为进一步验证,使用siRNA转染将小鼠BM-MNCs中Bola2基因下调。qPCR结果显示Bola2下调抑制IFN-α诱导的ISGs表达。这些数据表明,艾曲泊帕可通过调节铁代谢相关机制抑制Ⅰ型干扰素信号通路。2.2艾曲泊帕通过螯合单核细胞内铁离子以抑制ISGs表达。去铁胺（Deferoxamine,DFO）是经典的铁离子螯合剂。首先CCK-8检测了不同浓度的DFO对细胞活性的影响。结果发现低于20μM的DFO不会影响单核细胞的活力。之后qPCR和Western blotting检测发现,DFO与艾曲泊帕趋势相同,均可降低小鼠BM-MNCs内IFN-α诱导的STAT1磷酸化水平和ISGs表达。在艾曲泊帕处理组加入硫酸亚铁（Ferroussulfate,FeSO4）后,qPCR结果显示艾曲泊帕的抑制作用被部分恢复。为证明艾曲泊帕的确螯合了细胞内的铁离子,将对活细胞荧光标记的细胞染色试剂钙黄绿素乙酰氧基甲酯（CalceinAM）加入细胞内,再加入艾曲泊帕处理后,流式细胞仪检测平均荧光强度（Mean fluorescence intensity,MFI）以显示细胞内可变铁池（Labile iron pool,LIP）的水平变化。流式结果证明艾曲泊帕处理组的细胞内游离铁减少。以上结果说明,艾曲泊帕通过螯合细胞内的铁抑制ISGs的表达。3.艾曲波帕调控铁离子介导的活性氧生成抑制Ⅰ型干扰素通路。3.1艾曲泊帕抑制细胞内活性氧生成。因为细胞内的铁离子会通过Fenton氧化反应参与活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,因此我们检测了艾曲泊帕对人单核细胞内ROS水平的影响。将氧化敏感荧光探针DCFDA（2,7-二氯荧光素二乙酸酯）加入人单核细胞内,再加入艾曲泊帕处理后,酶标仪记录荧光值变化。结果发现H2O2可迅速升高细胞内ROS水平,而艾曲泊帕能够降低内源丰富的ROS水平。3.2艾曲泊帕降低ROS生成从而抑制JAK激酶活化及下游ISGs表达。为了进一步明确ROS是否参与单核细胞内艾曲泊帕介导的IFN-α下游通路抑制,使用qPCR检测艾曲泊帕和过氧化氢（Hydrogenperoxide,H2O2）共同加药组ISGs表达水平,同时使用Western blotting检测ROS参与影响的蛋白质磷酸化水平。结果发现H2O2可逆转艾曲泊帕对ISGs表达的抑制以及对JAK1和STAT1的磷酸化水平的降低。以上结果说明,艾曲泊帕通过螯合细胞内游离铁减少ROS产生,从而抑制IFN-α诱导的JAK的活化及下游ISGs生成。结论:本研究证实艾曲泊帕通过铁离子螯合作用,降低单核细胞内游离铁,导致ROS生成减少,从而抑制了 IFN-α诱导的JAK1和STAT1的磷酸化,最终导致ISGs表达降低,抑制I型干扰素通路。本研究对于系统认识艾曲泊帕在慢性病毒性肝炎伴血小板减少症的治疗中的作用具有参考价值。
郭玲[4]（2020）在《CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究》文中指出背景慢性乙型病毒性肝炎是一种免疫介导肝脏损伤的疾病。宿主的免疫功能对乙型肝炎病毒（HBV）感染的控制和疾病的临床转归有重要作用。CD8+T细胞免疫反应在控制慢性HBV感染中占据重要的地位,其功能“耗竭”是导致HBV感染慢性化的重要原因。但不断有研究表明CD8+T细胞是由表型和功能异质的亚群组成的。不同CD8+T细胞亚群可能在HBV感染中发挥不同作用。因此,深入探索CD8+T细胞的亚群可能有助于寻找慢乙肝治愈的新策略。目的本研究通过慢性HBV感染患者横向队列和抗病毒治疗患者的纵向队列探索CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染和抗病毒治疗中的表型和功能特点;分析肝内CXCL13表达对CXCR5+CD8+T细胞的趋化作用及与预测抗病毒治疗疗效的关系;最后通过小鼠细胞免疫过继实验阐明CXCR5+CD8+T细胞在肝内发挥抗病毒作用的免疫机制。方法在健康志愿者（HCs）、慢性HBV感染患者横向人群和临床抗病毒治疗纵向队列中,利用流式细胞术、酶联免疫实验、RNA测序等方法检测CXCR5+CD8+T细胞的表型与功能特点,利用体外共培养实验检测其对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。接着利用HBV感染者的肝癌（HCC）标本分析肝内CXCR5+CD8+T细胞的特点。另外,我们还通过检测抗病毒治疗纵向队列以及停药队列患者血清CXCL13的水平,并分析其与患者预后的关系,明确CXCL13趋化CXCR5+CD8+T细胞到肝内发挥抗病毒的分子机制。然后,我们利用高压尾静脉注射法（HDI）注射pAAV-HBV1.2质粒建立HBV感染小鼠模型,并利用IL-21受体基因敲除（IL-21RKO）小鼠和B细胞缺陷型（μMT）小鼠,检测CXCR5+CD8+T细胞在外周血、肝和脾脏中的表型与功能差异,以及探索IL-21R信号通路和B细胞对CXCR5+CD8+T细胞功能的影响。最后通过CXCR5+CD8+T细胞过继免实验,明确CXCR5+CD8+T细胞的抗病毒作用。结果1.慢性HBV感染患者CXCR5+CD8+T细胞中的特点1.1 HBV感染患者与HBsAg loss（慢性HBV感染患者HBsAg清除）患者CXCR5+CD8+T细胞频数显着高于HCs,且HBsAg loss患者CXCR5+CD8+T细胞频数也高于HBV组。1.2 相比于 CXCR5-CD8+T 细胞,CXCR5+CD8+T 细胞上 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CD38、CD69、CCR7、CD45RO、CD62L 表达更高,分泌干扰素（IFN）-γ、IL-2、IL-4、IL-17和IL-21能力更增强,但分泌granzyme B能力降低。1.3我们通过收集HBV感染的肝癌患者肝内淋巴细胞与外周血单个核细胞（PBMC）,发现肝内 CXCR5+CD8+T 细胞表达更高的 PD-1、CTLA-4、TIM-3、CD38、CD69、HLA-DR和CCR2等趋化因子受体。且肝内CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ能力比外周血CXCR5+CD8+T细胞强。通过五聚体标记HBV C18-27肽特异性CD8+T细胞时,我们发现肝内HBV特异性CXCR5+CD8+T细胞中的比例显着高于外周血。2.外周血CXCR5+CD8+T细胞与CXCL13表达预测替比夫定抗病毒治疗疗效2.1我们通过检测替比夫定抗病毒治疗队列患者PBMC中CXCR5+CD8+T细胞的动态改变,结果发现52周完全应答的患者（CR组）基线和第12周外周血CXCR5+CD8+T细胞频数升高,且该细胞亚群分泌IFN-γ能力在基线和第24周也显着升高。2.2抗病毒治疗基线和治疗第12周外周血CXCR5+CD8+T细胞频数与第52周时HBV DNA水平呈显着负相关。2.3通过替比夫定抗病毒治疗纵向队列血清检测,发现在抗病毒治疗的基线、第12周和第52周时间点,完全应答（CR）组患者血清CXCL13水平显着高于非完全应答（NCR）组。抗病毒治疗停药后,未复发组患者血清CXCL13水平也显着高于复发组。而我们利用HBV感染患者肝穿标本,发现肝内CXCL13 mRNA表达水平与外周血CXCL13水平呈正相关。3.CXCR5+CD8+T细胞通过分泌IFN-γ和辅助B细胞产生抗体控制HBV感染3.1分选外周血CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞,体外使用anti-CD3/CD28刺激,结果发现,相比于CXCR5-CD8+T细胞培养组,CXCR5+CD8+T细胞的培养上清中IFN-γ分泌升高,而granzymeB分泌减弱。利用培养上清刺激HepG2.2.15细胞后,我们发现CXCR5+CD8+T细胞组中HBsAg和HBeAg表达量降低更显着,而对HepG2.2.15细胞的杀伤作用更弱。3.2分选CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞后分别与B细胞共培养,结果发现CXCR5+CD8+T细胞的共培养体系中,分泌HBcAb的B细胞频数增加。4.HBV感染小鼠模型中CXCR5+CD8+T细胞的特点及对病毒控制的作用4.1通过注射pAAV-HBV1.2质粒建立HBV感染小鼠模型,我们发现HBV感染小鼠脾脏和肝内CXCR5+CD8+T细胞频数均高于外周血。与CXCR5-CD8+T细胞相比,CXCR5+CD8+T细胞上高表达PD-1、CCR7、CD62L和ICOS等受体。4.2分离肝、脾淋巴细胞后,通过anti-CD3/anti-CD28刺激,我们发现脾脏和肝脏的CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ和IL-21能力显着强于CXCR5-CD8+T细胞。而肝内CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ能力强于脾脏。4.3我们分选CXCR5+CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞,通过尾静脉过继免疫到HBV感染小鼠上,发现过继转移24h和48h时可以在肝脏内检测到到较高的CXCR5+CD8+T细胞频数。而且接受了 CXCR5+CD8+T细胞的小鼠血清HBsAg水平显着降低,且可以检测到相对更高水平的HBcAb。5.影响CXCR5+CD8+T细胞的抗病毒作用的分子机制5.1 HBV相关性HCC患者肝脏和外周血CXCR5+CD8+T细胞的IL-21R表达较CXCR5-CD8+T细胞的高,且其在肝脏内表达也显着高于外周血。5.2体外实验使用PD-1或TIM-3抑制性抗体以及IL-21刺激均可以使CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-y增加,而IL-21联合免疫检查点抑制剂作用更强。5.3在IL-21R-KO小鼠上建立HBV感染小鼠模型,结果发现IL-21R-KO小鼠和WT小鼠肝脏、脾脏或外周血CXCR5+CD8+T细胞频数无差异,但IL-21R KO小鼠肝内和外周血CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ的能力下降。5.4在μMT小鼠上建立HBV模型,结果发现μMT小鼠肝脏和脾脏CXCR5+CD8+T细胞频数较WT小鼠显着降低,同时肝内和外周血CXCR5+CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力下降。结论CXCR5+CD8+T细胞频数和其IFN-γ分泌功能与慢性HBV感染者的替比夫定抗病毒治疗应答相关。CXCR5+CD8+T细胞可以通过IFN-γ分泌以及辅助B细胞分泌抗体,发挥抗病毒作用。慢性HBV感染者肝炎活动时CXCL13表达升高,有助于趋化CXCR5+CD8+T细胞到肝内从而控制HBV。虽然CXCR5+CD8+T细胞呈现部分耗竭状态,但是体外和动物实验表明,IL-21可以显着增强其抗病毒功能。
魏艳艳[5]（2019）在《TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究》文中研究说明乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起,危及全球人类健康的传染病。在HBV感染过程中,适应性免疫应答在肝脏损害及病毒清除中发挥重要作用。研究表明,急性HBV感染时,激活外周血CD4+辅助性T细胞及CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocyte response,CTL）反应能够有效清除病毒。慢性HBV感染时,抑制性受体在病毒特异性CD8+T细胞表达逐渐增多,参与了CD8+T细胞耗竭,使其无法发挥有效清除病毒作用,导致病毒持续存在和肝损伤。阻断抑制性受体通路可逆转T细胞耗竭,增强T细胞免疫,从而增强病毒清除能力。T细胞免疫球蛋白域和免疫受体酪氨酸抑制基序（T cell immunoglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT）是在基因组研究中发现的共抑制受体,主要表达于T细胞、自然杀伤性细胞（Natural killer,NK）和调节性T细胞（Regulated T cell,Treg）等细胞表面。在病毒感染免疫方面,TIGIT在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）等感染的T细胞免疫中作为共抑制受体起关键作用。TIGIT作为抑制性受体在乙肝病毒感染中作用的相关研究少。近期有研究报道,在HBs Ag阳性小鼠中,TIGIT作用于肝脏HBV特异性CTL导致细胞免疫耐受,HBV难以清除,阻断TIGIT通路或抑制TIGIT表达可使HBV特异性CTL功能恢复,导致肝脏炎症激活和乙肝病毒清除。程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1,PD-1）也是参与T细胞耗竭的一个关键负调控分子。TIGIT作为抑制性受体在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能及其与PD-1是否有协同作用尚无相关报道。本研究主要探讨TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能,并揭示TIGIT与PD-1在慢性HBV感染者T细胞功能耗竭中的协同作用。本研究分为以下三个部分:第一部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达的研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞、T细胞分化亚群和HBV特异性CTL上的表达及其与PD-1表达的关系。方法:收集和分离73例慢性HBV感染者和28例健康志愿者（healthy donors,HD）血浆和外周血单个核细胞（PBMC）并冻存。采用流式细胞术检测:（1）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞表达;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞不同分化阶段的表达;（3）采用人白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-A*0201/FLPSDFFPSV（HBVcore18-27）和HLA-A*0201/NLVPMVATV（cytomegalovirus 65 k Da Phosphoprotein,CMVpp65）五聚体（pentamer,PENTA）检测HBV和CMV特异性CTL,随后检测TIGIT和PD-1在HBV及对照CMVpp65特异性CTL表达。结果:（1）与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达明显升高（12.28±0.93%vs.7.98±0.86%,P=0.0083;30.77±2.00%vs.16.61±2.17%,P=0.0001）;（2）与乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBe Ag）阴性组相比,TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者组CD4+和CD8+T细胞表达明显升高（13.79±1.31%vs.10.19±1.17%,P=0.0130;32.94±2.84%vs.27.75±2.64%,P=0.0043）;（3）与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者各T细胞分化亚群表达均上调（P值均<0.05）;且TIGIT在慢性HBV感染者CD28-CD45RA+CD4+和CD28-CD45RA+CD8+T细胞表达最高（P<0.01,P<0.001）;（4）TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上的表达和PD-1的表达呈正相关。TIGIT和PD-1在CD4+T细胞及CD8+T细胞表面均存在双阳性表达;（5）与CMVpp65特异性CTL相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高（P<0.0001,P=0.0003）;（6）与PENTA-CD8+T细胞相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高（P<0.0001,P<0.0001）;（7）TIGIT和PD-1在HBVcore18-27特异性CTL上双阳性表达所占百分比与TIGIT单阳性及PD-1单阳性表达所占百分比相比有差异（P<0.001）,以双阳性表达所占百分比最高。结论:（1）TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达均上调,在效应性T细胞亚群的表达最高;TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者PBMC中的T细胞表达高于HBe Ag阴性者;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上存在共表达状态;（3）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBV特异性CTL高表达,且以TIGIT和PD-1共表达状态为主。第二部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞中的功能研究目的:研究TIGIT对慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌、细胞增殖及凋亡敏感性的影响及TIGIT和PD-1的协同作用。方法:收集和分离85例慢性HBV感染者血浆和PBMC并冻存。采用流式细胞仪检测:（1）用佛波酯/离子霉素（phorbol 12-myristate-13-acetate/ionomycin,PMA/ionomycin）刺激,表面染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群表达CD69;采用胞内染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群分泌颗粒酶B（Granzyme B,Gr B）和穿孔素（Perforin）;（2）用HBVcore18-27肽段刺激,检测:（1）TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群表达CD69,TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群分泌Gr B、Perforin、干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）、白介素-2（Interleukin-2,IL-2）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）;（2）采用羟基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺脂（carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）实验检测细胞增殖;（3）TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞在未处理组、活化诱导凋亡（activation induced cell death,AICD）组和阻断TIGIT通路组凋亡比例;（4）用PMA/Ionomycin刺激,检测TIGIT+PD-1+和TIGIT-PD-1-CD8+T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α;（5）阻断TIGIT和/或PD-1通路,用HBVcore18-27肽段刺激,检测HBV特异性CTL分泌IFN-γ和IL-2。结果:（1）与TIGIT-CD8+T细胞群相比,TIGIT+CD8+T细胞群表面活化标记CD69表达明显升高（P=0.0095）,TIGIT+CD8+T细胞群中分泌Gr B和Perforin的细胞所占百分比明显下降（P=0.0205,P=0.0377）;（2）与TIGIT阴性HBV特异性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群表达CD69明显升高（P=0.0014）,TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌Perforin和Gr B的细胞所占百分比明显下降（P=0.0360,P=0.0205）;（3）与TIGIT阴性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞所占百分比均下调（P=0.0407,P=0.0446,P=0.0087）,细胞增殖降低（P=0.0029）;阻断TIGIT通路并用HBVcore18-27肽段刺激,HBV特异性CTL增殖增加（P=0.0023）;（4）与未活化诱导组相比,活化诱导后CD8+T细胞群凋亡敏感性增强（P=0.0004）;与活化诱导后TIGIT-CD8+T细胞组相比,活化诱导后TIGIT+CD8+T细胞群凋亡敏感性增强（P=0.0070）;阻断TIGIT通路,CD8+T细胞凋亡敏感性下降（P=0.0003）;（5）与TIGIT-PD-1-CD8+T细胞相比,慢性HBV感染者TIGIT+PD-1+CD8+T细胞分泌IFN-γ（P<0.001）、IL-2（P<0.001）、TNF-α（P<0.001）所占百分比明显下调;与对照组相比,阻断TIGIT和/或PD-1通路慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多（P<0.001,P<0.001）;与单独阻断TIGIT通路相比,联合阻断TIGIT和PD-1通路组慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多（P<0.001,P<0.001）。结论:（1）表达TIGIT的慢性HBV感染者PBMC中CD8+T细胞和HBV特异性CTL活性增加,其释放效应分子功能受到抑制;（2）TIGIT参与抑制慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌和细胞增殖,使其细胞凋亡敏感性增加;（3）阻断TIGIT通路,慢性HBV感染者HBV特异性CTL分泌细胞因子上调,细胞增殖功能增强,CD8+T细胞凋亡敏感性降低;（4）阻断TIGIT和PD-1通路可逆转耗竭的HBV特异性CTL细胞因子分泌功能。第三部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达与临床指标相关性研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达与临床指标的相关性。方法:收集和分离141例慢性HBV感染者和20例HD外周血血浆和PBMC并冻存。用如下方法检测:（1）全自动生化仪检测谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和转肽酶（gamma-glutamyl transpeptidase,GGT）等指标;（2）化学发光法检测乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）、HBe Ag滴度等;（3）实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测HBVDNA载量;（4）采用流式细胞术检测:（1）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达;（2）TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达;（3）TIGIT在慢性乙型肝炎组、乙肝相关肝硬化组和乙肝肝硬化合并原发性肝癌组和健康者组外周血CD4+和CD8+T细胞表达;（4）TIGIT在接受拉米夫定（lamivudine,LAM）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil,ADV）、替比夫定（Telbivudine,LDT）和恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗和未接受抗病毒治疗慢性HBV感染者外周血CD4+和CD8+T细胞表达。结果:（1）TIGIT在CD4+和CD8+T细胞表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（2）TIGIT在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;PD-1在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（3）TIGIT和PD-1在CD4+和CD8+T细胞共表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;（4）与未接受抗病毒治疗组相比,TIGIT在接受四种核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达均下调,有明显统计学差异（P<0.001,P<0.001）,且在ETV组表达最低;（5）随着慢性HBV感染病程进展,TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达呈上升趋势（P<0.001,P<0.001）,且TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞共表达亦呈上升趋势（P<0.001,P<0.001）。结论:（1）在慢性HBV感染者中,乙肝病毒复制和肝脏炎症环境可能诱导TIGIT和PD-1在T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达上调,并随着病情进展TIGIT和PD-1在T细胞的共表达呈上升趋势;（2）四种核苷（酸）类似物抗病毒药物均可抑制TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达。
周文靖[6]（2019）在《直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析》文中提出研究背景:慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。近年来,直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents,DAAs）的出现,使HCV感染成为可以治愈的疾病。自然杀伤（natural killer,NK）细胞作为机体天然免疫系统的主要成分,不仅在HCV感染早期病毒的自发清除中发挥着重要的作用,还与慢性HCV感染阶段机体的抗病毒治疗效果密切相关。目前,有关DAAs的研究大多集中在其临床疗效方面,对机体免疫系统的影响研究较少,尤其是DAAs治疗对CHC患者NK细胞免疫学特点的影响尚不明确。目的:本研究对接受达拉他韦（daclatasvir,DCV）和阿舒瑞韦（asunaprevir,ASV）治疗的初治型HCV 1b型CHC患者外周血NK细胞的亚群、表型和功能进行研究,以探索DAAs治疗对CHC患者外周血NK细胞免疫学特点的影响。方法:入组13例初治型HCV 1b型CHC患者,使用DCV/ASV治疗24周。同时,入组13例性别和年龄与之相匹配的健康者为健康对照（healthy controls,HC）组。采用流式细胞术分析患者治疗前、治疗第24周、治疗结束后随访第12周、随访第24周时外周血NK细胞的亚群、表型（HLA-DR,CD38,NKp46,NKp30,NKG2A）和功能（CD107a,IFN-γ,TNF-α）的特点。结果:（1）13例CHC患者经DCV/ASV抗病毒治疗24周均达到持续病毒学应答,且肝脏功能恢复正常;（2）与HC组相比,CHC患者抗病毒治疗前外周血NK细胞的亚群分布发生改变,且其表达HLA-DR、NKp46、CD38的水平增高,表达CD107a和分泌TNF-α的能力增强,但产生IFN-γ的能力减弱;（3）经DAAs治愈的CHC患者外周血NK细胞的亚群分布部分恢复,且其表达HLA-DR、NKp46的水平降低,表达CD107a的水平下降,分泌IFN-γ的能力增强。结论:DAAs可有效清除HCV,经DAAs治愈的CHC患者外周血NK细胞的活化程度降低、功能及亚群分布发生恢复。本研究阐明了DAAs治疗不但能直接抑制HCV的复制,而且可以实现CHC患者NK细胞表型和功能的恢复。
赵艳[7]（2019）在《miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究》文中指出目的:探讨micro RNA-141（miR-141）在Hepatitis C virus（HCV）感染过程中发挥的作用。主要从两方面进行研究,miR-141对HCV进入宿主细胞的调节机制及对interferonβ（IFNβ）信号通路的改变及HCV复制的影响。方法:利用q RT-PCR检测miR-141及相关基因的m RNA水平;Western blot和免疫组化等方法检测EPH receptor A2（Eph A2）及相关基因的蛋白表达;利用HCV病毒颗粒检测试剂盒测定制备的病毒滴度以及经处理的细胞培养上清中释放的病毒颗粒的滴度;利用免疫荧光检测进入细胞中的HCV颗粒、细胞表面受体的表达及共定位情况;用Target Scan、Pic Tar、star Base等在线软件预测miR-141的靶基因;利用UCSC、Reg RNA2.0等在线软件预测靶基因的启动子序列,并寻找靶基因与miR-141结合的位点;利用双荧光素酶报告基因试验验证miR-141与Eph A2之间的靶向关系及IFNβ和NF-κB p65的活性;利用si RNA敲低Eph A2和TLR8,分析敲低Eph A2与过表达miR-141的生物学影响的相似性;利用Eph A2的小分子抑制剂dasatinib处理肝癌细胞;利用共培养的方法检测过表达miR-141对细胞-细胞接触介导的HCV进入的影响。结果:Mi R-141在HCV感染的患者阳性外周血中表达极低,在HCV感染相关的肝癌组织中表达明显低于临近癌旁组织。过表达miR-141明显减少了进入细胞内的HCV非结构蛋白NS5A和结构蛋白Core的表达;免疫荧光结果显示,病毒感染早期,过表达miR-141的细胞中HCV Core的表达明显低于对照细胞;双荧光素酶报告基因实验验证了过表达miR-141能明显抑制Eph A2的表达;过表达miR-141的细胞中Eph A2的表达明显被抑制;HCV感染相关的肝癌组织Eph A2的表达明显高于临近癌旁组织;利用si RNA敲低Eph A2,明显减少了细胞内HCV NS5A和Core的表达;利用Eph A2的特异性抑制剂Dasatinib处理后,Eph A2的表达明显被抑制,细胞内HCV NS5A和Core的表达明显减少,进入细胞内HCV Core的表达减少;过表达miR-141抑制了Eph A2-CLDN1、Eph A2-OCLN以及CD81-CLDN的共定位;过表达miR-141能明显减少细胞-细胞间病毒的传播。另一方面,随HCV的感染的时间长,miR-141的表达逐渐降低;过表达miR-141明显降低了HCV Core和NS5A的表达;过表达miR-141的细胞,在感染HCV后IFNβ的表达明显增加;过表达miR-141增加了IFNβ信号通路中IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达;Western blot结果显示,IRF3、c-Jun和NF-κB p65的表达增加;敲低miR-141后,细胞内IFNβ信号通路中IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达减少,而HCV NS5A和Core的表达增加;非变性蛋白的Western blot结果显示,过表达miR-141的细胞在HCV感染后形成的IRF3二聚体明显增加,而敲低miR-141后二聚体的形成明显被抑制;体外过表达miR-141明显增加了TLR7、TLR8和TLR9的表达;软件预测发现miR-141能与IFNβ信号通路上游的TLR8基因的启动子区域结合;敲低TLR8,细胞内HCV NS5A和Core的表达明显增加,细胞内IRF3、c-Jun及NF-κB p65的表达及IRF3的二聚体化都减少。结论:miR-141可通过下调Eph A2,从而减少Eph A2与CLDN1和OCLN的结合,抑制CD81和CLDN1共定位,减少病毒-细胞受体复合物的内化,从而抑制HCV进入宿主细胞。miR-141能通过增强TLR8的表达而进一步激活IFNβ信号通路的表达,增强机体对HCV感染的抵抗作用。
王冬耀[8]（2019）在《Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究》文中进行了进一步梳理慢性感染性疾病以及恶性肿瘤严重威胁着当今世界人类的健康。近年来虽然出现了众多抗感染药物,对肿瘤的发病机制也从细胞水平到分子水平有了更为深入的认识,同时肿瘤靶向药物和小分子抑制剂的应用也取得了一定程度的临床疗效,然而在治疗过程中仍然存在着各种需要改善的问题,如何提高慢性感染性疾病以及恶性肿瘤的临床治疗效果已经成为亟待解决的重要问题之一。慢性乙型肝炎在世界范围内,尤其在亚洲地区,感染者数目仍然很多。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要分为干扰素和核苷或者核苷酸类似物等。然而在临床治疗过程中发现,只有干扰素才能够在部分乙肝患者中达到清除HBsAg及HBeAg的效果,其机理有很多,主要认为可能是通过STAT1分子向下游传递信号,从而诱导干扰素刺激基因的表达。因此对于干扰素应答与不应答患者之间的免疫学机制研究,从而寻找能够提高干扰素疗效的策略,已经成为关注的重要问题。T细胞与自然杀伤细胞（NK细胞）对抗病毒感染等起着至关重要的促进作用,但在慢性感染过程中,T细胞和NK细胞往往处于功能耗竭的状态。细胞因子IL-2对多种免疫细胞有着活化与扩增的作用,而且曾经应用于多种肿瘤的临床治疗。但是对于继干扰素使用后能否再序贯使用IL-2治疗尚未见报道。考虑到干扰素以及IL-2下游均能够通过STAT1分子传递信号,所以针对经过干扰素治疗后无效的慢性乙肝患者,能否序贯使用IL-2从而起到协同提高T细胞和NK细胞的免疫应答能力?该方法是否适合应用于乙肝患者的临床治疗?能否有利于提高临床治疗效果?我们主要针对上述三个问题,对经干扰素治疗无应答的乙肝患者展开临床试验研究。由慢性乙型肝炎逐渐进展,可能发展为肝硬化,最终进展为肝癌。而目前针对肝癌的药物并不多且效果并不理想,无论免疫卡控点治疗还是索拉菲尼,都无法显着延长患者生存期。手术一直是肝癌治疗的主要方式之一,但是手术也存在着很大的风险,即术后易于原位复发。肝脏本身具有强大的术后再生能力,IL-6家族成员均可通过STAT3向下游传递信号,促进肝脏再生,同时有报道认为IL-11与肝切除后肝脏细胞的代偿性增生有关,IL-11-STAT3信号通路对于结直肠癌的发生起到至关重要的作用。因此术后的再生过程是否也伴随或者促进了肿瘤的生长?IL-11-STAT3信号是否起到促进肝癌生长的作用?能否寻找一种行之有效的方式抑制肝癌术后的复发?围绕着这三个问题我们对于肝癌的术后展开了研究。本文主要从寻找提高无应答乙肝患者治疗临床效果和防止肝癌术后复发两个方面展开研究,获得了如下结果。Ⅰ.序贯使用IL-2可提高经干治疗无效的患者抗病毒应答能力通过第一项临床试验,我们选取了 92例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者。接受48周的标准长效干扰素治疗,并进行24周的随访。我们对入组的患者及正常人对照组的PBMC进行了系统的临床特征及免疫学分析,发现干扰素治疗为IL-2治疗提供了基础。继而我们通过第二项临床试验,对于经干扰素治疗无效的患者进行24周的序贯IL-2治疗。通过使用流式细胞术、ELISA、免疫荧光、western blotting、RTCA及相关性分析等,发现了序贯使用IL-2治疗能够提高临床治疗效果的机制。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.干扰素治疗后大多数患者为无应答患者,且IL-2Rα在CD4+T细胞表达降低通过分析经干扰素治疗后患者免疫学指标及临床指标,发现经过干扰素标准化治疗后多数患者为无应答患者,HBeAg未能转阴。IL-2R发生了显着变化,尤其IL-2Rα在CD4+T细胞表达显着下降。同时NK细胞表面的IL-2Rβ及IL-2Rα的表达在干扰素治疗后显着升高。总之,IFN-α治疗后,IL-2R主要传递正向免疫信号,从而为序贯IL-2治疗做铺垫。2.体外使用IL-2刺激可提高无应答患者T细胞及NK细胞的效应功能。当体外使用IL-2刺激从无应答患者外周血分离出的PBMC后,发现可以显着提高该部分患者T细胞及NK细胞的抗病毒效应功能,使产生IFN-γ及TNF-α的能力显着增强。CD38、NKG2D等活化分子表达升高,同时并未升高负调分子如PD-1,Tim-3的表达,且Treg细胞比例也未见升高。3.使用IL-2刺激可提高CHB患者肝脏组织淋巴细胞的效应功能。通过从乙肝患者肝穿组织分离的淋巴细胞进行IL-2体外刺激,发现不仅可以上调活化分子CD38、NKp30的表达,同时可以提高IFN-γ在淋巴细胞中的表达。4.体内经IL-2序贯治疗后不升高负调分子表达。通过对无应答患者进行IL-2治疗后检测发现,Treg细胞比例及PD-1分子表达均未见升高,反而有所下降。IL-2Rβ在NK细胞的表达显着升高。5.序贯IL-2治疗后增加p-STAT1表达同时下调p-STAT5表达通过western blotting检测发现对于体外使用IL-2刺激的无应答乙肝患者PBMC,p-STATl表达升高,p-STAT5表达下降。通过流式细胞术检测,经IL-2治疗后的患者,CD4+T细胞中p-STAT5表达下降。通过免疫荧光检测发现,淋巴细胞中的p-STAT1表达呈现出显着增加。6.使用IL-2治疗显着提高CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-γ。通过对不同时间点动态检测发现,经干扰素治疗无效的患者在IL-2治疗后,CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α及CD107a的水平显着升高。对患者治疗前后的血清进行比较,发现IFN-γ,IFN-αα水平在治疗后显着升高,而IL-10水平则保持稳定。7.使用IL-2治疗显着提高HBV特异性CD8+T细胞比例及杀伤作用。通过对不同时间点动态检测发现,在IL-2治疗后,pentamer+CD8+T细胞比例显着升高,此外CD44+CD62I-CD8+T细胞比例以及NKp30表达也有着显着升高。pDC细胞及CD80、CD86分子的表达也是呈现出显着增多。继而通过RTCA检测发现,从经IL-2治疗后的患者PBMC中分离出的CD8+T细胞具有更强的杀伤PLC/PRF/5细胞的功能。8.体内IL-2治疗可提高临床治疗效果通过对入组的23例患者临床资料分析发现,HBeAg水平在干扰素治疗前后未发生显着变化;然而经IL-2治疗后,HBeAg水平则显着下降。同时有5位患者HBeAg转阴,此外一位患者HBsAg转阴且伴有抗体的产生。对于免疫学指标与HBeAg进行相关性分析发现,pentamer+CD8+T细胞比例及 IFN-γ+CD107a+CD8+T细胞比例与HBeAg呈现明显负相关关系。9.CD24+CD38hiB细胞负调IFNα治疗效果然而并非所有乙肝患者经干扰素治疗后都适合序贯IL-2治疗,因此对于这部分患者则可能需要其他治疗策略。在研究过程中,除上述结果外,我们还发现了CD24+CD38hiB细胞比例及数目随干扰素的治疗呈现出动态增加,且CD24可作为CD24+CD38hi B细胞的标志分子。CD24+CD38hi B细胞可分泌高水平IL-10从而负调免疫应答。通过分选去除CD24+CD38hi B细胞后,则可以提高T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α的能力。最后通过构建的HBV小鼠模型使用anti-CD24抗体联合干扰素治疗,发现与单独干扰素治疗相比,发现可显着促进HBeAg及HBsAg的下降。综上所述,本研究表明虽然CHB患者经干扰素治疗后多数呈现无应答状态,但是CD4+T细胞表面的IL-2Rα表达下降,并且IL-2的高亲和力受体IL-2Rαβy表达降低,从而限制了 IL-2通过其下游STAT5分子磷酸化诱导FOXP3的表达,进而抑制了负向免疫应答。而序贯使用IL-2治疗后,则能够通过升高IL-2中亲和力受体IL-2Rβγ表达、促进STATI分子磷酸化,同时降低STAT5磷酸化,发挥正向免疫应答效应,包括提高CD8+T细胞和NK细胞的效应功能,以及pentαmer+CD8+T细胞比例等。与此同时,并不增加免疫负调分子表达及FOXP3+Treg细胞的比例。这些机制最终促进了抗病毒应答能力,并一定程度上促进了 HBeAg或HBsAg的清除。因此序贯IL-2的治疗对提高临床使用干扰素之后的HBeAg转阴率具有重要意义。而对于不适合序贯使用IL-2治疗的患者,anti-CD24抗体治疗或许又是一个有前景的、可供选择的方案。Ⅱ、肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发通过使用原位接种肿瘤模型,化学诱导致癌模型,原位移植瘤模型,研究手术对肿瘤的影响。通过基因芯片分析及基因敲除鼠验证IL-11是否对肿瘤生长起到促进作用。最后通过小分子抑制剂证明其能够有效的防止术后复发。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.肝癌术后可复发通过对不同国家的不同肿瘤术后五年复发率进行研究,发现肝癌在不同国家中术后复发率都很高。继而通过将肝癌模型小鼠的肿瘤切除后,发现确实可以术后复发。术后存在着更显着的PCNA和CD31的表达。2.肝切手术促进肿瘤生长通过肝损及部分切除后构建小鼠肝癌模型,发现肿瘤生长更为迅速。与对照组相比,手术损伤组小鼠肝脏纤维化程度更为严重,PCNA和CD31的表达更强。通过核磁拍照也同样证明经过手术切除部分肝脏再构建的肝癌模型,肿瘤生长更为致密,更为严重。3.术后肝脏局部IL-11表达升高通过对肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织进行基因芯片分析,发现IL-11在肿瘤组织中显着高表达。而IL-6在癌和癌旁中的表达水平均较高。通过对肝切后不同时间点的小鼠肝脏进行组化及ELISA检测,也发现IL-11在肝切后显着升高。最后通过GEO数据库,对374例肝癌组织与50例癌旁组织进行基因分析,发现仍然IL-11在肝癌组织中呈现出显着性高表达。4.IL-11信号对肝癌术后复发是必须的通过对Il-RaαKO鼠研究,我们发现当小鼠敲除IL-11信号后,可显着减缓肝癌术后的复发。无论肿瘤数目、重量,PCNA、AFP及p-STAT3表达均显着低于对照组。说明IL-11信号对肿瘤术后的复发是必要的。5.抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡通过体外使用IL-11刺激Hepa1-6细胞后,发现可以促进细胞增殖。当使用STAT3抑制剂Napabucasin阻断IL-11-STAT3信号后,则细胞发生明显凋亡。通过流式检测发现抑制IL-11信号后,7AAD+细胞比例显着增多;通过免疫荧光检测发现当使用Napabucasin处理细胞后,PCNA的表达显着降低。通过western blot检测发现在使用Napabucasin处理后,无论是否在细胞培养条件中加入IL-11或IL-6,细胞的p-STAT3表达都受到了显着抑制。6.Napabucasin可抑制术后复发通过使用Napabucasin治疗肝内接种肿瘤细胞后的小鼠,发现可以有效抑制肿瘤的生长。且HE染色发现肝脏病理损伤较轻,同时组化染色发现PCNA表达显着降低。继而通过术后复发模型,即手术切除肝脏肿瘤后再给小鼠注射Napabucasin,同样发现肿瘤生长受限。7.IL-6对肝癌术后复发不是必要因素我们发现Il-6KO鼠在接种肿瘤细胞后,可以正常成瘤。当手术切除肿瘤后能够正常复发。但在术后给予Napabucasin治疗则显着抑制复发。无论肿瘤大小、数目、重量以及PCNA表达都显着降低。8.抑制STAT3磷酸化可抑制IL-11对肿瘤生长的促进作用通过对WT鼠接种肝癌细胞系后,再给小鼠注射IL-11则能够显着促进肿瘤生长,而一旦使用Napabucasin治疗,则显着抑制肿瘤。同时发现当小鼠加入使用IL-11后肝脏纤维化程度加重,PCNA及AFP表达升高;而当使用Napabucasin治疗后,则显着抑制肿瘤生长,纤维化程度减弱,PCNA及AFP表达也明显受到抑制。此外,对DEN诱导的自发肝癌组织再经过同种异体移植后,发现经过手术切除肝脏肿瘤后,肿瘤依旧可以复发。然而在术后给予Napabucasin治疗后,则明显该模型中肝癌的术后复发。PCNA及p-STAT3的表达也相应的显着降低。综上所述,本研究表明在肝癌环境下,将肝脏肿瘤切除后,肝脏再生的过程中产生的细胞因子IL-11可通过IL-11-STAT3信号途径促进肿瘤生长,因此肝再生的同时也伴随了肝癌的复发。而对于肝癌患者又无法不进行手术,因此在术后联合使用如STAT3抑制剂Napabucasin可能起到较好的防止肝癌复发的作用,具有潜在的临床意义。
王方平[9]（2017）在《雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究》文中认为第一部分慢性丙型肝炎患者体内RIG-Ⅰ信号通路的研究研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）是一种单股正链RNA病毒,主要有6种基因型和超过70种亚型。据世界卫生组织估计全球大约有1.85亿人感染HCV,占世界人口的3.2%,同时每年大约有300到400万新发病例。急性丙型肝炎（Acutehepatitis C,AHC）大多是无症状的,其中55%-85%感染者不能清除该病毒并最终发展为慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）,经过20～30年的时间大约有10%-20%患者发展为肝硬化,1%-7%患者发展为肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。传统的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林方案,但是抗病毒疗效不佳并且不良反应较大;新型直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAAs）仍依赖聚乙二醇联合利巴韦林,且具有副作用及未知禁忌症。CHC的治疗及发病机制的研究,仍然是基础医学和临床医学探讨的热点。有研究表明,人感染HCV后,男性较女性更容易发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。这种性别与HCV感染转归差异的机制仍不清楚。目前,越来越多的证据表明,固有免疫在机体清除病毒或抗病毒治疗中起到非常重要的作用,因此,本文将就性别与固有免疫中RIG-Ⅰ及干扰素信号通路的关系进行探讨。研究目的1.了解CHC患者和健康人RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。2.了解不同性别CHC患者体内RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。研究方法1.研究对象:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊CHC患者作为研究对象。所有患者HCV基因型均为1b型,诊断符合《丙型肝炎防治指南》,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。并选择同期体检健康人作为对照。2.实时荧光定量PCR检测:本研究所用引物利用美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素mRNA序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和 GAPDH mRNA 表达量。3.统计分析:用SPSS 20.0软件对数据进行分析。正态分布的计量资料用均值（标准差）表示,非正态分布的计量资料采用均值（四分位间距）表示,计数资料采用百分数表示。两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,计量资料比较采用卡方检验,相关性分析使用Pearson（正态分布）或Spearman法（非正态分布）。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.与健康人相比,CHC患者肝功能指标ALT、AST、ALP、GGT、PA、TP、ALB、GLB、TBIL和DBIL明显异常,且hs-CRP升高,PT-act下降,差异有统计学意义。2.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显低于健康人,差异有统计学意义。3.RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量在男性和女性CHC患者间比较,差异无统计学意义。4.育龄期女性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量明显高于绝经后CHC患者和男性CHC患者;而绝经后女性CHC患者和男性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量比较,差异无统计学意义。5.CHC患者RIG-Ⅰ基因表达量与IFN-β基因表达量成正相关,与IFN-α基因表达量无相关性。研究结论1.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显下降,且RIG-Ⅰ基因可通过调节IFN-β基因表达量发挥抗病毒作用。2.育龄期女性患者IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ基因表达量较高,抗HCV力强于绝经后女性患者和男性患者。第二部分雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞RIG-Ⅰ信号通路的影响研究背景本课题前期研究表明,女性感染HCV后其体内RIG-Ⅰ及干扰素基因与男性相比无明显差异,但育龄期妇女较绝经后妇女和男性患者RIG-Ⅰ及干扰素基因明显升高,差异具有统计学意义。因此本文旨在探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中 RIG-Ⅰ 抗病毒信号通路的影响,为临床寻找新的更有效的CHC治疗方法提供有力证据。研究目的探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者PBMC中RIG-Ⅰ及干扰素基因表达量的影响。研究方法1.慢性丙型肝炎患者PBMC提取和培养:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊且未治疗的CHC患者6例,男性和女性患者各3例,诊断符合《丙型肝炎防治指南》。所有患者HCV基因型均为1b型,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。选择同期体检健康者6名作为对照,男性和女性各3名。采用Ficoll单次密度梯度离心法提取单个核细胞。在37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。2.实时荧光定量PCR检测:利用美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素 mRNA 序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和GAPDH mRNA表达量。3.统计分析:用SPSS20.0软件分析雌激素对不同性别组间RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量的影响。正态分布的计量资料用均值（标准差）表示,两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,对服从正态分布的数据相关性分析使用Pearson法,不服从正态分布的数据相关性分析使用Spearman法。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.在健康对照组中,男性PBMC加入干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 3.07倍;而女性PBMC加干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 5.28倍。2.单独用干扰素刺激男性CHC患者和男性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异无统计学意义（t=0.82,P =0.45）。而单独用干扰素刺激女性CHC患者和女性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异有统计学意义（t=4.34,P=0.01）。3.在男性CHC患者中,单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量明显增加,是未加干扰素刺激对照的2.58倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显着增加（t=7.56,P<0.001）;干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC 4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显着下降（t=7.35,P<0.001）。4.在女性CHC患者中,具有与男性患者相同的结果。单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量也明显增加,是未加干扰素对照的2.23倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显着增加（t=8.98,P<0.001）;干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显着下降（t=7.86,P<0.001）。5.单独干扰素,干扰素加雌激素以及干扰素结合雌激素拮抗剂加雌激素,分别刺激CHC患者PBMC发现,IFN-α、IFN-β基因表达量差异无统计学意义（P均>0.05）。研究结论1.干扰素能增加健康人PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量。2.干扰素能增加CHC患者PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量,女性患者增加更显着。3.雌激素通过协同干扰素增加RIG-Ⅰ基因表达量机体抗病毒能力。4.雌激素对IFN-α、IFN-β基因表达量无影响。
戴列军[10]（2008）在《B淋巴刺激因子与慢性丙型肝炎自身免疫现象关系的研究》文中进行了进一步梳理背景:慢性丙型病毒性肝炎（CHC）患者体内常能检测出多种自身抗体。但产生机制至今尚未阐明。有研究发现,HCV核心抗原的一段氨基酸序列与宿主抗原（GOR）有交叉免疫反应性,产生的自身抗体滴度也一般较低,不符合自身免疫紊乱表现,因此认为HCV感染者自身抗体阳性可能与宿主因素有关;另有研究证明:①50%-90%的混合性冷球蛋白血症及与其相关的肾小球肾炎患者HCV-RNA阳性;②在HCV感染者中可以检出自身免疫性肝炎标志性抗Ⅰ型肝肾微粒体抗体（LKM1）;③HCV感染者的肝脏组织学改变与自身免疫性肝病很相似等,所以人们推测HCV感染的发病机理有自身免疫因素参与,而HCV感染者伴多种自身抗体的产生可能系HCV诱导机体自身免疫紊乱所致。目的:HCV具有泛嗜性,免疫细胞可被感染,T淋巴细胞亚群改变,之间的相互协调或（及）制约功能遭到破坏已有报道。作为产生抗体的B淋巴细胞及其亚群与之功能有无改变,目前尚未见报道。本研究通过,对HCV感染者中自身抗体阳性的患者,检测血清B淋巴细胞刺激因子（BLyS）的含量;外周血单个核细胞BLyS-mRNA的表达水平以及检测B淋巴细胞亚群变化等实验。并以自身抗体阴性的HCV感染者和健康献血员作比较。目的在于:①研究HCV感染与自身免现象的关系。②进一步探讨丙型肝炎的发病机制,③为慢性丙型肝炎患者,特别是有自身抗体阳性的HCV感染者制定个体化治疗方案提供科学依据。方法:（1）设立健康对照组、慢性丙肝自身抗体阳性组和慢性丙肝自身抗体阴性组。（2）常规方法检测肝功能、免疫球蛋白、类风湿因子、放射免疫法检测肝纤维化四项血清学指标、定性法检测冷球蛋白以及采用ELISA法检测血清B淋巴细胞刺激因子。（3）对27例HCV-RNA阳性的慢性丙肝患者给予干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗,治疗期间每周采血一次,连续观察12周,观察血清HCV-RNA载量与治疗前血清BLyS水平的关系。（4）常规分离、培养人外周血单个核细胞（PBMC）,利用半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,分组检测BLyS-mRNA的表达水平。（5）用流式细胞仪技术检测外周血淋巴细胞亚群,以BLyS、CD19、CD38阳性淋巴细胞为观察指标,分组观察BLyS阳性淋巴细胞、B细胞亚群的百分数以及它们之间的相关性。（6）实验数据分别进行统计学分析处理。结果:58例慢性丙肝患者中,16例类风湿因子阳性,占27.6%。健康对照组仅1名,占2.5%。慢性丙型肝炎患者类风湿因子阳性率高于健康对照组（P＜0.05）。慢性丙肝患者血清BLyS平均水平为（4.7±1.1）ng/ml,健康对照为（3.1±0.67）ng/ml,慢性丙肝患者血清BLyS水平高于健康对照（P＜0.01）。慢性丙肝患者中,类风湿因子阳性者血清BLyS平均水平为（5.4±0.98）ng/ml,阴性者为（4.4±1.0ng/ml）,类风湿因子阳性者BLyS水平高于阴性者（P＜0.01）。慢性丙型肝炎患者BLyS因子水平与肝纤维化血清学指标均有一定的相关性（HA;r=0.599 P＜0.01;C-Ⅳ:r=0.392 P＜0.05;PcⅢ:r=0.268P＜0.05;LN:r=0.336 P＜0.05）。而与γ-球蛋白（IgG、IgA、IgM）,ALT,HCV-RNA无相关性（IgG:r=0.161,P＞0.05;IgA:r=0.21,P＞0.05;IgM:r=0.254,P＞0.05,ALT:r=0.23,P＞0.05:HCV-RNA:r=0.19,P＞0.05）。对27例慢性丙肝患者抗病毒应答作随访调查,BLyS正常组的3周、6周、9周、12周的积累病毒学应答（VR）分别为16.7%,41.7%,66.7%,75.0%,而BLyS升高组分别为0%,6.7%,13.3%,26.7%。BLyS升高组的中位VR时间为10.3周,BLyS正常组为6.6周。Kaplan-Meier分析表明,两组比较差异有统计学意义（Log-ranktest,P＜0.05）。慢性丙型肝炎患者PBMC中的BLyS-mRNA的表达明显高于健康对照（0.54±0.22 vs 0.40±0.14 P＜0.01）和慢性乙型肝炎患者（0.54±0.22 vs 0.42±0.17,P＜0.05）。慢性丙肝患者冷球蛋白阳性率为16.7%。慢性丙型肝炎患者中,有自身免疫现象者（冷球蛋白和或类风湿因子阳性）比无自身免疫现象者BLyS-mRNA表达水平更高（0.64±0.25 vs 0.49±0.20,P＜0.05）。无干扰素-γ刺激情况下,慢性丙型肝炎组和健康对照组在0h,6h,12h,24h的BLyS-mRNA表达水平无明显变化（HCV:F=1.86,P＞0.05 Control:F=1.17,P＞0.05）。经INF-γ刺激后,慢性丙肝患者和健康对照外周血单个核细胞BLyS-mRNA的表达均在6h左右达到最高,以后逐渐下降,6h与0h比较差异有统计学意义（HCV:0.74±0.09 VS 0.50±0.10,P＜0.001;Control:0.52±0.12 VS 0.34±0.06,P＜0.01）。慢性丙型肝炎患者各个时间点BLyS-mRNA水平均高于相应时间点的健康对照（P＜0.05）。与健康对照相比,慢性丙肝患者外周血中BLyS+淋巴细胞、CD19+淋巴细胞、CD19+CD38+淋巴细胞（外周血早期浆细胞）百分率（%）以及CD19+CD38+/CD38+比值（%）显着增加（分别为4.0±2.2 vs 2.3±0.75,P＜0.05;21.6±6.0 vs 13.4±3.9,P＜0.05;12.1±5.8 vs 5.8±1.6,P＜0.01;23.8±11.9 vs 11.4±2.3 P＜0.01）,而CD38+淋巴细胞百分率（%）无明显的差异（52.0±8.4 vs 50.0±7.0 P＞0.05）。BLyS+淋巴细胞增加与CD19+CD38+淋巴细胞增加正相关（r=0.303,P＜0.05）。结论:（1）部分HCV感染者自身抗体阳性,检测血清中是否存在自身抗体,是判断HCV感染者自身免疫现象或自身免疫紊乱的重要标志物之一。（2）发现血清自身抗体阳性的HCV感染者血清BLyS水平明显升高,并与PBMC高表达BLyS-mRNA一致,说明过度的BLyS表达可能是刺激机体产生自身抗体的原因。（3）HCV感染者PBMC中BLyS+细胞、CD19+细胞百分率较健康人明显增高,BLyS+细胞百分率与CD19+CD38+细胞（外周血早期浆细胞）百分率呈正相关。进一步揭示了HCV感染者自身免疫现象,其可能的机制之一是BLyS介导的B淋巴细胞异常增生和功能紊乱有关。（4）血清BLyS水平与血清肝纤维化指标有相关性,折射出与HCV感染慢性化及预后密切相关。（5）BLyS水平高低与抗病毒治疗后病毒学应答相关,值得进一步研究。
二、慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染复制与干扰素治疗反应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染复制与干扰素治疗反应（论文提纲范文）
（1）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者PBMCs中IFNAR启动子甲基化对MDM2表达的影响及与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中的MDM2启动子甲基化的诊断价值研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者PBMCs中MDM2启动子甲基化与氧化应激关系研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章1 |
| 英文文章2 |
（3）血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝炎病毒感染相关血小板减少的发病机制与治疗 |
| 前言 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 英文正文一 |
| 英文正文二 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 慢性HBV感染患者和抗病毒治疗队列CXCR5+CD8+T细胞的特点 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 1.2.3 血清学和病毒学检测 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.3 研究结果 |
| 1.3.1 慢性HBV感染患者外周血CXCR5+CD8+T细胞频数升高 |
| 1.3.2 慢性HBV感染患者CXCR5+CD8+T细胞呈现不同表型与转录谱 |
| 1.3.3 肝内与外周血CXCR5+CD8+T细胞表型表达对比特点 |
| 1.3.4 肝脏内CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ和IL-21分泌水平更强 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 外周血CXCR5+CD8+T细胞与CXCL13表达预测替比夫定抗病毒治疗疗效 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 2.2.3 血清学和病毒学检测 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 抗病毒治疗队列CXCR5~+CD8~+T细胞频数与功能动态变化特点 |
| 2.3.2 抗病毒治疗队列CXCR5~+CD8~+T细胞频数与治疗后HBVDNA负相关 |
| 2.3.3 慢性HBV感染患者肝内CXCL13表达和免疫细胞频数显着高于健康人 |
| 2.3.4 肝脏内CXCL13水平与血清CXCL13水平和ALT水平呈正相关 |
| 2.3.5 CXCL13水平与抗病毒治疗队列治疗预后有关 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 CXCR5~+CD8~+T细胞通过分泌IFN-γ和辅助B细胞产生抗体控制HBV感染 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 3.2.3 研究对象 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 外周血CXCR5~+CD8~+T细胞通过IFN-γ发挥抗病毒功能 |
| 3.3.2 CXCR5~+CD8~+T细胞可能通过分泌IL-21促进B细胞产生抗体控制病毒 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 HBV感染小鼠模型肝内CXCL13升高可募集CXCR5~+CD8~+T细胞到肝脏内发挥抗病毒作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 HBV感染小鼠模型外周血、肝脏和脾脏CXCR5~+CD8~+T细胞频数、表型与功能特点 |
| 4.3.2 CXCL13趋化过继转移的CXCR5~+CD8~+T细胞在HBV感染小鼠体内呈现向肝脏募集趋势 |
| 4.3.3 HBV感染小鼠模型CXCR5~+CD8~+T细胞可以抑制HBsAg表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 影响CXCR5~+CD8~+T细胞抗病毒作用的分子免疫机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 研究对象 |
| 5.2.2 主要试剂、耗材与仪器 |
| 5.2.3 人/小鼠血清学和病毒学检测 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 PD-1阻断和IL-21对CXCR5~+CD8~+T细胞功能的作用 |
| 5.3.2 CXCR5~+CD8~+T细胞的抗病毒功能受B细胞的调节 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文略缩词对照表 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本论文专用缩略词表(ABBREVIATIONS) |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.引言 |
| 2.T细胞介导的抗病毒反应 |
| 3.慢性病毒感染过程中抑制性受体在耗竭的CD8+T 细胞表达上调 |
| 4.TIGIT和 PD-1 的分子结构特点、表达、参与免疫调节及在慢性病毒感染中的作用 |
| 4.1 TIGIT |
| 4.2 PD-1 |
| 5.共抑制性受体的协同作用 |
| 6.慢性病毒感染中抑制性受体表达的转录调控 |
| 6.1 NFAT |
| 6.2 Blimp-1 |
| 6.3 T-bet |
| 6.4 T-box |
| 6.5 FoxO1 |
| 7.小结和展望 |
| 第一部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达的研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1. TIGIT在慢性HBV感染者和健康者外周血T细胞表达 |
| 2.TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞分化亚群各阶段表达 |
| 3. TIGIT和PD-1 在慢性HBV感染者外周血T细胞表达 |
| 4. HLA-A*0201 限制性表位肽/五聚体复合物流式细胞术检测HBV特异性CTL |
| 5. TIGIT和PD-1 在慢性HBV感染者外周血HBVcore特异性CTL表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞中的功能研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.慢性HBV感染者CD8+T细胞及HBV特异性CTL上CD69 的表达和Granzyme B、Perforin的分泌 |
| 2.慢性HBV感染者HBV特异性CTL细胞因子的分泌 |
| 3.慢性HBV感染者外周血特异性CTL增殖的检测 |
| 4.慢性HBV感染者CD8+T细胞凋亡敏感性 |
| 5.TIGIT和PD-1 共表达对慢性HBV感染者T细胞分泌细胞因子影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达与临床指标相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1. TIGIT在慢性HBV感染者T细胞的表达与临床指标的相关性 |
| 2. TIGIT在四种核苷(酸)类似物治疗的慢性HBV感染者T细胞表达情况 |
| 3. TIGIT在慢性HBV感染者不同疾病进展阶段外周血T细胞表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 博士期间以第一作者发表文章目录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 病例入组及相关事宜 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计学处理 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A:英中文术语和缩略语对照表 |
| 附录B:个人简历 |
| 附录C:攻读硕士学位期间参与的科研项目 |
| 附录D:综述 |
| 参考文献 |
（7）miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文缩略语 |
| 第一部分 miR-141对HCV进入宿主细胞的调节机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 临床标本收集 |
| 2.3.3 病毒制备 |
| 2.3.4 病毒感染 |
| 2.3.5 TRIzol法提取总RNA |
| 2.3.6 荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction) |
| 2.3.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.3.8 免疫荧光 |
| 2.3.9 HCV进入试验 |
| 2.3.10 细胞共培养试验 |
| 2.3.11 小干扰RNA转染 |
| 2.3.12 质粒转染和双荧光素酶报告基因试验 |
| 2.3.13 实验数据的统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 miR-141 抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.2 HCV进入因子EphA2是miR-141 的直接靶基因 |
| 3.3 敲低EphA2 明显抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.4 Dasatinib处理明显抑制HCV进入宿主细胞 |
| 3.5 miR-141 抑制HCV进入相关的膜受体的共定位 |
| 3.6 miR-141 抑制HCV病毒在细胞-细胞间的传播 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 miR-141调节干扰素信号通路的抗病毒效应 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 病毒感染 |
| 2.2.2 TRIREAGENT?BD法提取血浆RNA |
| 2.2.3 qRT-PCR引物设计 |
| 2.2.3 非变性凝胶电泳(Native-PAGE) |
| 2.2.4 小干扰RNA转染 |
| 2.2.5 质粒构建和双荧光素酶报告基因检测试验 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 miR-141在HCV感染的过程中表达下调 |
| 3.2 miR-141 通过增强IFNβ 信号通路抑制HCV的感染 |
| 3.3 敲低miR-141 的表达抑制了IFNβ 信号通路 |
| 3.4 TLR8 可能是miR-141 增强IFNβ 信号通路的靶点 |
| 3.5 miR-141主要是通过增加TLR8 的表达从而发挥抗病毒作用 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 miR-141对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的调节机制研究 |
| 附录二 攻读博士期间工作总结 |
| 附录三 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论乙肝和肝癌治疗研究现状 |
| 1.1 乙肝 |
| 1.1.1 慢性乙型肝炎的诊断及其感染过程 |
| 1.1.2 乙肝病毒特征 |
| 1.1.3 乙型肝炎与STAT信号相关免疫应答 |
| 1.1.4 慢性HBV感染的治疗 |
| 1.1.4.1 核苷类似物的治疗 |
| 1.1.4.2 干扰素的治疗 |
| 1.1.4.3 核苷类似物及干扰素联合治疗 |
| 1.1.4.4 肝炎其他治疗策略及目前肝炎治疗过程中存在的其他问题 |
| 1.1.5 I型干扰素调控免疫细胞功能 |
| 1.1.6. IL-2及其免疫治疗 |
| 1.2 肝癌 |
| 1.2.1 肝癌的分类及诊断 |
| 1.2.2 肝癌的流行病学及发生机制 |
| 1.2.3 肝再生 |
| 1.2.4 肝癌的治疗 |
| 1.2.4.1 手术 |
| 1.2.4.2 肝移植 |
| 1.2.4.3 介入放射 |
| 1.2.4.4 肝癌的化学治疗 |
| 1.2.4.5 免疫治疗 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床标本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 原代细胞培养相关试剂 |
| 2.1.4 细胞系及培养基 |
| 2.1.5 细菌培养及相关试剂 |
| 2.1.6 质粒及抽提试剂 |
| 2.1.7 RNA体外转录质粒及相关试剂 |
| 2.1.8 细胞因子及小分子抑制剂 |
| 2.1.9 细胞分离和纯化试剂 |
| 2.1.10 总RNA提取和RT-PCR试剂 |
| 2.1.11 核酸序列 |
| 2.1.12 PCR试剂和核酸电泳试剂 |
| 2.1.13 Western blotting试剂 |
| 2.1.14 流式抗体 |
| 2.1.15 免疫荧光及流式细胞术检测相关试剂 |
| 2.1.16 免疫组化及HE染色试剂 |
| 2.1.17 细胞三维立体培养试剂 |
| 2.1.18 抗原特异性T细胞检测试剂 |
| 2.1.19 ELISA检测试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床试验 |
| 2.3.1.1 临床试验Ⅰ |
| 2.3.1.2 临床试验Ⅱ |
| 2.3.2 人单个核细胞分离及CD8~+T细胞的纯化 |
| 2.3.3 人肝癌组织基因芯片数据分析 |
| 2.3.4 细胞总RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.3.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.3.6 流式细胞术检测 |
| 2.3.7 小鼠血清采集 |
| 2.3.8 放射免疫检测 |
| 2.3.9 免疫荧光实验 |
| 2.3.10 免疫组化、HE染色、Masson染色及天狼猩红染色实验 |
| 2.3.11 抗原特异性CD8~+T细胞检测 |
| 2.3.12 ELISA检测细胞因子 |
| 2.3.13 RTCA检测细胞杀伤 |
| 2.3.14 Western blotting |
| 2.3.15 基因缺陷小鼠构建 |
| 2.3.16 小鼠原发肝癌模型构建 |
| 2.3.17 小鼠自发肝癌模型及移植瘤模型构建 |
| 2.3.18 小鼠HBV模型构建 |
| 2.3.19 小鼠肝癌手术切除 |
| 2.3.20 小鼠肝癌模型治疗 |
| 2.3.21 小鼠肝炎模型治疗 |
| 2.3.22 小鼠组织单个核细胞的分离 |
| 2.3.23 统计学分析 |
| 第三章 序贯IL-2治疗有利于提高难治性无应答乙肝患者的免疫功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 Peg-IFN-α-2b治疗后多数CHB患者呈现无应答状态 |
| 3.3 Peg-IFN-α-2b治疗后IL-2Rα在CD4~+T细胞表达显着降低 |
| 3.4 体外使用IL-2促进外周T细胞和NK细胞表达IFN-γ及TNF-α |
| 3.5 体外使用IL-2促进人肝脏淋巴细胞表达IFN-γ |
| 3.6 无应答患者序贯使用IL-2治疗可抑制负调免疫应答 |
| 3.7 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进STAT1活化 |
| 3.8 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进分泌IFN-γ及TNF-α |
| 3.9 无应答患者序贯使用IL-2治疗可提高CD8~+T细胞毒性及抗原特异性CD8~+T细胞比例 |
| 3.10 序贯使用IL-2治疗可提高难治性无应答患者临床治疗效果 |
| 3.11 经Peg-IFNα-2b治疗后CHB患者外周血中CD24~+CD38~(hi)B细胞显着增加 |
| 3.12 Peg-IFNα可诱导CD24~+CD38~(hi) B细胞形成并产生大量IL-10 |
| 3.13 CD24~+CD38~(hi)B细胞抑制T细胞及NK细胞抗病毒能力 |
| 3.14 靶向CD24分子可清除CD24~+CD38~(hi)B细胞 |
| 3.15 anti-CD24抗体联合干扰素提高HBV耐受小鼠的治疗效果 |
| 3.16 讨论与总结 |
| 第四章 肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 手术后肝癌可复发 |
| 4.3 手术诱导肝癌过度生长 |
| 4.4 手术后IL-11水平升高 |
| 4.5 IL-11信号对术后肝癌生长是必要的 |
| 4.6 抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡 |
| 4.7 Napabucasin可抑制WT鼠肝癌术后复发 |
| 4.8 Napabucasin可抑制Il6~(KO)鼠肝癌术后复发 |
| 4.9 Napabucasin能够抑制同种移植模型中肝癌术后复发 |
| 4.10 Napabucasin可防止IL-11诱导的肝癌过度生长 |
| 4.11 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（9）雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩略语中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性丙型肝炎患者体内RIG-Ⅰ信号通路的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞RIG-Ⅰ信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
（10）B淋巴刺激因子与慢性丙型肝炎自身免疫现象关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 第一部分:HCV感染者血清BLyS水平与自身免疫现象的关系 |
| 一、病例资料和病例来源 |
| 二、主要的试剂和仪器 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分:BLyS-mRNA在HCV感染者PBMC中的表达及其临床意义 |
| 一、病例资料和病例来源 |
| 二、主要的试剂和仪器 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 第三部分:HCV感染者PBMC中BLyS~+细胞、CD19~+及CD38~+细胞的变化及其意义 |
| 一、病例资料和病例来源 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述1:BLyS在B细胞免疫中的机制 |
| 综述2:HCV诱导B细胞克隆扩增的机制 |
| 综述3:HCV感染导致的免疫异常 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV感染复制与干扰素治疗反应（论文参考文献）
- [1]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]MDM2启动子甲基化在慢性乙型肝炎和乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的研究[D]. 王婧雯. 山东大学, 2021(12)
- [3]血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制[D]. 马赛. 山东大学, 2021(10)
- [4]CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中的特点与免疫作用研究[D]. 郭玲. 南方医科大学, 2020
- [5]TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能研究[D]. 魏艳艳. 东南大学, 2019(05)
- [6]直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析[D]. 周文靖. 蚌埠医学院, 2019(01)
- [7]miR-141调控丙型肝炎病毒感染肝癌细胞的机制研究[D]. 赵艳. 华中科技大学, 2019
- [8]Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究[D]. 王冬耀. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [9]雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究[D]. 王方平. 武汉大学, 2017(06)
- [10]B淋巴刺激因子与慢性丙型肝炎自身免疫现象关系的研究[D]. 戴列军. 中南大学, 2008(12)