一、NestedRT-PCR技术检测CE AmRNA的方法及敏感性（论文文献综述）
李格菲[1]（2021）在《miR-4505通过Wnt/β-catenin信号通路调控人肾小球系膜细胞增殖的研究》文中进行了进一步梳理[目的]1.探讨miR-4505对高低糖培养下的人肾小球系膜细胞的表达差异性;2.探讨miR-4505是否通过Wnt/β-catenin信号通路调控人肾小球系膜细胞增殖。[方法]1.采用qRT-PCR技术分别检测在高低糖培养下的人肾小球系膜细胞（HMCs）中miR-4505的表达量;2.体外转染 miR-4505 mimic,mimic NC,miR-4505 inhibitor,inhibitor NC至HMCs,采用qRT-PCR检测HMCs中miR-4505的表达量以评估转染效率;3.采用CCK-8法评估miR-4505对高低糖培养的HMCs增殖影响;4.采用Western blot和qRT-PCR检测miR-4505对高低糖培养的HMCs中Wnt/β-catenin 信号通路相关因子（Wnt5a、Axin1、Dvl3、β-catenin、c-Myc、CyclinD1）表达情况的影响。5.采用SPSS对实验结果进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。[结果]1.CCK-8法检测高低糖培养的HMCs增殖能力:HMCs在高糖刺激下的增殖效果比低糖更为显着（p<0.05）;qRT-PCR和Western blot检测高低糖培养HMCs 的 Wnt/β-catenin信号通路相关因子（Wnt5a,Axin1,Dvl3,β-catenin,c-Myc,CyclinD1）的 mRNA 和蛋白表达:高糖组 Wnt5a,Axinl,Dvl3,β-catenin,c-Myc,CyclinD1的mRNA表达与低糖组相比显着升高（p<0.01）;高糖组Wnt5a,Axin1,Dvl3,c-Myc,CyclinD1的蛋白表达与低糖组相比显着升高（p<0.001）,β-catenin蛋白表达两组无明显差异（P>0.05）。2.qRT-PCR法检测高低糖培养的HMCs中miR-4505的表达:高糖环境下HMCs中的miR-4505的表达量相较于低糖组明显降低（P<0.05）。3.CCK-8法检测转染miR-4505的高低糖组HMCs结果显示:与对照组相比,过表达miR-4505可抑制HMCs增殖（P<0.01）。4.qPCR法检测转染miR-4505的高低糖组HMCs结果显示:低糖+mimic组与低糖组相比,Wnt5a,Axinl,Dvl3,β-catenin,c-Myc,CyclinD1 的表达量增加（p<0.001）;低糖+inhibitor 组与低糖组相比,Wnt5a,Axin1,c-Myc,CyclinD1的表达量增多（P<0.01）,Dvl3的表达量减少（P<0.001）,β-catenin的表达无明显差异（P>0.05）。高糖+mimic组与高糖组相比,Wnt5a,Axin1,Dvl3,β-catenin,c-Myc,CyclinD1 的表达量减少（p<0.001）;高糖+inhibitor 组与高糖组相比,Wnt5a,Axin1,Dvl3,β-catenin,c-Myc,CyclinD1 的表达量下降（P<0.001）。5.Western blot法检测转染miR-4505的高低糖组HMCs结果显示:低糖+mimic组与低糖组相比,Wnt5a,Axinl,Dv13,c-Myc的表达量显着升高（P<0.001）,β-catenin,CyclinD1 蛋白表达无明显差异（P>0.05）;低糖+inhibitor组与低糖组相比,Wnt5a,Axin1,Dvl3,c-Myc的表达量显着升高（P<0.001）,CyclinD1的表达量下降（P<0.001）,β-catenin蛋白表达无明显差异（P>0.05）。高糖+mimic组与高糖组相比,Wnt5a,Dvl3的蛋白表达量显着升高（P<0.001）,Axin1,c-Myc,β-catenin的蛋白表达量显着下降（P<0.001）,CyclinD1表达量无明显差异（P>0.05）;高糖+inhibitor组与高糖组相比,Wnt5a,Dv13,CyclinD1的蛋白表达量显着升高（P<0.001）,Axin1、c-Myc、β-catenin的蛋白表达量显着下降（P<0.001）。[结论]在高糖环境下,miR-4505可能通过负性调控Wnt/β-catenin信号通路,抑制HMCs增殖。
王泽[2]（2020）在《基于miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路探讨清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的作用机制》文中研究说明研究背景糖尿病是临床最常见的内分泌代谢疾病之一,其中90%以上为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）。2019年国际糖尿病联盟发布的最新调查数据显示,全球20-79岁的成人中约有4.63亿患有糖尿病,患病率为9.3%,预计到 2030 年将达到 5.78 亿（10.2%）。胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）是 T2DM发病的始动因素,并贯穿T2DM发展的全过程。积极改善IR成为治疗T2DM的关键策略。临床常用于改善IR的药物如双胍类、噻唑烷二酮类,往往存在一定的副作用,长期服用还可能出现失效现象。中医学在治疗T2DM方面具有鲜明的优势。中医理论认为,阴虚热盛是消渴病的基本病机。导师林兰教授在多年的临床实践中针对阴虚热盛型T2DM-IR确立了滋阴清热的基本治法,以其经验方—清润方（知母、黄柏、地骨皮等）为核心处方加减治疗,取得了良好疗效。课题组前期研究发现,清润方可减轻T2DM大鼠炎症反应和氧化应激,改善IR状态,但其深层次的分子机制尚待进一步探索。大量研究证实,T2DM在一定程度上是机体的低度炎症状态。炎症因子的释放可干扰胰岛素信号转导通路,导致IR的发生。SIRT1/NF-κB信号通路在介导肝脏炎症反应中发挥关键作用。微小核糖核酸（Micro ribonucleic acid,microRNA）是非编码RNA中一类重要的基因调节家族,可通过与靶基因3’端完全或不完全互补结合在转录或转录后水平影响靶基因的表达。研究显示,多种microRNA在T2DM-IR中呈现异常表达,其中miR-34a与肝脏糖脂代谢失调密切相关。而miR-34a可作为SIRT1的上游,直接靶向负性调控SIRT1的表达。因此,本研究在国家自然科学基金项目“基于miRNA调控SIRT1/NF-κB信号通路探讨滋阴清热法治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的分子机制”（No.81573792）的资助下,以前期工作为基础,集中探讨miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路在T2DM肝脏IR发病中的作用及清润方的干预机制,以期进一步发掘有效的治疗靶点,为中医药防治T2DM提供有力的理论和实验依据。研究目的（1）通过体内实验和体外实验结合,研究清润方改善T2DM大鼠和IR-HepG2细胞IR的作用;（2）以miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路为切入点探讨清润方改善T2DM-IR的分子机制。研究方法（1）体内实验以SD大鼠为研究对象,采用高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型,分为正常组、模型组、清润方高剂量组、清润方中剂量组、清润方低剂量组和二甲双胍组,每组10只,各组分别给予相应的药物灌胃干预8周。观察大鼠的一般状态,分别于药物干预前和干预后的第2、4、6、8周末记录大鼠体重并检测大鼠空腹血糖（FBG）,于药物干预后的第7周末进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）,并计算血糖曲线下面积（GAUC）。干预结束后腹主动脉取血和肝组织,放射免疫法检测空腹血清胰岛素（FINS）水平,并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）,氧化酶法和直接法检测血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）水平,蒽酮法检测肝糖原含量,HE染色观察肝组织的病理改变,透射电镜观察肝脏超微结构。ELISA法检测肝组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的水平,Western blot法检测肝组织沉默信息调节因子1（SIRT1）、核转录因子κB（NF-κB）、胰岛素受体底物1（IRS1）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的蛋白表达水平,RT-PCR法检测肝组织miR-34a、SIRT1mRNA、NF-κBmRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA的基因表达水平。（2）体外实验以人肝癌细胞株HepG2细胞为研究对象,以不同浓度的清润方干预HepG2细胞24h后,CCK8法检测清润方对HepG2细胞增值活性的影响,筛选清润方的干预浓度。采用1 ×10-6mol/L的胰岛素诱导36h建立IR-HepG2细胞模型,分为正常组、模型组、清润方组和二甲双胍组,各组分别给予相应的药物干预。葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,蒽酮法检测糖原含量,ELISA法检测TNF-α、IL-6 的水平,Western blot 法检测 SIRT1、NF-κB、IRS 1、GLUT4 蛋白表达水平,RT-PCR 法检测 miR-34a、SIRT1mRNA、NF-κBmRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA的基因表达水平。采用脂质体转染法向HepG2细胞转染miR-34a inhibitor,Western blot法和RT-PCR法检测相应的蛋白及RNA的表达水平。研究结果1.体内实验（1）与正常组比较,模型组大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、FINS、HOMA-IR、GAUC水平均明显升高（p<0.05）,肝糖原含量明显降低（p<0.05）。与模型组比较,清润方中剂量组大鼠第8周体重明显升高（p<0.05）;清润方高剂量组第8周FBG水平明显降低（p<0.05）;清润方低剂量组和清润方高剂量组FINS、HOMA-IR水平明显降低（p<0.05）;清润方各剂量组GAUC水平有所下降,但差异不明显（p>0.05）;清润方各剂量组TC、TG、LDL-C水平均明显降低（p<0.05）;清润方高剂量组肝糖原含量明显升高（p<0.01）;肝组织HE染色观察显示,模型组大鼠肝组织出现明显的脂肪变性和空泡变性,透射电镜观察其超微结构显示,模型组大鼠肝细胞出现线粒体、内质网等细胞器的损伤及散在脂滴,清润方各剂量组其病理变化较模型组均有不同程度的改善。（2）ELISA结果显示,与正常组比较,模型组TNF-α、IL-6水平明显升高（p<0.01）。与模型组比较,清润方高剂量组TNF-α水平明显降低（p<0.05）,清润方中剂量组和清润方高剂量组IL-6水平明显降低（p<0.05）。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组SIRT1、GLUT4蛋白表达水平明显下调（p<0.05）,IRS1蛋白表达水平下调,但差异不明显（p>0.05）,NF-κB蛋白表达水平明显上调（p<0.01）;与模型组比较,清润方各剂量组NF-κB蛋白表达水平明显下调（p<0.05）,清润方高剂量组GLUT4蛋白表达水平明显上调（p<0.05）,清润方各剂量组SIRT1、IRS1蛋白表达水平有所上调,但差异不明显（p>0.05）。RT-PCR结果显示,与正常组比较,模型组肝组织miR-34a、NF-κBmRNA表达水平明显上调（p<0.01）,SIRT1mRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA 表达水平明显下调（p<0.05）;与模型组比较,清润方高剂量组SIRT1mRNA、IRS1mRNA表达水平明显上调（p<0.05）,NF-κBmRNA表达水平明显下调（p<0.05）,清润方低剂量组和清润方高剂量组miR-34a表达水平下调,GLUT4mRNA表达水平上调,但差异不明显（p>0.05）。2.体外实验（1）清润方干预HepG2细胞后对其增殖有一定的抑制作用,当清润方干预浓度为5mg/mL时,细胞增殖活性仍为（94.15±6.23）%,选择此浓度作为清润方的工作浓度。1×10-6mol/L的胰岛素诱导HepG2细胞36h后,HepG2细胞葡萄糖消耗量明显减少（p<0.01）,糖原含量明显降低（p<0.01）,提示IR-HepG2细胞模型诱导成功。清润方干预后能提高IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量,但与模型组比较差异不明显（p>0.05）,并能显着提高IR-HepG2细胞糖原含量（p<0.05）。（2）ELISA结果显示,与正常组比较,模型组TNF-α IL-6水平明显升高（p<0.01）;与模型组比较,清润方组TNF-α、IL-6水平明显降低（p<0.01）。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组SIRT1、IRS1、GLUT4蛋白表达水平明显下调（p<0.01）,NF-κB蛋白表达水平明显上调（p<0.01）;与模型组比较,清润方组SIRT1、GLUT4蛋白表达水平明显上调（p<0.05）,IRS1蛋白表达水平上调,NF-κB蛋白表达水平下调,但差异不明显（p>0.05）。RT-PCR结果显示,与正常组比较,模型组miR-34a、NF-κBmRNA表达水平明显上调（p<0.01）,SIRT1 mRNA、IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平明显下调（p<0.01）;与模型组比较,清润方组NF-κBmRNA表达水平明显下调（p<0.05）,miR-34a表达水平下调,但差异不明显（p>0.05）,SIRT1mRNA表达水平明显上调（p<0.01）,IRS1mRNA、GLUT4mRNA表达水平上调,但差异不明显（p>0.05）。miR-34a inhibitor转染HepG2细胞后,Western b1ot结果显示,与inhibitor-NC组比较,inhibitor组SIRT1、IRS1、GLUT4表达水平上调,NF-κB表达水平下调,但差异不明显（p>0.05）。RT-PCR结果显示,与 inhibitor-NC 组比较,inhibitor 组 miR-34a表达水平明显下调（p<0.01）,SIRT1mRNA表达水平明显上调（p<0.05）,IRS 1 mRNA、GLUT4mRNA表达水平上调,NF-κBmRNA表达水平上调,但差异不明显（p>0.05）。研究结论（1）清润方可减轻T2DM大鼠糖脂代谢紊乱,改善IR状态,缓解肝脏病理损伤;提高IR-HepG2细胞的葡萄糖摄取和糖原合成能力,改善IR状态。（2）清润方改善T2DM肝脏IR的作用可能是通过抑制miR-34a的表达,激活SIRT1/NF-κB信号通路,减轻肝脏炎症反应对胰岛素信号转导通路的损伤,提高胰岛素敏感性实现的。
陈燕[3]（2020）在《TNFAIP3和Occludin在紫外线致慢性光化性皮炎发病中的机制研究》文中认为[研究背景]慢性光化性皮炎（chronic actinic dermatitis,CAD）是一组免疫介导的光敏性皮肤病。该病主要好发于中老年男性,在日照时间长、紫外线（ultraviolet,UV）强的高原地区尤为明显。皮损常发生于曝光部位,临床表现为面、颈、双手等曝光部位出现红斑、丘疹、结节伴瘙痒,严重者可发展为皮肤T淋巴瘤,成为慢性、迁延一生的疾病,给患者带来沉重的心理负担和精神压力。CAD的病因和发病机制仍不清楚,治疗效果有限。因此,探索新的发病机制对于CAD的治疗具有重要意义。长期以来,有学者提出CAD与免疫功能紊乱所诱发的迟发型超敏反应（Delayed type hypersenitivity,DTH）,氧化应激和角质形成细胞（keratinocyte,KC）异常凋亡等有关。除了这些以外,炎症在CAD发生发展过程中也发挥重要作用。其中,UV诱导的炎症反应参与CAD发病的多个环节,在CAD发病机制中一直受到广泛关注。有研究报道大于2倍最小红斑剂量（minimum erythema dose,MED）的UVB辐射可致CAD出现明显炎症浸润。UVB还可通过作用于KC,朗格汉斯细胞（Langerhans cell,LC）和T细胞等免疫细胞诱导炎性细胞因子发生变化进一步产生免疫抑制作用,从而引起KC损伤,产生炎症反应。KC作为皮肤免疫细胞的重要组成部分,与CAD炎症密切相关,但UVB诱导KC炎症反应参与CAD发病的机制仍不清楚。近年来,也有研究发现CAD患者皮损处经皮水份流失（transepidermal water loss,TEWL）增加,证实CAD中存在皮肤通透屏障受损。角质层（stratum corneum,SC）和紧密连接（tight junctions,TJ）是构成表皮通透屏障功能的主要结构,对维持正常皮肤通透屏障功能（epidermal permeability barrier function,EPB）起到重要作用。角质层中细胞不可逆地向终末分化过程中,角蛋白表达发生变化,其中K5和K14表达下调,K1和K10表达上调。丝聚合蛋白（filaggrin）、兜甲蛋白（loricrin）、内披蛋白（involucrin）等组装最终形成角化套膜（CE）,然后以“砖墙”结构的方式密封并通过与脂质结合在一起形成EPB的结构基础。细胞间脂质结构脂质的合成与颗粒层中的板层小体密切相关,在丝氨酸棕榈酰转移酶（Serine Palmitoyl Transferase,SPT）、脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthetase,FASN）、三羟基三甲基戊二酰辅酶A（Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase,HMGCoA）等的作用下,板层小体内含丰富的脂质合成和水解酶,可以合成脂质。TJ由不同类型的跨膜蛋白和胞质蛋白组成。跨膜蛋白主要有闭锁蛋白（occludin）,水闸蛋白（claudins）多基因家族和连接黏附分子（JAM）;胞质蛋白主要有闭锁小带蛋白（ZO）-1等。目前认为EPB受损可能与细胞间脂质改变、角化套膜、紧密连接相关蛋白以及角蛋白的异常表达有关。但CAD中EPB受损的具体分子机制还未见报道,CAD中炎症反应和皮肤屏障是否存在相关性仍有待研究。本课题前期通过对CAD组织mRNA表达谱的结果进行分析,主要从影响CAD炎症和表皮通透屏障两方面入手,筛选与之相关差异表达的mRNA,其中与炎症相关差异表达最明显的mRNA是TNFAIP3,与通透屏障相关差异表达mRNA是Occludin。TNFα诱导蛋白3（TNFAIP 3,又叫A20）。A20可作为调控因子控制NF-κB信号传导。NF-κB激活后可以快速诱导其表达,A20通过负反馈回路控制其表达,并产生炎症介质。Occludin是TJ的重要组成部分,主要受蛋白激酶C（PKC）的影响。PKC是一种依赖磷脂的蛋白激酶,通过催化各种蛋白质的磷酸化来调节细胞代谢。已有研究表明,Occludin的异常表达后会导致细胞的TEER增加,影响细胞旁渗透屏障功能。因此,本课题拟在前期CAD全转录组测序结果基础上,从CAD炎症和皮肤通透屏障功能受损两方面入手,找到CAD中与之相关差异表达的目标分子A20和Occludin,重点对A20和Occludin在CAD炎症和通透屏障功能调控中的作用及相互关系进行研究,并探讨A20和Occludin对紫外线介导CAD的炎症和皮肤屏障功能受损中的具体机制,将有助于深入了解CAD的发病机制。[目的]探讨A20参与UVB介导的CAD炎症反应中的作用机制和Occludin致CAD皮肤屏障受损和炎症反应及两者相互关系的研究[方法]第一部分:对前期RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）结果中差异表达的mRNA进行分析,筛选出与CAD炎症相关差异表达最明显的mRNA;收集CAD曝光部位和正常面部曝光部位皮肤组织进行A20免疫组化染色,观察两组A20的表达差异:qRT-PCR检测CAD中与皮肤渗透屏障相关蛋白（Occludin、Cldn1、Cldn5、Cldn7、ZO-1、filaggrin、loricrin、involucrin）及脂质关键合成酶（HMGCR、FAS、SPT）的表达。购买HaCaT细胞株,通过UVB（10-40mJ/cm2,0-72h）照射HaCaT细胞,CCK-8和流式细胞术检测细胞活性和细胞凋亡水平;qRT-PCR和ELISA检测UVB诱导的炎症因子的表达;Western Blot检测UVB对A20表达的影响;然后应用慢病毒稳定敲减或过表达A20转染HaCaT细胞的策略,对A20参与UVB介导的炎症反应的功能作用及机制进行研究;ELISA法检测A20敲减或过表达后炎性细胞因子水平;细胞跨膜电阻仪测量A20和对细胞跨膜电阻值（trans epithellal electric resistance,TEER/TER）的影响;Western Blot检测A20敲减或过表达后对NF-κB 和 MAPK 相关蛋白表达（包括 NF-κB P-P65、p-IkB、MAPK-JNK、ERK、p-38）,皮肤渗透屏障相关蛋白及脂质关键合成酶的表达;细胞免疫荧光检测A20敲减或过表达后NF-κB p65入细胞核情况。第二部分:对CAD患者额部皮损及健康对照者同一部位进行皮肤生理功能检测分析。并在前期RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）结果基础上对差异表达的mRNA进行分析,筛选出与CAD皮肤通透屏障相关差异表达最明显的mRNA;收集CAD曝光部位和正常面部曝光部位皮肤组织进行Occludin免疫组化和组织免疫荧光染色,观察两组Occludin的表达差异。在细胞水平,qRT-PCR和ELISA检测UVB诱导的炎症因子的表达;Western Blot检测UVB对Occludin和PKC表达的影响;细胞跨膜电阻测量UVB对细胞TER的影响。然后应用人工合成siOccludin和Occludin过表达质粒转染HaCaT细胞的策略,对Occludin致CAD皮肤屏障受损和促炎反应的作用机制进行研究:ELISA法检测Occludin敲减或过表达后炎性细胞因子水平;细胞跨膜电阻仪测量Occludin对TER的影响;Western Blot检测Occludin敲减角蛋白表达;siOccludin和PKC抑制剂（PKCi）处理HaCaT细胞后,ELISA和细胞跨膜电阻仪分别检测IL-6的分泌和TER有无恢复。[结果]第一部分:CAD中与炎症相关差异表达最明显的mRNA是A20。免疫组化结果显示A20在CAD皮损中表达明显低于正常面部对照皮肤（P<0.05）,且表达趋势与RNA-seq结果完全一致。在体外实验中,与对照组比较,UVB照射后的HaCaT细胞中A20表达显着降低（P<0.05）。UVB照射后HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的释放增加（P<0.01,P<0.01,P<0.05）,IL-10 分泌减少（P<0.05）;敲减A20后IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌显着增加（P<0.05,P<0.001,P<0.001）,IL-10的分泌减少（P<0.001）;A20敲减后NF-κB P-P65和p-IkB的蛋白表达水平增高（P<0.05,P<0.05）,NF-κB P-P65入核增多。NF-κB p65抑制剂（BAY11-7082）和A20上调后HaCaT细胞中IL-1β的炎症水平得到部分恢复（P<0.05,P<0.05）;A20干扰或过表达后,Occludin、Cldn1、Cldn5、Cldn7、ZO-1、filaggrin、loricrin、involucrin、HMGCR、FAS、SPT,JNK、ERK和p-38表达无明显变化;A20干扰或过表达后,细胞的TEER无明显变化。第二部分:CK检测结果显示,与对照组比较,CAD皮损处TEWL升高CAD中与通透屏障相关差异表达最明显的是Occludin。免疫组化结果显示Occludin在CAD皮损中表达明显低于正常面部对照皮肤（P<0.05）,表达趋势与RNA-seq结果完全一致。在体外实验中,与对照组比较,UVB照射后的HaCaT细胞中Occludin表达显着降低（P<0.05）,PKC表达增高（P<0.05）。UVB照射后HaCaT细胞中TER下降（P<0.05）;敲减Occludin后IL-6水平升高（P<0.05）,IL-1β、TNF-α、IL-10 无明显变化（P>0.05,P=0.73;P>0.05,P=0.92;P>0.05,P=1.13）。Occludin敲减后细胞TER下降;FD4渗透性增加,IL-6水平升高;K1表达增加,K5表达下调;促进HaCaT细胞增殖;PKCi能逆转UVB所致Occludin表达下调（P<0.05）,PKCi能部分恢复UVB所致TER降低（P<0.05）,PKCi能使降低Occludin下调所致IL-6分泌水平增高（P<0.01）。[结论]1.A20在CAD中表达降低;2.A20下调促进炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,抑制IL-10的分泌,其机制为A20通过负向调控NF-κB促进UVB诱导的炎症反应。3.A20与皮肤通透屏障无明显相关性。4.Occludin在CAD中表达明显下调;5.下调Occludin可降低HaCaT细胞的TER,增加细胞FD4渗透性,增加细胞的IL6水平,促进角蛋白表达异常及细胞增殖;6.UVB可通过激活PKC/Occludin通路影响细胞渗透屏障功能,进一步促进细胞炎症。
杨宏新[4]（2020）在《新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究》文中进行了进一步梳理SAS1B（sperm acrosomal SLLP1 binding protein,SAS1B）是新发现的基因,其表达产物最先在成熟卵细胞表面发现,后来在女性有关的癌症,如子宫癌、卵巢癌中发现有表达。癌症化学疗法是临床上最常见的治疗方法,但它非特异性杀灭癌细胞的同时,正常细胞也受累。如果化疗药物仅识别癌细胞,对其特异性杀灭,无疑会给癌症患者带来福音,但寻找癌细胞表面特异性抗原的研究一直没有重大突破。SAS1B蛋白若仅表达于癌细胞表面,这势必会为癌症治疗提供强有力的靶标,但目前SAS1B基因的功能不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因修饰、基因克隆、流式细胞术、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫组化染色、蛋白纯化、抗体制备、ELISA等技术对人肿瘤组织、胃癌细胞系、小鼠胚胎及成体组织的SAS1B基因开展多角度、全方位、深层次研究,旨在揭示SAS1B基因的生物学意义,为抗癌药物的研制、肿瘤早期诊断以及生殖医学提供翔实依据。（1）采用基因克隆技术构建pET-22b-SAS1B原核表达质粒,转化BL21（DE3）细胞,并通过AKTA pure 25蛋白纯化仪和Millipore 10kDa超滤技术制备SAS1B重组蛋白。利用目的蛋白制备兔抗人SAS1B多克隆抗体;通过间接ELISA检测抗体效价;通过Western Blot检测抗体与SAS1B重组蛋白的反应性;通过ELISA法检测甲状腺癌和胃癌患者血清中SAS1B蛋白的表达,采用免疫组织化学方法检测胃癌和甲状腺癌组织中SAS1B蛋白表达,并对抗体的灵敏性进行了评估。通过检测制备的兔抗人SAS1B多克隆抗体血清效价为1:25600以上;胃癌和甲状腺癌的癌组织中SAS1B在癌细胞胞浆和胞膜都有表达,癌旁组织中SAS1B不表达或低表达;胃癌和甲状腺癌患者血清中SAS1B蛋白表达量显着高于对照组,甲状腺癌患者的检测效果更为明显（P<0.05）,ROC曲线显示SAS1B抗体在胃癌和甲状腺癌的诊断中有很好的灵敏度。研究结果进一步提示,SAS1B表达产物主要存在于细胞膜和部分胞浆,而且具有分泌蛋白质的特征,SAS1B血清学检查结果无疑为临床胃癌和甲状腺癌早期筛查提供了更为经济更为便捷的检测方法,同时SAS1B在胃癌和甲状腺癌组织中特异表达结果提示SAS1B是一个非常有希望的靶标。（2）采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 pYSY-Cas9--SAS1B-gRNA1-eGFP和pYSY-Cas9-SAS1B1-gRNA2-Puromycin质粒,采用基因克隆技术构建PcDNA3.1+/C-（K）-SAS1B过表达质粒。通过细胞转染技术对胃癌SGC7901细胞进行研究发现,过表达SAS1B基因后通过上调中心体复制激酶Aurora-A的表达和上调Bard1 β的表达（P<0.05）,使DNA复制过程包括中心体的复制过程加快,促进细胞增殖。敲除SAS1B基因后下调了 Aurora-A和Bard1 β表达（P<0.05）,细胞周期被阻滞于S期,同时诱发胃癌SGC7901细胞死亡。研究结果证实SAS1B基因可作为诊断和治疗胃癌新的特异性靶标,为临床抗肿瘤新药的研发提供关键靶点。（3）本研究首先以小鼠SAS1B基因的三个特征性结构域进行引物设计,检测小鼠胚胎SAS1B基因表达,发现在小鼠胚胎中存在SAS1B基因表达。然后遵照q-PCR引物设计原则重新设计SAS1B扩增引物,发现SAS1B基因随小鼠胚胎发育表达量逐渐升高,小鼠胚胎E11.5和E12.5的表达量比E7.5、E8.5、E9.5高（P<0.05）,在小鼠胚胎发育过程中Bard1基因和Aurora-A激酶表达量也增高（P<0.05）,尤其Bard1上升趋势明显。小鼠成体组织中SAS1B基因呈现限制性表达,小鼠肾脏和睾丸中有SAS1B基因表达,但小鼠肝脏、小肠、脾脏和肺脏等组织中均没有检测到SAS1B基因表达产物。研究结果说明SAS1B基因可能是一个新型的组织特异性基因,与细胞增殖过程密切相关,不仅参与生殖细胞和胚胎发育,而且与肿瘤发生密切相关,但在肾脏表达的原因有待于进一步深入。综上,SAS1B基因是一个新型癌-卵基因,不仅在卵细胞膜上表达,而且在胚胎发育过程中又开始表达,但在大多数成体组织中不表达,然而当肿瘤发生时,SAS1B基因重启表达。胃癌和甲状腺癌患者血清中SAS1B表达特点进一步说明SAS1B蛋白具有分泌特征,可以影响肿瘤微环境。SAS1B基因可通过上调Bard1基因促进中心体扩增激酶Aurora-A表达而加速肿瘤细胞的增殖,敲除SAS1B基因后Bard1基因下调抑制了 Aurora-A表达,细胞周期被阻滞于S期,同时诱发细胞死亡。故SAS1B基因是肿瘤细胞特异性标志物,对胃癌和甲状腺癌的早期诊断和治疗具有十分重要意义,具有非常好的商业开发价值,也是肿瘤药物开发非常好的靶点,同时SAS1B与生殖医学也密切相关。
崔迪[5]（2017）在《抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究》文中认为骨骼肌是机体重要的运动及代谢器官,约占全身质量的1/3～1/2,衰老及退行性疾病的发生引起骨骼肌衰减从而影响人们生活质量并进一步恶化疾病状态。抗阻训练（Resistance Exercise,以下简称RE）或力量训练（Strength Training,以下简称ST）的产生源自于人们对力量的着迷,长期从事抗阻运动可有效刺激肌肉肥大、改善骨骼肌功能抑制肌肉衰减并防治肌肉衰减相关疾病的发生。已有报道提供了人体实验数据支持以上观点,但其分子机制尚待进一步研究。其中,以mTOR信号为中心的蛋白质合成调控通路在抗阻运动重塑骨骼肌质量与功能的过程中的作用机制仍待进一步揭示,而骨骼肌在体干细胞,即肌卫星细胞（Satellite Cell,以下简称SC）,在抗阻运动介导的骨骼肌肥大过程中的必要与否尚存争议。运动与骨骼肌健康领域中,多种实验动物抗阻训练模型如断肌腱术、协同肌剥离术、爬梯、电刺激骨骼肌收缩、被动跳水或后肢伸展及复杂抗阻训练笼盒/设备等先后被运动科学家报道,但均受限于模型非自主性、机体侵害损伤及非生理条件等因素影响不能在研究中广泛使用及推广,目前尚缺乏生理条件下有效合理的小鼠自主抗阻训练动物模型。为探讨生理条件下抗阻训练介导骨骼肌质量控制的分子机制,本研究研发了小鼠自主举重训练模型并通过急性、短时及长时训练研究不同时长举重训练对骨骼肌质量控制相关蛋白质合成与降解、肌卫星细胞活性等影响及其分子机制,同时采用骨骼肌卫星细胞（Satellite Cell,以下简称SC）缺失（Pax7Cre-RosaDTA,以下简称mSCD）转基因小鼠模型探究骨骼肌卫星细胞在抗阻运动介导骨骼肌肥大过程中的必要性,采用糖皮质激素地塞米松（Dexamethasone,以下简称Dex）诱导小鼠肌萎缩模型探索短时举重训练对药物性骨骼肌流失的干预作用及可能机制,旨在揭示抗阻运动介导骨骼肌质量控制、防治骨骼肌衰减的综合内在机制,为运动抗衰老及相关肌病、代谢相关疾病的运动防治提供理论参考和基础研究数据支持。目的:介绍小鼠自主举重训练模型设计思路、校准方法及不同时长（包括急性、长时、短时）举重训练方案;探究不同时长举重训练对骨骼肌质量及收缩功能的影响;探究急性举重训练对小鼠骨骼肌转录组基因表达的影响;探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质合成的影响;探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质降解的影响;探究不同时长举重训练对小鼠糖代谢功能的影响;探究不同时长举重训练对肌卫星细胞激活的影响;探究肌卫星细胞在长时举重训练介导骨骼肌肥大过程中的必要性;探究短时举重训练对糖皮质激素诱导骨骼肌萎缩模型的抑制作用。方法:1)小鼠自主举重模型建立与运动训练方案确定小鼠自主举重模型设计思路是利用食物的奖励策略,诱导小鼠利用举重笼具进行后肢屈伸的抗阻力量练习。该举重模型的设计基于小鼠普通饲养笼具（290×180× 200 mm）,根据笼具顶部周长及面积,切割透明塑料钢板裁制为相应大小,并粘合底座使其与普通饲养笼盒完全吻合,该笼盖即为举重模型的底座。在距离笼盖短边距离3 cm处,凿钻大小为10 cm×10 cm的矩形孔,使用相同的材料以三角接头将举重门孔固定,以便将食盒固定在门孔上方。采用金属钢板制作举重杠杆,沿钢板正中两侧凿钻直径为2.5 cm大小的圆形门孔以便小鼠通过该孔探寻食物,举重杠杆一侧固定在塑料钢板盖上,一侧则通过三角架可上下活动,伸出笼盒部分打孔以添加负荷重量。杠杆臂下端附着磁铁,与其对应笼盒部分固定磁力感应器,后者与计算机相连用以记录小鼠举重次数与频率。使用10-12周龄清洁级野生型C57BL/6雄性小鼠分别进行急性举重练习（n=1）及长时举重练习（n=4）,测试举重模型并根据小鼠举重情况确定运动训练方案。2)不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响本研究先后观察了急性（Acute Weightlifting,以下简称AWL）、短时（Short-term WL,以下简称 SWL）及长时（Long-term WL,以下简称 LWL）举重训练对小鼠骨骼肌质量的影响。急性举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）及急性举重训练干预组（AWL,n=5）,分别置于举重笼具及普通饲养笼中,AWL组小鼠进行为期一天的急性举重训练,训练时间从下午6:00至第二日晨6:00,举重负荷为150%体重（Body Weight,以下简称BW）。短时举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）及短时举重训练干预组（SWL,n=5）,SWL组小鼠进行为期2周的举重训练运动干预,举重负荷从100%BW增加至240%BW。长时举重训练干预实验中,10-12周龄雄性清洁级野生型C57BL/6小鼠,随机分为对照组（Con,n=8）及长时举重训练干预组（LWL,n=8）,LWL组小鼠进行为期8周的举重训练运动干预,举重负荷从100%BW增加至240%BW并维持240%BW直至训练结束。无论短时或长时举重训练干预,运动组小鼠置于举重笼具前禁食2小时,训练时间从下午6:00（熄灯）至第二天上午9:00,白天置于普通饲养笼具中,每2-3天训练周期后休息1天,对照组与训练组禁食干预一致。运动干预后进行相关功能测试,后采用颈椎脱臼处死小鼠并采集后肢骨骼肌及内脏样本。a)不同时长举重训练对小鼠体重、骨骼肌质量及收缩功能的影响采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌最大肌力、单收缩肌力、力量-频率关系、疲劳与恢复;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量参考值;采用超声磁共振技术（Echo-MRI）评价长时举重小鼠身体成分;采用核磁共振技术（MRI）检测长时举重训练对小鼠后肢骨骼肌横截面积影响;采用跑台耐力实验评价长时举重训练对小鼠有氧运动能力影响;采用超声心动信号采集系统检测小鼠心肌收缩功能;采用HE染色技术检测短时举重训练对小鼠骨骼肌肌纤维横截面积影响。b)急性举重训练对小鼠骨骼肌转录组基因表达影响制备腓肠肌mRNA,采用Illumina测序平台进行转录组测序（RNA-sequencing,以下简称RNA-seq）;抽提腓肠肌、胫骨前肌、股四头肌、心肌、肝脏组织总mRNA并制备相应cDNA样品,采用Semi-quantitive PCR技术检测Tweak,Fn14,D1scr1,Nr4a3,Cytb等基因mRNA表达。c)探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质合成的影响采用表面感应翻译技术（Surface sensingoftransltion,以下简称SUnSET）技术检测小鼠骨骼肌及内脏组织蛋白质合成;采用免疫印迹技术（Western Blot,以下简称WB）技术检测蛋白质合成相关Akt、p70S6k、4e-Bp-1蛋白表达及磷酸化修饰。d)探究不同时长举重训练对骨骼肌蛋白质降解的影响采用WB技术检测蛋白降解相关蛋白泛素化（Ubiquitination）;采用WB技术检测细胞自噬相关Lc3、p62蛋白表达、Lc3Ⅱ1/Lc3Ⅰ比值及线粒体含量相关Cox4或线粒体复合物Ⅰ-Ⅴ蛋白表达。e)探究长时举重训练对小鼠糖代谢功能的影响采用腹腔注射葡萄糖实验（Introperitoneal glucoe tolerance test,以下简称IGTT）检测长时举重训练对小鼠血糖清除能力影响;采用免疫印迹WB技术检测糖代谢相关Glut4蛋白表达及胰岛素刺激下Akt蛋白表达及磷酸化修饰。f)探究不同时长举重训练对Notch1蛋白表达及肌卫星细胞的影响采用WB技术检测细胞增殖相关Notch1蛋白表达;采用点击化学（Click chemistry）技术检测EdU标记骨骼肌DNA合成;采用免疫荧光技术检测Pax7标记肌卫星细胞。3)探究长时举重训练对成体肌卫星细胞缺失转基因小鼠骨骼肌质量的影响10-12周龄雄性mSCD小鼠及其同窝对照WT小鼠各10只,每种基因型小鼠又分为安静对照组（Sed）及举重干预组（WL）,即mSCD-Sed、mSCD-WL、WT-Sed、WT-WL,每组各5只。举重组（mSCD-WL、WT-WL）小鼠进行为期8周的举重训练,即负荷强度从100%BW增加到240%BW并保持至运动干预结束,每2-3天训练周期后休息1天。采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌收缩功能;采用IGTT技术检测小鼠葡萄糖清除能力;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量参考值。4)探究短时举重训练对糖皮质激素诱导骨骼肌萎缩的干预作用10-12周龄清洁级野生型C57BL/6雄性小鼠,随机分为对照组（Con,n=5）、地塞米松注射组（Dex,n=4）及地塞米松+举重组（Dex+WL,n=4）,Dex及Dex+WL组小鼠连续7天腹腔注射25mg/Kg BW剂量的Dex,运动组小鼠进行为期2周的短时举重训练。采用Aurora在体肌力评价系统测试小鼠后肢骨骼肌收缩功能;采用精密电子称称量比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌、心肌、附睾脂肪质量,使用游标卡尺测量胫骨长度作为组织相对质量的参考;采用SUnSET技术检测小鼠骨骼肌蛋白质合成。结果:1)小鼠自主举重模型建立与运动训练方案确立野生型小鼠能够使用举重模型进行自主抗阻练习,举重笼盒添加重量与负荷强度线性关系良好;急性举重训练预实验小鼠在100%、150%、200%BW负荷强度举重次数分别为645、291、5;长时举重预实验中随着负荷强度从100%增加到300%BW过程中,小鼠举重次数逐渐下降,在240%BW负荷强度下保持约200次/晚的举重频次。2)不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响a)急性举重运动干预结果显示,在150%BW负荷强度下,小鼠举重次数为422±64次,小鼠运动前后无体重下降现象,未比较急性举重小鼠骨骼肌质量变化。短时举重运动训练数据显示,鼠举重次数根据负荷强度的增加而降低,在240%BW负荷强度下基本保持约200次的频数;短时举重训练对小鼠骨骼肌、心脏附睾脂肪湿重的影响不大（P>0.05）,具体来说SWL组小鼠比目鱼肌质量较Con小鼠有增加趋势,而附睾脂肪湿重较Con组呈下降趋势;SWL组小鼠后肢肌肉最大肌力输出较Con呈增加趋势,而不论使用体重还是用腓肠肌质量为参考,最大肌力在两组比较中差异不明显（P>0.05）;力量-频率曲线关系百分比曲线,两组比较无差异,而在与腓肠肌质量相对肌力比较中SWL组小鼠在80、100、125 Hz频率刺激下力量输出显着高于Con组小鼠（P<0.05）;SWL组较Con组小鼠在肌纤维数量无差异,肌纤维横截面积在WL组呈增加趋势,而在具体肌纤维面积分布及数量变化上也无差异（P>0.05）。长时举重训练干预研究结果显示,小鼠举重次数根据负荷强度的增加而降低,在240%BW负荷强度下基本保持200次左右;8周运动过程中LWL小鼠体重逐渐增加,在运动干预结束的第8周,LWL组小鼠体重较Con组小鼠显着增加（P<0.01）;与Con比,LWL小鼠骨骼肌最大收缩肌力及短时收缩力相对值均显着增加（P<0.01）,无论参考体重或肌肉质量相对最大肌力及短时兴对收缩肌力均显着增加（P<0.05）;力量-频率关系最大值百分比在Con与LWL组无显着差异（P>0.05）,而肌力与体重相对值则呈现LWL组显着高于Con（P<0.01）,LWL组小鼠在相对体重收缩肌力在40及60 Hz显着高于Con组（P<0.01）;与最大值百分比疲劳曲线在LWL组较Con右移（P<0.01）,与体重相对肌力曲线也表现右移现象（P<0.01）,提示LWL组小鼠骨骼肌疲劳时间延长,这与到达50%最大肌力的时间差异变化一致（P<0.05）,在疲劳后期仍能保持较高肌力输出（P<0.0 1）,15 min两组小鼠肌力恢复情况无差异（P>0.05）;Echo-MRI结果显示脂肪含量、瘦体重、自由水及总水量在两组小鼠间无变化（P>0.05）;小鼠后肢肌肉横断面MRI结果发现LWL小鼠显着高于Con组（P<0.05）,该结果与肌肉湿重称重变化一致,即比目鱼肌、跖肌、腓肠肌及趾长伸肌长时举重运动干预后均显着高于Con组（P<0.05）,胫骨前肌无论在MRI结果及肌肉湿重称重比较中均无差异（P>0.05）,股骨前后径差异显着而中外侧径无变化;内脏组织湿重变化分析发现,心脏相对质量变化无差异,而指征脂肪含量的附睾脂肪含量在LWL组显着下降（P<0.05）;Con组小鼠与LWL组小鼠在跑台耐力训练中总跑步距离无差异;小鼠超声心动各项参数,分析数据未见两组间参数差异,仅有心率呈现下降趋势,但差异不具显着性（P>0.05）。b)急性举重训练干预中,RNA测序（RNAseq）结果筛选出490个基因转录表达水平在对照组Con与急性举重干预组AWL间存在显着差异（P<0.05）,其中较Con组显着上调基因为341个,显着下调基因为149个;AWL组小鼠腓肠肌中Dscr1,Fn14及Nr4a3表达较Con组显着增加（P<0.05）,分别为Con组的1.51、2.31及2.94倍,与RNAseq的检测结果一致;Dscr1及Fn14的基因表达水平在股四头肌组织中AWL组较Con组差异显着（P<0.05）,而胫骨前肌组织中未见二者基因表达差异（P>0.05）;Dscr1基因表达水平在心肌及肝脏组织中未见差异（P>0.05）,而在心肌组织中AWL组Fn14表达较Con显着增加（P<0.05）。c)急性举重训练对Akt及4e-Bp1信号的总蛋白表达与磷酸化修饰均无影响,表现为AWL组与Con组间无差异（P>0.05）。短时举重训练显着增加小鼠骨骼肌蛋白质合成,表现为在跖肌中SWL组小鼠SUnSET蛋白质合成水平显着高于Con组小鼠（P<0.05）,而肝脏组织中无变化（P>0.05）。长时举重训练中,SUnSET检测蛋白质合成数据结果显示跖肌、腓肠肌及股四头肌Puromycin标记多肽在LWL组显着高于Con组（P<0.05）,LWL组胫骨前肌及心肌蛋白质合成也显着增加,肝脏（LV）组织两组间无变化;8周举重训练后p-AktS473/Akt比值使WL组小鼠骨骼肌显着高于Con组（P<0.05）,p-p70S6kThr389及p-4e-Bp-1S65含量显着增加（P<0.05）。d)急性举重训练实验中,与Con比Lc3Ⅰ蛋白表达在AWL组呈降低趋势,Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值无变化;CoxIV蛋白含量在两组比较中无差异（P>0.05）。短时举重训练中,与Con组比SWL组小鼠骨骼肌Lc3Ⅰ蛋白表达显着增加（P<0.05）,Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值显着下降（P<0.05）,两组小鼠p62蛋白表达无差异（P>0.05）;SWL组较Con组指征线粒体含量的Cox4蛋白表达无差异（P>0.05）,相应地线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ亦无差异（P>0.05）。长时举重训练促进LWL组小鼠骨骼肌Lc3Ⅰ含量显着增加（P<0.05）,而对Lc3Ⅱ/Lc3Ⅰ比值无影响,p62含量在LWL组骨骼肌中显着下降（P<0.05）,而Cox4含量在两组比较中无差异;LWL组小鼠骨骼肌Ubiqutin含量较Con组显着增加（P<0.05）。e)长时举重训练干预后,IGTT试验结果显示禁食后LWL组小鼠基础血液葡萄糖水平显着低于Con组,葡萄糖注射30 min后Con组小鼠血糖水平迅速增加,而LWL组小鼠峰值显着低于Con组,60 min及120 min后Con组及LWL小鼠血糖恢复到基础水平但LWL组小鼠的血糖读值均显着低于Con组（P<0.01）,曲线下面积（Area under curve,以下简称AUC）结果显示,LWL组小鼠较Con组小鼠显着降低（P<0.01）;LWL组小鼠骨骼肌Glut4蛋白表达较Con组小鼠无差异,而胰岛素刺激下LWL组小鼠骨骼肌p-AktS473/Akt较Con组小鼠显着增加（P<0.05）。f)急性举重训练对腓肠肌Notch1蛋白的表达无影响,表现为Con与AWL组间比较无差异（P>0.05）。短时举重训练中,SWL组较Con组小鼠Notch1蛋白表达无差异（P>0.05）;SWL组小鼠Edu阳性细胞个数较Con组呈增加趋势（P=0.09）。长时举重训练干预后,LWL组小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达较Con组显着下调（P<0.05）。3)长时举重训练对诱导性骨骼肌卫星细胞缺失小鼠的研究结果显示,小鼠的运动情况变异系数较大,与之前长时举重运动干预情况不一致,可能是由于小鼠遗传背景不同而有所影响,WT-WL及mSCD-WL两组小鼠举重基本变化趋势一致无差异（P>0.05）;与长时举重运动干预一致地是,WT-WL组较WT-Sed组,mSCD-WL组较mSCD-Sed组小鼠糖耐量改善,表现为即刻0时血糖水平下降,葡萄糖注射后30 min血糖下降迅速（P<0.01）,并能继续保持较低水平并恢复至基础状态;AUC曲线变化与血糖耐量实验曲线变化一致,即WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组显着下降（P<0.05）,mSCD-Sed组与WT-Sed组比,无论血糖动态变化与AUC曲线均无差异（P>0.05）;与WT-Sed组比,mSCD-Sed组小鼠体重呈增加趋势,长时举重训练未改变WT-WL组及mSCD-WL组小鼠体重;骨骼肌湿重方面,与WT-Sed组比mSCD-Sed组小鼠比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、附睾脂肪无差异,心脏相对湿重呈下降趋势。长时举重训练干预对体重肌组织称重无影响,WT-WL组较WT-Sed、mSCD-WL组较mSCD-Sed组小鼠小鼠比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、附睾脂肪均呈下降趋势,而对心脏的作用呈相反增加趋势;小鼠骨骼肌收缩功能显示,WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组骨骼肌强直收缩及单收缩无差异（P>0.05）,mSCD-Sed组较WT-Sed组亦无变化（P>0.05）;骨骼肌强直收缩（Tetanic Force）及单收缩（Twitch Force）相对值比较中,WT-WL组较WT-Sed组、mSCD-WL组较mSCD-Sed组均呈升高趋势,提示8周长时举重训练对mSCD小鼠骨骼肌收缩功能肌力输出具有增加趋势;此外,前期预实验设计5只同窝雄性Pax7CreERr-ROSADTA176小鼠,随机选取2只作为对照（ConWL）,另外3只进行为期10天的Tamoxifen腹腔注射启动重组酶Cre剪切功能（TGWL）,经过一周Tamoxifen药物作用清除期,所有小鼠均进行为期4周的举重训练,观察两组（ConWL及TGWL）在抗阻运动干预后的适应性变化差别,结果主要发现,TGWL小鼠骨骼肌重及收缩功能低于ConWL小鼠（P=0.085）,骨骼质量表现为与ConWL相比,跖肌、腓肠肌显着下降（P<0.05）,而附睾脂肪质量增加（P=0.08）。肌肉强直收缩肌力输出在ConWL高于TGWL组（P=0.08）。4)短时举重训练结合Dex药物干预实验结果显示,实验前各组小鼠体重无差异,药物干预后Dex组小鼠体重较Con呈下降趋势但差异不具显着性（P>0.05）,Dex+WL组小鼠体重较Con及Dex组均显着下降（P<0.05）;与Con组比比目鱼肌湿重在Dex组无变化,而与Dex组比Dex+WL组小鼠比目鱼肌显着增加;Dex组小鼠跖肌、腓肠肌、胫骨前肌、趾长伸肌湿重均显着下降,Dex+WL组较Dex在这几组骨骼肌湿重的变化中下降更明显（P<0.05）;Dex组小鼠心脏质量呈增加趋势（P=0.07）,Dex+WL组小鼠心脏湿重呈增加趋势,但平均值低于Dex组;附睾脂肪含量结果显示,Dex+WL小鼠无论较Con或Dex组均显着下降;与Con组Dex组小鼠后肢骨骼肌收缩最大肌力输出绝对值呈下降趋势,而Dex+WL组小鼠最大肌力绝对值平均数高于Dex组,与Con组接近,但差异不具显着性（P>0.05）;相对肌肉质量骨骼肌最大肌力输出结果显示,无论与Con还是Dex组比,Dex+WL组小鼠相对肌力显着增加（P<0.05）;Con、Dex及Dex+WL三组小鼠蛋白质合成无差异（P>0.05）。结论:1)本研究研发了自主举重抗阻训练小鼠模型,该模型利用食物奖励策略诱导小鼠进行后肢伸展（类似负重深蹲及提踵练习）运动;根据实验观察确定了急性、短时、长时举重训练的干预方案,为系统研究抗阻训练健康促进机制提供了运动实验动物模型。2)长时举重训练正向重塑了小鼠后肢骨骼肌质量及收缩功能,骨骼肌收缩功能的增加表现为最大肌力、单收缩肌力及抗疲劳能力的增加,该过程中蛋白质合成增加且该现象在举重训练的早期即可观察到;调控蛋白质合成mTOR信号的上游Akt及下游p70S6k、4e-Bp-1级联磷酸化事件参与了长时举重训练介导的骨骼肌肥大;蛋白质泛素化水平在长时举重训练后增加,细胞自噬能力增强（LCI显着增加）、自噬流增加（p62蛋白含量下降,即可被p62标记靶向物质减少）,提示抗阻训练介导骨骼肌肥大过程中蛋白质降解可能优先选择泛素蛋白酶体途径进行;糖代谢方面,长时举重训练显着增加小鼠葡萄糖快速清除能力,胰岛素刺激Akt信号的激活参与其中,而葡萄糖转运相关的Glut4信号并未发生改变,提示可能存在其他信号通路参与或代偿了抗阻运动引起的糖代谢改善,待进一步研究;短时举重训练促进骨骼肌肥大相关细胞增殖,与此相关的Notch1信号在长时举重训练后显着下调;急性150%BW负荷强度举重运动引起小鼠骨骼肌转录表达谱490个基因发生显着变化,Nr4a3倍比变化最高,后者在糖代谢中发挥重要作用,Nr4a3的运动应激可能成为未来研究运动促进骨骼肌健康的重要靶向;该举重训练的转录水平运动应激在小鼠下,肢肌群腓肠肌、跖肌、股四头肌中应答良好,胫骨前肌应答不明显。短时举重训练介导骨骼肌蛋白质合成增加,促进成肌干细胞增殖。3)为研究肌卫星细胞在抗阻运动介导骨骼肌适应过程中的作用及其相关机制,本研究试图采用诱导型肌卫星细胞缺失模型（mSCD,Pax7CreERT-ROSADTA176）并使用抗阻举重模型干预8周,观察小鼠骨骼肌质量、收缩功能及糖代谢变化。长时抗阻训练干预能够促进小鼠骨骼肌收缩功能增加,肌卫星细胞缺失小鼠不能获得野生型小鼠的适应性改善水平,而对糖代谢功能的改善与对照组野生型小鼠的运动适应相一致。4)本研究试图采用连续腹腔注射糖皮质激素（本研究采用地塞米松,Dexamethason,以下简称Dex）构建药物性肌萎缩模型,应用小鼠短时举重训练模型尝试观察抗阻运动对肌萎缩的干预作用。短期举重训练不能逆转Dex介导的骨骼肌萎缩,但能够保持小鼠后肢骨骼肌的相对收缩功能,这可能与Dex使用对骨骼肌蛋白质合成的抑制作用相关。
李慧文[6]（2017）在《cGMP-PDE3-cAMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用及CNP的干预效应》文中提出随着新生儿重症监护医疗水平的提高和发展,早产儿存活率有明显提高,与此同时早产儿支气管肺发育不良（broncho-pulmonary dysplasia,BPD）,发病率也有明显增加;由于早产儿的肺血管内皮细胞对高氧、炎症引起的氧化损伤特别敏感,因此接受机械通气、氧疗后的早产儿肺出现肺水肿、肺淋巴管扩张、肺纤维化为主要病理特征的BPD。同时,BPD诱导引起的后遗症状越来越多,给患儿身心健康、家庭、社会造成严重负担,引起广大新生儿科专家的关注。环核苷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）,环磷酸腺苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）是一类可被磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）,水解的细胞内第二信使,参与调理机体信号传导,生理活动。哺乳动物PDE家族由1 1个保有不同调节功能、关联结构的基因组成,各个PDE不同特性、细胞内不同亚细胞靶点、参与调节伴侣间的差异,使cAMP,cGMP信号的振幅,持续时间,终止反应等方面出现功能区别。cGMP特异性PDE可抑制PDE3或可以激活PDE2,与细胞内cAMP/cGMP存在交集信号通路（cross talk）,PDE2可调节细胞内PDE3的表达（抑制cGMP型）,PDE2、PDE3的共同存在使cAMP信号在定位、持续时间和强度上受到cGMP的调控。C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide,CNP）是钠尿肽家族（natriuretic peptides,NPS）的组成部分之一,其与细胞膜上钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor,NPR）连和,产生排钠利尿、降血压、舒张血管、平衡水电解质紊乱等功效。钠尿肽受体,跟鸟苷酸环化酶（颗粒型）结合,诱导上调cGMP含量,增多的cGMP,进一步激活上调蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase,PKG）,参与生理反应。因此,本课题利用高氧诱导肺损伤新生大鼠模型,探究cGMP信号通路是否参与高氧诱导引起肺损,在此基础上,进一步阐明外源性CNP在高氧诱导肺损伤cGMP-PDE3-cAMP信号通路中的干预作用。第一部分 cGMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用目的:探讨cGMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤作用。方法:利用足月新生Wistar大鼠制备高氧性肺损伤模型,模型制作后第1、3、7、14天不同时间内检测新生大鼠体重、肺组织含水量;观察肺病理形态学改变;测定肺组织SOD,MDA,CAT含量;采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α、IL-1 β、IL-6、cAMP、cGMP 表达含量;利用 Western Blotting 方法检测 PDE2A、PDE3A、PDE3B,p-VASP表达水平;TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平;利用RT-PCR法检测PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA 表达。结果:1.体重测定结果:高氧组与对照组对比,高氧第3、7、14天体重与对照组同一天对比明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。各组第1天体重无明显变化。2.肺组织含水量测定结果:与正常组对比,高氧组第3、7、14天肺组织含水量明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。各组第1天肺组织含水量无明显变化。3.肺组织形态学改变结果:HE染色结果示,与同一天对照组相比,高氧组第3、7、14天新生大鼠肺组织形态学可见,肺组织结构紊乱。高氧暴露时间延长,肺泡结构简单化、数目明显减少,可见大量炎性细胞渗出,有的肺泡塌陷,肺泡出血,肺泡上皮细胞脱落。4.肺组织SOD、MDA、CAT测定结果:与正常组对比,高氧组第1、3、7、14天新生大鼠SOD,CAT含量较同一天对照组明显减少（P<0.05）;高氧组第1、3、7、14天新生大鼠MDA含量较同一天对照组明显升高（P<0.05）。5.BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定:与对照组同一天比较,高氧组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第1、3、7、14天时,明显增高,差异显着（P<0.05）。TNF-α、IL-1 β、IL-6含量随延长高氧暴露时间逐渐增高,第7天时达到高峰。6.高氧肺组织中cAMP、cGMP含量变化:与对照组相比,高氧组大鼠肺组织中第1、3、7、14天时,cAMP、cGMP表达明显降低（P<0.05）,随着高氧暴露时间延长,cAMP、cGMP含量逐渐减少,第14天时达最低值。7.Western Blot结果:与对照组同一天相比,高氧组第1、3、7、14天PDE2A,蛋白表达未见明显变化;与对照组同一天相比,高氧组第1、3、7、1 4天PDE3A,PDE3B蛋白表达上调;高氧组1、3、7、14天p-VASP蛋白表达低于同一天对照组。高氧组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1 β、IL-6蛋白在1、3、7、14天时,与对照组同一天比较明显增高,差异有显着性差异（P<0.05）。8.RT-PCR结果:与对照组同一天相比,高氧组1、3、7、1 4天PDE2A mRNA表达未见明显变化;与对照组同一天相比,高氧组1、3、7、14天PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达上调,随着时间延长mRNA表达逐渐增高。结论:1.高氧可诱发肺水肿、氧化应激及炎症反应。2.高氧诱导破坏cGMP,PKG活性,进而上调PDE3A,PDE3B蛋白表达,提示cGMP信号通路参与高氧诱导的肺损伤。第二部分 CNP-cGMP-PDE3-cAMP信号交叉对高氧诱导新生大鼠肺损伤的保护作用目的:观察CNP通过cGMP-PDE3-cAMP途径保护高氧诱导新生大鼠肺损伤。方法:选择Wistar新生大鼠建立新生大鼠高氧模型后,分为3组①对照组,②高氧组（85%O2）,③高氧+CNP组。高氧+CNP组腹腔注射CNP,1、3、7、14天天不同时间内检测新生大鼠体重、肺组织含水量;观察肺组织病理形态学改变;测定肺组织SOD、MDA、CAT含量;采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α、IL-1β、IL-6、CAMP、cGMP 的表达;利用 Western Blotting 方法检测 PDE2A、PDE3A、PDE3B表达水平;TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平;利用RT-PCR法检测PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA 表达;利用不同 PDE 抑制剂测定cGMP-PDE的抑制率。结果:1.体重测定结果:高氧+CNP组高氧暴露后第3、7、14天时体重与高氧组对比明显增高,均有显着性差异（P<0.05）;高氧组与同一天对照组对比明显降低（P<0.05）;各组第1天体重无明显变化。2.肺组织含水量测定结果:与同一天高氧组比较高氧+CNP治疗组第3、7、14天时,肺含水量明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,各组第1天肺组织含水量无明显变化。3.HE染色结果:HE染色结果示,与同一天高氧组相比,CNP+高氧组第1、3、7、14天新生大鼠肺组织形态学改变较同一时间高氧组好转,炎症渗出改善,肺泡结构较清晰,肺组织较前修复。4.肺组织SOD、MDA、CAT测定结果:与同一天高氧组比较;高氧+CNP组,第1、3、7、14天新生大鼠SOD、CAT含量明显上升（P<0.05）,MDA含量较同一天高氧组明显下降（P<0.05）。5.BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定:与高氧组同一天对比,高氧+CNP组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第1、3、7、14天时,明显减少,差异有显着性差异（P<0.05）。6.高氧肺组织中cAMP、cGMP含量变化:高氧+CNP组大鼠肺组织中第1、3、7、14天时,cAMP、cGMP表达水平与对照组相比明显上升（P<0.05）。7.Western Blot结果:与高氧组相比,高氧+CNP组同一天PDE3A,PDE3B蛋白表达下调,其灰度值亦显着减少,有统计学意义（P<0.05）;与高氧组相比,高氧+CNP组第1、3、7、14天PDE2A,p-VASP蛋白未见明显变化。与高氧组同一天对比,高氧+CNP组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量在高氧组第1、3、7、14天时,明显减少,差异有显着性差异（P<0.05）。8.RT-PCR结果:与高氧组相比,高氧+CNP组第1、3、7、14天PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达上调（P<0.05）;高氧+CNP组PDE2A mRNA与高氧组比较无明显差异。9.不同PDE抑制剂对cAMP、cGMP变化:IBMX干预下CNP不能改变eAMP的含量,但可改变cGMP的含量差异显着（P<0.05）;EHNA干预下CNP可改变cAMP,cGMP的含量,差异显着（P<0.05）;Milrinone干预下CNP不能改变cAMP的含量,但可改变cGMP的含量差异显着（P<0.05）。IBMX的cGMP-PDE抑制率最高,其次为Milrinone。结论:1.CNP能减轻高氧诱发肺组织水肿、氧化应激、炎症反应。2.CNP-cGMP 信号途径调节 PDE3 的活性,从而影响 cAMP 含量,提示CNP-cGMP-PDE3-cAMP信号交叉,对高氧性肺损伤起保护作用。
余年[7]（2017）在《孕烷X受体/核因子κB信号通路对癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响》文中研究指明研究背景目前全球约1/3癫痫患者为耐药性癫痫（DRE）,脑内多药耐药基因1（MDR1）编码的P-糖蛋白（P-gp）过表达是导致癫痫患者耐药的主要原因之一,抑制癫痫脑P-gp过表达是未来临床治疗DRE方向之一。我们先前研究发现,癫痫发作能够导致脑组织明显炎性反应,而脑组织炎症反应中的关键因子—核转录因子-κB（NF-κB）炎性通路能够促使癫痫鼠脑内P-gp过表达,抑制NF-κB活性能够下调癫痫脑内P-gp表达。除癫痫本身发作外,抗癫痫药物的使用也是诱导耐药蛋白过表达的重要因素之一,但其具体机制不明。孕烷X受体（PXR）是体内影响药物及外源性物质转运代谢的重要核受体;既往研究证实,其活性与NF-κB炎性信号通路密切相关。因此本研究提出假设:是否可以通过抑制PXR活性,干预NF-κB炎性通路,继而达到阻止癫痫脑P-gp过表达,最终实现抑制癫痫耐药发生。此外,颞叶癫痫（TLE）是临床最为常见的一种DRE,卡马西平（CBZ）是国内外诸多癫痫治疗指南推荐的TLE一线治疗药物,因此文献也有将DRE的特征性之一即是对CBZ耐药。因此本课题探讨能否通过调控脑内PXR/NF-κB信号通路,从而降低癫痫脑P-gp表达,CBZ诱导的脑内P-gp高表达是否与此信号通路有关,为临床治疗癫痫特别是DRE提供理论基础。第一部分 PXR/NF-κB信号通路对急性癫痫发作大鼠脑P-糖蛋白的调节作用目的:探讨PXR/NF-κB信号对急性癫痫发作大鼠脑P-糖蛋白（P-gp）的调节作用,并观察卡马西平（CBZ）对其影响,及CBZ的作用效应与PXR/NF-κB信号通路的相关性。方法:160只S-D大鼠随机分为,（1）假手术组（Sham组）,（2）急性癫痫模型组（AEP组）,（3）癫痫模型干预组,①PMA（PXR活性抑制剂）干预组,②PDTC（NF-κB活性抑制剂）干预组,③SJW（PXR活性激活剂）组,（4）CBZ治疗癫痫组,①CBZ治疗组,②CBZ组+PDTC干预组,③CBZ组+PMA干预组。海马微量注射海人酸（KA）制作癫痫模型,Sham组注射等体积生理盐水。干预组在KA注射前30 min分别给予侧脑室注射PMA、腹腔注射PDTC、灌胃SJW等;治疗组在癫痫模型制作前、后30 min各CBZ灌胃一次,期间记录各组大鼠死亡率、造模成功率、癫痫发作潜伏期（作为癫痫发作易感性指标）。所有模型于制作完成24 h后断尾采血,后予以快速扼颈而死,各组中5只大鼠脑组织予以Westem Blot（P-gp、PXR、NF-κBp65）与RT-PCR（mdr1a、mdr1b、PXR、p65）,其余大鼠模型脑组织予以甲醛固定,行免疫组织化学和免疫荧光双标染色,检测P-gp与PXR、P-gp和NF-κBp65共表达情况,采用ELISA法检测脑组织、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度。结果:1.各组癫痫大鼠死亡率、造模成功率差异无统计学意义。PDTC组发作潜伏期（SOT3=90.35±40.39 min 和 SOT5=105.28±28.26 min）较模型组（SOT3=66.31±12.95 min 和 SOT5=75.69±28.67 min）延长（P<0.05）,提示其发作易感性降低;而 PMA 组（SOT3=47.50±23.21 min 和 SOT5=60.57±21.10 min）癫痫发作潜伏期延长（P<0.05）,SJW组SOT3和SOT5时间与AEP组相比,差异无统计学意义。2.各组癫痫模型发作后脑组织炎性细胞因子较Sham组均升高（P<0.05）,但各组外周血清中炎性因子差异无统计学意义。与AEP组（脑IL-1 β=49.7±2.6 ng/L,IL-6=28.7+7.2 ng/L,TNF-α=42.8±2.4 ng/L）相比,PDTC 干预组脑组织中炎性细胞因子浓度均降低（脑 IL-1β=31.1±2.3 ng/L,IL-6=16.1+8.2 ng/L,TNF-α=28.2±3.0 ng/L）,PMA 组脑内促炎性因子浓度（IL-1β=52.5±8.3 ng/L,IL-6=32.5+6.1 ng/L,TNF-α=45.81±7.2ng/L）均有升高趋势,但差异均无统计学意义。与CBZ组相比,CBZ+PDTC组脑组织中炎性细胞因子浓度差异无统计学意义。3.与AEP组相比,PDTC干预组大鼠脑组织mdr1a、p65 mRNA及其P-gp、NF-κB p65蛋白表达降低（P<0.05）;NF-κBp65与P-gp有明显共表达;PMA干预组NF-κBp65和P-gp反而有升高趋势,但差异无统计学差异。与CBZ组相比,CBZ+PDTC组脑P-gp、NF-κBp65蛋白表达降低（P<0.05）,PXR表达两组差异无统计学意义。其他干预组、CBZ治疗组相应观察指标差异亦无统计学意义。各组间mdr1b mRNA水平差异亦无统计学意义。结论:癫痫急性发作期启动脑组织炎症反应;抑制NF-κB活性降低了脑P-gp及其编码基因mdr1a mRNA表达,同时有减轻急性发作期脑组织炎症反应趋势;而抑制急性癫痫发作期脑PXR活性,未降低脑内P-gp及mdr1a mRNA表达,反而有加剧脑组织炎症反应趋势;CBZ治疗对癫痫发作急性期炎性水平和P-gp表达未见明显影响。综上推测,癫痫发作急性期脑耐药蛋白表达升高,可能与其NF-κB活化所致脑组织炎症反应有关。第二部分PXR/NF-κB信号通路对慢性癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响目的:探讨PXR/NF-κB信号对慢性癫痫大鼠脑P-gp的调节作用,并观察CBZ对其影响,及CBZ与PXR/NF-κB信号通路相关性。方法:140只SD大鼠随机分为:（1）生理盐水组（NS组）,（2）慢性癫痫（CEP）模型组（KA组）,（3）CEP模型干预组,①KA+PMA干预组,②KAPDTC 组,（4）CBZ 治疗 CEP 组,①KA+CBZ 治疗组,②KA+CBZ+PMA干预组,③KA+CBZ+PDTC组。海马注射海人酸（KA）制作癫痫模型,出现≥2次非诱发性发作（即CEP模型）后,干预组分别给予侧脑室注射PMA、腹腔注射PDTC,治疗组予以CBZ灌胃,NS组注射等体积生理盐水。1 w后断尾采血,ELISA法测血清中IL-1β、TNF-α、IL-6浓度;后予以快速扼颈而死,各组中5只大鼠脑组织予以Westem Blot（检测P-gp、PXR、NF-κBp65）与RT-PCR（检测mdr1a、mdr1b、PXR、p65）,其余大鼠脑组织予以甲醛固定后,行免疫组织化学染色,观察P-gp、PXR的表达与分布情况。结果:1.120只癫痫造模大鼠中26只死亡,14只未出现非诱发性癫痫发作。与CEP组相比,各干预组（PDTC组、PMA组）和CBZ治疗组癫痫大鼠死亡率、造模失败率、慢性期内癫痫发作严重程度差异均无统计学意义。2.与NS组相比,CEP大鼠脑组织中P-gp及其编码的mdr1a mRNA和PXR及其编码mRNA均升高（P<0.05）;使用CBZ治疗一周后上述检测指标进一步升高（P<0.05）。与CEP组相比,KA+PMA组大鼠脑P-gp及其编码的mdr1amRNA和PXR及其编码mRNA下调（P<0.05）,而KA+PDTC干预组脑NF-κB表达下降（P<0.05）,但脑内P-gp表达差异无统计学意义。PMA干预后,CBZ治疗的癫痫大鼠脑P-gp表达降低（KA+CBZ组V.S.KA+CBZ+PMA组,P<0.05）。3.与NS组相比,各组CEP大鼠脑组织和血清中炎性细胞因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）均升高（P<0.05）。KA+PDTC干预组和KA+CBZ+PDTC组大鼠脑组织炎性细胞因子有下调趋势,但差异无统计学意义;而KA+PMA组大鼠脑组织炎症细胞因子水平有升高趋势,但差异亦无统计学差异。结论:癫痫慢性期脑组织与外周循环系统均存在炎症反应;频繁癫痫发作与服用CBZ均能够诱导慢性癫痫鼠脑P-gp高表达;抑制PXR活性,可降低癫痫发作和CBZ所诱导的脑内P-gp高表达,而抑制癫痫慢性期炎性反应对P-gp表达未见明显影响。提示癫痫发作慢性期脑耐药蛋表达升高,可能受PXR表达调控。第三部分P-糖蛋白在癫痫大鼠脑肠肝表达的组织差异性及其与PXR的相关性研究目的:探讨不同癫痫病程（急性期、慢性期、耐药期）P-gp在肠肝脑表达的组织差异性,及其与PXR的相关性。方法:100只S-D大鼠随机分为,（1）假手术组（Sham组）,（2）急性期癫痫模型组（AEP组）,（3）慢性期癫痫模型,又分为①NS治疗组（NSEP组）、②CBZ 治疗敏感组（CBZ-Responsive Chronic Epielpsy,RCEP 组）、③CBZ耐药组（CBZ-Non-Responsive Chronic Epielpsy,NRCEP 组）。海马微量注射海人酸（KA）制作癫痫模型,模型成功后满24 h为AEP组,急性期过后2 w内至出现≥2次非诱发性发作为慢性期癫痫模型,给予CBZ治疗1 w,期间癫痫总发作频率减少≥50%为RCEP组,<50%为NRCEP组,给予NS治疗为NSEP组。Sham组模型制作及干预试剂均为NS。所有模型于制作完成断尾采血后,后予以快速扼颈而死取脑,并分离肝脏、空肠,甲醛固定,对肠、肝、脑等组织分别进行P-gp、PXR免疫组织化学染色,ELISA法测血与脑组织IL-1β、TNF-α、IL-6浓度,并比较其组织表达差异性。结果:1.癫痫模型急性期死亡3只（3/20）,慢性期发作不达标9只（9/60）,慢性期死亡32只（32/60）,其中11只见于NSEP组,9只死于RCEP组,12只死于NRCEP组;死亡原因除急性期1只造模颅骨钻孔致大量出血外,其余均为发作过度。2.和Sham组比较,急性癫痫发作24 h后（AEP组）脑组织P-gp和PXR均表达升高（P<0.05）;与AEP组相比,慢性期癫痫模型脑组织P-gp和PXR蛋白表达均升高,且NRCEP组>RCEP组>NSEP组,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.Sham组、AEP组、NSEP组大鼠肠组织P-gp和PXR蛋白表达差异无统计学意义;与AEP组相比,CBZ治疗的慢性期癫痫模型（NRCEP组与RCEP组）空肠组织P-gp、PXR蛋白表达均明显升高,其中NRCEP组>RCEP组（P<0.05）。4.与Sham组比较,AEP组大鼠肝组织P-gp和PXR表达差异无统计学意义;与AEP组相比,慢性期癫痫模型肝脏P-gp与PXR表达均明显升高,其中NRCEP 组>RCEP 组。5.与Sham组相比,癫痫组脑组织、血清中炎性细胞因子均升高,其中NRCEP组>AEP组>RCEP组>NSEP 组（P<0.05）。结论:癫痫急性发作期仅脑组织中出现P-gp、PXR升高;慢性期癫痫大鼠脑、空肠、肝脏P-gp、PXR表达均明显升高;急性癫痫发作期脑组织炎性水平增高,而耐药性癫痫大鼠脑组织和外周循环系统均处于炎症活化状态。
张梅[8]（2016）在《基于乳腺癌分子分型的TOP2A、XRCC1基因检测及临床病理特征的相关性研究》文中认为乳腺癌（Breast Cancer, BC）是女性常见恶性肿瘤之一。据报道近10年来我国乳腺癌的总体发病率上升了47%。乳腺癌已经成为我国女性发病率最高的恶性肿瘤之一。乳腺癌的治疗与许多恶性肿瘤一样,是以手术为主的综合治疗。乳腺癌尽管通过包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗在内的综合治疗,可以显着降低患者术后的复发转移率,但仍有30%左右患者出现复发转移。究其原因,乳腺癌的局部治疗。手术、放疗和全身治疗-化疗、内分泌、靶向治疗虽然根据NCCN指南有章可循,但是因肿瘤的异质性导致治疗上的不确定性。对于乳腺癌的全身化疗有效的化疗药物较多,包括蒽环类、紫杉类、铂类等,如何选择最佳化疗方案,减少不必要的化疗损伤十分重要。临床医生在制定化疗方案时虽有治疗指南,但选择空间不大。在提倡精准医疗的今天,如何依据每位乳癌患者的分子生物学特性选择合理的化疗药物,在获得最佳疗效的同时使治疗副作用降到最低是困扰临床医生的难点课题。解决这一难题的一个基础就是明确乳腺癌患者对药物的敏感性。循证医学已经表明,蒽环类药物是乳腺癌化疗的一线基础用药,而铂类是继蒽环类和（或）紫杉类药物治疗失败之后常常选择的药物,本研究基于乳腺癌最新St.Gallen共识中的分子分型,检测TOP2A（蒽环类药物耐药基因）、XRCC1（铂类药物耐药基因）表达差异及与临床病理参数进行综合分析,为乳腺癌的临床基础研究、乳腺癌患者的个体化精准治疗等方面提供参考依据。同时,对目前临床治疗难点分型-三阴型乳腺癌进行XRCC1 Arg194Trp基因多态性分析及蛋白表达研究进一步了解乳腺癌耐药的发生发展原因。本研究分两部分进行：第一部分:TOP2A在乳腺癌不同分子分型中的表达及临床意义乳腺癌是一组具有显着异质性的肿瘤,不同分子分型的乳腺癌其临床特点、治疗效果以及预后均存在一定的差异。HER2过表达型虽然可采用靶向药物治疗,但临床仅有1/3的患者对其敏感且容易出现耐药性；三阴型患者则缺乏特异性治疗,预后较差。因此,对不同分子亚型乳腺癌发病机制的研究将有助于临床制定个体化的治疗方案,提高生存率。已有研究显示,TOP2A与乳腺癌的发生、发展及耐药均有关。目前对不同分子亚型乳腺癌患者TOP2A表达与其相关性的研究报道少见。现通过对不同分子亚型乳腺癌组织中TOP2A表达及临床病理的相关性进行研究,旨在对不同分子亚型乳腺癌,特别是HER2过表达型、三阴型乳腺癌发病机制及个体化治疗提供新的思路和有意义的实验依据。目的：探讨TOP2A在不同分子亚型乳腺浸润性导管癌患者癌及癌旁组织中的表达、临床意义、mRNA和蛋白水平表达的相关性及与临床病理特征相关性研究。方法：采用RT-PCR法检测TOP2AmRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达差异,免疫组化法检测TOP2A蛋白在乳腺癌组织中表达高低；采用免疫组化法检测乳腺癌细胞ER、PR及Ki-67表达状态,应用免疫组化法和FISH法检测HER2状态。基于最新St.Gallen国际共识,把乳腺癌分为Luminal A, Luminal B, HER2过表达及三阴型四种分子亚型,根据各分型的生物学行为特点,分组讨论TOP2AmRNA和蛋白水平表达的差异以及二者之间的关系。进一步统计分析TOP2A蛋白高表达率与患者年龄、肿瘤大小、病理分级、腋窝淋巴结有无转移、ER、PR、HER-2以及Ki-67表达之间的关系。结果：118例乳腺癌配对资料中,TOP2A mRNA表达量在乳腺癌组织中比癌旁组织明显增高（p<0.05）；乳腺癌各分子分型之间TOP2AmRNA表达水平的多重比较,发现TOP2A mRNA过表达在Luminal B型和HER2过表达型中更常见；TOP2A蛋白高表达也在Luminal B型和HER2过表达型中更常见,TOP2A蛋白表达与mRNA表达结果一致；TOP2A mRNA水平与蛋白水平表达呈正相关关系,具有统计学意义（p<0.001, r=0.704）。TOP2A蛋白高表达率与年龄、PR表达状况无明显相关（p>0.05）；与肿瘤大小、腋窝淋巴结阳性、组织学分级、ER阳性、HER-2基因扩增、Ki-67表达相关（p<0.05）结论：1、本研究进一步验证了TOP2A mRNA在乳腺癌组织中明显高表达,TOP2A蛋白高表达在HER2过表达型和三阴型比预后相对较好的Luminal分型中更常见,从分子生物学层面证实TOP2A与乳腺癌发病机制相关。2、乳腺癌分子分型中,TOP2A基因mRNA及蛋白水平高表达在LuminalB型和HER2阳性型中更常见,且二者结果呈正相关,可以考虑采用简单实用的免疫组化法检测TOP2A表达来代替mRNA检测,符合St.Gallen共识建议采用免疫组化法进行乳腺癌分子分型的主张。对TOP2A在该两型乳腺癌中的深入研究将对阐明乳腺癌浸润性转移机制及寻找新的治疗靶点提供实验依据。3、TOP2A的表达与肿瘤的大小、腋窝淋巴结转移情况、组织学分级、ER阳性、HER2扩增、Ki67表达高低呈正相关,因此TOP2A基因的过表达可能促进乳腺癌的进展,进而与乳腺癌的恶性程度相关。4、TOP2A是蒽环类药物的耐药基因和检测标靶,在临床工作中通过IHC法检测TOP2A表达来作为蒽环类药物选用的依据。TOP2A不仅是蒽环类药物疗效的预测靶点,还很有可能如HER2一样,成为乳腺癌治疗的新靶点。第二部分：基于乳腺癌分子分型的XRCC1基因多态性及蛋白表达的研究乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,乳腺癌的发生发展与遗传因素十分密切,寻找与乳腺癌预后相关的分子标志物对于乳腺癌的治疗具有重要的指导意义。X射线交叉互补修复基因1 （X-ray repair cross complementing groupl, XRCC1）是一种参与DNA损伤修复的重要基因,在维持基因组稳定性过程中起关键作用。XRCC1Arg194Trp位点多态性改变可能会影响XRCC1蛋白的正常功能,导致DNA修复能力降低,从而与多种肿瘤生物学行为、肿瘤易感性或化疗敏感性相关,本研究检测XRCC1 Arg194Trp位点基因多态性、XRCC1蛋白表达,以期了解与乳腺癌分子分型、临床病理特征的关系,结合已有文献报道,XRCC1是铂类药物耐药基因,本研究有助于进一步了解XRCC1在乳腺癌铂类药物的选择中的临床价值。目的：本实验通过对118例散发性乳腺癌XRCC1基因Arg194Trp多态性检测及XRCC1蛋白表达的研究,探讨XRCC1Arg194Trp及XRCC1蛋白表达在乳腺癌各分子分型中的表达差异、与临床病理参数的相关性、基因多态与蛋白表达之间的相关性,进而探讨其在乳腺癌铂类药物选择中的潜在价值。方法：随机收集山东省千佛山医院2014年3月-2015年12月期间术前未接受任何治疗的118例乳腺癌患者临床、病理资料,复阅病理切片,按照2015年St.Gallen共识进行分子分型。采用焦磷酸测序法检测该118例乳腺癌患者外周血中XRCC1 Arg194Trp多态性改变,应用免疫组化法检测乳腺癌组织中XRCC1蛋白表达情况,探讨XRCC1 Arg194Trp多态性、XRCC1蛋白表达在乳腺癌不同分子分型中的多态性分布、表达差异及与临床病理特征之间的关系。结果：1、XRCC1 （Arg194Trp）可见基因型：CC、CT、TT。本研究结果发现118例乳腺癌患者中CC基因型占53.39%（63/118）,CT基因型占36.44%（43/118）,TT基因型占10.17%（12/118）2、XRCC1Arg194Trp多态性与XRCC1蛋白表达之间无关（P<0.05）3、XRCC1Arg194TrpCT/TT型在HER2和三阴型乳腺癌中更常见,而CC型在Luminal型乳腺癌中更常见（P<0.05）; XRCC1Arg194Trp位点多态性在LuminalA型和B型中无统计学差异（p>0.05）; XRCC1Arg194Trp位点多态性在LuminalA型和HER2过表达型或三阴型间均有统计学差异（p<0.05）4、XRCC1蛋白表达在Luminal型乳腺癌与HER2过表达型/三阴型之间无统计学差异（p<0.05）,两组间无关联；XRCC1蛋白表达在LuminalA型与B型或HER2过表达型间无统计学差异（p>0.05）,而XRCC1蛋白表达在LuminalA型与三阴型之间有统计学差异（p<0.05）。5、XRCC1 Arg194Trp多态性分布、XRCC1低表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级均无显着性相关（p>0.05）,而与腋窝淋巴结转移、激素受体状态、HER2扩增状态、Ki67表达高低均显着性相关（P<0.05）。6、XRCC1低表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤组织学分级无显着性相关（p>0.05）,而与腋窝淋巴结转移、激素受体状态、HER2扩增状态、Ki67表达高低呈显着性相关（P<0.05）。结论：1、XRCC1Arg 194Trp多态性与XRCC1蛋白表达无关,说明XRCC1蛋白的表达不仅受XRCC1Arg 194Trp位点改变的影响,还可能存在其他位点的改变影响XRCC1蛋白表达。2、XRCC1Arg 194TrpCT/TT型（杂合／纯合突变型）在HER2阳性型、三阴型中更常见,结合药敏文献报道,建议铂类药物选用。3、XRCC1低表达在乳腺癌四种分子分型的三阴型中更常见,三阴型是乳腺癌中恶性程度最高,治疗效果最差的类型,建议对于三阴型乳腺癌免疫组化检测常规检测XRCC1蛋白,指导三阴型乳腺癌铂类化疗药物的选择。4、XRCC1Arg194Trp基因多态、XRCC1蛋白低表达分别与ER、PR、HER2、Ki67状态相关,可能与乳腺癌患者预后有关。
戴俊[9]（2016）在《miR-125a-5p通过靶向调控VEGF-A影响胃癌血管新生的研究》文中提出一,研究背景在我国,胃癌（Gastric Cancer,GC）在消化系统恶性肿瘤中的发病率和死亡率均居首位。胃癌的发生及发展受到多因素的影响,预后差。因此,研究胃癌发生发展的分子机制,开辟新的胃癌早期诊断指标和潜在治疗靶点,对治疗胃癌具有极重要的意义。microRNAs是一类具有调控功能的非编码RNA。研究发现microRNAs参与多种信号调节通路,它们调控的靶基因关系着肿瘤的分化、增殖、凋亡、侵袭、迁移和血管新生等各方面。血管新生为肿瘤发展必不可少的环节,大量研究证明,miRNA参与了肿瘤血管新生的过程,在肿瘤的血管新生中扮演重要角色。miR-125a-5p为miR-125a的成熟体之一,miR-125a加工成miR-125a-5p和miR-125a-3p才能发挥其生物学功能,已经研究证实miR-125a-5p在胃癌中参与HER-2信号通路的调控,本研究旨在更加深入的探讨miR-125a-5p在胃癌中的功能及可能机制。二、研究目的我们的目的是阐明miR-125a-5p转染的胃癌AGS细胞对HUVECs增殖、迁移能力等生物学行为,研究裸鼠成瘤模型中肿瘤生长的影响及机制研究,探讨miRNA-125a-5p在人胃癌组织中的表达并分析其与临床病理参数的关联及临床意义。三、研究内容1.生物信息学分析40余种不同胃癌细胞系中miR-125a DNA拷贝数情况;qRT-PCR验证分析胃癌细胞系SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p的表达情况；qRT-PCR、Western blot和ELISA分别被用来检测miR-125a-5p mimics和inhibitors转染AGS细胞后胞内VEGF-A的mRNA、蛋白水平以及培养液中的VEGF-A浓度；Lucifease assay被用来验证VEGF-A是否为miR-125a-5p的靶基因。2.将miR-125a-5p mimics和miR-125a-5p inhibitors转染的AGS细胞与HUVECs共培养。CCK-8和平板克隆形成实验、Transwell迁移及体外小管形成实验被分别用来检测miR-125a-5p转染AGS细胞对HUVECs细胞的增殖、迁移及小管形成能力的影响;MK-2206 2HCI （Akt活性抑制剂）被用来检测miR-125a-5p对VEGF-A下游信号通路的影响。3. 构建AGS胃癌细胞裸鼠成瘤模型后,qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-125a-5p及VEGF-A的mRNA表达水平;Western blot和IHC检测肿瘤组织中VEGF-A蛋白表达水平;IHC检测移植瘤组织中的CD31表达状况（微血管）。4. qRT-PCR检测73例胃癌标本中miR-125a-5p表达水平。IHC检测组织标本中VEGF-A、HER、Ki-67、E-cadherin表达水平以及CD31的表达状况,并分析其与临床病理指标的相关性,并做回顾性分析。5. 利用生物信息学分析胃癌中与VEGF-A表达相关的miRNAs。四、研究结果1.生物信息学资料显示,各细胞系中miR-125a的DNA拷贝数差异较大。RT-PCR结果显示SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p表达均低于正常胃粘膜上皮细胞GES-1（p<0.05）。miR-125a-5p mimics转染AGS可降低VEGF-AmRNA和蛋白表达,相对于对照组具有统计学差异（p<0.05）；而miR-125a-5pinhibitors转染AGS可使VEGF-A mRNA和蛋白表达增高,相对于对照组也具有统计学差异（p<0.05）。通过预测发现VEGF-A可能是miR-125a-5p的靶基因,而Lucifease assay验证了miR-125a-5p可以结合VEGF-A的3’UTR并抑制其表达。2.将miR-125a-5p mimics和inhibitors转染的AGS与HUVECs共培养。功能学分析显示,miR-125a-5p mimics可减少AGS细胞VEGF-A分泌,降低HUVECs增殖、迁移以及小管形成能力：而miR-125a-5p inhibitors增加AGS细胞VEGF-A分泌,增强HUVECs增殖、迁移以及小管形成能力,且Akt抑制剂可以逆转高浓度VEGF-A带来的这种增强效应（p<0.05）。3.我们成功使用AGS细胞构建胃癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,待瘤体长至50mm3时,在对照组和实验组瘤中和瘤周分别注射Control agomir和miR-125a-5p agomir 4周,结果显示,对照组平均移植瘤重及体积均比实验组大,两者存在显着差异（P值均<0.05）。RT-PCR结果显示对照组肿瘤组织中miR-125a-5p表达量比实验组肿瘤中表达量低（p<0.05）,同时Western blot显示VEGF-A表达量高（p<0.05）,微血管密度分析显示MVD与VEGF-A表达成正相关（r=0.5495）,与miR-125a-5p表达成负相关（r=-0.7419）。4.73例胃腺癌组织标本分析显示,肿瘤组织较癌旁正常组织而言miR-125a-5p表达降低,其表达量与肿瘤淋巴结转移（P=0.019）、临床分期（P=0.001）、MVD （P=0.002）、HER-2表达（P=0.007）、VEGF-A表达（P=0.001）相关。对VEGF-A的表达进行量化分析发现,VEGF-A表达与miR-125a-5p表达呈负相关（r=-0.5382）、与MVD呈正相关（r=0.7226）：与此同时miR-125a-5p表达与MVD呈负相关（r=-0.4554）。最后生存分析显示,低表达miR-125a-5p、高表达VEGF-A、高MVD均不利于预后,对miR-125a-5p进行meta-analysis后发现其为独立预后因素。5. 生物信息学分析筛选,let-7c、miR-100、miR-143与VEGF-A表达成负相关（r均<0.4,p值均<0.05）。而let-7g、miR-16-1、miR-15b、miR-126、miR-30b、 miR-191、miR-455、miR-200c、miR-500a与VEGF-A表达成正相关（r均>0.4,p值均<0.05）。五、研究结论1. miR-125a-5p通过靶向调节胃癌细胞VEGF-A的分泌影响肿瘤血管新生。2. miR-125a-5p agomir通过负向调节VEGF-A的分泌抑制肿瘤生长,是胃癌的潜在治疗靶点。3. miR-125a-5p在人胃癌中表达降低,且与VEGF-A表达负相关,影响血管新生,不利于患者预后。4. 对胃癌中与VEGF-A表达相关的miRNA做出了初步筛选,为后期研究奠定基础。
林鸾[10]（2016）在《穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响》文中提出目的：观察穴位埋线对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响,从miRNA调控生殖内分泌和胰岛素信号通路探讨穴位埋线治疗PCOS的作用机理。本研究包括文献研究和实验研究两部分,首先从文献研究角度论述了多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展,再从实验研究角度对穴位埋线干预PCOS-IR模型大鼠的疗效及作用机制进行了较为深入的研究。方法：1文献研究全面检索近年来与PCOS-IR有关的国内外文献报道,并进行较为系统的总结和综述,进而掌握了有关PCOS-IR研究及穴位埋线研究的前沿动态。主要包括以下3个方面：（1）多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展；（2）多囊卵巢综合征胰岛素抵抗动物模型的研究进展：（3）针灸改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展。2实验研究（1）来曲唑配合高脂膳食诱导多囊卵巢综合征胰岛素抵抗（PCOS-IR）大鼠模型：将24只3w龄雌性SD大鼠随机分为4组：PCOS-IR组（6只）,PCOS组（6只）,高脂组（6只）和对照组（6只）,PCOS-IR组予高脂饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃来曲唑CMC-Na溶液,连续9w；PCOS组常规饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃来曲唑CMC-Na溶液,连续9w；高脂组予高脂饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,连续9w；对照组常规饲料喂养12w,第6w龄时开始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,连续9w。观察大鼠体重、动情周期、卵巢组织学变化,测定血清性激素、血脂水平、糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FINS）浓度,并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。（2） PCOS-IR模型大鼠卵巢组织miRNA差异表达谱分析研究：随机从PCOS-IR模型组及正常对照组中各选取3只大鼠,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉下取一侧卵巢,液氮冷冻保存,由北京博奥晶典生物技术有限公司提供芯片筛选差异microRNAs实验服务；根据基因芯片筛选结果并进一步采用目前常用的比较公认的9款miRNA靶基因预测软件:DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22以及TargetScan进行靶基因预测,选择同时被上述数据库中3个或3个以上数据库预测为阳性的靶基因,结合靶基因预测结果,选择与PCOS生殖内分泌紊乱及胰岛素抵抗相关的miR-598和miR-125b进行real-time PCR验证。（3）穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠miR-125b调控生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响：PCOS-IR模型大鼠随机分为穴位埋线组（n=8）、假穴位埋线组（假埋线组,n=6）、模型对照组（n=6）、和二甲双胍组（n=8）,另设空白对照组（n=6）。穴位埋线组于105日龄起行穴位埋线治疗（穴位处方一：关元、三阴交（双）;穴位处方二：肾俞9双）、脾俞9双)、肝俞9双)),穴位埋线每5天1次,两组穴位交替,共治疗20天),假穴位埋线组大鼠给予埋线组相同的抓取、乙醚麻醉、固定、穴位剪毛、消毒,选穴及埋线操作同穴位埋线组,但埋线针管中不放置羊肠线,即穴位内不植入羊肠线；模型组：大鼠给予埋线组相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治疗；空白对照组：大鼠给予埋线组相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治疗；二甲双胍组：二甲双胍片捣碎溶解于双蒸水中,灌胃前摇匀,大鼠每天灌胃给药（剂量200mg/kg. d）,连续治疗20天。各组大鼠治疗后观察体重、体长、Lee’s指数、卵巢组织学变化,放射免疫分析方法检测血清性激素水平、血脂水平、糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖（FPG）和空腹胰岛素（FINS）浓度并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）, real-time PCR检测卵巢组织miR-125b, FSHR、LHR、P450c17a、INSR、ERK1、ERK2mRNA表达,western blot检测大鼠卵巢组织INSR、ERK1、ERK2蛋白表达水平及磷酸化水平。结果：（1）PCOS-IR组与PCOS组大鼠阴道涂片HE染色镜检结果显示均处于动情间期时相,仅见大量白细胞,偶见少量角化细胞,提示无排卵；高脂组、对照组仍保持规律的动情周期;PCOS-IR组和PCOS组卵巢呈多囊样改变,卵巢闭锁卵泡增多,闭锁卵泡的直径较大,颗粒细胞层数有所减少,白膜增厚,无成熟卵泡,未见黄体分布；高脂组及对照组卵巢分布有各级卵泡,可见较多黄体分布；与对照组相比,PCOS-IR组大鼠的血清睾酮（T）水平显着升高（P<0.01）、黄体生成素（LH）水平明显升高（P<0.05）、卵泡刺激素（FSH）水平明显下降（P<0.05）、泌乳素（PRL）水平显着升高（P<0.01）,雌二醇（E2）水平明显下降（P<0.05）、孕酮（P）水平显着下降（P<0.001）,体重显着增加（P<0.001）,血清总胆固醇（TC）水平明显升高（P<0.05）、低密度脂蛋白（LDL）显着升高（P<0.01）,糖耐量曲线下面积（AUC）显着增加（P<0.05）,胰岛素耐量AUC显着增加（P<0.01）,血清空腹胰岛素（FINS）水平显着升高（P<0.05）,胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）显着升高（P<0.05）。（2） PCOS-IR模型组和对照组卵巢组织中Fold Change值>1.5,P<0.05的差异表达miRNA 共 20个,14个miRNA在PCOS-IR模型组中上调、6个miRNA下调。其中上调最显着的是rno-miR-3585-5p、rno-miR-509-5p、rno-miR-218a-5p、 rno-miR-598-3p（以下简称miR-598）等,分别上调702.0倍、342.8倍、273.2倍及232.1倍,而下调差异最显着的分别rno-miR-31a-5p、rno-miR-185-5p、 rno-miR-126a-3p、rno-mir-125b-5p（以下简称miR-125b）等,分别下调1090.2倍、3.0倍、2.3倍及1.6倍。靶基因预测显示上调miRNA预测到7869个靶基因,下调miRNA预测到4779个靶基因,其中与PCOS生殖内分泌调节及胰岛素抵抗相关的miR-598和miR-125b通过real-time PCR技术进一步验证结果显示：PCOS-IR模型组miR-125b表达量相对对照组的表达量与芯片结果相当,表明芯片结果是可靠的,miR-125b参与PCOS-IR的发生；而miR-598定量PCR结果与芯片结果趋势相反。（3）穴位埋线组、二甲双胍组大鼠治疗后卵巢形态学镜检可见不同发育阶段的卵泡及多个黄体,大鼠恢复排卵、卵泡发育正常,假穴位埋线组与模型组大鼠卵巢囊状卵泡和闭锁卵泡增多,卵巢呈多囊样改变,颗粒细胞层数减少,白膜增厚,无成熟卵泡,无黄体和白体分布；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组大鼠治疗后血清LH水平明显降低（P<0.05）、T水平显着降低（P<0.01）、PRL水平显着降低（P<0.01）、FSH水平显着升高（P<0.01）、E2水平显着升高（P<0.01）、P水平明显升高（P<0.05）；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组大鼠治疗后卵巢miR-125b表达量显着提高（P<0.001）、FSHRmRNA表达量显着降低（P<0.001）、LHRmRNA表达量显着降低（P<0.001）、P450c17 α mRNA表达量显着降低（P<0.01）；miR-125b的表达量与FSHR、LHR、P450c17αmRNA表达量成负相关,相关系数分别为-0.814、-0.826、-0.823（P值均<0.001）。（4）与假穴位埋线组、模型对照组相比,穴位埋线组及二甲双胍组治疗后大鼠体重增加速度明显减缓（P<0.01）,Lee’s指数明显降低（P<0.001）；血清FINS及HOMA-IR显着降低（P<0.01）、糖耐量曲线下面积明显降低（P<0.05）;血清总胆固醇水平显着降低（P<0.01）,血清低密度脂蛋白显着降低（P<0.01）,穴位埋线组与二甲双胍治疗组差异无统计学意义；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组治疗后,大鼠卵巢组织miR-125b表达量显着提高（P<0.001）、ERK1mRNA表达量明显降低（P<0.01）、ERK2mRNA表达量显着下调（P<0.001）。miR-125b的表达量与ERK1、ERK2mRNA表达量成负相关,相关系数分别为-0.850、-0.689（P值均<0.001）,miR-125b的表达量与INSRmRNA表达量无显着相关；与假穴位埋线组相比,穴位埋线组治疗后,大鼠卵巢组织INSR蛋白表达无显着改变,但INSR磷酸化比例明显升高（P<0.01）,ERKl、ERK2蛋白表达下调（P<0.001）,磷酸化比例明显降低（P<0.001）。结论：（1）来曲唑灌胃配合高脂膳食喂养雌性SD大鼠可成功诱导PCOS-IR动物模型,该模型避免了其他造模方法皮下注射或皮下埋植给药方式对针灸疗法效应的干扰,可以作为一种适宜针灸疗法研究的PCOS-IR动物模型。（2）PCOS-IR模型大鼠卵巢组织miR-125b下调表达,靶向调控FSHR、ERK、INSR和AKT等生殖内分泌、胰岛素信号通路相关基因异常表达,为进一步探讨穴位埋线改善PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌及胰岛素抵抗的表观遗传作用机制研究提供了依据。（3）穴位埋线能够明显改善PCOS-IR大鼠生殖内分泌紊乱,促进卵泡正常发育和排卵;其机理在于穴位埋线下调PCOS-IR模型大鼠卵巢LHR和P450c17 α mRNA的表达,降低雄激素水平,解除高雄激素血症对miR-125b表达的抑制,使miR-125b表达上调,miR-125b进一步通过负调控途径降低其靶基因FSHRmRNA表达,在转录后水平改善卵巢对FSH的高反应,促进卵泡正常发育。（4）穴位埋线能明显改善PCOS-IR模型大鼠胰岛素抵抗,提高卵巢miR-125b的表达,miR-125b通过负向调控降低其靶基因ERK1、ERK2高表达,下调MAPK/ERK通路的异常活化,恢复颗粒细胞增殖与凋亡的平衡,降低卵泡膜细胞过多合成雄激素,可能是穴位埋线改善PCOS胰岛素抵抗进而改善生殖内分泌的表观遗传转录后作用机制。
二、NestedRT-PCR技术检测CE AmRNA的方法及敏感性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NestedRT-PCR技术检测CE AmRNA的方法及敏感性（论文提纲范文）
（1）miR-4505通过Wnt/β-catenin信号通路调控人肾小球系膜细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 维生素D在糖尿病肾病中的肾脏保护作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）基于miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路探讨清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一: microRNA在2型糖尿病胰岛素抵抗中的研究进展 |
| 1 microRNA概述 |
| 2 microRNA与胰岛素信号转导系统 |
| 3 microRNA与糖脂代谢紊乱 |
| 4 microRNA与炎症反应 |
| 5 小结与展望 |
| 综述二: 中医学对2型糖尿病胰岛素抵抗的认识及治疗概况 |
| 1 中医学对2型糖尿病胰岛素抵抗的理论认识 |
| 2 中医药治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的研究概况 |
| 3 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的体内实验研究 |
| 实验一 清润方对T2DM大鼠胰岛素抵抗作用的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 清润方改善T2DM大鼠肝脏胰岛素抵抗作用的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的体外实验研究 |
| 实验三 清润方对IR-HepG2细胞胰岛素抵抗作用的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 清润方改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗作用的机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点与不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（3）TNFAIP3和Occludin在紫外线致慢性光化性皮炎发病中的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 TNFAIP3参与UVB介导的CAD炎症反应的机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Occludin致CAD皮肤屏障受损和炎症反应的研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 紫外线辐射对皮肤屏障功能的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 SAS1B基因 |
| 1.3 Aurora基因 |
| 1.4 Bard1基因 |
| 1.5 肿瘤-一个发育生物学问题 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 SAS1B基因原核表达载体构建和重组蛋白制备 |
| 2.1 主要试剂及来源 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 2.4 SAS1B原核表达载体的设计 |
| 2.5 重组原核表达质粒pET-22b-SAS1B-His的构建 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 阳性克隆的筛选 |
| 2.8 SAS1B表达质粒的制备与鉴定 |
| 2.8.1 pET-22b蛋白表达菌和质粒的制备 |
| 2.8.2 阳性克隆提取质粒进行电泳和测序 |
| 2.9 SAS1B重组蛋白的制备 |
| 2.10 考马斯亮蓝染色和Western blot鉴定纯化蛋白 |
| 2.11 蛋白浓度测定 |
| 2.12 实验结果 |
| 2.12.1 PET-22b-SAS1B质粒电泳结果 |
| 2.12.2 测序结果分析 |
| 2.12.3 蛋白的纯化(亲和层析) |
| 2.12.4 SAS1B重组蛋白的鉴定 |
| 2.13 讨论 |
| 2.14 小结 |
| 3 兔抗人SAS1B多克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 抗原准备 |
| 3.3 制备抗体流程 |
| 3.3.1 采集阴性对照血清 |
| 3.3.2 免疫兔子 |
| 3.3.3 间接ELISA抗体效价检测 |
| 3.4 Western blot检测抗体的反应性 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 抗体效价 |
| 3.5.2 抗体与SAS1B重组蛋白反应性 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 4 新制备SAS1B抗体检测癌症患者血清SAS1B表达 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.2 实验步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 肿瘤患者SAS1B间接ELISA检测结果 |
| 4.3.2 SAS1B抗体的敏感度分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 新制备抗体检测癌组织SAS1B蛋白表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 主要设备和主要试剂 |
| 5.3 主要溶液配制 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 组织切片制作 |
| 5.4.2 苏木精-伊红染色 |
| 5.4.3 免疫组织化学染色 |
| 5.4.4 Western blot检测 |
| 5.5 统计学分析 |
| 5.6 实验结果 |
| 5.6.1 HE染色结果 |
| 5.6.2 免疫组化结果 |
| 5.6.3 胃癌免疫组化结果 |
| 5.6.4 胃癌和甲状腺癌组织Western Blot结果 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 小结 |
| 6 SAS1B mRNA在人胃癌和甲状腺癌组织中表达研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 主要试剂 |
| 6.3 实验仪器和设备 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.4.1 组织总RNA提取 |
| 6.4.2 逆转录 |
| 6.4.3 普通PCR检测SAS1B基因表达 |
| 6.4.4 q-PCR检测SAS1B基因表达 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 SAS1B普通PCR扩增结果 |
| 6.5.2 SAS1B实时荧光定量PCR结果 |
| 6.5.3 Bard1和Aurora-A实时荧光定量PCR结果 |
| 6.6 讨论 |
| 6.7 小结 |
| 7 基因敲除和过表达SAS1B对胃癌细胞的影响 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 主要试剂及来源 |
| 7.3 主要仪器 |
| 7.4 实验方法 |
| 7.4.1 人SAS1B基因敲除质粒的构建 |
| 7.4.2 SAS1B基因过表达质粒制备 |
| 7.4.3 细胞培养 |
| 7.4.4 细胞转染 |
| 7.4.5 敲除和过表达SAS1B细胞的筛选 |
| 7.4.6 细胞总RNA的制备 |
| 7.4.7 RNA浓度的测定 |
| 7.4.8 逆转录 |
| 7.4.9 实时荧光定量PCR |
| 7.4.10 免疫荧光染色 |
| 7.4.11 CCK-8法检测细胞增殖活性 |
| 7.4.12 流式细胞检测对细胞周期的影响 |
| 7.5 溶液配制 |
| 7.6 统计分析 |
| 7.7 结果 |
| 7.7.1 人SAS1B基因敲除质粒转化子PCR验证 |
| 7.7.2 人SAS1B转化子的测序结果 |
| 7.7.3 SAS1B敲除和过表达质粒的电泳结果 |
| 7.7.4 SAS1B敲除和过表达质粒测序比对结果 |
| 7.7.5 细胞培养及转染实验后荧光观察 |
| 7.7.6 Bard1、Aurora-A、SAS1B mRNA表达结果 |
| 7.7.7 Bard1、Aurora-A免疫荧光染色结果 |
| 7.7.8 细胞生长活性检测 |
| 7.7.9 细胞周期检测结果 |
| 7.8 讨论 |
| 7.9 小结 |
| 8 C57 BL/6小鼠胚胎SAS1B基因的表达 |
| 8.1 实验材料 |
| 8.1.1 实验动物 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.2 实验方法 |
| 8.2.1 动物饲养及样本制备 |
| 8.2.2 样本总RNA制备 |
| 8.2.3 核酸琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 8.2.4 反转录 |
| 8.2.5 q-PCR检测 |
| 8.2.6 Western blot检测 |
| 8.3 实验结果 |
| 8.3.1 胚胎总RNA检测结果 |
| 8.3.2 胚胎SAS1B及相关基因表达结果 |
| 8.3.3 胚胎组织中SAS1B、Bard1、AuroraA蛋白表达 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 成年C57 BL/6小鼠不同组织SAS1B基因的表达研究 |
| 9.1 实验材料 |
| 9.2 主要仪器和设备 |
| 9.3 主要试剂 |
| 9.4 实验方法 |
| 9.4.1 组织总RNA制备(Trizol法) |
| 9.4.2 RNA浓度测定 |
| 9.4.3 逆转录 |
| 9.4.4 PCR检测 |
| 9.4.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 9.5 实验结果 |
| 9.5.1 不同组织的SAS1B基因表达结果 |
| 9.5.2 SAS1B基因表达产物测序结果 |
| 9.5.3 不同组织中SAS1B荧光定量PCR结果 |
| 9.5.4 不同组织中SAS1B蛋白的表达 |
| 9.6 讨论 |
| 9.7 小结 |
| 10 结论 |
| 11 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 骨骼肌健康与抗阻训练 |
| 第一节 骨骼肌概述 |
| 1 骨骼肌结构与功能 |
| 1.1 骨骼肌的结构 |
| 1.2 骨骼肌的肌管系统 |
| 1.3 肌原纤维的肌丝组成 |
| 1.4 兴奋-收缩偶联 |
| 1.5 骨骼肌特性及收缩功能 |
| 2 骨骼肌发育生物学 |
| 3 肌纤维类型 |
| 4 骨骼肌萎缩/衰减及临床表现 |
| 第二节 骨骼肌的运动适应 |
| 1 骨骼肌与代谢 |
| 2 骨骼肌的内分泌功能 |
| 3 骨骼肌与炎症 |
| 第三节 抗阻训练及实验条件抗阻训练模型比较分析 |
| 1 抗阻训练 |
| 2 实验动物抗阻训练模型 |
| 第二章 抗阻训练健康促进机制 |
| 第一节 抗阻训练与骨骼肌蛋白质质量控制 |
| 1 mTORC为中心的骨骼肌蛋白质合成信号通路 |
| 2 骨骼肌蛋白质降解相关信号通路 |
| 2.1 泛素-蛋白酶体降解系统 |
| 2.2 细胞自噬 |
| 3 骨骼肌蛋白质质量的调节 |
| 3.1 激素调节 |
| 3.2 线粒体功能与蛋白质合成 |
| 3.3 外泌体及miRNA对蛋白质合成的调控 |
| 4 小结 |
| 第二节 抗阻训练与肌卫星细胞 |
| 1 骨骼肌卫星细胞概述 |
| 2 抗阻训练与肌卫星细胞 |
| 第三章 抗阻训练与疾病防御 |
| 1 败血症 |
| 2. Sarcopenia |
| 3 癌症恶病质 |
| 4 废用性萎缩 |
| 第二篇 研究报告 |
| 第一章 小鼠自主举重训练模型与运动方案 |
| 1 实验对象及方法 |
| 1.1 小鼠自主举重笼盒设计 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 运动方案测试 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 举重笼盒的负荷校准 |
| 2.2 预实验 |
| 2.3 小鼠举重训练方案制定及模型演变 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 小鼠抗阻训练举重模型的设计及优、劣势 |
| 3.2 举重训练运动方案的比较与讨论 |
| 3.3 举重训练模型的应用前景 |
| 4 小结 |
| 第二章 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量控制的影响 |
| 第一节 不同时长举重训练对小鼠体重、骨骼肌质量及收缩功能的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物分组及运动方案 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同时长举重训练情况及小鼠体重变化 |
| 2.2 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌质量的影响 |
| 2.3 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌收缩功能的影响 |
| 2.4 长时举重训练对小鼠跑台耐力试验及超声心动参数的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 急性举重运动对小鼠骨骼肌转录组基因表达的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对小鼠腓肠肌转录组影响 |
| 2.2 急性举重运动对小鼠不同骨骼肌肌群及内脏相关基因mRNA表达的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第三节 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌蛋白质合成与降解的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对小鼠骨骼肌蛋白合成及降解相关信号蛋白表达的影响 |
| 2.2 短时举重训练对小鼠骨骼肌蛋白合成与降解的影响 |
| 2.3 长时举重训练对小鼠骨骼肌蛋白合成与降解相关信号蛋白表达的影响 |
| 2.4 长时举重训练对小鼠糖代谢的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 抗阻训练对蛋白质合成与降解的影响 |
| 3.2 抗阻训练对糖代谢的影响 |
| 4 小结 |
| 第四节 不同时长举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达及细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 运动方案与取材 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 急性举重运动对骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.2 短时举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.3 长时举重训练对小鼠骨骼肌Notch1蛋白表达的影响 |
| 2.4 短时举重训练对小鼠骨骼肌细胞增殖的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 长时举重训练对肌卫星细胞缺失(Pax7~(CreER)-ROSA~(DTA176))小鼠的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验动物的繁殖 |
| 1.2 基因型鉴定 |
| 1.3 实验动物及分组 |
| 1.4 主要实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 PAX7~(CreER)小鼠基因型鉴定 |
| 2.2 ROSA26-DTA176小鼠基因型鉴定 |
| 2.3 Pax7~(CreER)-ROSA~(DTA76) (mSCD)转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 mSCD小鼠举重情况 |
| 2.5 mSCD小鼠葡萄糖耐量试验 |
| 2.6 mSCD小鼠体重、骨骼肌及内脏组织湿重 |
| 2.7 mSCD小鼠骨骼肌收缩功能 |
| 2.8 预实验结果 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 肌卫星细胞缺失小鼠模型 |
| 3.2 长时举重训练对肌卫星细胞缺失小鼠骨骼肌质量及收缩功能的影响 |
| 3.3 长时举重训练对肌卫星细胞缺失小鼠糖代谢功能的影响 |
| 4 小结 |
| 第四章 短时举重运动对DEX诱导肌萎缩的干预研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 动物实验 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 短时举重训练及DEX对小鼠体重的影响 |
| 2.2 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌及内脏组织湿重的影响 |
| 2.3 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌收缩功能的影响 |
| 2.4 短时举重训练及DEX对小鼠骨骼肌蛋白合成的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 3.1 DEX诱导肌萎缩模型 |
| 3.2 DEX诱导肌萎缩模型的机制 |
| 3.3 抗阻训练对DEX诱导肌萎缩模型的干预机制 |
| 4 小结 |
| 第三篇 研究总结 |
| 1 主要结果与结论 |
| 2 主要创新之处 |
| 3 主要缺陷与不足 |
| 4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 RNAseq结果 |
| 附录2 缩略词 |
| 附录3 Aurora肌力评价系统 |
| 附录4 葡萄糖耐受实验及跑台耐力实验 |
| 附录5 H&E染色 |
| 附录6 总RNA提取及完整性鉴定 |
| 附录7 反转录及RT-PCR |
| 附录8 蛋白质凝胶电泳及免疫印迹 |
| 附录9 EdU染色 |
| 附录10 基因组DNA抽提 |
| 后记 |
| 作者简历及在学期间所取的科研成果 |
（6）cGMP-PDE3-cAMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用及CNP的干预效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 cGMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料 |
| 2.1 动物分组及模型制备 |
| 2.1.1 动物分组 |
| 2.1.2 模型制备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 实验步骤 |
| 3.2 肺组织含水量测定 |
| 3.3 肺组织病理学检查:Hematoxylin-Eosin(HE)染色 |
| 3.4 肺组织T-SOD,MDA,CAT测定 |
| 3.5 ELISA检测 |
| 3.5.1 测定BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6细胞因子浓度 |
| 3.5.2 测定肺组织中cGMP浓度 |
| 3.5.3 测定肺组织中cAMP浓度 |
| 3.6 Western Blot方法 |
| 3.6.1 蛋白提取 |
| 3.6.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 3.6.3 SDS-PAGE凝胶配制 |
| 3.6.4 上样 |
| 3.6.5 电泳 |
| 3.6.6 转膜 |
| 3.6.7 封闭 |
| 3.6.8 一抗 |
| 3.6.9 二抗 |
| 3.6.10 显影 |
| 3.7 RT-PCR检测mRNA的表达 |
| 3.7.1 引物序列 |
| 3.7.2 PDE2A,PDE3A,PDE3B mRNA检测 |
| 3.8 统计学分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 高氧对不同时间新生大鼠体重变化的影响 |
| 4.2 新生大鼠吸入高氧时间的延长肺组织含水量的变化 |
| 4.3 肺组织HE染色结果 |
| 4.4 高氧对肺组织SOD,MDA,CAT的影响 |
| 4.4.1 高氧对肺组织SOD的影响 |
| 4.4.2 高氧对肺组织MDA的影响 |
| 4.4.3 高氧对肺组织CAT的影响 |
| 4.5 高氧BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量变化 |
| 4.5.1 高氧BALF中TNF-α含量变化 |
| 4.5.2 高氧BALF中IL-1β含量变化 |
| 4.5.3 高氧BALF中IL-6含量变化 |
| 4.6 高氧肺组织中cAMP、cGMP含量变化 |
| 4.6.1 高氧肺组织中cAMP含量变化 |
| 4.6.2 高氧肺组织中cGMP含量变化 |
| 4.7 高氧对肺组织各种蛋白表达的影响 |
| 4.8 高氧对肺组织PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达的影响 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 第二部分 CNP保护高氧诱导新生大鼠肺损伤机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料 |
| 2.1 动物分组及模型制备 |
| 2.1.1 动物分组 |
| 2.1.2 模型制备 |
| 2.1.3 给药方式 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 实验步骤 |
| 3.2 肺组织含水量测定 |
| 3.3 肺组织病理学检查:Hematoxylin-Eosin(HE)染色 |
| 3.4 肺组织T-SOD,MDA, CAT测定 |
| 3.5 ELISA检测 |
| 3.5.1 测定BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6细胞因子浓度 |
| 3.5.2 测定肺组织中cGMP浓度 |
| 3.5.3 测定肺组织中cAMP浓度 |
| 3.6 Western Blot方法 |
| 3.6.1 蛋白提取 |
| 3.6.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 3.6.3 SDS-PAGE凝胶配制 |
| 3.6.4 上样 |
| 3.6.5 电泳 |
| 3.6.6 转膜 |
| 3.6.7 封闭 |
| 3.6.8 一抗 |
| 3.6.9 二抗 |
| 3.6.10 显影 |
| 3.7 RT-PCR检测 mRNA的表达 |
| 3.7.1 引物序列 |
| 3.7.2 PDE2A,PDE3A,PDE3B mRNA检测 |
| 3.8 不同PDE抑制剂对cAMP、cGMP的表达 |
| 3.9 统计学分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 CNP对不同时间新生大鼠体重变化的影响 |
| 4.2 CNP对肺组织含水量的作用 |
| 4.3 肺组织HE染色结果 |
| 4.4 CNP对肺组织SOD,MDA,CAT的影响 |
| 4.4.1 CNP对肺组织SOD的影响 |
| 4.4.2 CNP对肺组织MDA的影响 |
| 4.4.3 CNP对肺组织CAT的影响 |
| 4.5 CNP对BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6影响 |
| 4.5.1 CNP对BALF中TNF-α影响 |
| 4.5.2 CNP对BALF中IL-1β影响 |
| 4.5.3 CNP对BALF中IL-6的影响 |
| 4.6 CNP对肺组织中cAMP、cGMP的影响 |
| 4.6.1 CNP对肺组织中cAMP的影响 |
| 4.6.2 CNP对肺组织中cGMP含量变化 |
| 4.7 CNP对肺组织各种蛋白表达的影响 |
| 4.8 高氧对肺组织PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达的影响 |
| 4.9 不同PDE抑制剂对cAMP、cGMP的影响 |
| 4.9.1 IBMX对CNP干预高氧肺组织cAMP、cGMP的影响 |
| 4.9.2 EHNA对CNP干预高氧肺组织cAMP、cGMP的影响 |
| 4.9.3 Milrinone对CNP干预高氧肺组织cAMP、cGMP的影响 |
| 4.9.4 IBMX,EHNA,Milrinone cGMP-PDE抑制率的比较 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 cAMP,cGMP双重特异性磷酸二酯酶2,3的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录：攻读博士学位期间公开发表的期刊论文 |
（7）孕烷X受体/核因子κB信号通路对癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PXR/NF-κB信号通路对急性癫痫发作大鼠脑P-糖蛋白的调节作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 PXR/NF-κB信号通路对慢性癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 P-糖蛋白在癫痫大鼠脑肠肝表达的组织差异性及其与PXR的相关性研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 1. 期刊论文 |
| 2. 会议论文 |
| 3. 获得科研基金项目 |
| 致谢 |
（8）基于乳腺癌分子分型的TOP2A、XRCC1基因检测及临床病理特征的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 TOP2A在乳腺癌不同分子分型中的表达及临床意义 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 第3章 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 附录Ⅰ 附图 |
| 附录Ⅱ 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于乳腺癌分子分型的XRCC1基因多态性及蛋白表达的研究 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 第3章 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 附录Ⅰ 附图 |
| 附录Ⅱ 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（9）miR-125a-5p通过靶向调控VEGF-A影响胃癌血管新生的研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展 |
| 1.1.1 多囊卵巢综合征概述 |
| 1.1.2 多囊卵巢综合征与胰岛素抵抗的关系 |
| 1.1.3 PCOS胰岛素抵抗的主要信号转导途径 |
| 1.1.4 miRNA、PCOS与胰岛素抵抗 |
| 1.1.5 PCOS胰岛素抵抗评价方法 |
| 1.1.6 多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的治疗 |
| 1.2 多囊卵巢综合征胰岛素抵抗动物模型的研究进展 |
| 1.2.1 PCOS常用动物模型的胰岛素抵抗特征 |
| 1.2.2 高脂膳食诱导胰岛素抵抗的研究进展 |
| 1.2.3 激素联合高脂喂养诱导PCOS-IR模型 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 针灸改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的研究进展 |
| 1.3.1 中医对多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的病因病机认识 |
| 1.3.2 针灸治疗多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的选穴规律研究 |
| 1.3.3 针灸改善多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的机理研究 |
| 1.3.4 小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 来曲唑配合高脂膳食诱导多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型的实验研究 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.2 PCOS-IR模型大鼠卵巢组织miRNA差异表达谱分析研究 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠miR-125b调控生殖内分泌的影响研究 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 实验结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.4 穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠miR-125b调控胰岛素抵抗的影响研究 |
| 2.4.1 材料与方法 |
| 2.4.2 实验结果 |
| 2.4.3 讨论 |
| 结语 |
| 1.1 结论 |
| 1.2 创新点 |
| 1.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
四、NestedRT-PCR技术检测CE AmRNA的方法及敏感性（论文参考文献）
- [1]miR-4505通过Wnt/β-catenin信号通路调控人肾小球系膜细胞增殖的研究[D]. 李格菲. 昆明医科大学, 2021
- [2]基于miR-34a调控SIRT1/NF-κB信号通路探讨清润方改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的作用机制[D]. 王泽. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]TNFAIP3和Occludin在紫外线致慢性光化性皮炎发病中的机制研究[D]. 陈燕. 昆明医科大学, 2020(02)
- [4]新癌—卵基因SAS1B在人胃癌和甲状腺癌中表达及生物学意义研究[D]. 杨宏新. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [5]抗阻训练控制骨骼肌质量分子机制研究[D]. 崔迪. 华东师范大学, 2017(04)
- [6]cGMP-PDE3-cAMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用及CNP的干预效应[D]. 李慧文. 延边大学, 2017(05)
- [7]孕烷X受体/核因子κB信号通路对癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响[D]. 余年. 南京医科大学, 2017(05)
- [8]基于乳腺癌分子分型的TOP2A、XRCC1基因检测及临床病理特征的相关性研究[D]. 张梅. 山东大学, 2016(03)
- [9]miR-125a-5p通过靶向调控VEGF-A影响胃癌血管新生的研究[D]. 戴俊. 华中科技大学, 2016(08)
- [10]穴位埋线对PCOS-IR模型大鼠生殖内分泌和胰岛素抵抗的影响[D]. 林鸾. 广州中医药大学, 2016(02)