一、人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达(论文文献综述)
谢海松,郑倩倩,斯成赐[1](2019)在《利用毕赤酵母发酵胰岛素类似物的研究进展》文中指出胰岛素类似物已广泛用于治疗糖尿病,毕赤酵母表达系统是生产胰岛素类似物的常用表达系统。本文从基因表达载体构建、发酵培养基、溶氧、温度、pH、甲醇的流加等角度对毕赤酵母高密度发酵胰岛素类似物的研究进展做了较详细的综述,旨在为实际生产提供工艺设计思路。
徐栋生[2](2017)在《人血清白蛋白—肝细胞生长因子融合蛋白突变体的表达及其活性分析》文中研究说明肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种主要由肝脏非实质细胞分泌的多功能细胞因子,可以刺激多种组织器官修复。肝细胞生长因子在多种疾病的研究中均具有一定的治疗潜力,包括:肝纤维化(liver fibrosis)、急性肾衰竭(acute renal failure)、慢性皮肤溃烂(chronic leg wounds)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)等,并且国外已初步进行了HGF治疗肾炎的临床安全性评估。已有报道认为,HGF具有促进肝脏再生恢复以及抗肝纤维化的作用,提示其可能是具有相关治疗的潜力药物分子。本研究以设计和评价HGF成药性为目的,对HGF进行分子改造,保证其生物活性,提高稳定性,为肝纤维化治疗提供有潜力的药物候选分子。主要结果如下:(1)HGF药物候选分子的设计与改造人HGF在体内以无活性的单链前体方式合成与分泌,需要胞外酶对HGF第494位的酶切位点水解切割,再以二硫键装配,从而形成有活性的异二聚体。基因工程技术表达的HGF同样是无活性的单链分子,需要体外切割再加工才能形成活性分子。针对成熟HGF分子的结构特点,将HGF 494位的酶水解位点定点突变,开发不需要活化过程的突变体分子HGF(R494E),该分子可以促进MDCK细胞离散生长以及刺激肝细胞表面HGF受体酪氨酸残基磷酸化,表明单链HGF突变体保持生物学活性。HGF单体在体内稳定性差、半衰期短,通过本实验室成熟的白蛋白融合技术将白蛋白HSA与HGF(R494E)拼接,设计融合蛋白HSA-HGF(R494E),融合蛋白仍然可以促进MDCK细胞离散生长以及刺激肝细胞表面HGF受体酪氨酸残基磷酸化,保持有生物学活性。血液动力学实验表明,HSA-HGF(R494E)在小鼠体内半衰期由单体的3 min增加到3 h左右,体内循环稳定性明显提高。(2)rhHGF的生物学制备以及HGF(R494E)的表达根据研究报道,rhHGF在大肠杆菌、毕赤酵母与CHO体系中均已尝试表达。由于HGF分子量较大、二硫键较多且空间结构复杂;毕赤酵母表达产物由于糖基化问题会产生免疫毒理局限,因此本研究选择CHO细胞作为表达宿主。借鉴CHO抗体表达体系,筛选出可以明显促进HGF表达的信号肽Gaussia luciferase,以该信号肽引导HGF(R494E)分子的分泌表达。表达得到了具有活性的产物,不需要后续剪切再加工过程,简化了制备过程。HGF(R494E)分子有潜力成为治疗急性肾衰竭等急性病的药物候选分子。(3)融合蛋白HSA-HGF(R494E)在CHO细胞中的表达Albuferon是干扰素与白蛋白融合药物,由酵母表达生产,但此药物进行临床研究时发生一例免疫毒性引起的死亡案例,因此本研究选择CHO作为表达宿主。融合蛋白表达过程中,培养基中的目标蛋白累积到一定程度后不再增加,在HSA-HGF(R494E)表达周期中每间隔2天添加20 mg?L-1的泛素连接酶抑制剂沙利度胺,整个表达周期培养基中目的蛋白HSA-HGF(R494E)每天明显累积,培养基中的HSA-HGF(R494E)表达量由50 mg?L-1增加到130 mg?L-1。胞外累积的HSA-HGF(R494E)导致CHO胞内融合蛋白的降解是限制该蛋白表达在主要限制因素。融合蛋白的活性降低到天然蛋白的4%左右,活性下降没有超过100倍,符合成药性要求。(4)融合蛋白HSA-HGF(R494E)抗肝纤维化药效学研究HSA-HGF(R494E)在体外促进CCl4损伤肝细胞恢复,抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA与COLⅠ的表达。小鼠体内实验中,CCl4损伤肝脏一段时期后,肝脏结构破坏严重,保肝药水飞蓟素每天灌胃处理可以明显改善肝脏状态。融合蛋白HSA-HGF(R494E)在一个低尾静脉注射量以及低注射频率下(3天一次)具有明显提高肝功能以及缓解纤维化的作用,显示了该蛋白良好的保肝及抗肝纤维化效果。本研究设计了成药性更好的新型抗纤维化药物前体分子HSA-HGF(R494E),解析了限制培养液中融合蛋白累积的主要原因,实现了融合蛋白HSA-HGF(R494E)在CHO中的稳定高效表达,证实了融合蛋白HSA-HGF(R494E)具有明显的肝保护与抗纤维化作用。
李鹏飞[3](2017)在《重组肝再生增强因子(rALR)的50L发酵与高效分离纯化研究》文中研究指明肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)在肝脏损伤和肝再生过程中发挥着重要的作用,是一种潜在的肝脏疾病靶向药物。目前国内外研究主要针对其作用机理进行研究,利用生物工程制备重组ALR(recombinant augmenter of live regeneration,rALR)也停留在实验室规模,尚未大规模应用。本论文选用毕赤酵母为表达宿主,并针对rALR的高效表达、规模放大和纯化等过程中的关键技术进行了研究,并在纯化过程中首次引入双水相萃取技术,最终获得了高表达量、高纯度和高活性的rALR。主要研究内容包括:(1)rALR的高效表达工程菌的构建及筛选:优化ALR基因序列并构建至3种毕赤酵母表达载体(pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A),分别转入3种宿主菌(X-33、GS115和SMD1168),对得到的7种载体-宿主组合进行鉴定、诱导表达,最终筛选得到rALR的高效表达菌株。结果表明,pPICZα-A/X-33组合的表达量高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115组合,显着高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168组合。(2)rALR的表达条件优化和规模放大:本研究对表达过程中的关键因素进行了优化和规模放大,包括pH、诱导温度、甲醇浓度、溶氧条件等,结果表明rALR在pH=5.5,诱导温度26℃,诱导甲醇浓度0.25%,溶氧20%的最佳条件下时,诱导6d的表达量达到最高,且发酵规模成功放大至50L中试规模。(3)rALR的分离纯化条件优化及纯化体系放大:以rALR 50L规模的发酵液为研究对象,进行分离纯化条件摸索。结果表明,双水相萃取技术具有显着的纯化效果,经双水相偶联离子交换层析两步纯化,获得了纯度高于95%,收率高于85%的rALR。(4)rALR的生物学活性测定:主要对rALR的体外、体内生物学活性进行测定。首先测定了rALR的巯基氧化酶酶活性,同时用MTT法测定rALR对HepG2细胞的活性影响,结果表明rALR具有较好的酶学活性,并能够促进肝癌细胞系HepG2的增殖;其次利用CCl4急性肝衰竭模型对rALR的作用进行测定,结果发现,rALR对于肝损伤具有明显的促进和修复作用,说明rALR具有良好的生物学活性。结论:本文建立了rALR的中试规模高效表达及纯化生产工艺。其中,rALR在50L规模下表达量达到545mg/L,较现有水平[1](424mg/L)提高了28.5%,建立了相应规模的纯化工艺,获得了纯度大于95%,收率高于85%且具有良好的生物学活性的rALR。为阐明ALR的作用机制、临床研究以及产业化奠定了良好的基础。
宋旭飞[4](2016)在《重组人肝细胞生长因子在毕赤酵母中的表达》文中提出目的:1.建立有效的真核表达体系。2.分泌表达出具有生物活性的HGF蛋白。方法:本研究首次利用p GAPZαA这一真核表达载体表达HGF蛋白。我们从gene bank上找到HGF全长片段,然后根据真核表达偏爱密码子将其合成。为得到二级结构的HGF蛋白,我们在494位氨基酸Arg和495位氨基酸Val间添加了肠激酶序列。将HGF和p GAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体p GAPZαA-HGF,测序后将穿梭载体进行线性化,然后电转化入毕赤酵母GS115进行表达,分别在24h,48h,72h,96h取样。将得到的蛋白行亲和层析纯化,然后行Western Blot检测。最后分离小鼠原代肝细胞,采用MTT法检测HGF蛋白的生物学活性。结果:成功构建了p GAPZαA-HGF穿梭质粒,Western Blot检测显示80k Da左右有阳性条带,HGF蛋白成功表达,在48h时表达量较好,浓度为16.6mg/L,并且得到的HGF蛋白具有生物学活性。结论:建立了有效的真核表达体系,分泌表达出具有生物活性的HGF蛋白,为真核表达HGF蛋白提供了实验依据,为后续大量表达HGF蛋白提供了可行性。
吴贻琛,辛绍杰[5](2012)在《肝再生增强因子研究进展》文中研究表明肝再生增强因子是一种新型的肝细胞刺激因子。本文从分子生物学特性、生物活性与作用机制等方面对肝再生增强因子的研究进展进行综述。
迟春萍[6](2011)在《人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究》文中认为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD)是一类金属酶,是生物体防御氧化损伤的重要酶类,广泛存在于需氧生物,耐氧生物和某些厌氧生物中。目前已知的SOD主要分为三类,即Fe-SOD,Mn-SOD和Cu,Zn-SOD。超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢与氧气。此酶在保护机体免受超氧自由基以及由其生成的活性氧类的氧化伤害过程中起着极其关键的作用。目前,SOD已经在化妆品,保健食品添加剂等方面得到了广泛的应用。Cu, Zn-SOD的稳定性高于Mn-SOD,并且在哺乳动物中含量远高于Mn-SOD,因此众多学者更重视Cu, Zn-SOD在临床上的应用。目前国内市场上的SOD大多采用动物血液或植物提取,因此在使用效果及免疫原性方面都存在着不足,而且人体对这种异种蛋白的耐受性尚需进一步研究;在提取过程中,容易发生致病微生物污染及有机试剂残留;欧盟从1997年1月起禁止使用动物SOD,基因工程SOD从根本上克服了动植提取SOD的各种弊病(主要是病毒交叉感染),决定了该项目开发的美好前景。本课题根据酵母密码子偏好性化学合成人Cu, Zn-SOD基因,并将其克隆至整合型真核分泌表达载体pPIC9K,用不同的电转条件转化毕赤酵母GS115,用MD和MM平板进行表型筛选,获得阳性转化子,以甲醇诱导实现分泌表达。本研究建立了rhCu, Zn-SOD中试发酵纯化工艺,建立了rhCu, Zn-SOD脂质体载酶工艺,为rhCu, Zn-SOD的产业化奠定了基础。Pichia. Pas toris基因表达系统经过近十几年发展,已基本成为较完善外源基因表达系统,具有易于高密度发酵,表达基因可以稳定整合在宿主基因组中,能分泌表达目的蛋白并适当糖基化等特点。目前美国FDA已具备评价来自该系统的基因工程产品的能力,来自该系统的Cephelon已获得FDA批准,所以该系统被认为是安全的。本研究成功构建了4株GS115/Cu, Zn-SOD转化子,用Southern blot法检测GS115/Cu, Zn-SOD转化子拷贝数量,对其中拷贝数量较高的3株传代,考察基因整合的稳定性,转化子的生长曲线表明了重组酵母菌16h后进入对数生长期,24小时后进入生长稳定期,试验确定了最佳诱导时间。对其中的高拷贝转化子进行了摇瓶培养和罐培养的条件优化,首先在摇瓶水平上进行单因素培养条件优化,最适培养条件为:初始pH6.0,维持1.5%甲醇浓度,72小时收获,然后设计4因素3水平正交实验获得了摇瓶培养的最适条件:1.5%甲醇诱导,pH6.0,温度30℃,72小时收获。最适摇床诱导表达可得到大于600 U/ml的酶活性的二聚体蛋白,其分子量为40KDa,单体分子量20KDa,低糖基化,均为分泌表达,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。电泳薄层扫描分析,目的蛋白占外分泌蛋白总量的79.6%。用组装的双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测蛋白后计算可知,目的蛋白占总蛋白的65%,表达量为70mg/L。从酶的稳定性实验可知:粗酶在氯仿、丙酮和乙醇中60min内稳定,对H2O2不稳定,在85℃15分钟内和pH4-10范围内都较稳定。在优化摇瓶培养条件的基础上设计正交试验,确立了大罐的发酵工艺,即以A600200为起始诱导的菌浓度诱导,在pH6.0,温度25℃,2ml/min流速流加甲醇条件下rhCu, Zn-SOD表达活性及蛋白含量最佳。极差分析也显示了甲醇浓度对诱导表达的影响最大,同时也表明,罐培养时,适当降低温度更有利于蛋白的分泌表达。以优化的最适条件进行罐培养,rh Cu,Zn-SOD目的蛋白占总蛋白的66%,表达量为615mg/L,活性大于5000U/ml,比活性大于9×103U/mg,比摇瓶培养条件所获得的目的蛋白活性及蛋白表达量高8倍。高密度罐发酵的重组大Cu, Zn-SOD发酵液超滤浓缩5倍后,重组人Cu, Zn-SOD活性及蛋白回收率可达100%,纯化率达85%。小量实验确立了阴离子交换层析条件,摸索了最佳盐析及凝胶过滤条件,五批纯化结果显示,每批原液中重组人Cu, Zn-SOD的浓度都在lmg/ml以上,比活性6 x 103U/mg,重组人Cu, Zn-SOD目的蛋白活性及蛋白回收率大于70%,纯度达95%以上,各项质量指标均符合生物制品中基因工程产品的检定规程。本研究建立了rhCu, Zn-SOD蛋白含量及活性检测方法。参照抗体技术实验指南制备用于检定rhCu, Zn-SOD特异性的单克隆抗体及多克隆抗体,并建立了以多克隆抗体包被,单克隆抗体标记的双抗体夹心ELISA检测方法,组装了用于检测发酵液表达目的蛋白检测试剂盒。经鉴定,最低检测极限为18.75ng/ml,批内CV<10%,批间CV<15%,特异性良好。克服了生化检测带来的偏差,真实反映了发酵液中rhCu, Zn-SOD目的蛋白的表达量。为表达研究提供了可靠的检测手段和实验依据。rhCu,Zn-SOD纯品参照中华人民共和国药典三部2005版的有关基因工程制品原液检定项目进行全面检定。用非还原SDS-PAGE法和HPLC法检查rhSOD纯度,Western blot法检查特异性,还原SDS-PAGE法检查分子量,考马斯亮蓝法及双抗体夹心ELISA法检测蛋白含量,用活性检测试剂盒测定酶活性,地高辛标记法检测残余DNA,酶联免疫法测定残余蛋白,鲎试剂法测定纯品的内毒素,微生物检查法检测无菌试验,等电聚焦法检测Cu, Zn-SOD的等电点,用Edman降解法测定rhCu, Zn-SOD的N末端氨基酸序列。检测结果符合生物制品各项检测指标。为了能更好的应用,本研究对纯品进行脂质体载酶研究,采用本课题组较成熟的旋转蒸发法制备脂质体技术,结合冻干水重建脂质膜的方法,正交设计了优化脂质体修饰rhCu, Zn-SOD条件,分析影响因素,用最适的优化条件制备rhCu,Zn-SOD脂质体,粒径平均80nm左右。进行Cu, Zn-SOD脂质体的稳定性实验,用凝胶过滤法分离游离蛋白及rhCu, Zn-SOD脂质体以计算脂质体包封率,制备的脂质体包封率最高达85%。4℃和室温放置6个月包封率下降不明显。可以规模化制备稳定的rhCu, Zn-SOD脂质体。药代动力学显示rhSOD脂质体明显提高了体内的半衰期,提高了该制品的生物利用度,血中及肝脏组织中生物利用度分别为195.94%和134.86%,为rhCu, Zn-SOD的临床应用奠定了基础。
陈罡[7](2009)在《人肝再生增强因子生物活性的研究》文中进行了进一步梳理人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration, hALR)是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子,除促进肝细胞增殖外,还能保护肝脏,预防肝纤维化。本实验的目的是克隆人肝再生增强因子ALR205基因并研究其对大鼠急性肝损伤的治疗作用。方法利用RT-PCR技术从人肝癌细胞HepG2中扩增ALR205基因编码区,构建真核表达载体pCDNA3.1-ALR205。将重组质粒以200μg/kg剂量尾静脉注射给CCL4致急性肝损伤大鼠,检测血清AST、ALT水平,肝组织病理学变化、肝组织增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen PCNA)并对照pCDNA3.1-ALR125基因治疗来观察ALR205基因对急性肝损伤的疗效。结合RT-PCR检测肝组织ALR205 mRNA表达情况。结果克隆出ALR205基因,测序结果与文献报道一致。两种重组质粒用于急性肝损伤大鼠后,血清酶学检查结果表明外周血AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)水平显着降低(P<0.01),肝组织病理损害情况大幅度减轻,治疗组肝PCNA指数均明显高于其它组(P<0.01)且ALR205比ALR125在促肝细胞增殖方面有明显差异(P<0.05),只有ALR205基因治疗组检测出阳性条带。结论。ALR205重组质粒体内表达产物通过促进肝细胞增殖,降低血清AST、ALT水平发挥抗急性肝损伤作用。
相代荣[8](2009)在《重组人肝再生增强因子的克隆和在毕赤酵母中初步表达》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)有促进肝细胞再生、抗肝纤维化等作用,对各种原因的肝衰竭、重型肝炎等情况下的肝细胞再生有重要作用。我们已经实现了人肝再生增强因子(human augmenter of liverregeneration,h-ALR)在大肠杆菌中的表达,但表达产物是以无活性的单体形式(15KD)存在。由于真核表达系统-毕赤酵母表达系统对所表达蛋白有磷酸化、糖基化、二硫键形成等蛋白加工功能,且迄今已有多种蛋白实现了在毕赤酵母中的活性表达。所以我们拟实现人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达,以期得到有活性的蛋白。本研究分两部分进行研究。第一部分,在大肠杆菌DH5α中实现人肝再生增强因子重组克隆的构建。以本实验室保存菌株为模板,利用PCR扩增方法,克隆得到预期大小基因,约为424bp。之后通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切作用,将同样经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切作用的载体pPIC3.5K连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,抽提阳性大肠杆菌DH5α的质粒行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和PCR初步鉴定后,将阳性重组载体送检测序,最后成功构建重组载体pPIC3.5K-ALR。第二部分,将重组表达载体pPIC3.5K-ALR用SalⅠ酶切使其线性化后,电转化感受态宿主菌GS115,通过MM和MD平板筛选得到Mut+转化子,并通过PCR检测筛选得到阳性重组毕赤酵母菌株。转化后阳性菌株经BMMY诱导后,分别在诱导0时、12时、24时、48时、96时取样。分别对不同诱导时间样品的上清和细胞沉淀行SDS-PAGE检测,结果在细胞沉淀中得到了预期约40KD大小的蛋白,从而初步实现了ALR在毕赤酵母中的表达。
平续斌,李志敏,叶勤,黄秀东,曹之舫[9](2008)在《甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响》文中研究指明考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略(恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度)对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子(hALR)的影响。控制恒定甲醇浓度为10g/L诱导时,甲醇比消耗速率和hALR表达速率显着高于其它两种流加策略,最终hALR表达水平为360mg/L。
陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松[10](2007)在《人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究》文中研究说明肝再生增强因子(ALR)是一类胞源性肝细胞生长因子。为在毕赤酵母中分泌表达人肝再生增强因子(rhALR),以色谱法分离纯化后进行体外活性研究,构建表达载体pPICZαA-ALR,经电穿孔转入毕赤酵母中,用0.5%甲醇诱导表达;重组酵母培养上清经SDS-PAGE电泳和western blot鉴定后表明,rhALR以分子量为30kDa的二聚体为主;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中rhALR约占总蛋白的66%,表达量约为40mg/L;经DEAE柱和G75柱纯化后,获得的rhALR纯度大于95%,得率为52%;体外生物学活性实验表明,rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞的增殖。
二、人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达(论文提纲范文)
(1)利用毕赤酵母发酵胰岛素类似物的研究进展(论文提纲范文)
1 胰岛素类似物 |
2 毕赤酵母表达系统的优势 |
3 毕赤酵母发酵工艺介绍 |
4 关键工艺参数 |
4.1 C肽序列的设计 |
4.2 外源基因拷贝数 |
4.3 启动元件的选择 |
4.4 培养基 |
4.5 溶氧控制 |
4.6 诱导温度 |
4.7 诱导pH |
4.8 甲醇的流加速度 |
5 小结 |
(2)人血清白蛋白—肝细胞生长因子融合蛋白突变体的表达及其活性分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第一章 绪论 |
1.1 肝纤维化形成过程及治疗 |
1.1.1 肝纤维化概况 |
1.1.2 肝纤维化形成过程 |
1.1.3 肝硬化 |
1.1.4 肝纤维化治疗方法 |
1.2 肝细胞生长因子 |
1.2.1 肝细胞生长因子结构 |
1.2.2 肝细胞生长因子受体 |
1.2.3 HGF治疗肝纤维化 |
1.2.4 HGF的重组表达 |
1.2.5 HGF的部分临床研究 |
1.3 中国仓鼠卵巢细胞 |
1.3.1 表达系统简介 |
1.3.2 CHO细胞系的发展历程 |
1.3.3 CHO阳性细胞株的构建 |
1.3.4 信号肽对CHO表达外源蛋白的影响 |
1.4 研究背景及研究内容 |
1.4.1 研究背景及立题依据 |
1.4.2 主要研究内容 |
第二章 肝细胞生长因子药物候选分子的设计与改造 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 菌种、哺乳动物细胞及质粒 |
2.2.2 试剂 |
2.2.3 培养基与相关溶液的配制 |
2.2.4 HGF定点突变、表达载体的构建与Pool细胞的获得 |
2.2.5 HSA基因与HGF(R494E)基因的融合拼接与Pool细胞的获得 |
2.2.6 HGF(R494E)与HSA-HGF(R494E)的生物学活性初步检测 |
2.3 结果与讨论 |
2.3.1 HGF基因的定点突变 |
2.3.2 Pool细胞表达HGF(R494E) 的活性检测 |
2.3.3 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的设计 |
2.3.4 Pool细胞表达HSA-HGF(R494E) 的活性检测 |
2.4 讨论 |
2.5 本章小结 |
第三章 HGF生物学制备及突变体分子HGF(R494E)的表达 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 菌种、哺乳动物细胞及质粒 |
3.2.2 试剂 |
3.2.3 培养基与相关溶液的配制 |
3.2.4 HGF在大肠杆菌中的表达 |
3.2.5 HGF在毕赤酵母中的表达 |
3.2.6 CHO细胞中高效分泌HGF的信号肽筛选 |
3.2.7 稳定表达HGF(R494E)细胞株的筛选、细胞悬浮驯化与补料分批培养 |
3.2.8 检测方法 |
3.2.9 HGF(R494E)的分离纯化 |
3.2.10 HGF(R494E)生物学活性检测 |
3.3 结果与讨论 |
3.3.1 HGF基因的原核表达 |
3.3.2 人HGF在毕赤酵母中表达 |
3.3.3 信号肽引导HGF表达细胞株的筛选 |
3.3.4 CHO细胞株的悬浮驯化及批次实验 |
3.3.6 不同信号肽CHO细胞的表达过程差异比较 |
3.3.7 不同信号肽引导表达的HGF活性检测 |
3.3.8 Gaussia luciferase信号肽引导HGF(R494E)细胞株的构建 |
3.3.9 HGF(R494E)的表达与纯化 |
3.3.10 HGF (R494E)的生物学活性检测 |
3.4 讨论 |
3.5 本章小结 |
第四章 人血清白蛋白与HGF(R494E)融合蛋白在CHO细胞中的表达 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 菌种、哺乳动物细胞、质粒以及其它细胞 |
4.2.2 试剂及仪器 |
4.2.3 HSA-HGF(R494E)融合基因细胞株的构建 |
4.2.4 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的分离纯化 |
4.2.5 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体外生物学活性检测 |
4.2.6 表达周期中目的基因的mRNA含量分析 |
4.2.7 表达周期中胞内目的蛋白分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 构建高表达HSA-HGF(R494E)蛋白的CHO细胞株以及补料分批培养 |
4.3.2 表达过程中HSA-HGF(R494E)转录水平分析以及胞内蛋白表达检测 |
4.3.3 HSA-HGF(R494E)对其它HSA融合蛋白表达的影响 |
4.3.4 含不同结构域的HSA与HGF(R494E)融合后在CHO中表达 |
4.3.5 抑制胞内降解途径显着提高HSA-HGF(R494E)蛋白在CHO中的表达 |
4.3.6 HSA-HGF(R494E)蛋白的分离纯化 |
4.3.7 HSA-HGF(R494E)的生物学活性检测-MDCK细胞离散实验 |
4.3.8 融合蛋白刺激L02细胞受体磷酸化以及降低HSC在纤维化标志物表达 |
4.4 讨论 |
4.5 本章小结 |
第五章 HSA-HGF(R494E)蛋白抗肝纤维化成药性初步分析 |
5.1 前言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 实验材料与主要仪器 |
5.2.2 相关溶液的配制 |
5.2.3 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体内半衰期分析 |
5.2.4 融合蛋白HSA-HGF(R494E)的体外抗肝纤维化分析 |
5.2.5 动物模型的建立以及给药 |
5.2.6 实验动物处理及取材 |
5.2.7 制备肝组织石蜡切片 |
5.2.8 肝组织切片的HE染色 |
5.2.9 肝组织切片的Masson染色 |
5.2.10 血清中相关肝功能指标测定 |
5.2.11 肝组织中 α-SMA和COLⅠ基因转录水平检测 |
5.3 结果与讨论 |
5.3.1 融合蛋白HSA-HGF(R494E)体内半衰期检测 |
5.3.2 融合蛋白HSA-HGF(R494E)体外抗肝纤维化分析 |
5.3.3 体内抗肝纤维化实验小鼠生长情况及肝脏观察 |
5.3.4 肝脏病理学观察 |
5.3.5 肝功能指标检测 |
5.4 本章小结 |
主要结论与展望 |
主要结论 |
展望 |
论文主要创新点 |
致谢 |
参考文献 |
附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
(3)重组肝再生增强因子(rALR)的50L发酵与高效分离纯化研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语表 |
第一章 文献综述 |
1.1 肝再生增强因子(ALR) |
1.1.1 ALR的发现 |
1.1.2 ALR的分子结构和理化性质 |
1.1.3 ALR的生物学功能 |
1.1.4 ALR与疾病 |
1.2 毕赤酵母表达系统 |
1.2.1 毕赤酵母表达系统 |
1.2.2 影响外源蛋白的表达因素 |
1.3 重组蛋白的分离纯化 |
1.4 本文的目的与意义 |
1.4.1 目的 |
1.4.2 意义 |
第二章 材料与方法 |
2.1 实验器材 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2 实验材料 |
2.1.3 常用试剂配制 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 rALR基因序列的设计、载体构建及鉴定 |
2.2.2 转化毕赤酵母X-33、GS115及SMD1168及阳性克隆鉴定 |
2.2.3 摇瓶中的最佳表达条件试验 |
2.2.4 中试规模诱导表达 |
2.2.5 分离纯化条件优化 |
2.2.6 ALR的双向电泳(IEF/SDS-PAGE,2D) |
2.2.7 ALR的 2D/MS定性: |
2.2.8 rALR巯基氧化酶活性检测 |
2.2.9 体外活性测定 |
2.2.10 体内活性测 |
第三章 实验结果 |
3.1 rALR表达质粒的鉴定结果 |
3.2 阳性克隆的筛选、诱导表达及鉴定 |
3.3 rALR的摇瓶表达条件优化 |
3.4 rALR的3L规模发酵 |
3.4.1 不同起始诱导菌体密度优化 |
3.4.2 溶氧体积分数优化 |
3.4.3 甲醇浓度优化 |
3.4.4 诱导时间优化 |
3.5 10L和50L中试结果 |
3.6 rALR分离纯化条件优化 |
3.6.150mL双水相优化结果 |
3.6.2 双水相体系放大 |
3.6.3 rALR分离纯化结果 |
3.6.4 质谱鉴定结果 |
3.7 rALR蛋白巯基氧化酶活性 |
3.7.1 体外活性 |
3.7.2 体内活性 |
第四章 讨论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文 |
(4)重组人肝细胞生长因子在毕赤酵母中的表达(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
常用缩写词中英文对照表 |
前言 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 重组HGF基因全长片段合成 |
2.2 pGAPZαA-HGF穿梭载体的构建 |
2.3 重组质粒pGAPZαA-HGF线性化 |
2.4 重组质粒pGAPZαA-HGF电转GS115后菌液PCR |
2.5 重组HGF在毕赤酵母中的表达 |
2.6 重组HGF蛋白的纯化 |
2.7 肠激酶切HGF蛋白 |
2.8 HGF蛋白浓度检测 |
2.9 HGF蛋白Western Blot分析 |
2.10 HGF蛋白活性检测 |
3 讨论 |
3.1 HGF基因优化 |
3.2 HGF蛋白表达 |
3.3 HGF蛋白活性检测 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
附录1 |
附录2 |
附录3 |
致谢 |
在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
个人简历 |
(5)肝再生增强因子研究进展(论文提纲范文)
1 ALR的分子生物学特性 |
1.1 基因克隆 |
1.2 分子结构和功能 |
1.3 组织表达定位 |
1.4 受体分布 |
2 ALR的生物活性及作用机制 |
2.1 信号转导途径 |
2.2 促进肝细胞再生 |
2.3 促进线粒体基因表达与氧化磷酸化作用 |
2.4 巯基氧化酶的作用 |
2.5 免疫调控功能 |
2.6 其他作用 |
3 结语 |
(6)人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略语表 |
第一章 绪论 |
1.1 超氧化物歧化酶概述 |
1.2 基因工程超氧化物歧化酶(SOD)研究进展 |
1.3 酵母表达系统概述 |
1.4 脂质体技术 |
1.5 课题目的意义、研究内容及技术路线 |
第二章 实验方法 |
2.1 材料与仪器设备 |
2.2 合成人Cu,Zn-SOD基因 |
2.3 构建重组质粒pPIC9K/Cu,Zn-SOD |
2.4 构建重组酵母GS115/Cu,Zn-SOD |
2.5 筛选rhCu,Zn-SOD转化子 |
2.6 PCR法鉴定GS115/Cu,Zn-SOD转化子 |
2.7 Southern blot法检测GS115/Cu,Zn-SOD转化子拷贝数量 |
2.8 检测重组酵母GS115/Cu,Zn-SOD转化子的传代稳定性 |
2.9 建立检测表达产物的纯度、活性、含量、及特异性检测方法 |
2.10 重组毕赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD转化子诱导表达 |
2.11 优化重组毕赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD的表达条件 |
2.12 重组毕赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD最适摇床诱导条件验证 |
2.13 表达上清中目的蛋白酶对温度、化学试剂、pH的稳定性研究 |
2.14 重组毕赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD高密度发酵 |
2.15 重组毕赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD高密度发酵液纯化 |
2.16 rhCu,Zn-SOD原液检定 |
2.17 rhCu,Zn-SOD原液稳定性 |
2.18 rhCu,Zn-SOD纯化原液脂质体载酶研究 |
第三章 结果 |
3.1 人Cu,Zn-SOD基因的合成 |
3.2 pPIC9K/Cu,Zn-SOD构建 |
3.3 GS115/Cu,Zn-SOD转化子的筛选鉴定 |
3.4 Southern blot法检测GS115/Cu,Zn-SOD转化子拷贝数量 |
3.5 rhCu,Zn-SOD转化子鉴定及传代后的基因稳定性检测 |
3.6 rhCu,Zn-SOD毕赤酵母转化子表达产物分析 |
3.7 建立双抗体夹心ELISA检测试剂盒 |
3.8 rhCu,Zn-SOD毕赤酵母转化子的表达研究 |
3.9 rhCu,Zn-SOD高密度发酵 |
3.10 rhCu,Zn-SOD高密度发酵最适条件验证 |
3.11 rhCu,Zn-SOD发酵液三步纯化结果 |
3.12 rhCu,Zn-SOD纯化工艺验证 |
3.13 rhCu,Zn-SOD纯化后的原液检定结果 |
3.14 rhCu,Zn-SOD纯化后的原液稳定性 |
3.15 rhCu,Zn-SOD脂质体载酶条件的优化 |
3.16 rhCu,Zn-SOD脂质体最适条件验证 |
3.17 rhCu,Zn-SOD脂质体稳定性研究 |
3.18 rhCu,Zn-SOD脂质体药代动力学及生物利用度 |
第四章 结论 |
4.1 成功构建了GS115/Cu,Zn-SOD转化子 |
4.2 构建的GS115/Cu,Zn-SOD转化子实现了高表达 |
4.3 建立了rhCu,Zn-SOD大罐的高密度发酵工艺 |
4.4 建立了双抗ELISA检测试剂盒用于发酵液的目的蛋白的分析 |
4.5 建立了rhCu,Zn-SOD稳定的纯化工艺及原液检定方法 |
4.6 建立了rhCu,Zn-SOD脂质体载药技术提高了生物利用度 |
第五章 讨论 |
5.1 Pichia pastoris表达系统的选择 |
5.2 分泌表达方式的选择 |
5.3 甲醇利用表型(Mut~+和Mut~s)的选择 |
5.4 影响发酵上清酶活性的因素 |
5.5 影响毕赤酵母外源蛋白表达量的内在因素 |
5.6 rhCu,Zn-SOD活性及稳定性 |
5.7 rhCu,Zn-SOD纯化和酶修饰 |
5.8 本课题的工作展望 |
参考文献 |
(7)人肝再生增强因子生物活性的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
第一章 前言 |
1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现 |
1.2 人肝再生增强因子(ALR205)的克隆 |
1.3 ALR125的基因结构 |
1.4 ALR205的组织表达定位 |
1.5 ALR205的生物学活性和作用机制 |
1.6 本研究的意义和主要内容 |
第二章 实验材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 菌株和质粒 |
2.1.2 引物 |
2.1.3 试验动物与细胞株 |
2.1.4 主要试剂 |
2.1.5 主要仪器和设备 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 ALR205基因的克隆 |
2.2.2 酵母高表达ALR125蛋白工程菌最佳表达时间的确定 |
2.2.3 ALR125的纯化 |
2.2.4 pCDNA3.1-ALR205与pCDNA3.1(+)-ALR125重组质粒的大量提取 |
2.2.5 ALR125活性检测 |
2.2.6 肝再生增强因子基因治疗及纯化蛋白的体内活性检测 |
第三章 实验结果及分析 |
3.1 ALR205基因片段的扩增、克隆及序列分析 |
3.1.1 ALR205基因的PCR扩增结果 |
3.1.2 重组载体pCDNA3.1(+)-ALR205的酶切和PCR鉴定结果 |
3.1.3 DNA序列测定 |
3.1.4 高表达工程菌ALR125最佳表达时间的确定 |
3.2 ALR125的纯化 |
3.2.1 (NH_4)_2SO_4沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清 |
3.2.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化ALR125 |
3.2.3 sephadex G-75凝胶层析精制ALR125 |
3.3 ALR125活性实验结果 |
3.3.1 ALR125体外促进细胞增殖的活性 |
3.3.2 大鼠的一般情况 |
3.3.3 肝组织形态学改变 |
3.3.4 肝组织PCNA指数 |
3.3.5 ALR205基因在大鼠肝组织中的表达情况 |
3.3.6 血清ALT和AST水平变化 |
第四章 讨论 |
第五章 总结 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的论文 |
致谢 |
(8)重组人肝再生增强因子的克隆和在毕赤酵母中初步表达(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
英文摘要 |
目录 |
第一部分 重组人肝再生增强因子克隆表达载体的构建 |
1 引言 |
2 实验材料与仪器 |
3 实验方法 |
4 实验结果 |
5 讨论 |
第二部分 重组人肝再生增强因子重组载体在毕赤酵母中初步表达 |
1 引言 |
2 实验材料与仪器 |
3 实验方法 |
4 表达蛋白初步分析——SDS-PAGE |
5 实验结果 |
6 讨论 |
7 下一步的研究方向 |
参考文献 |
附录 |
(10)人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材 料 |
1.2 重组载体的构建 |
1.3 构建酵母表达菌 |
1.4 重组蛋白的表达及鉴定 |
1.5 rhALR的纯化 |
1.6 rhALR体外活性检测 |
2 结 果 |
2.1 PCR扩增及重组质粒鉴定结果 |
2.2 重组蛋白的表达鉴定结果 |
2.3 重组蛋白纯化结果 |
2.4 rhALR体外活性检测 |
3 讨 论 |
四、人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达(论文参考文献)
- [1]利用毕赤酵母发酵胰岛素类似物的研究进展[J]. 谢海松,郑倩倩,斯成赐. 海峡药学, 2019(12)
- [2]人血清白蛋白—肝细胞生长因子融合蛋白突变体的表达及其活性分析[D]. 徐栋生. 江南大学, 2017(04)
- [3]重组肝再生增强因子(rALR)的50L发酵与高效分离纯化研究[D]. 李鹏飞. 河南师范大学, 2017(02)
- [4]重组人肝细胞生长因子在毕赤酵母中的表达[D]. 宋旭飞. 山西医科大学, 2016(08)
- [5]肝再生增强因子研究进展[J]. 吴贻琛,辛绍杰. 传染病信息, 2012(01)
- [6]人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究[D]. 迟春萍. 吉林农业大学, 2011(01)
- [7]人肝再生增强因子生物活性的研究[D]. 陈罡. 沈阳药科大学, 2009(S1)
- [8]重组人肝再生增强因子的克隆和在毕赤酵母中初步表达[D]. 相代荣. 浙江大学, 2009(11)
- [9]甲醇流加策略对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子的影响[J]. 平续斌,李志敏,叶勤,黄秀东,曹之舫. 中国医药工业杂志, 2008(11)
- [10]人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究[J]. 陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松. 中国生物工程杂志, 2007(06)