一、奶牛跗关节滑液的物理特性及细胞成分的研究（论文文献综述）
张宏燕,岳亚辉,邢小勇,龙翠琴,武小椿,温峰琴,包世俊[1]（2021）在《滑液支原体亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）的原核表达及亚细胞定位》文中研究指明滑液支原体（Mycoplasma synoviae, MS）是一种重要的禽类致病性支原体,感染鸡（Gallus domesticus）和火鸡（Meleagris gallopavo）后引起渗出性滑膜炎、关节炎、跗跖部肿胀和呼吸道炎,造成养鸡业的重大经济损失。亚甲基四氢叶酸脱氢酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, MTHFD）催化5,10-亚甲基四氢叶酸生成5,10-甲炔基四氢叶酸,该酶是叶酸代谢中的关键酶,参与嘌呤核苷酸的合成。为研究滑液支原体MTHFD蛋白的免疫原性及其在MS中的分布,本研究参照GenBank中MS WVU1853株双功能5, 10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶/5, 10-亚甲基四氢叶酸环化水解酶（bifunctional 5, 10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase/5,10-methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase, folD）基因序列设计引物,利用PCR扩增MS folD基因并对其序列进行分析和优化。结果表明,MS folD基因全长837 bp,与GenBank中其他MS菌株folD基因的序列相似性达99.6%。folD基因克隆至pET-28a （+）质粒后转化至大肠杆菌（Escherichia coli） BL21 （DE3）感受态细胞,诱导后SDS-PAGE检测表达情况。结果显示重组蛋白（recombinant protein, r） MS MTHFD成功表达,且相对分子质量约为36 kD。纯化蛋白免疫新西兰兔（Oryctolagus cuniculus）制备抗血清,并利用Western blot、ELISA与免疫荧光试验对rMS MTHFD的免疫原性和MTHFD在MS中的分布进行分析。结果表明,rMS MTHFD蛋白具有良好的免疫原性,MTHFD在MS的细胞膜和细胞浆中均有分布,但在胞浆中的含量较多。本研究结果为滑液支原体MTHFD生物学功能的深入研究提供了基础资料。
李桥[2]（2021）在《犬缺血性骨软骨病细胞凋亡与基质紊乱的机制研究》文中研究指明骨软骨病（osteochondrosis,OC）是以软骨内骨化发生局灶性紊乱为特征的软骨疾病。通常引起人和动物关节疼痛和功能障碍等临床症状。OC患者初期临床症状不明显,导致其早期诊断困难。发展到中后期却治疗困难。关于OC的病因学的研究集中在缺血性生长软骨损伤,主要表现为细胞大量坏死或凋亡,软骨基质胶原和蛋白聚糖降低。然而,这种基质的主要成分和微观结构的变化规律还不明确,引起这种病变的潜在生物学机制也还不清楚。目前大多数关于OC的研究集中在手术切除的骨软骨碎片的组织学变化,以探讨其发病机制。然而,这些处于疾病后期的软骨碎片不能代表原发性OC疾病特征。犬和人OC的发生存在着高度相似性,包括临床表现、好发部位和影像学的改变以及晚期病变的组织学表现,表明他们可能有潜在共同的发病机制。因此,本研究旨在建立犬早期缺血性骨软骨病的基础上,探索其发生的潜在机制,有助于寻找动物和人OC发病早期的诊断生物标志物和新的防治策略。1.缺血诱导犬骨软骨病人和动物的软骨管内血管供应存在于骺生长软骨发育的早期阶段的有限时间内。在生长过程中,位于软骨管中段和远端的软骨管血管随着骨化前沿的推进与软骨下骨的血管形成吻合。当血管吻合发生紊乱时,软骨内骨化不能正常进行,从而导致骨软骨病的发生。软骨管血管的供血障碍在OC发生中起重要作用。因此,研究人员常通过阻断骺生长软骨的血液供应,诱导OC的发生。诱导性生长软骨缺血方法取决于软骨管血管的走向。基于本实验室前期的犬微血管灌注结果,我们发现幼犬股骨髁软骨管血管比滑车软骨管血管长、密度小;而股骨内侧髁软骨管血管比外侧髁软骨管血管长、密度小且分支较少。因此,与股骨滑车和外侧髁相比,犬股骨内侧髁是诱发缺血性软骨损伤的合适部位。本研究于犬股骨内侧髁的远轴侧行全层软骨切除,阻断软骨膜源血供以诱导OC,对侧肢内侧髁做健康对照;术前及术后6、10、20和30 d,分别进行X线影像学检查,评估骺生长软骨的钙化情况;术后6和30 d,分别随机选取6只犬,手术采集膝关节股骨髁软骨组织,采用HE染色、番红固绿染色和甲苯胺蓝染色,对其进行组织学评估;TUNEL染色检测软骨细胞凋亡情况;扫描电镜观察软骨胶原微观形态变化;拉曼光谱学检测软骨组成成分变化。结果显示:术后6、10、20与30 d,膝关节X影像学检查可见OC组犬的股骨远端内侧髁局部缺损随时间的增加而显着降低。术后6 d软骨的组织学观察,OC组出现了典型的缺血性软骨坏死病变,坏死软骨管内血管完整性缺失,软骨管周围部分软骨细胞核消失或胞核胞浆浓缩、胞浆呈嗜酸性等细胞变化;番红固绿及甲苯胺蓝染色显示软骨基质染色变浅,在坏死软骨管周围区域表现更为明显;软骨中间层与深层区软骨细胞出现大量凋亡。术后30 d,软骨细胞与软骨基质的病变更为显着;软骨细胞凋亡从深层区逐渐进展到浅层区;扫描电镜观察到软骨基质胶原出现大量紊乱;拉曼光谱主要组成成分分析结果显示,OC组软骨中蛋白聚糖与胶原相关峰的病变主要集中在中间层与深层。可见软骨细胞凋亡与基质紊乱诱导了OC的发生。2.基于Label free蛋白组学技术的犬骨软骨病差异表达蛋白分析在人与动物的正常生长板软骨和/或骺软骨中,软骨管随机体生长与发育会发生生理性退化。主要表现为软骨管血管退化、消失,小管间充质细胞分化为软骨细胞,最终小管被基质填充,但邻近的软骨细胞未出现异常。病理状态下,早期缺血性OC主要表现为软骨管周围细胞坏死（或凋亡）以及基质的紊乱,可发展为剥脱性骨软骨病（osteochondrosis dissecans,OCD）,也可自愈。这说明生长板软骨中特定的生物学物质可能参与了缺血性OC的发生与发展的调节。本研究应用蛋白质组学技术寻找差异表达蛋白,以探索骨软骨病潜在的分子生物学机制。术后30 d,本研究对OC组和对照组的骺生长软骨相近部位进行全层软骨采样（约3 mm）,采用Label free蛋白组学技术对软骨样本进行差异表达蛋白分析。使用ELISA方法对蛋白质组学的结果进行了验证。对照组与OC组共获取1369种蛋白,对鉴定到的蛋白进行差异表达筛选,OC组与对照组相比,共获得差异蛋白78种,其中显着上调差异蛋白31种,显着下调差异蛋白47种。ELISA验证结果与蛋白组学测序结果高度一致。部分差异蛋白（Htr A1、POSTN、S100A4、IGFBP5、PEDF、ALP和FⅩⅢ等）参与了细胞外基质紊乱的调节。Htr A1、S100A4和Fis等蛋白参与了细胞凋亡。其中,OC软骨中的Htr A1（一种分泌型丝氨酸蛋白酶）水平显着升高。据报道,Htr A1参与细胞外基质的降解,同时调控细胞凋亡。因此,我们推测Htr A1可能通过诱导软骨细胞凋亡与基质紊乱在OC疾病发生中发挥重要作用。3.Htr A1在骨软骨病发生中的作用本试验分离原代犬的生长板软骨细胞,并用免疫荧光进行鉴定。构建了Htr A1过表达质粒pc DNA3.1（+）-Htr A1。使用不同剂量Htr A1过表达质粒（1、3和6μg/m L）转染犬的原代软骨细胞。流式细胞术检测Htr A1过表达诱导软骨细胞凋亡变化;基因和蛋白水平检测与凋亡相关的XIAP/caspase 9/caspase 3信号通路的变化;检测细胞外基质主要组成成分（collagen II和aggrecan）和基质金属蛋白酶（ADAMTS4和ADAMTS5）基因的表达。培养骺生长板软骨外植体,不同剂量Htr A1重组蛋白组（0.1、1和5μg/m L）作用软骨外植体24 h,进行HE染色、番红固绿染色和甲苯胺蓝染色组织学评估;扫描电镜观察软骨胶原微观形态变化;拉曼光谱学检测软骨组成成分变化;检测细胞凋亡和基质紊乱相关基因与蛋白表达的变化。这些研究确定Htr A1在诱导骨软骨细胞凋亡和基质紊乱中的作用,阐明OC发生发展的分子生物学机制。原代软骨细胞培养试验结果显示,不同剂量过表达Htr A1（1、3和6μg/m L）均显着诱导了软骨细胞凋亡,呈剂量依赖性;过表达Htr A1通过激活XIAP/caspase9/caspase 3信号通路诱导了软骨细胞凋亡;过表达Htr A1显着升高了ADAMTS4和ADAMTS5基因的表达,显着降低了细胞外基质主要组成成分（collagen II和aggrecan）基因和蛋白的表达。表明过表达Htr A1可以诱导软骨细胞凋亡与细胞外基质紊乱。软骨外植体研究表明,中剂量和高剂量的重组蛋白Htr A1（1和5μg/m L）)可诱导软骨OC样病变,且呈剂量依赖性。外植体组织学分析显示,中剂量和高剂量Htr A1重组蛋白组中可观察到软骨管和周围软骨细胞大量坏死。同时,软骨外植体组织基质染色较浅,在坏死软骨管周围区域尤为明显。扫描电镜观察显示,Htr A1重组蛋白组的全层软骨（浅层、中间层和深层）胶原分布均出现一定程度紊乱,甚至有明显的断裂现象。这与前一部分中OC软骨中间层与深层的胶原微观形态学变化十分相似。拉曼光谱技术检测到Htr A1重组蛋白处理组软骨主要成分蛋白聚糖和胶原的降低。中剂量和高剂量的重组蛋白Htr A1显着降低了软骨外植体基质相关蛋白collagen II和aggrecan的表达。这些试验证实,异常升高的Htr A1可诱导软骨细胞凋亡和基质紊乱,进而促进OC的发生。综上所述,本研究通过阻断犬股骨远端骺生长软骨的局部血液供应,成功地诱导早期缺血性骨软骨病的发生。应用Label free蛋白质组学技术寻找到生长板软骨中特定的生物学物质Htr A1。通过原代软骨细胞与生长板软骨外植体培养,最终确定了Htr A1在诱导软骨细胞凋亡和基质（胶原和蛋白聚糖）发生紊乱中的作用,阐明OC发生发展的分子生物学机制。
魏泽华[3]（2020）在《温度敏感型滑液囊支原体减毒株的培育与生物学特性鉴定》文中指出滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）在自然条件下主要感染鸡和火鸡,引起渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎,导致蛋鸡的减产和肉鸡的胴体废弃率升高。MS的传播效率高,既可垂直传播,又可水平传播。近年来,MS感染在我国的流行范围广,发病率高,造成的经济损失巨大。目前,MS-H是我国唯一批准使用的商品化弱毒疫苗,但由于其售价较高,仅有少数种禽场使用。因此,研制成本较低且与国内流行株抗原性一致的MS弱毒疫苗是目前的迫切需要。1 我国MS流行菌株的致病性研究基于近三年来本实验室从国内不同省份分离到的46个基因K型MS菌株（国内流行的优势基因型）,选取部分不同来源的菌株（Ningxia/2017-1、Ningxia/2019-3和Shandong/2017-2）进行了致病性研究。研究分别采用胸腔气囊内注射和气管内接种两种方式进行攻毒。经胸腔气囊内注射途径接种14日龄SPF鸡时,Ningxia/2017-1引起的气囊炎发生率为8/12,Ningxia/2019-3和Shandong/2017-2引起的气囊炎发生率分别为11/12和13/13。Ningxia/2017-1引起的气囊损伤严重程度明显低于Ningxia/2019-3 和 Shandong/2017-2（p<0.05）。Shandong/2017-2 引起的气囊损伤严重程度略高于Ningxia/2019-3,但没有显着差异。Shandong/2017-2引起的足垫损伤发生率为5/13,死亡率为4/13,而Ningxia/2017-1和Ningxia/2019-3不引起足垫损伤和鸡只死亡。将Shandong/2017-2的菌液进行梯度稀释,并分别通过胸部气囊内注射方式接种30日龄SPF鸡,以测定Shandong/2017-2的最小致病剂量。结果表明菌液滴度最低为5×105 CCU/ml时可引起全部鸡只发病。对14日龄雏鸡经气管内接种途径进行攻毒时,三个毒株攻毒组试验鸡的临床表现均显着轻于通过气囊内注射攻毒,但3个毒株的致病性强弱程度在两种攻毒方式下表现一致。Ningxia/2017-1株毒力最低,在接种14天后气囊损伤的发生率为20%,未发生跗关节或足垫肿胀。Ningxia/2019-3株毒力居中,在接种14天后气囊损伤的发生率为30%,未发生跗关节或足垫肿胀。Shandong/2017-2株毒力最强。接种14天后气囊损伤的发生率为40%,且出现5例喉头出血,其中3例伴有气管出血;1例跗关节肿胀,肿胀关节内可见脓性渗出。各组气囊损伤评分Ningxia/2017-1组最低,但组间没有统计学差异。本章建立了 MS感染的病理模型,整理出了气囊损伤和足垫损伤的评分方法,为后续试验提供参考。研究结果表明,Shandong/2017-2表现出了最强的致病性,可以作为后续试验中的标准强毒菌株。Ningxia/2017-1致病性最弱,可以其作为培育MS弱毒菌株的母本菌株。2 温度敏感型MS弱毒株的培育温度敏感型（temperature sensitive,ts+）MS弱毒疫苗菌株仅能在感染鸡的上呼吸道定植,不能发生全身性感染,在定植部位通过“占位效应”发挥竞争性排斥作用阻断MS野毒株的感染。本研究采用三种不同浓度的N-硝基-N’-甲基-N-亚硝基胍（N-nitro-N’-methyl-N-nitrosuguanidine,NTG）对连续传代的Ningxia/2017-1菌株进行诱变,获得了 66个单菌落子代克隆菌株。从这些子代菌株中筛选出了 9个ts+菌株。分别通过5周龄SPF鸡足垫内接种途径和1日龄雏鸡胸部气囊内接种途径对9个ts+菌株进行致病性测定。在5周龄SPF鸡足垫内接种试验中,M2、M3、5-18和18-22接种4周后没有引起临床症状或病理变化,且在接种后第2、3、4周引发的抗体水平低于Ningxia/2017-1亲本株的接种组。M10、M20和5-9仅能引起轻微的足垫肿胀,但不能导致气囊炎的发生。在1日龄雏鸡胸部气囊内接种试验中,5-9和5-18不引起气囊炎。M2、M3、M10和18-6均可引起轻度的气囊炎,相互之间没有显着差异。M14引起的气囊炎发生率为7/11,且气囊损伤评分显着高于其它菌株（p<0.05）。M20和18-22组的气囊炎损伤评分略高于M14之外的接种组,但是与包括M14在内的组均没有显着差异。根据致病试验结果选择M2和5-9进一步进行免疫攻毒保护效力试验,以商品化活疫苗（MS-H株）作为对照。于7日龄对SPF鸡进行免疫,免疫25天后使用强毒株Shandong/2017-2进行攻毒。结果显示,5-9可提供30%的保护率,MS-H可提供50%的保护率,而M2仅有10%的保护率。5-9和MS-H接种组的气囊损伤评分均值均显着低于对照组（p<0.05）,但两个免疫组之间没有统计学差异。M2接种组的气囊损伤评分显着高于MS-H接种组（p<0.05）。M2、5-9和MS-H接种后第7、14、21和25天的血清样品均为阴性,这表示3个菌株在接种后25天的时间内均未能引起体液免疫反应。在后续工作中,仍需要对本研究中获得的其他弱毒菌株进行系统的安全性和免疫保护效力评价,以期最终研制一款可应用于临床的商品化MS减毒活疫苗。综上所述,本研究首先通过动物试验筛选出毒力较低的Ningxia/2017-1作为培育减毒株的母本菌株,之后使用不同的方式对其进行诱导突变。通过动物实验对ts+的子代菌株进行筛选,最终发现了具有低致病性且能够提供一定免疫保护作用的菌株5-9,为进一步开发MS弱毒疫苗奠定了基础。
郭亚男[4]（2020）在《宁夏地区牛支原体分型鉴定及其对牛外周血单核巨噬细胞的功能影响研究》文中进行了进一步梳理牛支原体病是一种具有高度传染性的疫病,由于缺少有效的预防控制措施,目前呈世界范围内流行,在我国已成为了一种牛常见性疫病。宁夏回族自治区是我国的肉牛和奶牛主要养殖地区,养牛水平和生产性能名列中国前茅。近些年,由于牛支原体病在宁夏各地不断发生,严重影响了宁夏地区养牛业的绿色健康发展。本论文开展了宁夏地区牛支原体病进行流行病学调查、牛支原体流行菌株的菌群结构分析、牛支原体对牛外周血单核巨噬细胞凋亡影响机制和抗原加工递呈机理的研究,研究结果如下:1.采用ELISA方法对2016年～2018年宁夏全部县区1980份血清进行检测。结果显示,宁夏22个县区牛支原体检出率为100%,3年间牛支原体血清阳性率呈现增长的趋势,年度差异显着（P<0.05）。吴忠市牛支原体阳性率最高,不同县区间存在差异。流行病学调查说明了宁夏地区牛支原体感染普遍存在,且感染率呈现逐年增长趋势。2.为了调查引起宁夏地区牛支原体普遍感染的菌群结构,采用多位点序列分型（MLST）法对2009年至2018年从宁夏不同地区分离的65株菌株进行分型并与国内不同ST型菌株和国际菌株PG45进行联合分析。结果表明,宁夏地区仅有2种ST型,ST10和ST134。构建的进化树揭示了3 个不同的系谱,ST26 的 Hubei-1 菌株、ST172 的 HBHS01 和 Shananxi04 菌株、ST43的NHD0966和EZ-2菌株均与ST10的菌株在同一系谱;PG45菌株（ST17）与NMH7菌株（ST173）在同一系谱;ST134（43.1%）是单独的一个系谱。ST134菌株是新的ST菌株,于2009年首次发现并且目前仅在宁夏地区广泛分布。ST10菌株在中国许多省份广泛传播,自2010年以来在宁夏广泛传播。3.为了研究不同ST型牛支原体对牛外周血单核巨噬细胞（BMDMS）凋亡和免疫功能的影响,本研究采用3种不同ST型牛支原体按照不同的感染复数感染BMDMS,并在4个不同时间点进行凋亡、活性氧和免疫因子检测。结果显示不同ST型牛支原体感染BMDMS均抑制其凋亡,与ST型无关。牛支原体可以抑制ROS的释放。牛BMDMS通过释放IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23和INF-α因子等细胞因子起到引起炎症反应和免疫杀伤作用,均在感染后6h抗体含量增大,之后下降,18h增多,24h下降。4.采用蛋白质组学和转录组学技术对牛支原体感染BMDMS后检测其胞内蛋白变化,并进行差异蛋白筛选、功能分析、信号通路分析及凋亡和抗原加工递呈相关蛋白差异性分析。结果显示,牛支原体感染BMDMS后可以抑制凋亡蛋白BAX的下调和促进BCL-2凋亡抑制蛋白合成进而抑制牛外周血单核巨噬细胞的凋亡,促进细胞的存活;CDK9的显着上调和NELF的下调促进了BCL-2的持续性转录和翻译;牛支原体可以通过抑制依赖Caspase的细胞凋亡途径抑制BMDMS的凋亡;钙离子水平和细胞色素C变化无差异,再次证明了牛支原体可以通过抑制BAX和Caspase8介导的内质网通路和线粒体通络,进而抑制细胞凋亡;AIF的显着性下调抑制了 DNA片段化。CapG蛋白显着下调,影响了 BMDMS的移动,进而影响BMDMS分泌MHCⅡ。BOLA-DR蛋白量下调,HLA-DM蛋白量显着下调,CD74/Ii链含量显着下调,说明了牛支原体可以抑制BMDMS对牛支原体的加工和递呈作用逃逸宿主细胞的杀伤进而使牛支原体可以在宿主细胞存活。Nramp1蛋白显着下调,进而影响了巨噬细胞对病原微生物的杀伤性进而使牛支原体病原可以在其胞内持久存活。
刘星丽[5]（2020）在《家禽支原体和滑液囊支原体的分离鉴定和基因组序列分析》文中研究指明支原体种类繁多,能够感染禽类的支原体至少有28种。大多数支原体属于条件性致病菌,仅有少数支原体可导致禽类发病。支原体单独或混合感染不仅可导致家禽产生慢性呼吸道病、关节炎和气囊炎等,而且还可导致禽类生长发育不良、生产性能降低等,产生十分严重的经济损失。本研究从发生呼吸困难的孔雀和发生瘫痪的商品肉鸡分别分离出两种不同的支原体,进行了病原学鉴定、诊断方法建立和全基因组测序研究。现汇报如下:1.支原体的分离鉴定、生物学特性和16S rRNA基因系统发育分析（1）孔雀源支原体按照常规方法对发病孔雀进行支原体的分离和纯化、形态学鉴定和生理生化实验,进行了16S rRNA基因测序,结果分离出一株家禽支原体（Mycoplasma gallinaceum,MGC）,与家禽中常见的鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）和滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）同属于支原体科、支原体属,但为不同的种,命名为Peacock20181011。该菌生长速度较快,经过23次纯培养后,液体培养1220 h即可观察到培养基颜色由红变橙黄,而MG和MS等其它支原体一般在4872 h才发生颜色的改变。结合16S rRNA基因测序分析显示,该菌与MGC经典模式菌株NCTC10183（LR214950）的相似性为99.8%,而与家禽经典菌株MG、MS的相似性仅为73.9%和88%。综合比较显示,该菌株是一株MGC新菌株。致病性研究表明,该菌株不会引起SPF鸡病变,不会致死鸡胚,但可引起鸡胚发育迟缓以及爪部蜷缩等病变,具有一定的鸡胚致病性。最小抑菌浓度实验（minimum inhibitory concentration experiment,MIC）结果显示该菌对单硫酸卡那霉素和氟苯尼考等6种药物敏感,为临床该病的治疗用药提供了依据。（2）肉鸡源支原体利用常规的支原体分离鉴定方法从发生瘫痪的肉鸡关节液中分离出一株支原体,该菌株与MS模式菌株WVU1853高度同源,16S rRNA基因相似性为98.5%,而与MGC、MG、鸡支原体和火鸡支原体的相似性分别为92.8%、77.4%、89.5%和90.1%。结合理化特征和16S rRNA基因序列同源性,确定新分离菌株属于MS,命名为WF2018。鸡胚接种试验表明,MS可以致死SPF鸡胚,引起鸡胚发育迟缓,致病性明显强于MGC。MIC结果则与MGC相同。2.建立了检测MGC的PCR方法和针对MS的LAMP方法（1）PCR诊断利用Primer 5软件,针对MGC 16S rRNA基因序列具有种属特异性的高保守区段,设计1对PCR引物,进行了PCR反应温度优化、特异性和灵敏度评估。结果表明,其反应最佳退火温度为52℃,最小检测剂量为1.07 pg/μL,且与MG、MS和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）等无交叉反应,具有较好的特异性和灵敏度,适合于临床MGC的快速诊断。（2）LAMP通过Primer Explorer V5软件,针对MS VLHA基因具有种属特异性的高保守区段设计LAMP引物,并进行反应条件优化。结果表明,LAMP反应的最佳温度为63℃,扩增时间为60 min,最低检测的剂量为807 fg/μL,且与MG、MGC和A.laidlawii等反应阴性,为MS的特异性诊断提供了方法。3.分离株的基因组序列测定和功能分析利用二代和三代测序技术,分别对Peacock20181011和WF2018进行了全基因组测序,并进行基因组成分和功能分析。（1）Peacock20181011菌株该菌株基因组全长为1 183 913 bp;预测有898个基因;含有非编码RNA（non coding RNA,ncRNA）46个,其中5S rRNA 3个拷贝,16S rRNA和23S rRNA各4个拷贝;（G+C）mol%含量为28.7%。该菌与MGC菌株模式菌株NCTC10183和南非流行株B2096 8B在基因组方面存在一定的差异。对Peacock20181011基因组进行了COG和GO数据库注释,发现其功能基因较多;同时,进行了KEGG数据库比对,预测了其代谢通路,发现该菌株具有较为完整的糖酵解/糖异生代谢途径。数据库比对显示,含有20个毒力基因和2个四环素耐药基因。（2）WF2018菌株该菌株基因组全长为809 346 bp;预测有743个基因;含有48个ncRNA,其中含有3个拷贝5S rRNA,16S rRNA和23S rRNA各有2个拷贝;（G+C）mol%含量为28.36%。该菌与MS模式菌株NCTC10124和我国地方流行株HN01等基因组信息相似。同MGC基因组分析方法相同,对该菌株进行了COG、GO和KEGG等数据库比对分析,发现该菌株与经典菌株GX11-T的蛋白功能分类和部分代谢通路存在一定的差异。数据库比对显示,共有67个毒力基因,其中54个为VLHA,还预测到该菌株有8个抗生素抗性基因,319和631号基因与氟喹诺酮抗生素抗性相关,707号基因与利福霉素的耐药性相关。
郭荣显[6]（2019）在《鸡白痢沙门菌致病多样性及DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用》文中指出鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种急性、全身性传染病,是严重危害我国禽养殖业发展的常见性疫病。通常,鸡白痢沙门菌以侵害21日龄以内雏鸡为主,以白色下痢为致病特征,发病率和死亡率相对较高。成年种鸡多呈慢性或隐性感染,表现为无症状带菌,然而可以经过种蛋将病原垂直传播给子代导致孵化率和出雏率的降低。近年来,我国鸡白痢沙门菌的流行呈现新的特点,引起的感染表现出鸡群易感日龄增加以及临诊病型多样的趋势,其中以关节肿胀、跛行等为主要症状的关节炎致病型的疫情具有蔓延态势。鸡白痢既能水平传播又能垂直传播的流行特点,为其防控增添了难度。种群净化是控制鸡白痢的根本措施。然而,就目前我国养鸡业的现状而言,产业分散、饲养模式多样、管理水平参差不齐、鸡白痢疫情多发,检疫淘汰的策略实际操作起来成本过高,短期内尚无法广泛实施。在外界的关注和呼吁下,家禽养殖过程中抗生素的使用也正逐步减少。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》提出,要结合实际情况制定实施种鸡场沙门菌病净化方案。根据我国养鸡业现状和长期以来对鸡白痢防控措施的探索,制定控制鸡白痢的方法应该取决于一个地区的感染水平。感染水平低或可实施检疫淘汰的地区可采取血清学检测和扑杀阳性鸡的手段进行净化,感染水平高或者无法进行淘汰扑杀的地区则考虑使用疫苗免疫和种群净化结合的综合防制措施。相较于灭活疫苗、菌影疫苗和亚单位疫苗等,减毒活疫苗免疫途径及诱导产生的免疫应答反应多样,能提供更有效的免疫保护。传统的疫苗免疫雏鸡后刺激产生的抗体与野生型细菌感染所产生的抗体无法区分,干扰沙门菌血清监测程序的正常实施。DIVA疫苗具有区分感染和免疫动物（Differentiationof Infected and Vaccinated Animals）的特征,应用于畜禽疫病的预防控制更显重要意义。沙门菌的血清监测主要依靠于检测动物针对细菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）产生的抗体,玻板凝集试验是目前国内外广泛用于鸡白痢检疫诊断的方法。O-特异多糖（即O-抗原）由重复的寡糖单位呈链状结构排布于LPS最外层,是沙门菌的重要毒力因子,与致病性密切相关,参与维持细菌稳态、抵御环境压力、信号识别、黏附和定殖等。缺乏O-特异多糖链的LPS称为粗糙型LPS,含有一定数量或完整O-特异多糖结构的LPS称作光滑型LPS。沙门菌光滑型和粗糙型菌株之间无血清学交叉反应,因此,LPS是构建鸡白痢沙门菌DIVA疫苗合适的选择靶标。本文对致关节炎鸡白痢沙门菌的病原学及致病特征进行研究,以雏鸡感染模型成功复制出关节炎症状;证明了鸡白痢沙门菌O-特异多糖的致病作用;构建了 7个LPS合成相关基因突变株,从中筛选出具有理想的减毒效应、免疫保护力和DIVA特性的疫苗候选株S06004△spiC△rfaL,并对其进行了系统的疫苗评价。1.致关节炎鸡白痢沙门菌的分离鉴定与致病特征从表现有关节肿胀或破行等临床症状的病死鸡关节组织中分离鉴定鸡白痢沙门菌,对分离株进行抗生素耐药性、生物膜形成能力、CRISPR分子分型和毒力等分析,建立雏鸡感染模型复制关节炎症状,同时,利用全基因测序和比较基因组学的方法,分析致关节炎鸡白痢沙门菌的基因组特征。结果显示,关节组织中分离到的5株沙门菌经生化鉴定和血清型分析均为鸡白痢沙门菌。分离株对氨苄青霉素、链霉素和萘啶酮酸普遍耐药,对卡那霉素、氯霉素庆大霉素和呋喃妥因等抗生素较敏感。5株鸡白痢沙门菌的CRISPR间隔序列相同,CRISPR1 位点上依次为 Ent1、Ent2 和 Ent3,CRISPR2 依次为 EntBO、GallB1、GallB2、EntB8和EntB9var2,属于我国鸡白痢沙门菌CRISPR聚类分析中的最大分支。致关节炎鸡白痢沙门菌分离株具有较强的生物膜形成能力和鸡胚致死能力,对1日龄雏鸡的LD50在1.7×107CFU～7.2×107CFU之间。通过雏鸡致病模型,成功复制出关节炎症状,多数病例表现为一侧或两侧跗关节及周围组织肿大,逐渐发展为跛行、站立或行走困难。剖检病变可见跗关节明显肿胀,触之柔软有波动感,腱鞘略微肿大,关节腔内有淡黄色、清亮渗出液。组织病理切片主要表现为肝脏局部有坏死灶和炎性细胞浸润,脾脏淋巴细胞减少、坏死,有异嗜性粒细胞浸润等。致关节炎鸡白痢沙门菌在感染雏鸡的肝脏、脾脏、盲肠和跗关节腔等组织中均有分布。分离株的基因组长度为4855288 bp,核苷酸GC含量为52.1%,共注释到5006个基因。通过比对沙门菌MLST分型的管家基因序列,确定5株鸡白痢沙门菌的ST型均为ST92。鸡白痢沙门菌关节炎致病型菌株与白痢致病型菌株S06004基因组差异分析表明,两种致病型菌株同源性极高,存在46个非同义突变的ORF以及2213个单核苷酸多态性位点。以上结果为致关节炎鸡白痢沙门菌的病原学特征、分子致病机制和防控措施等方面的研究奠定了基础。2.鸡白痢沙门菌O-特异多糖的致病作用利用λ-Red同源重组技术敲除编码O-抗原连接酶的waa（同rfaL）基因,构建鸡白痢沙门菌S06004AwaaL::cat缺失株,对其生物学特性进行研究。缺失株与沙门菌09单因子诊断血清不发生凝集反应,而吖啶橙凝集为阳性,LPS结构不完整,O-特异多糖链缺失。鸡白痢沙门菌O-特异多糖的缺失,会影响细菌群体之间的凝集效应,缺失株表现出明显的自凝集现象。在酸性（pH 5.0）培养条件下,O-特异多糖的缺失影响鸡白痢沙门菌分泌蛋白的表达。LPS结构的完整性对于鸡白痢沙门菌抵抗蛋清和血清杀伤作用至关重要,O-特异多糖的缺失增强了细菌对蛋清和血清的敏感性。鸡白痢沙门菌waaL基因缺失后,细菌对DF-1细胞的黏附能力显着降低。通过鸡胚致死性试验,发现缺失株对12日龄鸡胚的致死性显着降低,在肝脏、脾脏、尿囊液和羊膜液中的定殖量明显低于野生株,表明O-特异多糖是鸡白痢沙门菌感染鸡胚和胚内定殖的关键毒力因子。与野生株相比,S06004△waaL::cat的LD50提高了近100倍,说明鸡白痢沙门菌O-特异多糖对于雏鸡是重要的致病因素。这些发现为进一步认识鸡白痢沙门菌的致病性和垂直传播的特征,制定合理的防控策略以及开发有效的疫苗提供了依据。3.鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因的缺失对毒力和免疫原性的影响为获得鸡白痢沙门菌粗糙型LPS突变株,研究不同结构的LPS对细菌生长、免疫原性、安全性和DIVA特性的影响,本部分利用λ-Red同源重组技术,缺失鸡白痢沙门菌rfaL、rfaJ、rfaI、rfaH、wzy、wzzB和fepE等基因,对其LPS结构进行定向改造,构建不同糖链结构或长度的突变株。其中,鸡白痢沙门菌S06004△spiC△rfaL::cat、S06004△spiC△rfaJ::cat、S06004△spiC△rfaH::cat、S06004△spiC△rfaI::cat和S06004△spiC△wzy::cat等缺失株的核心多糖或O-特异多糖的合成受阻,符合粗糙型LPS的特点。以上5个LPS合成相关基因的缺失均未引起鸡白痢沙门菌生化特性的改变,对生长速率也无显着影响。粗糙型鸡白痢沙门菌缺失株对鸡胚的毒力显着降低,对1日龄雏鸡的LD50与野生株相比均提高了 400倍以上。鸡白痢沙门菌粗糙型缺失株接种雏鸡后,在感染初期,S06004△spiC△rfaJ和S06004△spiC△rfaI在组织中的定殖量略低于其他3株。缺失株在肝脏中的定殖周期维持在21 d左右,在脾脏中维持约28d,随后即被机体清除。粗糙型突变株免疫组雏鸡经S06004攻毒后存活率均为 100%,S06004AspiC△rfaL、S06004△spiC△rfaH和 S06004△spiC△wzy 同时具有良好的对鸡伤寒沙门菌的交叉保护能力。LPS结构充分截短的缺失株（△rfaL、△rfaJ、△rfaI与△rfaH）接种雏鸡后,血清与检测抗原不发生凝集反应,S06004△spiC△wzy免疫组所制备的血清与检测抗原混合后有微弱的凝集颗粒。通过毒力、免疫保护效力和DIVA特征等方面综合评价,所构建的LPS合成相关基因缺失株中,S06004△spiC△rfaL::cat和S06004△spiC△rfaH::cat可作为疫苗候选株进一步评价。4.鸡白痢沙门菌DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用利用重叠延伸PCR（SOEing PCR）和自杀性质粒介导的同源重组技术,成功构建了无痕敲除rfaL基因的鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004△spiC△rfaL。疫苗株具有良好的遗传稳定性,传代后其生物学性状未发生改变,基因回复突变或毒力返祖的能力完全丧失。鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004AspiC△rfaL在干燥、缺乏营养的不利条件下持续生存能力显着降低,对紫外线暴露、氧应激、NaOH和消毒剂的敏感性增强,表明疫苗被接种动物排泄后更容易从环境中清除,具有良好的环境安全性。通过观察不同接种剂量的雏鸡反应,发现疫苗候选株以低于108CFU的免疫剂量接种雏鸡具有绝对的安全性。利用“seederchick”模型,对鸡白痢沙门菌疫苗株S06004△spiC△rfL的水平传播能力进行评估,结果表明,与野生株S06004相比,疫苗株在鸡群中的水平传播能力较低。疫苗接种不影响雏鸡生长,在免疫14 d以后,免疫组雏鸡的抗体水平持续增高,显着高于对照组（P<0.01）,表明鸡白痢沙门菌疫苗株S06004AspiC△rfaL能诱导雏鸡产生良好的体液免疫应答。通过细胞增殖ELISA定量分析,疫苗株免疫后第21 d,鸡外周血淋巴细胞增殖的SI值（3.197±0.068）显着高于对照组（1.05±0.1）。而且疫苗接种组CD4+和CD8+T细胞的相对数量均显着增加,与对照组相比,分别提高约2倍和1.5倍。以上说明,疫苗株能够刺激机体产生显着的细胞免疫应答。雏鸡攻毒保护试验表明,疫苗不仅具有理想的针对不同致病型鸡白痢沙门菌感染的保护效力,还具有针对鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的交叉保护能力,同时免疫雏鸡后能有效地诱导机体清除强毒菌株的感染和定殖。疫苗株缺失的spiC基因和rfaL基因可作为分子鉴别标记,通过PCR与野生株菌株区分。鸡白痢沙门菌疫苗候选株S06004△spC△rfaL缺少O-抗原结构,雏鸡免疫后血清不与鸡白痢鸡伤寒多价染色抗原发生凝集反应,通过简单易行的血清玻板凝集试验,即可有效区分疫苗免疫雏鸡和野生菌感染雏鸡,表现出显着的DIVA特征。
张志恒[7]（2019）在《骨关节炎损伤机制及Ⅱ型胶原代谢产物浓度变化的研究》文中研究说明骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常发生于老年动物的慢性、退行性骨关节疾病,也称退行性关节炎、增生性关节炎。它以软骨渐进性变性、软骨边缘骨赘形成及软骨下骨重塑为特点。主要临床表现为关节肿胀、慢性疼痛、僵硬且活动受限。OA常发于老龄动物,膝关节是骨关节炎最常波及的关节。兽医临床工作中,OA的确诊通常基于影像学检查（如X线片）和临床症状,但目前仍缺少可有效诊断OA的生物标志物。先前研究多集中于某一时间点的单一标志物,并没有对OA中这些标志物的变化趋势进行研究。因此,本研究分为离体试验、在体试验和临床试验三个部分,以SD大鼠和奶牛为研究对象,研究OA软骨损伤机制及骨关节炎发病过程中PⅡCP、CTX-Ⅱ和C2C生物标志物浓度变化。为筛选OA分子标志物提供理论依据,以实现OA病情的评估及早期诊断,为奶牛OA快速诊断技术提供理论基础,增加生产性能。本试验通过体内外方法模拟OA发生。离体试验使用14-24 d幼鼠进行软骨培养,试验前对细胞进行饥饿处理,使其同步化。之后,加入IL-1β处理软骨细胞0 h、12 h、24 h和48h诱导炎症模型模拟离体OA。通过Western-blot方法检测NF-κb信号转导通路及基质降解相关产物MMP-3、MMP-13、iNOS、p65和p-p65的蛋白变化;免疫荧光法检测p65核转位;生化试剂盒检测NO的浓度;使用ELISA方法检测细胞培养上清中Ⅱ型胶原相关分子标志物（CTX-Ⅱ、C2C和PⅡCP）含量变化趋势,探究OA时软骨损伤机制并初筛变化显着指标。在体试验分为两组,假手术组（Sham组）仅切开关节囊后缝合,手术组（ACLT组）切开关节囊后切断前十字韧带。两组于术后0、2、4、6、8、10周采样,取右后肢胫骨用于制作病理组织学、番红O切片;取血清,用于检测血清CTX-Ⅱ、C2C、PⅡCP的浓度。应用试验完达山奶牛场奶牛,进行跛行分级后分成两组:正常组和OA组,取血清检测CTX-Ⅱ、C2C、ⅡCP的浓度含量变化。使用Spearman方法分析标志物与疾病严重的的相关性,使用ROC曲线分析标志物对于诊断OA的价值。结果发现:1.IL-1β可以诱导NF-κb通路激活,继而引起软骨细胞产生炎症反应。2.软骨细胞产生炎症反应时,NF-κb通路的激活可以诱导MMP-3、MMP-13、iNOS的表达增加,使CTX-Ⅱ和C2C的浓度增加,导致细胞外基质发生破坏。3.ACLT模型中,随时间延长软骨基质破坏加重,血清CTX-Ⅱ和C2C的浓度也增加,且软骨OARSI评分变化与CTX-Ⅱ和C2C的浓度趋势存在相关性。4.ROC分析结果显示,CTX-Ⅱ和C2C诊断牛OA的AUC值较高,诊断价值较大。试验结果表明:IL-1β刺激软骨细胞后,NF-κb通路被激活,诱导通路下游联级反应,造成软骨损伤,导致Ⅱ型胶原降解增加。而且,ACLT大鼠血清中C2C和CTX-Ⅱ的浓度随软骨损伤程度加重而增加,其可作为诊断OA的潜在分子标志物;此外,OA牛血清中C2C和CTX-Ⅱ的含量也较正常增加,对于诊断奶牛OA价值较大。
石晓磊,齐田苗,边海霞,周云锋[8]（2018）在《宁夏地区鸡滑液囊支原体的分离鉴定与药敏试验》文中研究说明鸡滑液囊支原体是除鸡毒支原体之外另一种引起家禽疾病的重要支原体病原,由于传染性极强,疫苗免疫效果欠佳,近几年给国内外养禽业带来了很大的危害。2017年初,宁夏地区发现鸡滑液囊支原体病疫情,在宁夏发病地区采集了87份疑似感染鸡的病料,分离得到13株滑液囊支原体,每个分离地随机挑选1株进行了抗菌药物的敏感性试验。结果表明,3株滑液囊支原体均对泰万菌素、泰妙菌素、泰乐菌素敏感,而对氟苯尼考和恩诺沙星有一定的耐受性。研究结果对该地区滑液囊支原体病的治疗用药提供了参考。
孙石开[9]（2018）在《本地品种鸡传染性关节炎的病因鉴定、流行病学分析及防控技术研究》文中研究表明2010年,一种传染性关节炎疾病首先在广东和广西两省的本地品种肉鸡中爆发,随后逐步蔓延至全国十余个省、市,给我国养禽业带来了数亿元的经济损失。为系统深入地掌握该病的病因和流行特点、探究有效的防控措施,本研究开展了病原分离鉴定、流行病学分析、疫苗和药物防控研究等工作,结果如下。（一）本地品种鸡传染性关节炎病原鉴定与流行情况分析对来自16个省、市的本地品种肉鸡养殖场和种鸡场的18063份滑液囊分泌液拭子、1688份血清和215份患病鸡腿等样品进行分析后发现,滑液囊分泌液拭子Mycoplasma synoviae（M.synoviae）阳性率为96.31%,发病鸡只血清中M.synoviae阳性率为69.57%-95.16%,从215份患病鸡腿样品中分离的110株M.synoviae感染SPF鸡后,复制出典型的临床症状。研究结果表明,引起上述传鸡染性关节炎的主要致病原为M.synoviae。M.synoviae是引起鸡和火鸡出现急性或慢性传染性关节炎的一种重要病原。中国本地品种鸡中M.synoviae感染的流行病学特点表现为:1.种鸡场不同日龄群中M.synoviae感染具有普遍性,蛋传率高:8-29周龄鸡群抗体阳性率7%-97%不等;30周龄后鸡群抗体阳性率高达100%;7～9日龄的鸡胚核酸检测阳性率平均16.14%,最高阳性率可达36.8%。2.M.synoviae感染鸡体后抗体反应缓慢,呈现周期性排毒,水平传播能力强:1日龄雏鸡体内可同时检测到M.synoviae抗原和母源抗体,1日龄鸡群中10%的鸡只感染M.synoviae后鸡群中免疫产生的抗体初见于50日龄左右,100日龄抗体阳性达到100%;10-70日龄,鸡只带毒率为10-80%,呈现周期性升高的趋势。3.M.synoviae在中国流行范围广,本地品种鸡易感:流行病学数据分析发现,2010～2015年,在广东、广西、福建、浙江等16省均出现鸡M.synoviae感染和发病,共9773群鸡发病,超过1000万只鸡被淘汰;十多个本地品种鸡对M.synoviae易感,防控压力较大。4.种鸡抗体水平影响M.synoviae在子代肉鸡的水平传播和繁殖速度:对三个品种分析发现,竹丝鸡种鸡抗体水平最低、胚蛋感染率最高,子代肉鸡抗体呈现阳性最早、转阳性率最高;清远麻种鸡抗体水平最高、胚蛋感染率接近竹丝鸡,但子代肉鸡抗体呈现阳性最晚、抗体转阳性率最低。（二）鸡M.synoviae中国分离株遗传进化及其致病性测定将本研究中110株M.synoviea分离株和国外分离株vlhA基因76～421 nt区域推导氨基酸序列进行比对,结果发现共有6处区域存在明显的差异。遗传进化分析结果显示,绝大部分分离株属于新的K亚群,6个小分支,番鸭分毒株与疫苗株MS-H同属E基因亚群。K亚群不同毒株存在致病力差异,但不同分支分离株致病力差异无规律性。将M.synoviea分离株体外连续传代至70～77代后发现,各实验株VllhA蛋白序列均出现了不同程度的突变,突变集中在161～240、321～400位氨基酸区域。分离株QZ-ZZX的vlhA蛋白70～200位氨基酸区域130个氨基酸缺失后,致病力下降60%,说明此区域氨基酸与致病力存在密切关系。（三）鸡M.synoviae疫苗研制及免疫效果评估本研究研制出M.synovia 灭活疫苗,确定肌肉注射方式为免疫后保护效果评估的攻毒模式、HN03为灭活疫苗株、20和41日龄（0.3 mL/只/次）两次免疫为最佳的免疫程序,证实免疫灭活疫苗的SPF鸡、本地品种鸡对M.synoviae感染有不同程度的保护力（存在品种差异）。试验鸡接种两次灭活疫苗后,抗体水平维持在抗体阳性率≥60%、抗体滴度均值≥5000状态大约10周左右,通过加强免疫可迅速提升免疫鸡群的抗体水平。本地品种种鸡免疫后,其携带M.synoviae母源抗体的子代小鸡可以有效抵抗M.synoviae野毒的侵袭,抗体滴度越高,保护效果越显着,但是携带母源抗体的SPF小鸡抗M.synoviae侵袭能力相对较低。研究表明,本研究研制的灭活疫苗可以为免疫鸡及其子代提供保护力,抵抗M.synoviae野毒侵袭,但不能完全清除M.synoviae的影响。本研究还评估确定:0.2×104EID50传染性支气管病毒株IBV-GX与107 CCU M.synoviea分离株QZ-ZZX为MS-H疫苗免疫后最佳的共感染评估模型;免疫MS-H疫苗的鸡群人工感染M.synoviea可获得100%保护;临床应用MS-H疫苗免疫超过124万只本地品种肉鸡群,其群发病率和群内发病率相对未免疫鸡群分别降低了 20%和1.62%,本地品种肉鸡免疫MS-H可获得对M.synoviea感染的保护力。（四）鸡M.synviae药物防治效果评估·体外药敏测定结果显示,2012-2015年M.synoviae分离株对金霉素、泰万菌素、泰乐菌素、泰妙菌素、林可-大观霉素、多西环素等药物较为敏感,但对土霉素和诺氟沙星耐药性明显。鸡只感染M.synoviae后饲喂含金霉素饲料,只能延缓实验鸡只的发病时间（1-3天）,但对感染结果无实质性影响;鸡只饲喂金霉素（150ppm）后感染M.synoviae,可延缓实验鸡发病、降低发病率,但不同毒株存在很差异;种鸡周期性饲喂含金霉素（400 ppm）和泰万菌素（50ppm）的饲料后,M.synoviae在鸡群体内生长繁殖受到有效抑制,药物防控时间越早、效果越明显。研究表明,药物防治可以降低M.synviae感染和发病率,适合作为M.synviae预防措施。（五）鸡M.synoviae综合防控措施应用评估本研究根据研究结果制定了一套M.synviae防控方案,并在全国16个M.synoviae感染高发的省（市）推广、应用和验证,结果收到良好的应用效果:M.synoviae感染发病的临床病例从2013年最高时的4500群,快速下降到2015年的不足1000群,月群内发病率超过1%的群数从2013年最高的300群减少到2015年不足50群。结果表明,通过采取本研究制定的综合防控措施,2013-2015年16个省应用养殖场M.synviae感染发病群数减少80%,发病情况得到有效控制。
吴宁[10]（2018）在《磷酸替米考星的体内外药效学、一般药理学及其对靶动物猪的安全性研究》文中研究指明替米考星是畜禽专用大环内酯类抗生素,具有极强的抗菌能力,耐药性低,抗菌谱广,对全部革兰氏阳性菌、部分革兰阴性氏菌、支原体、螺旋体均有抑杀作用,用于治疗猪、鸡、羊、奶牛等的感染疾病。但因其具有难溶于水、味苦等适口性差等特点,该药物的临床应用一直存在局限性。猪支原体肺炎是一种发病率高、死亡率低的慢性疾病,由猪肺炎支原体引起,临床症状主要为慢性喘气、干咳。继发感染其他病原体时,动物会出现食欲不振、发热、呼吸困难及机能衰竭等症状。在不同日龄的同圈猪之间,该病可以互相传染,导致猪体增重率降低、死亡增加、饲养效率低和医药成本增加,经济损失巨大。为更好的适应市场需求和便于临床应用,替米考星的化学结构上增加磷酸基团可有效增加其水溶性。为了客观评价宁夏泰瑞制药有限公司所研制的磷酸替米考星原料药及其制剂10%磷酸替米考星可溶性粉对猪支原体肺炎的体内、外临床治疗效果及其对实验动物安全药理学特点和对靶动物猪的安全性,我们进行了本研究。本试验采用96孔板进行倍比稀释的微量稀释法客观比较了磷酸替米考星、替米考星、泰乐菌素和泰妙菌素等4种抗生素对9种畜禽常见病原微生物的体外抑菌活性,即最小抑菌浓度（MIC）。试验结果显示,磷酸替米考星对猪肺炎支原体与鸡毒支原体的MIC分别为0.3125 μg/mL和0.0049 μg/mL,表现出较强抑菌活性;对猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等临床致病菌的MIC也均在0.0049-2.5μg/mL之间,抑菌活性良好;与其他受试抗生素相比,磷酸替米考星具有更强或相当的抑菌活性。与主要对照药物替米考星相比,磷酸替米考星的水溶性更强、便于饲喂给药。试验表明,磷酸替米考星对受试病原微生物（支原体、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）抑制效果良好,且对部分病原的效果优于替米考星,可用于治疗上述敏感菌所致的畜禽疾病。本试验评价了 10%磷酸替米考星可溶性粉对人工感染猪支原体肺炎的治疗效果。首先建立了人工感染猪支原体的肺炎模型,通过观察试验猪的死亡率、治愈率、有效率、增重效果、感染仔猪的肺部病变等级,评估不同剂量10%磷酸替米考星可溶性粉对人工感染猪支原体肺炎病猪的治疗效果。研究显示,100 mg/L10%磷酸替米考星溶性粉显示出明显地对猪肺炎支原体引起的支原体肺炎的治疗效果,但60-80 mg/L剂量通过饮水口服途径即已显示出良好治疗效果,并且使用60-80 mg/L剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉治疗效果与市售替米考星可溶性粉（10 g/0.1 kg,75 mg/几水,以替米考星计）相当。同时,10%磷酸替米考星可溶性粉还具有缓解患猪增重减慢的作用。试验表明,60-80 mg/几剂量可作为10%磷酸替米考星可溶性粉治疗猪支原体肺炎的推荐使用剂量。而与替米考星相比,增加了磷酸基团的磷酸替米考星显着增强了其水溶性,因此10%磷酸替米考星可溶性粉在临床使用中会更加便捷。为进一步确定10%磷酸替米考星可溶性粉对猪肺炎支原体的治疗效果、临床应用剂量、治疗时间等使用相关问题,在前述人工猪支原体肺炎模型基础上,本试验通过检测各组受试猪的死亡率、治愈率、有效率、增重效果、感染仔猪的肺部病变评分以及相关生理生化和尿液等相关指标,进行了 10%磷酸替米考星可溶性粉对猪肺炎支原体病的临床治疗试验。结果显示,10%磷酸替米考星可溶性粉100 mg/L、80 mg/L、60 mg/几剂量组对猪支原体肺炎均具有良好的治疗效果,显着降低患病猪肺脏的实变评分,且与对照组10%替米考星可溶性粉药物的治疗效果相当。饲喂10%磷酸替米考星可溶性粉可以改善受试猪的相对增重效果。以100 mg/几水-60 mg/几水的剂量对猪只使用10%磷酸替米考星可溶性粉,不显着影响受试猪的血常规指标、血液生化指标和尿常规指标,使用于试验动物猪是安全的。由此可见,在临床上使用60-80 mg/几水剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉治疗猪支原体肺炎是安全且有效的。在经过实验室的治疗试验和II期临床试验基础上进行该III期临床试验,以进一步验证10%磷酸替米考星可溶性粉对仔猪自然感染猪肺炎支原体病的治疗效果,为其在家畜疫病防治中的推广应用提供临床依据。本研究在自然感染猪支原体肺炎的病猪上,通过检测各组受试猪死亡率、治愈率、有效率、增重效果、感染仔猪的肺部病变评分等指标,进行了 10%磷酸替米考星可溶性粉治疗猪肺炎支原体病的III期临床试验。结果显示,80 mg/几剂量组10%磷酸替米考星可溶性粉对猪支原体肺炎的治疗效果明显好于60 mg/几剂量组和10%替米考星可溶性粉对照药物组;但各治疗组的治疗效果相当。10%磷酸替米考星60-80 mg/几对猪支原体肺炎自然发病猪群饮水饲喂治疗1周,能显着改善猪群的生长速度,且效果好于相同含量的替米考星,但和健康猪群相比仍有很大差距。10%磷酸替米考星可溶性粉60-80 mg/几剂量组、10%替米考星75 mg/L对照组可明显降低猪支原体肺炎自然发病猪肺脏病变变程度。由上述结果可以看出,60-80 mg/几剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉饮水治疗猪自然感染肺炎支原体的效果显着,且治疗效果与治疗剂量成正比。本试验还探讨了 10%磷酸替米考星可溶性粉对家犬心血管系统、呼吸系统,小鼠神经系统和大鼠消化系统、泌尿系统的影响。结果表明,10%磷酸替米考星可溶性粉40 mg/kg、20 mg/kg和10 mg/kg三个剂量组和阴性对照组（蒸馏水）经十二指肠给药后180 min内,受试麻醉犬各剂量组各时间点血压、呼吸频率、呼吸幅度及各项心电图指标给药前后自身对照,无显着性统计学意义（P>0.05）。表明该药在试验剂量范围内对犬心血管与呼吸系统都没有显着影响。10%磷酸替米考星可溶性粉对小鼠神经系统影响的试验结果表明,240 mg/kg、120 mg/kg和60 mg/kg三个剂量组和阴性对照组（蒸馏水）灌胃给药后,均对小鼠耳壳血管及尾色泽无明显影响,各剂量组小鼠活动正常;该药对小鼠机能协调无明显影响;10%磷酸替米考星可溶性粉各剂量组与阈下剂量的戊巴比妥钠无协同作用,对小鼠自发活动没有明显影响（P>0.05）。10%磷酸替米考星可溶性粉对大鼠消化系统、泌尿系统影响试验的结果表明,120 mg/kg、60 mg/kg和3 0 mg/kg三个剂量组和阴性对照组（蒸馏水）灌胃给药后,除高剂量组显着升高大鼠血清总蛋白、白蛋白,中剂量组显着升高尿素氮外（其值仍在正常范围之内）,三个剂量组对大鼠胆汁分泌、肠推进、胃液分泌、尿常规、泌尿系统相关血清生化指标均无明显影响（P>0.05）。同时,为具体评估10%磷酸替米考星可溶性粉在靶动物猪上临床使用时的安全性,本研究以50头40日龄健康断奶姜曲海品系仔猪为试验对象,分别以1倍、3倍、5倍及10倍剂量该药物连续饮水给药21 d,检测喂服该受试药物前后试验猪的血常规、血生化、血凝、尿常规、料重比等指标以及组织病理学等指标的变化情况。结果表明,受试仔猪没有表现出明显不良症状,除10倍剂量受试猪的生化指标血清钙、肌酸激酶与空白对照组相比有极显着差异（P<0.01）外,其它各用药组受试猪的所有检测指标与空白对照组相比没有显着性差异或其测定值均位于正常值范围,未出现与用药明显相关的不良反应。说明10%磷酸替米考星可溶性粉毒性很小,受试猪体的耐受性高,至少以10倍推荐剂量连续饮水给药21 d对靶动物猪是安全的。另外,本试验补充了正常饲养的姜曲海品系仔猪血常规、血生化、凝血指标、尿常规、生长期的饲料报酬等方面的统计数据,为上述指标的进一步研究或者实际应用提供了参考依据。本研究证明,磷酸替米考星对支原体支原体、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果,60-80 mg/几水及以上剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉对人工感染和自然感染的猪肺炎支原体病有着良好的临床治疗效果,且建议将60-80 mg/几水作为推荐剂量,饮水口服,每日1次,连用7日。同时,本研究还表明,受试剂量的磷酸替米考星对实验动物的心血管系统、呼吸系统,小鼠神经系统和大鼠消化系统、泌尿系统均无明显的毒性作用,10倍推荐剂量的磷酸替米考星对靶动物猪的各项生理指标也是安全的。本研究为磷酸替米考星及其制剂10%磷酸替米考星可溶性粉的临床推广应用提供了有效的试验依据。
二、奶牛跗关节滑液的物理特性及细胞成分的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、奶牛跗关节滑液的物理特性及细胞成分的研究（论文提纲范文）
（1）滑液支原体亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）的原核表达及亚细胞定位（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌种，实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 MS基因组的粗提 |
| 1.4 MS fol D基因扩增 |
| 1.5 同源性分析 |
| 1.6 MS fol D基因优化 |
| 1.7 MS fol D表达载体的构建 |
| 1.8 重组蛋白的表达与纯化 |
| 1.9 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 1.1 0 MS MTHFD抗血清的制备 |
| 1.1 1 MS全菌、胞膜及胞浆蛋白的提取 |
| 1.1 2 MTHFD在MS细胞内的分布 |
| 1.1 2. 1 Western blot检测 |
| 1.1 2. 2 ELISA检测 |
| 1.1 3 免疫荧光试验 |
| 2.1 同源性分析 |
| 2.2 MS fol D基因的overlap PCR扩增 |
| 2.3 重组表达载体的构建 |
| 2.4 r MS MTHFD蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 2.6 多克隆抗体的制备 |
| 2.7 MTHFD蛋白在MS中的分布 |
| 2.8 免疫荧光实验 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）犬缺血性骨软骨病细胞凋亡与基质紊乱的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTACT |
| 缩略词表(ABBREVIATION) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 软骨 |
| 1.1 软骨的分类与组成 |
| 1.2 软骨的结构 |
| 1.3 软骨管 |
| 1.4 骨的形成 |
| 2 骨软骨病 |
| 2.1 骨软骨病的概况 |
| 2.2 骨软骨病的表征 |
| 2.3 骨软骨病的病因学 |
| 3 蛋白质组学 |
| 3.1 软骨相关疾病研究的蛋白质组学概况 |
| 3.2 软骨相关疾病研究的蛋白质组学技术发展 |
| 3.3 软骨及相关样品的蛋白质组学分析 |
| 4 本研究的内容、目的与意义 |
| 4.1 研究内容 |
| 4.2 研究目的与意义 |
| 第二章 缺血诱导犬骨软骨病 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要药品试剂 |
| 2.3 主要溶液及试剂的配制 |
| 2.4 试验动物及分组 |
| 2.5 血管阻断诱导犬骨软骨病损伤手术 |
| 2.6 术后护理 |
| 2.7 X线影像学检查 |
| 2.8 样本采集与处理 |
| 2.9 骨软骨病损伤组织学评估 |
| 2.10 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.11 拉曼光谱学分析 |
| 2.12 数据分析与处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 X线影像学观察 |
| 3.2 组织学评估 |
| 3.3 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 3.4 扫描电镜观察 |
| 3.5 拉曼光谱学分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 基于Label free蛋白组学技术的犬骨软骨病差异表达蛋白分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要溶液及试剂的配制 |
| 2.4 试验动物样品采集与编号 |
| 2.5 Label-free蛋白质组学分析 |
| 2.6 差异蛋白验证 |
| 2.7 数据分析与处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋白质浓度定量与SDS-PAGE电泳 |
| 3.2 酶解肽段浓度测定 |
| 3.3 蛋白质和肽段鉴定结果 |
| 3.4 鉴定蛋白与肽段的数据质控相关的统计图 |
| 3.5 蛋白生物信息功能注释分析 |
| 3.6 GO分析 |
| 3.7 KEGG分析 |
| 3.8 蛋白质互作网络分析 |
| 3.9 蛋白质组学验证 |
| 4 讨论 |
| 第四章 HtrA1 在犬缺血性骨软骨病中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 骺生长软骨细胞与软骨外植体的分离与培养 |
| 2.4 骺生长软骨细胞的形态观察 |
| 2.5 骺生长软骨细胞鉴定 |
| 2.6 细胞生长曲线的绘制 |
| 2.7 HtrA1 过表达载体构建与转染 |
| 2.8 Annexin V-FITC/PI双染色法检测凋亡细胞 |
| 2.9 荧光定量PCR |
| 2.10 Western-blot |
| 2.11 统计分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 骺生长软骨细胞的分离、培养与细胞形态的观察 |
| 3.2 骺生长软骨细胞鉴定结果 |
| 3.3 软骨细胞生长曲线的绘制 |
| 3.4 软骨细胞转染条件摸索 |
| 3.5 软骨细胞HtrA1 过表达验证 |
| 3.6 HtrA1 过表达诱导软骨细胞凋亡 |
| 3.7 HtrA1 过表达通过作用XIAP/caspase9/caspase3 通路诱导软骨细胞凋亡 |
| 3.8 HtrA1 过表达诱导软骨细胞基质变化 |
| 3.9 HtrA1 重组蛋白处理对软骨外植体的作用 |
| 3.10 拉曼光谱学分析 |
| 3.11 重组蛋白HtrA1 诱导软骨外植体凋亡与基质相关蛋白的变化 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）温度敏感型滑液囊支原体减毒株的培育与生物学特性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 鸡滑液囊支原体免疫防控技术进展 |
| 1 支原体感染对养禽业的影响 |
| 1.1 MG对养禽业的影响 |
| 1.2 MS对养禽业的影响 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 流行现状 |
| 2.2 一般规律 |
| 3 禽支原体感染的防控方法 |
| 3.1 净化 |
| 3.2 药物治疗 |
| 3.3 免疫接种 |
| 4 MG活疫苗研究进展 |
| 4.1 F株 |
| 4.2 6/85株 |
| 4.3 ts-11株 |
| 5 MS活疫苗研究进展与展望 |
| 5.1 ts~+菌株MS-H |
| 5.2 MS1 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 我国MS流行菌株的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 MS菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 MS的单菌落纯化 |
| 1.6 MS菌株致病性的比较 |
| 1.7 Shandong/2017-2最小致病量试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 MS的单菌落纯化 |
| 2.2 气管内接种攻毒试验 |
| 2.3 气囊内注射攻毒试验 |
| 2.4 Shandong2017-2最小致病剂量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 温度敏感型MS弱毒株的培育 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 鸡胚与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 MS菌株 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 1.5 ts~+菌株的培育 |
| 1.6 ts~+菌株毒力测定 |
| 1.7 免疫保护效力试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ningxia/2017-1子代菌株 |
| 2.2 ts表型测定 |
| 2.3 ts~+菌株对5周龄鸡的致病性 |
| 2.4 ts~+菌株对雏鸡的致病性 |
| 2.5 弱毒菌株的免疫保护效力 |
| 2.6 弱毒菌株接种后的抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（4）宁夏地区牛支原体分型鉴定及其对牛外周血单核巨噬细胞的功能影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛支原体的特性 |
| 1.2 牛支原体流行状况 |
| 1.3 牛支原体造成的经济损失 |
| 1.4 牛支原体的病程研究 |
| 1.5 病理组织学变化 |
| 1.6 牛支原体分型技术 |
| 1.7 巨噬细胞对牛支原体的作用 |
| 1.8 牛支原体对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 1.9 研究意义 |
| 1.10 技术路线图 |
| 第二章 宁夏地区牛支原体血清流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同年份不同地区牛支原体流行病学调查结果 |
| 2.2.2 宁夏地区不同年份间牛支原体流行病学调查分析 |
| 2.2.3 不同市牛支原体血清阳性率分析结果 |
| 2.2.4 2016-2018年不同县区牛支原体血清阳性率分析 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 宁夏地区近十年牛支原体多位点序列分型鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 牛支原体电镜鉴定 |
| 3.2.2 牛支原体分子生物学鉴定结果 |
| 3.2.3 65株宁夏分离菌株信息统计 |
| 3.2.4 牛支原体分离株的MLST分型结果 |
| 3.2.5 遗传进化树分析 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 不同ST型牛支原体病原感染牛单核巨噬细胞后凋亡及相关因子检测 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 牛支原体菌株鉴定及计数结果 |
| 4.2.2 牛外周血单个核细胞分离、活性、纯度检测及计数 |
| 4.2.3 不同ST型牛支原体侵入牛单核巨噬细胞后细胞凋亡检测 |
| 4.2.4 不同感染复数的牛支原体侵入牛单核巨噬细胞后活性氧检测 |
| 4.2.5 不同感染复数的牛支原体诱导下牛单核巨噬细胞相关细胞因子检测 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛支原体诱导下牛外周血单核巨噬细胞胞内蛋白差异性分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 蛋白浓度测定和SDS-PAGE结果 |
| 5.2.2 蛋白鉴定总览 |
| 5.2.3 质谱稳定性质控 |
| 5.2.4 样品重复性检验结果 |
| 5.2.5 蛋白差异表达分析 |
| 5.2.6 差异表达蛋白功能分类 |
| 5.2.7 凋亡相关蛋白统计分析 |
| 5.2.8 抗原加工递呈相关蛋白影响 |
| 5.2.9 差异表达蛋白PRM验证结果 |
| 5.3 分析与讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛支原体诱导下牛外周血单核巨噬细胞差异蛋白转录水平检测和分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 质量检测结果 |
| 6.2.2 转录组文库质量评估 |
| 6.2.3 测序数据及其质量控制结果 |
| 6.2.4 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 6.2.5 基因表达量分析 |
| 6.2.6 差异表达分析 |
| 6.2.7 差异表达基因功能注释和富集分析 |
| 6.2.8 凋亡相关蛋白转录水平统计分析 |
| 6.2.9 抗原加工递呈相关蛋白影响 |
| 6.2.10 荧光定量PCR验证差异表达基因结果 |
| 6.3 分析与讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 作者简历及论文发表情况 |
（5）家禽支原体和滑液囊支原体的分离鉴定和基因组序列分析（论文提纲范文）
| 中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 支原体 |
| 1.2 家禽支原体 |
| 1.3 滑液囊支原体 |
| 1.4 病原微生物的快速诊断 |
| 1.5 基因组研究进展 |
| 1.6 本研究的立题依据、研究内容及技术路线 |
| 第二章 支原体的分离鉴定、生物学特性研究 |
| 第1节 孔雀源支原体的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病料来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 孔雀源支原体的分离纯化 |
| 1.2.2 形态学鉴定 |
| 1.2.3 细菌L型鉴别 |
| 1.2.4 生理生化特性研究 |
| 1.2.5 致病性研究 |
| 1.2.6 药物敏感性 |
| 1.2.7 分子生物学鉴定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 分离纯化 |
| 1.3.2 形态学观察 |
| 1.3.3 细菌L型鉴别 |
| 1.3.4 生理生化特性 |
| 1.3.5 致病性 |
| 1.3.6 药物敏感性 |
| 1.3.7 分子生物学鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 肉鸡源支原体的分离鉴定和生物学特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要和仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 分离纯化 |
| 2.3.2 形态学观察 |
| 2.3.3 细菌L型鉴别 |
| 2.3.4 生理生化特性 |
| 2.3.5 致病性 |
| 2.3.6 药物敏感性 |
| 2.3.7 分子生物学鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 MGC PCR和 MS LAMP诊断方法的建立 |
| 第1节 MGC PCR诊断方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 支原体基因组的提取与含量测定 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 扩增体系 |
| 1.2.4 扩增程序 |
| 1.2.5 退火温度的优化 |
| 1.2.6 特异性测定 |
| 1.2.7 灵敏度的测定 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 退火温度 |
| 1.3.2 特异性 |
| 1.3.3 灵敏度 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 MS LAMP诊断方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 支原体基因组的提取与含量测定 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 反应体系 |
| 2.2.4 反应温度的优化 |
| 2.2.5 反应时间的优化 |
| 2.2.6 特异性测定 |
| 2.2.7 灵敏度的测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 反应温度 |
| 2.3.2 反应时间 |
| 2.3.3 特异性 |
| 2.3.4 灵敏度 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 Peacock20181011和WF2018 的全基因组测序分析 |
| 第1节 Peacock20181011 的全基因组测序分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株来源 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 基因组提取与检测 |
| 1.2.2 全基因组测序与组装 |
| 1.2.3 基因组组分分析 |
| 1.2.4 基因组功能分析 |
| 1.2.5 基因组圈图 |
| 1.2.6 共线性分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 基因组提取与检测 |
| 1.3.2 基因组组分分析 |
| 1.3.3 基因组功能分析 |
| 1.3.4 基因组圈图 |
| 1.3.5 共线性分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第2节 WF2018 全基因组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株来源 |
| 2.1.2 主要仪器试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组提取与检测 |
| 2.2.2 基因组测序与组装 |
| 2.2.3 基因组组分分析 |
| 2.2.4 基因组功能分析 |
| 2.2.5 共线性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 基因组提取与检测 |
| 2.3.2 基因组组分分析 |
| 2.3.3 基因组功能分析 |
| 2.3.4 基因组圈图 |
| 2.3.5 共线性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）鸡白痢沙门菌致病多样性及DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述一 鸡白痢沙门菌研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 基因组学 |
| 4 感染模型 |
| 5 致病与感染机制 |
| 6 检测诊断 |
| 7 预防控制 |
| 8 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 禽源沙门菌疫苗研究进展 |
| 1 血清型分布 |
| 2 鸡白痢/鸡伤寒沙门菌疫苗 |
| 3 肠炎沙门菌疫苗 |
| 4 鼠伤寒及其他血清型沙门菌疫苗 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第一章 致关节炎鸡白痢沙门菌的分离鉴定与致病特征 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡白痢沙门菌O-特异多糖的致病作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡白痢沙门菌LPS合成相关基因的缺失对毒力和免疫原性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡白痢沙门菌DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术成果目录 |
（7）骨关节炎损伤机制及Ⅱ型胶原代谢产物浓度变化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 骨关节炎概述 |
| 1.2 骨关节炎相关代谢改变研究进展 |
| 1.2.1 软骨细胞代谢的改变 |
| 1.2.2 胶原代谢的变化 |
| 1.2.3 软骨下骨的代谢改变 |
| 1.2.4 滑膜代谢改变 |
| 1.3 NF-κb信号通路、炎症与OA |
| 1.3.1 NF-κb信号通路概述 |
| 1.3.2 NF-κB通路与OA炎症 |
| 1.4 OA诊断概述 |
| 1.5 分子标志物与OA诊断 |
| 1.5.1 新表位分子生物标志物 |
| 1.5.2 神经肽类分子生物标志物 |
| 1.5.3 其他类型分子生物标志物 |
| 1.6 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验试剂及药品 |
| 2.1.3 试验设备 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.2.1 离体试验设计 |
| 2.2.2 在体试验设计 |
| 2.2.3 临床应用试验 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 软骨细胞分离与培养 |
| 2.3.2 软骨细胞鉴定 |
| 2.3.3 软骨细胞蛋白的提取和Western Blot |
| 2.3.4 NF-κB信号通路核转位检测 |
| 2.3.5 大鼠OA建模及样本处理 |
| 2.3.6 眼观评分、病理组织学检查及牛跛行评分标准 |
| 2.3.7 培养液及血清中试验指标的测定 |
| 2.4 数据统计和分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 软骨细胞培养形态学观察及鉴定 |
| 3.1.1 软骨细胞形态学观察 |
| 3.1.2 软骨细胞鉴定 |
| 3.2 IL-β对软骨细胞MMP-3和MMP-13表达的影响 |
| 3.3 IL-β对软骨细胞iNOS和NO表达的影响 |
| 3.4 IL-β对软骨细胞NF-κb通路及p65核转位的影响 |
| 3.5 IL-β对软骨细胞培养上清中PⅡCP、C2C及CTX-Ⅱ的影响 |
| 3.6 SD大鼠ACLT骨关节模型评价 |
| 3.6.1 p后不同间点胫骨平台眼观变化及评分 |
| 3.6.2 术后不同间点胫骨平台番红O固绿染色及OARSI评分 |
| 3.6.3 术后不同间点胫骨平台HE染色情况 |
| 3.7 ACLT大鼠血清分子标志物(PⅡCP、CTX-Ⅱ及C2C)的浓度变化及相关分析 |
| 3.7.1 ACLT大鼠血清中PⅡCP、CTX-Ⅱ及C2C的浓度变化 |
| 3.7.2 ACLT大鼠血清PⅡCP、CTX-Ⅱ及C2C与OARSI评分的相关性分析 |
| 3.7.3 CTX-Ⅱ与C2C检测鼠OA的 ROC分析 |
| 3.8 牛血清中分子标志物的浓度(PⅡCP、CTX-Ⅱ及C2C)变化及ROC分析 |
| 3.8.1 试验奶牛跛行分级 |
| 3.8.2 奶牛血清中PⅡCP、CTX-Ⅱ及C2C的浓度变化 |
| 3.8.3 使用CTX-Ⅱ与C2C检测牛OA的ROC分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 OA软骨基质代谢的改变对Ⅱ型胶原代谢产物的影响 |
| 4.2 OA软骨细胞iNOS、NO及NF-κb信号通路的改变 |
| 4.3 分子标志物诊断与其他OA诊断方法相比的优势 |
| 4.4 CTX-Ⅱ和C2C在牛OA中的应用及评估 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）宁夏地区鸡滑液囊支原体的分离鉴定与药敏试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 临床病料的采集 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗菌药物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采样部位及分离培养 |
| 1.2.2 病变关节腔渗出物的常规细菌学鉴定 |
| 1.2.3 PCR检测 |
| 1.2.4 抗菌药物的稀释 |
| 1.2.5 常用抗菌药物最小抑菌浓度的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 滑液囊支原体的分离鉴定 |
| 2.1.1 常规细菌学鉴定 |
| 2.1.2 滑液囊支原体的固体培养和菌落特征 |
| 2.1.3 常规细菌分离 |
| 2.1.4 分子生物学诊断 |
| 2.2 MIC的测定 |
| 3 讨论 |
（9）本地品种鸡传染性关节炎的病因鉴定、流行病学分析及防控技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 部分缩写的中英文对照(1) |
| 部分缩写的中英文对照(2) |
| 第一章 综述 |
| 1. 鸡滑液囊支原体概况 |
| 1.1 M. synoviae生物学特性 |
| 1.2 M. synoviae的感染和传播 |
| 1.3 M. synoviae的流行分布 |
| 2. M. synoviae的感染鉴定 |
| 2.1 分离培养 |
| 2.2 核酸检测 |
| 2.3 血清学检测 |
| 3. vlhA基因及编码的蛋白功能 |
| 4. M. synoviae对宿主细胞作用机制 |
| 4.1 M. synoviae侵入与损伤机制 |
| 4.2 M. synoviae的免疫逃避机制 |
| 5. M. synoviae防控措施 |
| 5.1 药物防治研究 |
| 5.2 疫苗防控研究 |
| 6. 本研究的目的和意义 |
| 第二章 本地品种鸡传染性关节炎病原鉴定及流行情况分析 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 病原调查和鉴定 |
| 3.2 2010-2015年国内16个省本地品种鸡中M. synoviae感染流行分析 |
| 3.3 M. synoviae在种鸡场不同周龄鸡群同时期流行情况 |
| 3.4 自然感染条件下M. synoviae在本地品种鸡中的感染规律 |
| 3.5 M. synoviae在不同本地品种肉鸡流行状况研究 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 M. synoviae的分离培养 |
| 4.2 M. synoviae的流行情况分析 |
| 4.3 M. synoviae自然感染条件下的共感染风险 |
| 5. 小结 |
| 第三章 鸡M. synoviae分离株遗传进化分析及其致病性测定 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 分离毒株的遗传进化分析 |
| 3.2 分离株毒株连续传代后的遗传进化分析 |
| 3.3 分离株毒株致病力差异分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 以vlhA基因为遗传进化分析靶基因的原因 |
| 4.2 不同基因亚型分离毒株毒力差异问题 |
| 4.3 连续传代对分离毒株的遗传进化影响 |
| 5. 小结 |
| 第四章 鸡M. synoviae疫苗研制及免疫效果评估 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 灭活疫苗的制备和评价体系建立 |
| 3.2 灭活疫苗免疫保护效果评估 |
| 3.3 弱毒疫苗免疫效果评估 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 M. synoviae疫苗免疫攻毒模型讨论 |
| 4.2 中国本地品种鸡中MS-H弱毒疫苗的应用问题 |
| 4.3 M. synoviae灭活疫苗免疫效果问题 |
| 4.4 免疫后中国本地品种种鸡子代和SPF种鸡子代抗M. synoviae的差异 |
| 5. 小结 |
| 第五章 鸡M. synovia药物防治效果及综合防控措施应用评估 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 体外培养条件下分离株对不同药物的敏感性情况 |
| 3.2 饲料中添加药物防治M. synoviae的评估效果 |
| 3.3 M. synoviae综合防控措施应用效果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 针对M. synoviae感染的药物治疗 |
| 4.2 鸡M. synoviae的药物预防 |
| 4.3 M. synoviae综合防控措施 |
| 5. 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（10）磷酸替米考星的体内外药效学、一般药理学及其对靶动物猪的安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 部分缩写的中英文对照 |
| 引言 |
| 第一章 磷酸替米考星与猪支原体肺炎 |
| 1 替米考星研究进展 |
| 1.1 替米考星的概况 |
| 1.2 替米考星的抑菌效果及其相关机理 |
| 1.3 替米考星的安全药理学研究 |
| 1.4 替米考星的药效学研究与临床应用 |
| 1.5 替米考星的不良反应与缺陷 |
| 2 磷酸替米考星研究进展 |
| 2.1 磷酸替米考星的概况 |
| 2.2 磷酸替米考星作用机理 |
| 2.3 磷酸替米考星的毒性与毒理学研究 |
| 2.4 磷酸替米考星的药代动力学研究 |
| 2.5 磷酸替米考星药效学研究 |
| 3 猪支原体肺炎研究进展 |
| 3.1 支原体概况 |
| 3.2 猪支原体病 |
| 3.3 猪支原体肺炎 |
| 3.4 猪肺炎支原体 |
| 3.5 猪肺炎支原体致病机理 |
| 参考文献 |
| 第二章 磷酸替米考星对畜禽常见病原菌的体外抑菌活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验药品及药液的配制 |
| 1.2 受试菌株 |
| 1.3 细菌培养基 |
| 1.4 菌液制备 |
| 1.5 最小抑菌浓度检测 |
| 1.6 结果判定 |
| 2 结果 |
| 2.1 磷酸替米考星等受试药物对支原体的体外抑菌试验结果 |
| 2.2 磷酸替米考星等受试药物对革兰氏阳性菌的体外抑菌试验结果 |
| 2.3 磷酸替米考星等受试药物对革兰氏阴性菌的体外抑菌试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 10%磷酸替米考星可溶性粉对人工感染猪肺炎支原体病的治疗剂量筛选试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验分组 |
| 1.4 菌种及培养基 |
| 1.5 人工感染试验动物 |
| 1.6 临床观察及药物治疗 |
| 1.7 疗效评价指标 |
| 1.8 数据的统计处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪肺炎支原体病人工感染模型建立 |
| 2.2 10%磷酸替米考星可溶性粉对人工诱发猪肺炎支原体病的治疗效果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 10%磷酸替米考星可溶性粉治疗人工感染猪肺炎支原体病的Ⅱ期临床试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验分组 |
| 1.4 接种菌液 |
| 1.5 试验动物的人工感染 |
| 1.6 临床观察及药物治疗 |
| 1.7 疗效评价指标 |
| 1.8 数据的统计处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪肺炎支原体病人工感染模型建立 |
| 2.2 10%磷酸替米考星可溶性粉对人工感染猪肺炎支原体病的治疗效果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 10%磷酸替米考星可溶性粉对肺炎支原体自然感染猪的Ⅲ期临床试验 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 药品 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 仔猪呼吸道感染猪肺炎支原体的确诊 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 疗效评价指标 |
| 1.6 数据的统计处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 各试验组受试仔猪在试验期内的死亡情况 |
| 2.2 各试验组受试仔猪的死亡率、治愈率、有效率 |
| 2.3 各试验组受试仔猪的相对增重率 |
| 2.4 各试验组受试猪肺脏病变评分比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 10%磷酸替米考星可溶性粉的安全药理学研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 药物与试剂 |
| 1.2 受试动物 |
| 1.3 试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 10%磷酸替米考星可溶性粉对犬心血管系统及呼吸系统的作用 |
| 2.2 10%磷酸替米考星可溶性粉对小鼠神经系统的影响 |
| 2.3 10%磷酸替米考星可溶性粉对大鼠消化系统的影响 |
| 2.4 10%磷酸替米考星可溶性粉对大鼠泌尿系统的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 10%磷酸替米考星可溶性粉对犬心血管系统及呼吸系统的作用 |
| 3.2 10%磷酸替米考星可溶性粉对小鼠神经系统的影响 |
| 3.3 10%磷酸替米考星可溶性粉对大鼠消化系统的影响 |
| 3.4 10%磷酸替米考星可溶性粉对大鼠泌尿系统的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 10%磷酸替米考星可溶性粉对靶动物猪的安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验分组及处理 |
| 1.3 样品的采集与处理 |
| 1.4 试验项目 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 试验猪的临床表现 |
| 2.2 血液常规分析 |
| 2.3 血凝指标分析 |
| 2.4 血清生化指标分析 |
| 2.5 尿常规分析 |
| 2.6 增重及料重比 |
| 2.7 组织病理学检查 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 致谢 |
四、奶牛跗关节滑液的物理特性及细胞成分的研究（论文参考文献）
- [1]滑液支原体亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）的原核表达及亚细胞定位[J]. 张宏燕,岳亚辉,邢小勇,龙翠琴,武小椿,温峰琴,包世俊. 农业生物技术学报, 2021(12)
- [2]犬缺血性骨软骨病细胞凋亡与基质紊乱的机制研究[D]. 李桥. 华中农业大学, 2021
- [3]温度敏感型滑液囊支原体减毒株的培育与生物学特性鉴定[D]. 魏泽华. 扬州大学, 2020
- [4]宁夏地区牛支原体分型鉴定及其对牛外周血单核巨噬细胞的功能影响研究[D]. 郭亚男. 宁夏大学, 2020
- [5]家禽支原体和滑液囊支原体的分离鉴定和基因组序列分析[D]. 刘星丽. 山东师范大学, 2020(01)
- [6]鸡白痢沙门菌致病多样性及DIVA疫苗候选株的构建与免疫作用[D]. 郭荣显. 扬州大学, 2019(02)
- [7]骨关节炎损伤机制及Ⅱ型胶原代谢产物浓度变化的研究[D]. 张志恒. 东北农业大学, 2019(12)
- [8]宁夏地区鸡滑液囊支原体的分离鉴定与药敏试验[J]. 石晓磊,齐田苗,边海霞,周云锋. 动物医学进展, 2018(11)
- [9]本地品种鸡传染性关节炎的病因鉴定、流行病学分析及防控技术研究[D]. 孙石开. 广西大学, 2018(12)
- [10]磷酸替米考星的体内外药效学、一般药理学及其对靶动物猪的安全性研究[D]. 吴宁. 南京农业大学, 2018(07)