一、流式细胞术三色分析调查成年人外周血CD34~+造血干细胞绝对计数参考范围（论文文献综述）
王亦心[1]（2021）在《利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答》文中进行了进一步梳理研究目的:流感病毒属于正粘病毒科,分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒（Influenza A viruses,IAVs）是导致人类流感大流行的主要原因,对公众健康造成潜在威胁。目前对于IAVs主要的预防措施是应用流感病毒疫苗,但是由于存在抗原漂移及抗原突变的情况,使得这种方式难以发挥较好的保护作用,并且一种疫苗难以针对不同种病毒毒株进行中和。很多研究发现组织定居记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells,Trm cells）可能对于抵抗流感病毒感染有一定的作用,因此近些年针对于T细胞疫苗的研究也逐渐开展。甲型流感病毒的研究主要依赖于小鼠模型,但小鼠的肺组织结构及细胞比例与人肺脏存在一定的差异,因此小鼠的肺脏在感染后的免疫变化可能无法完全反应在人肺中的情况。而轻、中度流感病毒患者的肺组织样本往往难以取材,多数样本来源于癌旁组织及器官捐献,这些样本难以进行流感病毒感染期间肺内免疫细胞的动态观察研究。因此我们在给NCG免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统（human immune system,HIS）的基础上,同时在鼠背部皮下移植同源HL组织,建立人免疫系统-人肺小鼠（HIS with autologous lung xenograft,HISL mice）模型。通过对移植后的人肺脏组织进行甲型流感病毒感染,来研究人肺中以及各个器官在感染之后的免疫应答情况,探究此模型的重要临床意义。研究方法:（1）通过给NCG小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织、背部皮下移植同源肺脏组织（HL）及尾静脉注射同源肝脏来源CD34+造血干细胞,建立HISL小鼠模型;（2）给予HISL小鼠皮下人肺移植物接种H1N1病毒,对照组给予PBS等体积接种,研究两组小鼠免疫细胞的变化、特异性抗体的产生、转录组的特征及差异;（3）给予HISL小鼠皮下HL预先接种H1N1病毒,再给予HISL小鼠致死剂量H1N1病毒经鼻接种,探求预先接种对于HISL小鼠接受致死剂量H1N1经鼻感染后的保护作用。研究结果:（1）给予接受全身辐照后的NCG小鼠肾被膜下胚胎胸腺组织移植、皮下同源胚胎肺组织移植、尾静脉注射同源胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞后,成功建立HISL小鼠模型,其人CD45+细胞嵌合比例可达90%以上,以T细胞、B细胞为主,髓系细胞、自然杀伤细胞比例较低;小鼠皮下移植的HL组织在模型建立成功后可见其具有与成人肺中相似的、完整的呼吸性气道等结构。（2）H1N1病毒感染小鼠皮下移植的人肺组织后,H1N1组HISL小鼠人肺中的HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞比例显着高于对照组,且H1N1组小鼠HL中CD4+Trm、CD8+Trm水平较PBS组显着升高,其水平与HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞的比例呈正相关;H1N1组HISL小鼠HL中HLA-A*0201限制性H1N1抗原特异性的CD8+T细胞的比例相比对照组显着升高;H1N1组HISL小鼠血清中产生病毒特异性的Ig、IgG抗体;两组小鼠人肺的转录组测序后表达基因存在显着差异,H1N1组小鼠HL中H1N1流感病毒感染相关、免疫相关的基因表达显着上调。（3）HISL小鼠皮下HL经过5000TCID50 H1N1病毒单次接种后,再次给予小鼠致死剂量（5000TCID50）病毒的经鼻接种,小鼠死亡;预先给予HISL小鼠多次500 TCID50 H1N1病毒皮下HL内接种,小鼠在经过致死剂量流感病毒经鼻感染后生存时间较对照组显着延长。研究结论:（1）HISL小鼠模型可实现对人肺脏组织结构、免疫细胞水平及变化等的研究。（2）HISL小鼠可研究人肺脏组织在流感病毒感染后人肺中的免疫细胞的变化,可进一步研究其中T细胞亚型的特点、基因组的差异以及血清中特异性抗体的产生。（3）多次低剂量H1N1病毒预先感染HISL小鼠皮下HL可提供一定的保护作用,延长该小鼠在接受致死剂量病毒经鼻感染后的生存时间,并提高其生存率。综上所述,本课题首次建立了可用于流感病毒研究的人肺脏组织及免疫系统的小鼠模型,为后期进一步研究感染后免疫系统的变化、T细胞表型特点、特异性抗体的产生、转录水平的差异等提供了有力的工具,并对后期疫苗的研发及其他肺部感染性疾病的研究等具有重要意义。
于亚菲[2]（2021）在《WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究》文中指出第一部分:利用全外显子组测序技术筛选ITP致病基因及亚组致病基因研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种病因尚未完全阐明的获得性出血性疾病。患者的共同特点是血小板计数低于正常参考值下限（100×109/L）,其临床表现具有异质性,患者可伴或不伴不同程度、不同部位的出血症状,近年来,乏力、焦虑甚至认知功能障碍等症状也逐渐引起重视。迄今为止,ITP的关键病因是免疫失耐受,导致血小板破坏增加或血小板产生不足。其中主要涉及体液和细胞免疫两大方面,涉及多种免疫细胞包括B细胞、T细胞、单核/巨噬细胞（Mφ）、树突状细胞（DCs）、间充质干细胞（MSCs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）等。目前已证实患者免疫系统对自身血小板表面膜糖蛋白失耐受,机体产生血小板表面膜糖蛋白特异性抗体致敏血小板,进而导致单核巨噬系统吞噬破坏血小板能力增强;ITP患者体内杀伤性CD8+T细胞对自身血小板失耐受,可直接裂解血小板;ITP患者血小板表面糖蛋白（GP）去唾液酸化增加,易被肝脏捕获吞噬等多种途径导致血小板的破坏加速。另一方面,多种免疫细胞、细胞因子及血小板抗体的异常导致巨核细胞增殖、成熟和凋亡障碍,最终导致血小板产生不足。随着对ITP发病机制更深入更全面的研究,ITP患者与正常人体内复杂交错的微观差异也逐步被揭示,涉及多种分子、细胞、器官、系统,因此寻找ITP最本质的差异,探索最源头的病因,也日渐成为ITP领域研究者的重点攻坚问题。全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）与全外显子组测序（Whole Exome Sequencing,WES）是目前DNA水平高通量测序的主要研究内容,人类基因组包含约31.6亿脱氧核糖核苷酸碱基对,其中外显子组占1-2%。加州大学圣克鲁兹分校（University of California Santa Cruz,UCSC）提供的 hg19 版本人类参考基因组中有entrez gene ID号的基因是23056个,虽然外显子在人类所有基因中所占的比例不足2%,但是它却包含约85%的已知致病突变。因此检测基因组中所有的外显子,即全外显子组测序,对于筛选与所研究疾病有关的致病突变具有重要意义。高通量测序技术自诞生以来已成功应用于多个科研领域,医学研究涉及广泛,如食管鳞癌基因组变异研究,多发性肺癌基因组异质性研究,同步双侧卵巢癌的异质性和克隆进化研究,外显子测序揭示肝细胞-胆管癌的进化及起源,单细胞转录组测序探究示踪造血干细胞形成过程等。基于急性髓细胞白血病（Acute myeloidleukemia,AML）的基因测序研究改写了 2016年WHO分型指南,急性白血病、骨髓增生异常综合征（MDS）等疾病都已有应用于临床的基因检测panel,而ITP方面目前尚未有测序相关研究报道,本研究首次探索ITP患者的基因组特点及变异信息,筛选与正常健康对照的基因差异,并且探究ITP患者内部的基因差异,包括骨髓巨核细胞数量相对正常与显着增多患者、rhTPO治疗有效与无效患者的基因差异,从而探索寻找ITP的致病突变基因以及ITP内部异质性的基因根源。研究目的:（1）描述与统计本研究中ITP患者基因组测序数据的基本变异特点。（2）探究ITP患者与正常对照全外显子组的差异,包括突变位点、结构变异,并进行有害性分析,筛选ITP患者共有突变基因,得出致病候选基因,并进行基因富集分析和蛋白质交互作用预测。（3）探究疾病亚组间的基因差异,亚组包括骨髓巨核异常增多与骨髓巨核大致正常ITP患者、对rhTPO治疗有效与无效的ITP患者,旨在揭示ITP患者间骨髓巨核差异以及对rhTPO治疗反应差异的基因根源。研究方法:（1）ITP患者与健康对照样本:严格按照纳入与排除标准,筛选ITP患者,匹配同年龄、同性别的健康志愿者,采集患者和健康志愿者外周血,记录患者病例信息资料。（2）外周血DNA全外显子组测序:提取外周血DNA,经DNA样品检测、建库捕获、库检、采用Illumina Novaseq 6000测序平台进行测序。（3）测序数据质量评估:将获得的原始测序数据（Rawdata）进行精细过滤,得到cleanreads,有效测序数据通过BWA比对到人类参考基因组（GRCh37/hg19）上,初始比对结果为BAM格式,然后用SAMtools软件对其排序,再用Sambamba进行重复数据标记,最后进行覆盖度、深度等统计。（4）生物信息分析:将过滤后的高质量序列比对到人类参考基因组上,检测样本变异,并利用ANNOVAR对变异进行注释。筛选ITP相关有害变异位点与基因的步骤包括:1)筛选高质量ITP差异位点与基因;2)根据已有数据库进一步筛选突变位点;3)ACMG突变位点有害性分类;4)结构变异有害性分析;5)ITP共有突变基因筛选;6)候选基因相关性排序;7)候选基因富集分析;8)蛋白相互作用分析。另外对ITP患者内部巨核细胞显着增多与相对正常者、rhTPO有效与无效者进行基因组外显子区差异分析。（5）分析结果验证:从测序、生信分析后得到的候选致病基因中随机挑选,提取患者外周血单个核细胞（PBMC）RNA反转录,从cDNA水平进行候选致病位点的Sanger验证,以确定突变位点确实影响到mRNA,并随机挑选部分基因对应的mRNA进行差异表达检测与分析。研究结果:（一）测序标本统计信息:纳入55例ITP患者及55例同年龄、同性别的健康对照者。1、ITP患者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为11（范围:1-47）×109/L,男性21人,女性34人。2、健康对照者:中位年龄为39（范围:18-80）岁,基线中位血小板计数为185（范围:161-239）×109/L,男性21人,女性34人。（二）送检标本质控信息:55例ITP患者外周血提取DNA后经全外显子组测序获得平均原始数据量11.6±0.97 G,所有测序标本比对到参考基因组上的总reads数量比例均达到99.9%。目标区域的中位覆盖率为99.6%（范围:99.6-99.9%）,目标区域平均测序深度112.0±9.12 X。（三）ITP测序标本基因变异结果:（1）基因组上各分区单核苷酸变异（SNV）结果显示:内含子变异数目最多70788±4827,其次是外显子区域22002±151.6和基因间区域20545±2430。而编码区上不同类型SNV结果为同义突变最多11261±82.8,其次是错义突变10199±88.59。其余区域和类型数目相对较少。（2）基因组上各分区插入缺失变异（InDel）结果显示:内含子变异数目最多10322±752.3,其次是基因间区域3026±388.6和非编码RNA内含子区域818.3 ±72.54,外显子区域为613.3±17.79。而编码区上不同类型InDel结果为非移码缺失最多198.6 ± 10.03,非移码插入183.1±10.49,未知功能位点90.62 ±3.325,移码缺失 76.56±6.215,移码插入 58.16±4.803。（3）基因组上各分区拷贝数变异（CNV）结果显示:CNV总数目较少,其中CDS区相对最多,其余区域CNV基本可忽略不计。（四）基因组检测结果生信分析:本研究共得到总变异位点数目SNV 778643个,InDel 147859个,从测得的变异结果中去除人群高频的SNP,利用现有数据库,软件等,结合ITP血小板减少特点,进行再筛选,最终得到总SNV 15054个,总InDel 1900个,合并相同位点后共得到428个候选致病位点,342个候选致病基因,并注释出ACMG分类为致病的159个已知致病基因。经数据库筛选以及经55例正常对照筛选的共有候选基因富集分析显示卟啉与叶绿素代谢通路、抗坏血酸和醛酸代谢通路、甾体激素生物合成、戊糖和葡萄糖酸酯的相互转化、视黄醇代谢、药物代谢等KEGG信号通路在ITP患者与正常对照间存在显着差异。另外还进行了巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者差异基因的筛选。（五）分析结果验证:随机抽取342个候选致病基因中的FHOD1基因的6个候选致病位点,设计引物扩大样本至200例进行Sanger测序得到各个SNV的变异频率为:rs200317614（0.5%）,rs6499118（3.0%）,rs1 17880323（0.5%）,rs199924523（0.5%）,rs539519503（0.5%）,67264047（0.5%）。另外对部分随机抽取的 7 个候选基因进行RT-qPCR相对表达定量检测,发现3个基因在ITP患者与正常对照间表达有显着差异,包括MMP9、ERCC6、NFIB,其余4个基因表达量与正常人无显着差异,但表达量的标准差要大于正常对照组。研究结论:（一）在对测序结果进行质控筛选后确保质量可靠的前提下,ITP患者与正常对照基因组确实存在差异,基因组上SNV在内含子区最多,其次为外显子区,而InDel在内含子区也最多,其次为基因间区域,而CNV数目很少。（二）经测序和生信分析共得到428个外显子区候选致病位点,342个候选致病基因,其中ACMG分类为致病的为159个已知致病基因。对候选基因富集分析显示ITP与正常对照之间在多个代谢相关的KEGG信号通路存在显着差异。（三）巨核异常增多与巨核相对正常ITP患者、rhTPO治疗有效与无效ITP患者间也存在差异基因,这些差异为探究ITP患者内部巨核细胞的异质性以及预测rhTPO效果可能具有重要指导意义。第二部分:rhTPO影响血小板抗体阳性ITP巨核产板的异质性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种以血小板计数持续减低为特征状态的获得性自身免疫性疾病。迄今为止,ITP的发病机制尚未完全阐明,其中心学说为“免疫失耐受”,体液与细胞免疫异常导致机体对自身血小板表面抗原失耐受从而加速血小板的破坏,免疫异常还影响巨核细胞的发育、成熟和凋亡产板,免疫系统对自身血小板及巨核的失耐受导致血小板破坏增加,生成减少,从而形成机体血小板持续减低的状态。血小板表面膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）特异性抗体是攻击血小板的主要分子,70%的ITP患者血浆中可检测到该类抗体（以抗GPⅡb/Ⅲa或GPⅠb/Ⅸ为主）,抗体作为体液免疫的重要组成部分,也是ITP最早发现的发病机制,是ITP发病机制的关键部分。已有多项研究表明,抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ抗体对巨核细胞生成血小板具有不同影响:小鼠模型中发现,部分抗GPⅡb/Ⅲa抗体可以抑制巨核增殖,引起巨核数目减少,但抗GPIbα抗体对骨髓巨核计数影响较小;GPIbα可以影响血小板的体积,GPIbα敲除小鼠可以模拟巨血小板综合症,使其出现血小板增大和数量的减少。GPIbα胞内区域与细胞骨架细丝蛋白A相连接,调控生成血小板的大小,体外实验中发现,细丝蛋白A可以与PACSIN2（BAR/F-BAR蛋白的一种）相互作用,调控巨核胞内界膜系统生成,以及血小板内管状膜性结构生成。综合以往研究,抗GPⅡb/Ⅲa抗体主要阻碍巨核增殖,抗GPⅠbα抗体更多地影响血小板内部骨架结构,而TPO可特异性促进造血干细胞自我更新和增殖,还可以促进巨核祖细胞向巨核细胞的分化与增殖,rhTPO以及其他TPO-RAs已被证实可有效地促进ITP患者血小板提升,那么两种血小板抗体阳性ITP患者巨核产板障碍的情况是否都能被rhTPO纠正尚未阐明。研究目的:通过体外观察ITP患者血清在加入不同血小板表面膜糖蛋白纯化功能性抗体的作用下对巨核发育成熟、凋亡以及血小板生成的影响,以及探究rhTPO能否弥补或纠正这种影响,并通过体内动物实验,探究rmTPO对ITP小鼠在注射不同血小板表面膜糖蛋白功能抗体的作用下,恢复血小板水平的效果。为临床rhTPO应用前疗效预测提供基础研究依据。研究方法:（1）ITP患者和健康志愿者:收集外周血,无菌分离制备血清及血浆。（2）MAIPA检测:检测患者血浆两种血小板抗体的结果,并分组留取不同MAIPA结果患者的血清。（3）脐血诱导巨核细胞:采集健康的足月妊娠女性脐血80-100mL,无菌分离单个核细胞,并进一步磁珠分选CD34+细胞,培养基选择无血清培养基（Serum-Free Expansion Medium,SFEM）,其中加入重组人血小板生成素,重组人IL-3以及干细胞因子三种细胞因子,诱导培养脐血来源的CD34+细胞向巨核系方向分化。（4）体外细胞实验:第一部分:A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组,C组:抗体双阴组,D组:正常对照组。第二部分:A组:双阴血清对照组,B组:血清加抗GPⅡb抗体组,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组,D组:血清加双抗体组。CD34+细胞经以上处理分组培养,14天后采用流式细胞术检测各组巨核细胞生成比例和凋亡比例、多倍体巨核比例和产血小板数量等指标,比较不同处理对巨核发育、成熟及产板的影响。14天后向第二部分各组加入rhTPO,继续培养14天,再次流式细胞术检测各组巨核细胞比例和凋亡比例、多倍体巨核比例以及产血小板数量等指标,比较rhTPO对不同组巨核发育、成熟及产板的影响。（5）体内动物实验:构建C57BL/6背景的ITP被动小鼠模型:A组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:小鼠+抗GPⅡb功能抗体+等量生理盐水,C组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:小鼠+抗GPⅠbα功能抗体+等量生理盐水。每周采集并检测不同组ITP小鼠的血小板变化情况。研究结果:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。本研究共纳入41例ITP患者和8例正常对照者,对49例样本外周血贫血小板血浆（PPP）进行MAIPA检测,得到抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者13人（A组）,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者8人（B组）,抗体双阴患者13人（C组）,抗体双阳患者7人（D组）,抗血小板抗体阳性检测率为68.3%（28/41）,8例正常对照者MAIPA检测结果为双阴性（E组）。ELISA检测该49例外周血血清TPO水平,按照MAIPA结果对5组TPO水平进行统计分析显示各组TPO水平之间无统计学差异（P>0.05）。（2）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入不同MAIPA结果的ITP或正常对照者的血清,分为A组:抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性患者组（n=13）,B组:抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者组（n=8）,C组:抗体双阴组（n=13）,D:正常对照组（n=8）。四组培养体系中细胞总数之间无显着差异,而CD61+细胞比例以及CD61+巨核细胞数量抗GPⅡb/Ⅲa与抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性组都显着低于正常对照组,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性组水平最低,还显着低于抗体双阴性组,而各组ITP患者相比正常对照组血小板释放都显着减少。（3）抗血小板GPⅠbα与GPⅡb特异性抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。向脐血来源的CD34+细胞诱导巨核体系中,加入血小板抗体双阴性ITP患者血清以及纯化的抗人CD41a（GPⅡb）和/或CD42b（GPⅠbα）功能抗体,分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。抗GPⅡb抗体组以及双抗体组CD61+细胞比例都显着低于抗体双阴性组,而≥4N多倍体巨核细胞比例双抗体组显着低于抗体双阴性组,各组巨核凋亡比例未见显着差异,加抗体各组血小板生成数量要显着低于抗体双阴组。（4）rhTPO对血清和血小板抗体孵育脐血诱导的巨核生成、成熟、凋亡和血小板生成的影响不同。脐血诱导巨核体系在与血小板抗体孵育后分为A组:双阴血清对照组（n=10）,B组:血清加抗GPⅡb抗体组（n=10）,C组:血清加抗GPⅠbα抗体组（n=10）,D组:血清加双抗体组（n=10）。再应用rhTPO,检测培养体系CD61+细胞比例,发现抗体双阴性组与加抗GPⅡb抗体组要显着高于加双抗体组,而相比于应用rhTPO之前,抗GPⅡb抗体组CD61+细胞比例提升较抗GPⅠbα抗体组显着增加,提高抗体双阳性组≥4N多倍体巨核细胞比例至与其他组无显着差异水平,各组巨核凋亡比例仍未见显着差异。培养体系血小板释放增加,但GPⅠbα抗体组与双抗体组仍显着低于双阴组,而GPⅡb抗体组提升至与双阴组无显着差异水平。（5）rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。A组:抗GPⅡb功能抗体+rmTPO,B组:抗GPⅡb功能抗体+NS,C组:抗GPⅠbα功能抗体+rmTPO,D组:抗GPⅠbα功能抗体+NS。A组血小板计数比B组显着增高,但C组与D组相比无统计学差异,说明rmTPO对抗GPⅡb抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升显着,但对于抗GPⅠbα抗体诱导的ITP小鼠模型血小板的提升作用不佳。结论:（1）不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清TPO水平之间无显着差异。（2）体外不同MAIPA结果ITP患者与正常对照者血清对脐血诱导巨核细胞和血小板生成的影响具有异质性,MAIPA阳性ITP患者与正常对照者相比巨核以及血小板生成显着受抑制,其中抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性ITP患者血清孵育的巨核细胞比例和数量最低,显着低于正常对照者和双阴性ITP患者。（3）体外抗GPⅡb抗体对血清孵育脐血诱导的巨核细胞生成数量影响较大,而抗GPⅠbα抗体可能对巨核细胞大小或成熟程度影响较大,两种抗体同时存在会显着降低≥4N多倍体巨核比例以及产板量。rhTPO的应用可以显着提升抗GPⅡb抗体组巨核细胞比例,并且提升双抗体组多倍体巨核比例。（4）体内小鼠模型也显示rmTPO对抗GPⅠbα抗体诱导的小鼠血小板减少的治疗作用效果不佳。第三部分:ITP患者血小板自身抗体特异性与对rhTPO反应性的相关性研究研究背景:原发免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）是一种获得性自身免疫性出血性疾病,其年发病率为2～5/10万成人,患者常有不同程度的出血症状。近年来,还发现乏力等症状也与ITP发病有关。糖皮质激素和静脉注射丙种球蛋白（intravenousimmunoglobulin,IVIG）目前仍然是我国成人ITP患者的一线治疗方案。然而,仍有15%～25%的患者对一线治疗无效,并且激素的长期使用甚至是不规范使用给ITP患者带来了严重的不良反应,因此,亟需寻找其他安全有效的ITP治疗药物。随着ITP患者巨核细胞生成障碍以及血小板产生不足的发病机制逐步被揭示,TPO受体激动剂类药物,包括rhTPO、艾曲泊帕、阿伐曲泊帕以及国外的罗米司亭等是近年来ITP领域的研究热点,并且大量高质量RCT研究证实其临床疗效可达60%～90%。而rhTPO作为我国的原研药,其应用于ITP也已近20年,具有大量丰富的临床应用数据,表现出良好的疗效性和安全性。但TPO-RAs与激素相比,价格更加昂贵,因此,寻找此类药物的获益人群,有针对性的个体化用药,对于提高ITP治疗效果,规避不良反应风险以及降低医疗费用具有重要意义。在ITP研究领域已有相关文献报道,ITP患者体内血小板自身抗体可以作为药物疗效的预测指标。改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原实验（modified monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigen,MAIPA）是一种间接检测ITP患者血浆中游离抗血小板抗体的实验技术。其具有特异性较高,但灵敏度稍低的特点,是ITP辅助诊断的重要实验技术。已有多项基础和临床研究证实,抗GPIb/IX抗体阳性ITP患者对激素和IVIG的治疗反应不佳。目前国内外尚无研究证实,ITP患者体内血小板自身抗体与rhTPO治疗反应相关性的情况。研究目的:回顾性分析应用rhTPO的、一线治疗无效或复发的且检测过血浆血小板自身抗体的成人ITP患者,通过统计学分析,探究rhTPO疗效与自身抗体特异性的相关性,旨在寻找可以预测rhTPO疗效的指标,从而有益于ITP的个体化和精准治疗。研究方法:（1）患者入组:回顾性收集2010年8月至2019年4月山东大学齐鲁医院血液科入院患者信息。纳入标准:一线治疗无效或复发的ITP患者,入院应用rhTPO治疗,治疗前接受过血小板抗体检测。rhTPO治疗前至少4周未接受过其他ITP特异性治疗药物。排除标准:妊娠合并ITP患者等需排除。记录纳入患者基线统计学信息。（2）研究变量:MAIPA检测患者血浆血小板自身抗体。rhTPO用法用量为300U/kg皮下注射连续14天。总有效（OR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于30 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。完全有效（CR）定义为:至少两次间隔7天及以上的血常规检测结果显示血小板计数大于100 × 109/L,并且至少高于两倍的基线血小板值且不存在出血症状。无效（NR）定义为:rhTPO治疗后,血小板仍低于30 × 109/L或仍存在出血症状。据此计算纳入患者起效时间（TTR）、总有效率（ORR）、完全有效率（CRR）等数据信息。（3）统计分析:根据变量为数值变量或分类变量选择统计分析方法,包括t检验、方差检验、非参数检验和卡方检验等,多组间的比较采用Bonferroni校正法,采用多因素logistic回归和析因设计分析全面评估可能影响rhTPO疗效的相关指标。P值为双侧检验,P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:（1）根据纳入和排除标准最终共有123例ITP患者纳入分析。女性72人,男性51人。中位年龄48（范围:16-92）周岁,中位病程3（范围0-368）个月,基线血小板中位值为8（范围0-37）× 109/L。58人抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性,其中单阳患者20人;50人抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性,其中单阳患者12人;38人抗体双阳性;53人抗体双阴性。（2）123人中有90人获得OR（73.2%）,其中53人为CR,37人部分有效。有效患者中位起效时间为7（范围2-13）天,抗GPIb/IX抗体阴性患者总有效率要显着高于抗体阳性患者:82.2%（60/73）vs.60.0%（30/50）,χ2=7.444,P=0.006。CR也具有同样的统计学差异趋势:47.9%vs.36.0%,χ2=5.448,P=0.020。而抗GPⅡb/Ⅲa抗体阳性或阴性患者的OR和CR均未见统计学差异。（3）多因素logistic回归分析显示年龄、性别、基线血小板值或抗GPⅡb/Ⅲa抗体都与rhTPO疗效无关,只有抗GPⅠb/Ⅸ抗体的存在与否与rhTPO疗效显着相关,抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性患者与其抗体阴性患者获得rhTPO反应的比值比为0.040（P=0.003,95%CI:0.005-0.336）,析因设计也同样证实抗 GPⅠb/Ⅸ 抗体是 rhTPO疗效的主要影响因子（F=12.826,P<0.001）。两种分析方法均表明两抗体间不存在交互作用。结论:（1）MAⅠPA检测血浆抗GPⅠb/Ⅸ阳性患者对rhTPO治疗反应差,而抗GPⅡb/Ⅲa抗体则无预测作用。（2）两种血小板抗体在影响rhTPO疗效方面无交互作用。（3）该研究提示rhTPO临床应用中,可优先推荐应用于抗GPⅠb/Ⅸ抗体阴性患者,这部分患者可能更获益。
王宇[3]（2021）在《淋巴细胞亚群和CD34+造血干细胞计数的标准化相关问题研究》文中进行了进一步梳理目的（1）对淋巴细胞亚群计数自制参考物质（百分计数和绝对计数）进行评价,将其应用于检测系统性能验证和室内质量控制研究,为其在临床实验室的大规模推广应用奠定基础。（2）对参加CD34+造血干细胞计数全国室间质量评价的实验室进行问卷调查和质评数据分析,以了解临床实验室开展CD34+造血干细胞计数的现状及存在的问题,为制定和实施质量改进方案提供参考依据。方法（1）淋巴细胞亚群计数自制参考物质的评价与应用研究:①自制参考物质的评价:依据ISO Guide 35和JJF1343-2012指南文件,对Lym202001和Lym202002两个批号淋巴细胞亚群计数自制参考物质百分和绝对计数的均匀性和稳定性进行评估,联合9家临床实验室对其百分和绝对计数进行定值;②自制参考物质在性能验证中的应用:A.精密度验证:参考ICSH和ICCS、CLSIH62等指南文件,批内精密度使用1份自制参考物质、2份进口质控品和3份新鲜临床标本,在一个实验批内,每份标本分别标记3次,每管重复上机检测3次;日间精密度验证方案见室内质量控制应用,将室内质控结果的变异系数（CV）与厂家说明书和基于生物学变异（BV）数据计算的不精密度质量规范指标进行比较;B.线性范围验证:参考EP6-A指南文件,使用自制参考物质进行浓缩稀释配制出不同浓度梯度的标本进行线性范围验证,同时采用WS/T 420-2013和EP6-A评价方法对验证结果进行评价。C.正确度验证:参考EP15-A3指南文件,在同一实验批内,分别对已定值的两个批号自制参考物质重复标记5次,共进行5批实验,计算检测结果的总均值,根据自制参考物质的定值结果计算正确度验证区间,并将检测结果的偏倚与基于BV数据计算的允许偏倚质量规范指标进行比较。③自制参考物质在室内质量控制中的应用:参考WS/T 641-2018文件,使用1个批号自制参考物质和1个批号进口质控品,在一个实验批内,每份标本重复上机检测3次,每周开机检测2次,持续2个月,比较两者的室内质控应用效果。（2）CD34+细胞计数的检测现状及参考物质的初步评价:①检测现状调查:以参加CD34+细胞计数全国室间质评的101家实验室为调查对象,通过问卷调查和参考物质检测,收集相关检测方法学信息及参考物质检测结果。参考国内外指南文件确定CD34+细胞计数的质量控制要求,对调查实验室的遵循情况进行分析,以提出具体改进意见或建议;②参考物质均匀性评价和长期稳定性监测:参考ISO Guide 35和JJF1343-2012对参考物质均匀性进行评价,并对参考物质的长期稳定性进行监测,第0～12周内,每周检测一次,12周后每两周检测一次,以评价参考物质的稳定期限。结果（1）淋巴细胞亚群计数自制参考物质的评价与应用研究:①自制参考物质的评价:Lym202001和Lym202002各检测参数均匀性良好,且在2～8℃贮存条件下可稳定27周（6个月）。Lym202001 批号的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+和 CD3-CD16/56+的百分计数（%）定值结果分别为:62.8±3.4、15.4±1.4、41.7±3.7、19.1±2.3 和 17.9±3.0,绝对计数（个/μL）定值结果分别为:649±92、158±19、428±45、199±41 和 186±46;Lym202002批号的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+和 CD3-CD16/56+的百分计数（%）定值结果分别为:76.6±3.8、38.2±1.9、33.3±2.9、6.6±1.0 和 13.8±2.3,绝对计数（个/μL）定值结果分别为:892±130、439±78、387±55、75±19和157±43。②性能验证结果:批内精密度和日间精密度检测结果的CV均小于厂家说明书或基于BV的适宜或最低水平的不精密度质量规范;线性范围验证各检测参数线性回归方程的R2均大于0.995,各参数线性误差和检测不精密度均在允许范围内,表明各亚群检测结果在所验证范围内呈线性;正确度验证各检测参数的均值均在验证区间内,且偏倚在基于BV的适宜水平的允许偏倚范围内。③室内质量控制应用结果:自制参考物质各参数检测结果的CV与进口质控品变异水平接近,且均在基于BV的不精密度允许范围内。（2）CD34+细胞计数的检测现状及参考物质的初步评价:①检测现状调查:共收到97家实验室回报的调查问卷信息,99家实验室回报的参考物质检测结果。问卷调查数据显示实验室对设门方案、移液方式和获取细胞数等关键质量控制要求的遵循率较高,分别为92.8%、83.9%和82.5%;而对采用全血质控品开展室内质量控制、溶血素的选择、样品是否洗涤、是否报告绝对计数以及仪器的质量控制等质量控制要求的遵循率较低,分别为5.2%、28.9%、39.2%、46.4%和55.7%。参考物质检测结果显示,国内实验室百分计数的CV与CAP质评数据相近,但绝对计数CV要大于CAP数据。②参考物质均匀性评价和长期稳定性监测:本次调查所发放的参考物质均匀性符合要求,长期稳定性监测结果显示该参考物质在2～8℃贮存条件下可稳定20周。结论（1）本研究中的淋巴细胞亚群计数自制参考物质具有良好的均匀性和长达6个月的稳定期,联合多家临床实验室对其百分计数和绝对计数同时进行定值后,可用于淋巴细胞亚群计数的性能验证和室内质量控制。（2）临床实验室对部分CD34+细胞计数质量控制要求的遵从性较差,绝对计数结果的实验室间差异较大,建议实验室加强CD34+细胞计数质量控制相关培训,特别是绝对计数方法和技术要求的培训。CD34+细胞计数参考物质具有良好的均匀性和较长的稳定期,能够满足室内质量控制和室间质量评价对参考物质的要求。
刘青武[4]（2021）在《回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究》文中认为背景:慢性皮肤溃疡是糖尿病、放化疗、周围血管病等常见的并发症,是外科常见病及多发病,迁延难愈,愈后常复发。尤其是长期不愈合,呈现疮面清冷,脓液稀薄,疮周紫黯不温的症状,在中医属于阴证疮疡的疮面,治疗难度最大。近年来,以间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）为主的细胞治疗在慢性创面修复中取得较大进展,但植入MSCs修复溃疡的治疗方法,存在细胞来源不稳定、操作复杂、不良反应及费用昂贵等不足,临床使用和推广困难。慢性皮肤溃疡属于中医“疮疡”的范畴,其中慢性皮肤溃疡阴证具有“肾精虚衰”的特点。北京中医医院皮外科奠基人赵炳南教授及其传人王玉章、吕培文教授以益肾填精、活血通络的回阳生肌汤治疗慢性皮肤溃疡阴证安全有效。鸡血藤作为回阳生肌汤活血通络的主要成分,其促进骨髓造血功能的作用受到广泛报道,但鸡血藤用于创面修复的研究较少。干细胞具有中医“肾精”的属性,因此提出回阳生肌汤通过益肾填精、活血通络促进内源性骨髓MSCs的增殖,提升其趋化和迁移能力,达到化生气血、生肌长肉,而促进慢性皮肤溃疡创面愈合的假说。研究将通过体内和体外实验加以验证,探索回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤治疗慢性皮肤溃疡阴证的作用和靶点。目的:研究回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤促进慢性皮肤溃疡愈合过程中,对MSCs增殖、趋化和迁移功能的调节作用及其机制,为临床中医血管外科防治慢性皮肤溃疡阴证提供实验基础和理论依据。方法:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:BALB/C小鼠灌胃给药,制备含药血清,采用高效液相色谱串联质谱技术（Ultra-performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）对回阳生肌汤和鸡血藤水提物的入血成分进行分析;2.体内实验:（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:采用db/db糖尿病小鼠背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法制备糖尿病伤口模型,并使用回阳生肌汤干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;采用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色观察创面组织学形态;提取小鼠全骨髓细胞,采用显微镜下计数方法观察骨髓细胞数量;流式细胞术检测骨髓中干细胞标志物CD29、CD44、干细胞表面抗原（Stem cell antigen 1,Sca-1）、CD117阳性细胞比例;免疫荧光染色检测创面中MSCs标志物CD29、CD271阳性细胞数量;炎症因子芯片检测创面中白介素3（Interleukin 3,IL-3）、IL-6、IL-13等炎症因子表达;（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:采用尾静脉注射（8mg/kg）的多柔比星联合背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法,制备骨髓抑制大鼠伤口模型,并使用回阳生肌汤和鸡血藤水提物进行干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;称量胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数和脾指数;采用血常规检测观察外周血白细胞数量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测了大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor,G-CSF）的浓度;HE及Masson染色并观察创面组织学形态和胶原含量;免疫荧光染色检测创面中CD34、CD133阳性细胞数量;流式细胞术检测骨髓及外周血中CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例;采用骨髓细胞贴壁培养法提取和纯化各组药物干预后大鼠的BMSCs;EdU染色检测BMSCs的增殖能力;划痕和Transwell试验检测BMSCs的迁移和趋化能力;Western Blot法检测SDF-1和趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）蛋白的相对表达量。3.体外实验:采用全骨髓细胞贴壁培养法纯化大鼠BMSCs;流式细胞术、成脂和成骨分化鉴定BMSCs;使用H2O2刺激BMSCs制作氧化应激BMSCs模型,并使用回阳生肌汤提取物和鸡血藤水提物干预;采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测BMSCs的增殖活力;划痕试验检测BMSCs的迁移能力;Transwell趋化试验检测BMSCs的趋化能力;Western Blot法检测BMSCs中SDF-1和CXCR4蛋白表达水平。结果:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:（1）对回阳生肌汤的入血成分进行分析,共得到19个化合物,包括黄酮类,萜类,皂苷类及糖类,含量较高者分别为刺芒柄花苷、汉黄芩素、马钱素、（6αR,11αR）-10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷、16-氧乙酰茯苓酸甲酯、莫诺苷、核黄素、β-谷甾醇、奥刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,主要来自鸡血藤、牛膝、苍术、山茱萸、黄芪、茯苓;（2）对鸡血藤水提物的入血成分分析,共得到8个化合物,均为黄酮类化合物,含量由高到低分别为芒柄花黄素、阿夫罗摩辛、异甘草素、大豆素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、密花豆素、樱黄素、卡亚宁。2.体内实验（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠创面愈合率升高;在创面中,与模型组相比,创面肉芽组织新生增多,MSCs 标志物 CD29、CD271 阳性细胞数量增多,IL-3、IL-6、IL-15、Fas 配体（Fas ligand,Fas L）表达升高,IL-13、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、细胞间黏附分子-1（Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、趋化因子LIX/CXCL5表达降低;在骨髓中,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠骨髓细胞数量增加,骨髓中MSCs标志物CD29、CD44、Sca-1阳性细胞比例升高。（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组和鸡血藤水提物可提高模型大鼠的创面愈合率,升高胸腺指数和脾指数;在创面中,与模型组比较,可见回阳生肌汤组和鸡血藤水提物组大鼠中创面炎性细胞数量减少,胶原合成增加,干细胞标志物CD34、CD133阳性细胞数量增多;在骨髓中,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增加;在外周血中,与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组血清中SDF-1和G-CSF的浓度升高,白细胞数量增加,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增多;分离提取药物干预后的原代大鼠BMSCs,与模型组比较,可见回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖细胞数量增加,迁移能力和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达增多。3.体外实验:大鼠BMSCs细胞呈梭形,呈旋涡状、席纹状排列,折光性良好;第三代细胞MSCs标志物CD29、CD44阳性细胞比例分别99.9%和97.8%,造血干细胞表面标志物CD45表达率为0.47%。氧化应激状态下的原代大鼠BMSCs的增殖活力降低,趋化和迁移能力下降;与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖活力升高,迁移和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达升高。结论:1.回阳生肌汤和鸡血藤入血成分主要为黄酮类化合物,提示黄酮类化合物在回阳生肌汤和鸡血藤的药效中发挥了重要作用;2.回阳生肌汤干预db/db糖尿病小鼠伤口模型,能够加速创面愈合,并促进小鼠骨髓BMSCs的增殖,增加创面干细胞的数量,调控创面的炎症反应,促进肉芽组织新生;3.回阳生肌汤和鸡血藤水提物干预骨髓抑制大鼠伤口模型,能够促进大鼠血清SDF-1和G-CSF的分泌,且激活模型大鼠BMSCs SDF-1/CXCR4信号轴,促进骨髓干细胞的增殖、迁移和趋化能力,并动员干细胞进入外周血中,增加创面干细胞的数量,促进胶原合成,加速创面的修复;4.回阳生肌汤和鸡血藤水提物在体外作用于大鼠BMSCs,能够激活SDF-1/CXCR4信号轴,保护氧化损伤的BMSCs的活性,提升氧化损伤状态下BMSCs的迁移和趋化能力。
胡梦佳[5]（2021）在《SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究》文中研究指明随着核能与核相关技术在工农业生产、医疗、军事等多个领域的广泛应用,由电离辐射（ionizing radiation,IR）引起的放射损伤也越发常见。骨髓（bone marrow,BM）对射线极度敏感,短时间内受照剂量超过1.0 Gy就足以产生明显的造血系统损伤。中高剂量的电离辐射还会严重扰乱造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的稳态,导致其数量急剧减少,最终引起骨髓造血功能衰竭,但其中的机制仍未阐明,目前也无有效的救治措施。因此,进一步揭示骨髓造血干细胞稳态调节的关键因素,以及放射损伤后造血干细胞枯竭和造血功能衰竭的发生机理,对寻找新的救治策略以及研制相关新药具有重要的指导意义。成熟的血细胞寿命有限,必须由造血干细胞通过增殖、分化进行补充。造血干细胞具有自我更新和向各系造血细胞分化的能力。根据存活时间长短和自我更新能力强弱,造血干细胞又分为长期造血干细胞（long-term HSC,LT-HSC）、短期造血干细胞（short-term HSC,ST-HSC）和多能祖细胞（multipotent progenitor,MPP）。成体造血干细胞主要处在氧分压较低的骨髓龛（niche）中,其具有独特的代谢特点,即主要依赖无氧的糖酵解为其生命活动提供能量,有氧代谢则处于相对抑制的状态。而在各种应激（如辐照、感染和化疗）条件下,它原有的代谢模式会发生转变,逐渐向线粒体代谢倾斜,以满足能量增加的需求。在正常情况下,骨髓组织中的大部分造血干细胞都处于静止或者静息状态,尤其是LT-HSC基本上处于休眠状态,这是维持其稳态并防止电离辐射和细胞毒性物质损伤的关键。虽然在过去的50多年中,国内外的研究人员已经发现了多种关键的造血调节因子,但造血干细胞稳态的精确调控机制尚未完全阐明,亟待深入地探索和研究。类固醇受体活化辅激活因子3（steroid receptor coactivator 3,SRC-3）,是SRC家族（包括了SRC-1、SRC-2和SRC-3三个同源性蛋白）中的一个成员。作为核受体和其他转录因子的辅助活化因子,SRC-3可以招募转录所必需的组蛋白乙酰化酶以及其他一些转录共激活分子,调控靶基因的转录,从而在机体生长发育、性器官成熟、能量代谢等多个方面发挥着重要的生物学功能。由于SRC-3在多种肿瘤细胞（包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等）中高表达,因此之前的研究主要聚焦于它与肿瘤发生和发展之间的关系,而对它在造血系统中的作用知之甚少。但有文献报道,SRC-3敲除后小鼠外周血中白细胞显着增多,血小板显着减少。我们前期研究也发现,SRC-3基因敲除小鼠(SRC-3-/-)骨髓巨核细胞多倍体明显减少,并且其对辐照的敏感性明显增加,然而潜在的机制并不清楚,这种缺陷很可能来自于造血干/祖细胞层面。同时,我们也发现普通C57小鼠辐照后骨髓造血干细胞中SRC-3表达显着降低,提示SRC-3的下降很可能是辐照后造血干细胞稳态失衡的重要原因。最近还有研究指出,SRC-3是胚胎干细胞和肿瘤干细胞多能性网络的关键分子。据此,我们推测SRC-3可能对造血干细胞的稳态和功能具有潜在的调控作用。此外,以SRC-3为靶点,有望为骨髓放射损后造血干细胞稳态的失衡探寻新的救治方法。因此,本研究首先通过定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot检测了SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达水平;然后主要利用流式细胞术对野生型（wild-type,WT）和SRC-3-/-小鼠骨髓造血干细胞的比例、数量、细胞周期、增殖、凋亡、分化以及动员等情况进行了全面的对比和分析,以明确SRC-3对造血干细胞稳态的调控作用;在此基础上,我们利用小鼠急性放射损伤模型,观察了SRC-3对造血干细胞的辐射保护作用,并通过非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植等实验研究了SRC-3缺失对造血干细胞长期造血重建能力的影响;最后,通过全转录组芯片、流式细胞术、免疫沉淀、Seahorse分析、慢病毒转染等技术对SRC-3调控造血干细胞稳态的机制进行深入的分析和探讨。主要研究结果及结论如下:1、定量PCR、流式细胞术、免疫荧光和Western blot结果显示,SRC-3在小鼠骨髓造血干细胞中的表达显着高于造血祖细胞以及分化成熟的细胞,这种特殊的表达模式提示SRC-3对造血干细胞可能具有潜在的调控作用。2、流式细胞术检测发现,SRC-3敲除后小鼠骨髓中造血干细胞的总数显着增加;在造血干细胞亚群中,LT-HSC的比例升高,MPP的比例降低,ST-HSC的比例没有显着变化;在造血祖细胞中,髓系共同祖细胞（common myeloid progenitor,CMP）的比例显着降低,但是粒单系祖细胞（granulocyte monocyte progenitor,GMP）、巨核系-红系祖细胞（megakaryocyte erythroid progenitor,MEP）和淋巴系共同祖细胞（common lymphoid progenitor,CLP）的比例并没有发生显着变化。这些结果表明SRC-3的存在有助于维持骨髓中造血干/祖细胞比例和数量的平衡。3、Ki67和Brd U染色结果显示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞的静止状态受到扰乱,导致其过度增殖和活化;另外,定量PCR结果也显示,SRC-3敲除后造血干细胞中细胞周期蛋白Cyclin E1和Cyclin E2显着上调,细胞周期抑制因子P21和P27显着下调。这表明SRC-3参与了造血干细胞静止状态的维持。4、SRC-3敲除后小鼠脾脏和外周血中造血干细胞的比例显着增加,说明SRC-3缺失促进了造血干细胞从骨髓向外周的动员。5、利用小鼠急性放射损伤模型,我们发现与野生型小鼠相比,SRC-3敲除小鼠在辐照之后骨髓造血干细胞的恢复明显减慢,DNA损伤和凋亡也显着增加,说明SRC-3对造血干细胞具有辐射保护作用;此外,SRC-3敲除也增加了造血干细胞对5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）的敏感性。这些可能是由于SRC-3敲除后造血干细胞失去静止、异常增殖所致。6、非竞争性骨髓移植、竞争性骨髓移植、反向骨髓移植等实验证实SRC-3缺失损伤了造血干细胞的长期造血重建能力,并且SRC-3主要是通过内在性的机制调控了造血干细胞的稳态。7、全转录组芯片提示,SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中线粒体相关成分显着上调,氧化磷酸化通路显着活化;进一步的实验证实,SRC-3缺失增加造血干细胞中线粒体的数量、膜电位以及代谢活性。8、SRC-3敲除后小鼠骨髓造血干细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的水平显着增加,并且这些活性氧主要来源于线粒体,因此抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）的处理可部分逆转SRC-3缺乏后造血干细胞的异常表型和功能。9、SRC-3缺失导致造血干细胞中乙酰化酶GCN5的表达显着下调,从而降低了过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活蛋白1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivators 1α,PGC-1α）的乙酰化水平并导致其活化,最终促进了线粒体的能量代谢。因此通过慢病毒转染过表达GCN5可明显改善SRC-3缺失诱导的造血干细胞表型和功能的缺陷。总之,通过本研究,我们首次揭示了SRC-3是一个参与造血干细胞稳态调控的关键因子,同时明确了SRC-3对造血干细胞的辐射保护以及功能维持作用,也进一步阐明了SRC-3调节造血干细胞稳态和功能的分子机制,为放射损伤条件下造血干细胞稳态失衡的防治提供了一定的指导。
张爱君[6]（2021）在《IgD-Fc-Ig融合蛋白对急性T淋巴细胞白血病动物模型的作用及其对mTORC2/Akt信号的调控》文中提出急性T淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）是前体T淋巴细胞克隆性增生,引起正常造血受抑制的一组异质性恶性疾病。临床上的表现主要包括白细胞计数升高、中性粒细胞和血小板减少、造血功能衰竭、淋巴结或中枢神经系统浸润,有部分患者会出现纵膈肿块。T-ALL占儿童急性淋巴细胞白血病的10%-15%,约占成人急性淋巴细胞白血病的25%,并且男性中的发病率是女性的两倍。临床对T-ALL的诊断主要依靠免疫学检测,欧洲白血病免疫分类小组根据胸腺内分化的相应阶段提出将T-ALL分为:pro-T、pre-T、cortical-T和mature-T几个阶段,pro-T（c CD3+,s CD3-,CD1a-,CD2+,CD5-,CD7+,CD34-）,pre-T（c CD3+,s CD3-,CD1a-,CD2+,CD5+,CD7+,CD34-）,cortical-T（c CD3+,s CD3+/-,CD1a+,CD2+,CD5+,CD7+,CD34-）和mature-T（c CD3+,s CD3+,CD1a-,CD2+,CD5+,CD7+,CD34-）。近几十年来为改善T-ALL的治疗人们做出了巨大努力,多药联合和大剂量化疗等治疗手段不断改进及各类造血干细胞移植的应用和推广,使得T-ALL的无事件生存率得以提高,但对耐药或复发T-ALL患者治疗效果仍然较差,该病的总体疗效和预后远不如常见的急性B淋巴细胞白血病。因此,发掘特异性更高的T-ALL治疗靶点,探究T-ALL发病机制,具有十分重要的临床意义。1965年首次发现免疫球蛋白D（Immunoglobulin D,IgD）,包括分泌型IgD（secreted IgD,s IgD）和膜结合型IgD（membrane IgD,m IgD）。IgD本身可以作为B细胞表面受体,另外还可以与膜受体即免疫球蛋白D受体（Immunoglobulin D receptor,IgDR）结合发挥功能,人类外周血T细胞和小鼠T细胞上都发现有IgDR的存在。T细胞上IgDR与IgD相互作用可导致抗原特异性T细胞克隆增加,而T细胞上IgDR与B细胞上m IgD交联可抑制T细胞凋亡。本课题组前期研究发现s IgD在弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）患者血清中表达较健康志愿者明显升高;IgD可以上调Burkitt淋巴瘤细胞Daudi表面IgDR的表达,可以显着地促进Daudi细胞的增殖,减少细胞凋亡,加速细胞周期从G1期到S期的转化进程。前期体外实验发现人外周血CD4+T细胞和人T-ALL细胞株（Jurkat、MOLT-4细胞）均存在IgDR,IgD及IgD-Fc-Ig可以与CD4+T、Jurkat和MOLT-4细胞上IgDR结合,IgD-Fc-Ig可以抑制IgD诱导的Jurkat和MOLT-4细胞的增殖,并促进IgD抑制的Jurkat和MOLT-4细胞的凋亡,Western blot结果观察到IgD-Fc-Ig抑制了IgD上调的mTOR、Rictor和p-Akt（Ser473）水平。结果提示IgD/IgDR有可能成为T-ALL的治疗新靶点,特异性阻断IgD/IgDR信号转导可能通过影响mTORC2/Akt信号通路成为T-ALL的免疫新疗法。课题组前期体外实验发现IgD-Fc-Ig能够抑制IgD诱导的T-ALL细胞株增殖,下调mTOR、Rictor和p-Akt（Ser473）蛋白表达。因此,本课题将结合临床T-ALL样本和T-ALL动物模型,进一步研究IgDR在T-ALL患者和健康对照者中表达差异,IgD-Fc-Ig体外对T-ALL患者T细胞以及体内给药对T-ALL动物模型的影响。本课题以IgD/IgDR为靶点,成功将人IgD-Fc段与人Ig G1-Fc段连接并合成了融合蛋白IgD-Fc-Ig（Idfigine,艾迪非吉）,旨在特异性阻断IgD-IgDR通路,高选择性抑制T细胞的异常增殖,已获得中国发明专利授权。本课题以T-ALL患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）、C57BL/6小鼠胸腺T细胞、鼠T-ALL细胞株EL-4细胞和T-ALL小鼠模型为研究对象,观察T-ALL患者和健康对照者外周血T细胞上IgDR的差异,检测IgD对T-ALL患者T细胞功能的作用及IgD-Fc-Ig的作用,观察IgD和IgD-Fc-Ig对C57BL/6小鼠胸腺T细胞和EL-4细胞株增殖、凋亡和相关蛋白的影响,并通过T-ALL小鼠模型的建立,在整体水平观察IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠治疗作用,为将IgD-Fc-Ig开发为高选择性治疗T-ALL创新药物研究提供实验依据。目的:明确T-ALL患者和健康对照者外周血中特征性标记物T细胞亚群上IgDR表达的差异,明确IgD对T-ALL患者特征性标记物T细胞亚群增殖的影响及IgD-Fc-Ig的作用,明确IgD对C57BL/6小鼠胸腺T细胞和EL-4细胞增殖、凋亡的作用及IgD-Fc-Ig作用,并研究相关机制。揭示IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠的治疗作用及部分机制。为阐明IgD/IgDR信号转导通过调控mTORC2/Akt信号通路在T-ALL发病中的作用和机制,并将IgD-Fc-Ig作为治疗T-ALL的创新药物提供实验依据。方法:收集T-ALL患者和健康人外周血,离心收集血浆,通过Ficoll密度梯度离心法得到PBMCs用于培养检测相关指标,流式细胞术和激光共聚焦检测外周血中特征性标记物T细胞亚群上IgDR表达情况,流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞增殖的影响;CCK-8法检测IgD对C57BL/6小鼠胸腺T细胞活力的影响,CCK-8法检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的EL-4细胞活力的影响,流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD抑制的EL-4细胞凋亡的影响;Western blot法检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的EL-4细胞mTOR、Rictor、Akt、p-Akt（Ser47）蛋白的表达情况;选用BALB/c裸鼠建立Jurkat异种移植T-ALL小鼠模型,将裸鼠随机分出一组为正常组,其余裸鼠尾静脉移植细胞,选取造模成功的裸鼠随机分为模型组、IgD-Fc-Ig三个剂量组（1.625、3.25、6.5mg/kg）、阴性对照组Ig G-Fc（6.5mg/kg）、阳性对照组阿霉素（Adriamycin,3mg/kg）,正常组8只,其余各组9只。ELISA检测T-ALL小鼠血清IgD的水平;瑞氏-吉姆萨染色法检测IgD-Fc-Ig对各组小鼠外周血和骨髓中Jurkat细胞的影响;流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠骨髓和脾脏中Jurkat细胞的影响以及对IgDR、IgD型浆细胞和外周血淋巴细胞凋亡的影响;研究IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠整体指标和肝脾病理学改变的影响;Western blot法检测T-ALL小鼠脾脏中mTOR、Rictor、Akt、p-Akt（Ser473）蛋白的表达情况。结果:1.T-ALL患者和健康对照者外周血中特征性标记物T细胞亚群的IgDR表达差异收集T-ALL和健康对照者各8名,患者年龄范围为15～69岁,男女比例为1:1,流式细胞术检测结果显示:T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群上IgDR显着高于健康对照者,T-ALL患者和健康对照者在pro-T阶段（CD7+CD5-CD3-CD4-）细胞表面就已经存在IgDR,T-ALL患者各个阶段的T细胞上IgDR水平高于健康对照者,差异有统计学意义。2.T-ALL和健康对照者外周血中CD7+T细胞和IgDR表达的差异激光共聚焦结果显示:再次验证CD7+T细胞上表达IgDR,部分T-ALL患者的CD7+T细胞上的IgDR比健康对照者表达高,与流式细胞术结果保持一致。3.IgD对T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响IgD（1、3和10μg/ml）体外刺激T-ALL患者PBMCs,流式细胞术结果显示,IgD（3、10μg/ml）浓度组体外刺激24h,可明显促进T-ALL患者pro-T（CD7+CD5-CD3-CD4-T）和mature-T（CD7+CD5+CD3+CD4-T、CD7+CD5+CD3+CD4+T）细胞表达。4.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响流式细胞术结果显示:IgD（3、10μg/ml）浓度组可明显促进T-ALL患者外周血中CD7+CD5-CD3-CD4-T、CD7+CD5+CD3+CD4-T和CD7+CD5+CD3+CD4+T表达,IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）浓度组能下调IgD诱导的CD7+CD5-CD3-CD4-T、CD7+CD5+CD3+CD4-T和CD7+CD5+CD3+CD4+T的表达。5.IgD对C57BL/6小鼠胸腺T细胞活力的影响CCK8结果发现,人源的IgD可以刺激鼠源的T细胞,并且IgD（3、10μg/ml）浓度组能上调小鼠T细胞活力。6.IgD对T-ALL鼠源EL-4细胞株活力的影响CCK8结果显示IgD（3、10μg/ml）浓度组可以促进鼠源T-ALL细胞株EL-4细胞的活力。7.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的T-ALL鼠源EL-4细胞株活力的影响CCK8结果显示:IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）可显着抑制IgD诱导的EL-4细胞增殖,Ig G-Fc蛋白（10μg/ml）对IgD的作用无显着影响。8.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的EL-4细胞凋亡的影响流式细胞术结果发现,IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）可显着上调IgD抑制的EL-4细胞凋亡,Ig G-Fc（10μg/ml）对IgD的作用无显着影响。9.IgD对EL-4细胞mTOR、Rictor、Akt和p-Akt（Ser473）蛋白表达的影响及IgD-Fc-Ig的作用Western blot法的结果显示,IgD（3μg/ml）显着上调EL-4细胞中mTOR、Rictor、和p-Akt（Ser473）蛋白的表达,IgD-Fc-Ig（3、10μg/ml）下调IgD诱导的mTOR、Rictor、和p-Akt（Ser473）蛋白表达。10.T-ALL小鼠模型的建立与评价本课题通过尾静脉移植方式进行T-ALL模型的建立,结果显示:T-ALL小鼠第7天未出现明显变化,第14天开始表现出嗜睡、饮食欠佳等状态,第21天尾静脉移植组出现弓背、消瘦、活力减低和明显萎靡不振等现象,第28天则有部分裸鼠出现濒死状态,伴有脊柱弯曲。正常对照组裸鼠正常生长,活泼好动,食欲精神良好,未出现病态体征。11.模型小鼠Jurkat细胞在外周血中浸润变化瑞氏-吉姆萨染色结果显示:正常对照组外周血中未见Jurkat细胞,以红细胞为主,有核细胞少见。尾静脉移植组在第7天时,外周血中存在少量的Jurkat细胞,到第10天时,有核细胞明显增多,Jurkat细胞数量也高于第7天。流式细胞术结果则显示:在第14天时外周血中Jurkat细胞与第7天时结果差异有显着性,综合以上结果,提示我们第10天开始给药。12.T-ALL小鼠血清中IgD水平的变化与正常组小鼠相比,T-ALL小鼠血清IgD水平显着高于正常组。13.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠外周血和骨髓中Jurkat细胞的影响取外周血和骨髓细胞进行涂片,通过随机选取3个视野记录有核细胞数和Jurkat细胞数,瑞氏-吉姆萨结果显示,模型组小鼠外周血中Jurkat细胞百分比最高,可以高达11.21%,IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阿霉素（3 mg/kg）组显着降低外周血中Jurkat细胞百分比,差异有统计学意义。骨髓中的流式结果显示:模型组小鼠骨髓中Jurkat细胞百分比最高,IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阿霉素（3mg/kg）组显着降低骨髓中Jurkat细胞百分比,差异有统计学意义。14.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏和骨髓中Jurkat细胞的影响Jurkat细胞表面标志物为CD3,流式细胞术检测不同组小鼠脾脏和骨髓中CD3的表达,结果显示,T-ALL小鼠脾脏和骨髓中Jurkat细胞百分比最高,而给药组中IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阿霉素（3 mg/kg）能明显降低T-ALL小鼠脾脏和骨髓中Jurkat细胞的浸润率。15.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏中Jurkat细胞IgDR的影响流式细胞术检测T-ALL小鼠脾脏中Jurkat细胞IgDR表达情况,结果显示:模型组裸鼠脾脏中Jurkat细胞IgDR表达高于正常组,给药组中IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阳性药阿霉素能降低脾脏细胞IgDR表达,差异有统计学意义。16.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏中IgD型浆细胞的影响用取得的T-ALL小鼠脾脏细胞用流式细胞术检测CD19-CD138+IgD+细胞,结果发现模型组小鼠中表达CD19-CD138+IgD+细胞高于正常对照组,差异有统计学意义。给药组中IgD-Fc-Ig（6.5 mg/kg）和阳性药阿霉素能显着降低CD19-CD138+IgD+的表达,差异有统计学意义。17.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠外周血淋巴细胞凋亡的影响流式细胞术检测T-ALL小鼠外周血淋巴细胞凋亡的情况,结果显示,IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阳性药阿霉素可以增加T-ALL小鼠外周血淋巴细胞凋亡率,差异有统计学。18.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏病理和肝脏病理的影响处死小鼠,取脾脏和肝脏,进行HE染色,观察组织病理变化。结果发现,正常组小鼠脾脏可见红髓和白髓整齐分布,白髓是由中央动脉和动脉周围的淋巴鞘组成,红髓由脾窦和脾索组成。模型组小鼠切片可见红髓与白髓的界限消失,白髓严重萎缩,Jurkat肿瘤淋巴细胞聚集成团或分散,给药组中IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）和阳性药阿霉素可改善病理改变。肝脏组织HE染色结果显示,正常组裸鼠肝组织结构完整,肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列,无组织病理学变化。模型组裸鼠肝组织切片可见Jurkat细胞浸润,出现部分肝组织坏死,肝脏正常组织结构被破坏,给药组中IgD-Fc-Ig（3.25、6.5 mg/kg）可改善病理改变。19.IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏p-Akt（Ser473）、Akt、mTOR、Rictor蛋白表达的影响Western blot法检测不同组别小鼠脾脏p-Akt（Ser473）、Akt、mTOR和Rictor的蛋白表达,结果显示,Akt总蛋白表达在正常组、模型组以及给药组之间无明显差异,而模型组小鼠p-Akt（Ser473）、mTOR和Rictor蛋白表达明显升高,IgD-Fc-Ig（3.25、6.5、13 mg/kg）能下调T-ALL小鼠中升高的p-Akt（Ser473）、mTOR和Rictor蛋白表达。结论:1.部分T-ALL患者外周血中T细胞上IgDR表达高于健康对照者,IgD可以升高T-ALL患者中pro-T（CD7+CD5-CD3-CD4-T）和mature-T（CD7+CD5+CD3+CD4-T、CD7+CD5+CD3+CD4+T）细胞的百分比,IgD-Fc-Ig可以降低IgD诱导的T-ALL患者pro-T和mature-T细胞的百分比。2.IgD可以刺激C57BL/6小鼠胸腺T细胞和EL-4细胞的增殖,抑制EL-4细胞的凋亡,IgD-Fc-Ig抑制IgD引起的EL-4细胞增殖,促进IgD抑制的EL-4细胞凋亡,下调IgD诱导的EL-4细胞mTOR、Rictor和p Akt（Ser473）蛋白表达。3.T-ALL模型小鼠血清IgD水平高于正常小鼠,IgD-Fc-Ig改善T-ALL小鼠的整体指标,降低Jurkat细胞在外周血、脾脏和骨髓中的浸润率,减轻肝脾组织病理程度。4.IgD-IgDR可能通过调控mTORC2/Akt信号通路成为T-ALL治疗的一个新靶点,IgD-Fc-Ig对伴有高IgD水平或高IgDR活性的T-ALL治疗可能具有重要前景。
葛洋洋[7]（2020）在《CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究》文中提出急性髓系白血病（Acute Myeloid leukemia,AML）占成年人急性白血病的80%左右。现行AML治疗多采用以阿糖胞苷为基础的联合化疗方案,完全缓解率在70%左右。但是,化疗药物的攻击会使AML细胞上调某些耐药相关蛋白的表达,降低细胞对化疗药物的敏感性,同时还引导细胞向骨髓、脾脏等基质细胞丰富的组织器官趋化归巢,在其中形成微小残留病灶,导致患者易耐药和复发,三年内的复发率高达50%-60%。化疗药物普遍缺乏靶向性,会带来严重的毒副作用,老年患者对于化疗的耐受尤其差;而复发或难治性AML患者对化疗不再敏感,也难以再从化疗中受益。此外,AML细胞遗传学异常复杂,涉及数千种基因突变,针对基因突变的靶向药物的研发充满挑战,迄今进入临床的数量极为有限。目前国际上AML的五年总生存率仅为25%左右,因此,迫切需要研发更为有效的新技术和新治疗手段。已有研究表明,多种类型的AML细胞表面会表达某些共同的耐药相关抗原,成为AML治疗和药物研发的靶标蛋白,趋化因子受体CXCR4是其中一种。CXCR4高表达的AML细胞可通过与配体CXCL12相互作用,归巢到骨髓微环境中,从中获得增殖和耐药信号;同时,在CXCL12的招募下,向脾脏和肝脏等器官中浸润。临床上已明确CXCR4高表达与AML患者的不良预后密切相关。目前有若干CXCR4拮抗剂在临床Ⅰ期或Ⅱ期研究阶段,尚未获批用于AML治疗。我们实验室前期根据CXCR4的序列特征自主研发了一种新的化学合成CXCR4拮抗多肽（E5）,可有效干扰多种人源AML细胞系的CXCR4/CXCL12生物轴,抑制细胞的迁移和粘附,并在急性早幼粒白血病异种移植瘤小鼠模型中表现出良好的抗肿瘤效果。基于以上背景,本课题的研究思路与目标是将CXCR4拮抗多肽E5与两亲性磷脂大分子培化磷脂酸乙醇胺（Distearoyl phosphoethanolamine-PEG,简称DSPE）组装成负载E5的胶束（命名为M-E5）,一方面提高其在溶液中的稳定性,以期在难治性白血病小鼠模型上获得更好的拮抗治疗效果;同时,将其作为靶向CXCR4的药物递送平台,将化疗药盐酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride,简称Dox）负载到M-E5中,提高难治性AML小鼠的化疗效果。本文制备了两种胶束:首先,利用涡旋混合、超声和55℃加热等,制备得到了负载CXCR4拮抗多肽E5的胶束（M-E5）。在此基础上,将Dox引入到M-E5中,制备出负载E5和Dox且载药比例可调的胶束（M-E5-Dox）。采用透射电子显微镜、原子力显微镜及动态光散射等方法对上述两种胶束的粒径、表面电势及形貌进行了表征。结果表明,E5可单独或与Dox共同负载到DSPE胶束上。M-E5和M-E5-Dox两种胶束均呈尺寸均一的球形,在5%的葡萄糖溶液或生理缓冲液中稳定分散。用半致死剂量的X射线辐照C57小鼠4h后,通过尾静脉注射来自濒死AML1-ETO（AE）&C-KITD816V小鼠的脾脏细胞,建立了难治性AML小鼠模型。抗体竞争性结合性实验的结果表明,M-E5可与CXCR4的胞外N端结合;迁移实验结果表明,M-E5有效阻止了 CXCL12介导的脾脏和骨髓AML细胞的迁移。体内定植实验的结果显示,M-E5皮下给药24 h后,脾脏和骨髓中AML细胞的比例显着降低。此外,M-E5能动员AML细胞进入外周血循环,在皮下给药后2 h达到最佳效果。免疫原性实验结果表明,M-E5免疫原性较低,长时间多次皮下注射未诱导机体产生IgG和IgA抗体。对AML小鼠给予皮下注射M-E5治疗后,小鼠外周血、脾脏及骨髓中的AML细胞比例均显着降低;与此同时,外周血中的白细胞数也显着减少。转录组测序分析结果显示,经M-E5治疗后,小鼠AML细胞中上调的基因显着富集到与凋亡和分化相关的生物学过程,而下调的基因显着富集到增殖和粘附相关的生物学过程。通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、免疫组化和流式细胞术对测序分析的结果予以验证,结果显示,脾脏和骨髓AML细胞中与凋亡相关的基因Caspase8和Endog、凋亡蛋白Cleaved-Caspase3以及分化标志物CD11b和Gr-1的表达显着升高,表明M-E5主要通过诱导AML细胞发生分化和凋亡产生抗肿瘤效果。给予皮下注射10mg/kg M-E5治疗后,AML小鼠的中位生存期显着延长。此外,当M-E5与化疗药组合高三尖杉酯碱和盐酸阿霉素联合应用时,可显着提高化疗的效果。此外,M-E5-Dox能够将更多的Dox递送到对盐酸阿霉素耐药的HL60细胞（HL60/A）中,有效增加Dox在该耐药株内的积累,产生了更强的细胞毒性。在难治性AML小鼠模型上,连续4天腹腔注射M-E5-Dox后,在停药第6天,AML小鼠外周血、脾脏、骨髓及肝脏中的AML细胞比例显着降低。与此同时,与各对照治疗组相比,M-E5-Dox组小鼠的中位生存期显着延长。Western blot的分析结果表明,M-E5-Dox使脾脏组织中CXCR4/CXCL12轴下游信号蛋白Erk和p-38的磷酸化水平以及抗凋亡蛋白Mcl-1和CXCR4的表达水平显着降低,因而抗AML的效果显着增强。综上所述,M-E5作为单药可通过拮抗CXCR4/CXCL12生物轴,有效抑制AML细胞在脾脏和骨髓中的定植、动员AML细胞到外周血循环,显着降低外周血、脾脏及骨髓中AML细胞的负荷,延长难治性AE&C-KITD816V小鼠的生存期;也可与化疗药组合（柔红霉素和高三尖杉酯碱）联合应用,增强化疗效果。此外,共载药纳米胶束M-E5-Dox同时具有CXCR4靶向性、CXCR4拮抗功能和Dox的杀伤作用,三者联合作用,有效增强了对AE&C-KITD816V小鼠的治疗效果。
陈凯[8]（2020）在《组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺通过抑制Mcl-1及诱发DNA损伤增敏ABT-199对急性髓系白血病的抗肿瘤效应》文中研究说明急性髓系白血病是一种起源于髓系造血细胞的克隆性恶性增殖血液系统恶性肿瘤,其特征为骨髓内髓系原始或幼稚细胞的失控式快速增长。尽管随着治疗方案的改进,成人AML诱导缓解率达65%-75%,但目前AML患者的5年生存率仅27.4%,欧洲数据库显示,年龄小于60岁的AML患者复发率可达35%（低危组）～80%（高危组）,而大于60岁的患者复发率为60%～85%,一旦复发,预后极差。同时,传统化疗、特别是大剂量化疗产生的严重感染、出血等毒副作用也给患者带来极大的风险,不少患者死于化疗并发症而不是白血病本身。因此,从已在临床应用的安全药物中积极需求一种或多种药物组合,将当前靶向不同靶标、不同信号通路的靶向药物联合应用,以有效安全地清除白血病细胞而对正常造血细胞无影响,无疑具有十分重要的意义和广阔的应用前景。近年来,Bcl-2高度选择性抑制剂ABT-199的诞生,在血液系统恶性肿瘤的研究中引起了极大的反响。其初期研究表明,ABT-199能选择性地靶向Bcl-2,因此能有效且安全地诱导白血病细胞凋亡。然而越来越多研究表明肿瘤细胞接受ABT-199治疗会通过代偿性上调其他抗凋亡蛋白逐步获得耐药性,极大地限制了其有效性和抗瘤谱。目前研究表明表观遗传学调控在AML发生和发展中发挥重要作用,本课题组前期研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）西达本胺可通过染色质组蛋白修饰干扰DNA损伤修复杀伤AML干细胞,还有报道西达本胺可通过p53通路下调Mcl-1表达,提示西达本胺联合ABT-199有望协同杀伤AML细胞。本研究首先证实低杀伤剂量西达本胺联合ABT-199可明显诱导AML细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖能力,抗肿瘤效应呈时间和浓度依赖性。且随着用药时间的延长,存活细胞数目逐渐越少,于72h内白血病细胞逐渐消亡。同时,即使药物撤退后,仍能极大程度地损伤白血病细胞的克隆形成能力。并通过建立细胞系动物模型和来源于FLT3-ITD突变难治复发AML患者的PDX小鼠模型进一步验证西达本胺联合ABT-199的体内抗肿瘤活性。其次,利用AML患者临床样本及造血干细胞移植健康供者的原代细胞,本研究进一步证实西达本胺联合ABT-199不仅可靶向杀伤AML细胞（尤其对高白细胞性白血病患者更有效）,而且对具有白血病干祖细胞表型的原代CD34+CD38-AML细胞亦具有明显的凋亡诱导作用,却不影响正常造血细胞。最后,本研究证实低杀伤剂量西达本胺联合ABT-199发挥协同抗肿瘤作用机制可能是由于西达本胺可通过降低Mcl-1表达、诱发DNA损伤及加剧ABT-199所致线粒体膜电位下降增强线粒体凋亡途径等方式增强了 ABT-199的杀伤AML活性。综上所述,本研究首次提出并验证低杀伤剂量西达本胺增敏ABT-199对AML细胞系及原代细胞的体内外抗白血病作用,并从逆转Mcl-1表达、干扰DNA损伤和增强线粒体凋亡途径等方面探讨了其可能的分子机制,为该药物联合在AML患者中临床转化和日后的临床试验研究中提供明确的理论基础与可靠的实验依据。
姚雯[9]（2020）在《双阴性T细胞治疗移植后复发的急性髓系白血病安全性及有效性研究》文中研究指明异基因造血干细胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）是当前恶性血液病的治疗重要方法。然而,根据国际骨髓移植登记处（CIBMTR）2016～2017年的统计资料显示,患者在接受allo-HSCT后,血液肿瘤的复发仍然是致使患者死亡的主要原因（全相合同胞供体vs非血缘供体移植,59%vs 51%）。我们的研究提示,移植前未缓解的恶性血液患者,即便行非血缘脐血移植,复发所致死亡亦很突出。Allo-HSCT后复发的治疗策略主要包括化学药物再诱导治疗、二次移植、免疫治疗。化学药物再诱导治疗缓解率低,且缓解维持时间短,患者往往会出现再次复发而致最终死亡。而仅有20%左右的患者具有二次移植治疗指征,且二次移植后患者的OS仅为28%～29%,再次复发率高达60%左右。而免疫治疗是最常用的治疗策略。首先,减停免疫抑制剂是早期复发患者治疗的第一步,但仅仅对部分患者有效,对于全面血液学复发、疾病进展快的患者,效果不佳。供者来源的淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion,DLI）可以发挥移植物抗白血病（graft versus leukemia,GVL）效应,从而控制原发病。然而,DLI的主要限制是可能诱导严重的移植物抗宿主病（graft versus host disease,GVHD）,治疗不当或疗效不佳将导致患者死亡。另外,脐带血移植（umbilical cord blood transplantation,UCBT）后复发治疗最大的局限性在于缺乏持续的淋巴细胞来源。因此积极寻找新的治疗策略,弥补UCBT后复发无持续的淋巴细胞来源的缺陷,提高UCBT后复发患者的存活率,是造血干细胞移植治疗中亟待解决的挑战,探寻新的解决策略具有十分重要的临床意义。CD4或CD8分子大多共表达于CD3+T细胞表面,但有极少数的T细胞只表达CD3而不表达CD4、CD8,后者被称为双阴性T细胞（double negative T cells,DNT细胞）。由于人体外周血中DNT细胞含量较少,并且缺乏有效的体外培养和扩增方法,因此其在抗肿瘤中的作用尚未被阐明。Zhang L等研究发现,从接受大剂量化疗后1月内且尚处于完全缓解（complete remission,CR）期的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）患者或健康供者外周血中均能分离出DNT细胞,经特定的体外刺激后可大量扩增,体外能有效杀伤AML细胞株和原代AML细胞,且不诱发GVHD。然而值得注意的是,同种DNT细胞对于不同AML细胞杀伤效率不同,不同DNT细胞对于同种AML细胞的杀伤效率也不同。因此本研究（1）拟寻找对DNT细胞高度敏感/耐受的AML细胞的靶基因;（2）同时通过体外培养第三方健康供者DNT细胞验证其抗白血病效应以筛选供者,并期望通过临床研究进一步评估DNT细胞的体内安全性及有效性。第一部分:脐带血移植挽救性治疗26例未缓解恶性血液病患者结果分析研究目的:了解未缓解的恶性血液病患者行挽救性脐血移植的疗效。研究方法:我们回顾性分析了从2005年7月和2014年7月,19例急性白血病,5例骨髓增生异常综合征（MDS-RAEB）,和2例非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤患者,接受单份HLA配型≦ 2位点不合清髓性脐血移植后的疗效。所有患者在移植前均为未缓解状态。结果:所有患者中位随访时间为27（5-74）个月。总共有14名患者存活且持续完全缓解（CR）,12人死亡,其中3例复发,9例为非复发死亡（6例严重感染,3例急性移植物抗宿主病）。2年总生存率,无病生存率,复发率,和非复发死亡率分别为 50.5%（95%CI=31.3-69.7%）,40.3%（95%CI=21.4-59.2%）、28.9%（95%CI=11.5-46.3%）和 35.2%（95%CI=16.8-53.6%）,结论:挽救性脐血移植是治疗血液系统恶性肿瘤的一种有效方式,尤其是对于肿瘤负荷量高的患者。但移植后复发不容忽视。第二部分:DNT细胞分离体外扩增培养及杀伤实验研究目的:1.筛选出DNT杀伤敏感/耐受AML原代细胞。2.寻找对DNT细胞高度敏感/耐受的靶基因。研究方法:1.选用第三方健康供者外周血培养扩增从而获得富含DNT细胞的悬液,采用流式细胞术和酶联免疫吸附测定法（ELISA）法检测体外扩增的DNT细胞对11名AML患者原代肿瘤细胞的杀伤能力,由此判断DNT细胞在体外对不同AML原代肿瘤细胞杀伤的敏感性。取体外扩增14-17天的DNT细胞作为效应细胞,1 1名AML患者的原代肿瘤细胞作为靶细胞,以效靶比4:1混合孵育2小时后,使用流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡和坏死情况。效/靶细胞共孵育结束后收集上清液,通过ELISA方法检测上清中IFN-γ的含量以间接判断DNT细胞的杀伤活性。设置AML肿瘤细胞株MV-4-11细胞作为实验的阳性对照。结合两种方法获得的数据,对DNT细胞杀伤11名AML患者原始细胞的结果进行全面分析。2.筛选对DNT敏感或耐受的AML患者原代细胞各两例进行高通量转录组测序（RNA-seq）。寻找对DNT细胞高度敏感/耐受的差异基因,并通过生物信息学分析确定靶基因。结果:1.经过17-20天的体外扩增后平均每毫升外周血可得到0.5×108个DNT细胞,其纯度>90%。2.检测体外扩增的DNT细胞对11名AML患者原始细胞的杀伤活性,在符合流式细胞术检测要求的4名患者AML原始细胞中,DNT细胞对这4名AML患者原始细胞具有杀伤活性,与ELISA检测方法获得结果一致,两种方法高度相关（100%符合）;3名未能经流式方法检测的患者,经ELISA方法测定具有杀伤活性;其它4名未能经流式方法检测的患者,经ELISA方法检测,不具有杀伤活性。由此,通过流式细胞术和/或ELISA方法检测,确定11名患者中对DNT细胞体外杀伤敏感的患者共7名,占总标本量的64%（7/11）。3.对筛选出的对DNT细胞高度敏感（2例）或耐受（2例）AML患者样本进行高通量转录组测序及分析,26种基因均存在差异表达。结论1.本研究通过加拿大多伦多大学Dr.L Zhang及其团队研发的DNT细胞培养专利技术,成功分离并体外扩增DNT细胞,纯度>90%,满足临床治疗剂量;2.DNT细胞对患者原代白血病细胞杀伤作用果差异较大,对DNT细胞体外杀伤敏感的患者约占64%（7/11）,存在对DNT细胞高度敏感和耐受的AML基因。意义:筛选出对DNT敏感/耐受的基因,则可作为生物学标志更好地筛选DNT细胞有效治疗的患者,并可预先有针对性地干预对DNT细胞耐受的患者,更好的发挥DNT细胞的治疗作用,解决UCBT后复发无传统DLI治疗的难题。第三部分改良的DLI（第三方健康供者DNT细胞）治疗异基因造血干细胞移植后复发的急性髓系白血病单中心临床研究研究目的:1.初步研究改良的DLI（第三方健康供者来源的DNT细胞）治疗allo-HSCT后复发的AML的安全性。2.初步研究改良的DLI（第三方健康供者来源的DNT细胞）治疗allo-HSCT后复发的AML的有效性。研究方法:拟入组12例患者评价第三方健康供者来源的DNT细胞治疗经allo-HSCT后复发的AML患者的安全性和有效性。所输注的DNT细胞均来源于体外筛选敏感供者。第1次DNT细胞输注前,使用氟达拉滨（FLU）联合环磷酰胺（CTX）进行免疫抑制治疗。每个患者接受3次相同剂量的DNT细胞输注,输注周期分别为第1天、第7天、第14天。每个患者DNT单次输注数量分别为5× 107/kg（受者体重）、1× 108个/kg（受者体重）和2～4×108/kg（受者体重）。主要疗效指标:完全缓解率（CR）。次要疗效指标:造血细胞恢复时间,CR持续时间,早期死亡率,1年期总存活率（OS）,1年期无白血病存活率（LFS）,治疗前及治疗后后微小残留病（MRD）、WT-1基因表达量、肿瘤基因突变谱、染色体消长率等。主要安全性指标:治疗相关死亡率（TRM）次要安全性指标:Ⅱ～Ⅳ度及Ⅲ～Ⅳ度GVHD发生率,不良事件,严重不良事件,外周血中DNT细胞数量,血清细胞因子:白介素（IL）-6、干扰素（IFN）-γ、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α、MIP-1β、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）及可溶性受体IL-1Rα和IL-2Rα的水平。研究结果:1.12例受试者回输过程顺利,DNT细胞输注后患者出现发热,其中3例患者出现发热并伴低血压,均经对症治疗后好转。患者细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）分级均为1/2级,未出现2级以上与DNT输注相关的不良事件,心肺肝肾等脏器功能正常,无急性/慢性GVHD的发生。2.截止2020年8月1日,患者中位随访时间为4.3（1.7-12.2）个月,1例患者因个人原因未能完成三次DNT输注而退组。可评估的1 1例患者中,6例（54.5%）患者获得了完全缓解（CR）,其中有5例（45.4%）MRD转阴。1例（9.1%）患者获得了部分缓解（PR）。截至末次随访前,有4例（36.3%）患者仍处于完全缓解期。3.大部分患者中,供者DNT细胞数量在第一次回输后6h开始上升,在回输后24h达到高峰,之后逐渐下降。第二次和第三次回输后,供者DNT细胞数量仅有少量的上升,但在体内约持续存在约2周时间。但是患者体内总DNT细胞数量呈持续上升趋势,均在每次回输后5天达到高峰。值得注意的是,5名在接受DNT细胞治疗后获得CR的患者（患者5、6、7、9和11）,最后一次随访时的DNT细胞水平仍高于输注前水平;而对DNT输注治疗无反应的患者8,在最后一次随访时的DNT细胞计数与输注前减少。此外,在最后一次随访中获得MRD阴性CR而没有疾病复发的7号患者,在第102天骨髓T细胞中有19.8%的DNT细胞。4.与输注前相比,所有9名可评价患者在每次输注DNT细胞后不久,CRS相关细胞因子IL-6、IL-10、MIP-1 α、MIP-1和MCP-1水平均升高,并在48小时内恢复正常。DNT每次输注6h后,血清IFN-γ（2.03±0.28倍）和TNF α（1.93±0.33倍）水平显着升高,表明DNT细胞在每次输注后的抗白血病活性。结论:本研究首次采用改良的DLI（第三方健康供者来源的DNT细胞）治疗allo-HSCT后复发的AML,其安全、耐受性好,部分患者有效,输注后患者体内总的DNT细胞呈持续上升趋势。
付笑迎,张小玲,刘梦桐,余阅,陈诗杨,彭冬,邝雅贤,刘四喜,陈运生[10]（2020）在《E6流式细胞仪检测CD34+细胞百分比和绝对计数方法的建立》文中认为目的应用E6流式细胞仪建立检测CD34+细胞百分比和绝对计数的方法并进行验证。方法收集2019年1月至2019年12月在深圳市儿童医院血液肿瘤科因重型β-地中海贫血行异基因造血干细胞移植的患儿89例,以移植患儿供的骨髓或外周血为研究对象,应用E6流式细胞仪建立ISHAGE法检测CD34+细胞百分比,应用"流式直接体积法"计算CD34+细胞的绝对计数,并结合白细胞手工计数对CD34+细胞绝对计数的结果进行验证。结果结合白细胞手工计数对CD34+细胞的绝对计数结果的正确性进行验证,Pearson相关分析结果显示:供者外周血干细胞或骨髓干细胞CD34+细胞绝对计数流式结果与CD34+细胞绝对计数计算结果高度相关（r=0.93,R2=0.87,P<0.0001）;两次供者外周血干细胞或骨髓干细胞白细胞计数和单个核百分比结果高度一致;同样,两次供者外周血干细胞或骨髓干细胞CD34+细胞流式计数百分比和绝对计数结果亦高度一致。结论应用E6流式细胞仪的"流式直接体积法"计算CD34+细胞绝对计数结果准确,可以作为造血干细胞移植术前计算供者外周血干细胞或骨髓干细胞CD34+细胞数目的可靠依据。
二、流式细胞术三色分析调查成年人外周血CD34~+造血干细胞绝对计数参考范围（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流式细胞术三色分析调查成年人外周血CD34~+造血干细胞绝对计数参考范围（论文提纲范文）
（1）利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 甲型流感病毒的概述 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 结构及致病机制 |
| 2.1.3 预防和治疗 |
| 2.2 流感病毒感染后机体的免疫应答 |
| 2.2.1 病毒如何进入宿主 |
| 2.2.2 病毒编码的几种蛋白 |
| 2.2.3 固有免疫反应 |
| 2.2.4 适应性免疫反应 |
| 2.3 人源化小鼠模型的发展和应用 |
| 2.3.1 人源化小鼠模型的发展 |
| 2.3.2 人源化小鼠模型在流感病毒研究中的应用 |
| 2.4 组织定居记忆性T细胞 |
| 2.4.1 概述 |
| 2.4.2 特征 |
| 2.4.3 发展 |
| 2.4.4 Trm与呼吸系统 |
| 第3章 人免疫系统-人肺小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 人胚胎组织来源 |
| 3.2.3 材料及试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人胚胎肺脏组织处理 |
| 3.3.2 人胚胎肝脏来源CD34~+细胞的分离 |
| 3.3.3 人胚胎胸腺组织处理 |
| 3.3.4 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.3.5 HISL小鼠模型的构建 |
| 3.3.6 HISL小鼠构建后流式细胞术鉴定免疫系统重建水平 |
| 3.3.7 HISL小鼠取材检测 |
| 3.3.8 HISL小鼠各组织器官HE染色 |
| 3.3.9 流式细胞术染色方案 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.4.2 HISL小鼠模型构建 |
| 3.4.3 HISL小鼠免疫系统的重建水平 |
| 3.4.4 HISL小鼠建立后HL结构及其中免疫细胞的水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 人免疫系统-人肺小鼠流感病毒感染后的免疫应答 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 SPF鸡蛋 |
| 4.2.3 甲型流感病毒和MDCK细胞 |
| 4.2.4 材料和试剂 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 种蛋孵育 |
| 4.3.2 甲型流感病毒的扩增 |
| 4.3.3 甲型流感病毒血凝值的测定 |
| 4.3.4 甲型流感病毒TCID50测定 |
| 4.3.5 人免疫系统-人肺小鼠建立及鉴定 |
| 4.3.6 人免疫系统-人肺小鼠感染甲型流感病毒 |
| 4.3.7 感染甲型流感病毒后21天取材检测 |
| 4.3.8 流感病毒特异性IgM、IgG抗体ELISA检测 |
| 4.3.9 各器官组织化学染色 |
| 4.3.10 流式细胞术染色方案 |
| 4.3.11 转录组测序分析 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 H1N1流感病毒效价及TCID50 |
| 4.4.2 HISL小鼠感染H1N1后免疫细胞的总体变化 |
| 4.4.3 HISL小鼠感染H1N1病毒后T细胞亚群的表达情况 |
| 4.4.4 HISL小鼠感染H1N1病毒后病毒特异性T细胞的产生 |
| 4.4.5 HISL小鼠感染H1N1病毒后血清特异性抗体的产生 |
| 4.4.6 HISL小鼠感染H1N1病毒后HL基因组测序分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 流感病毒预先接种对人免疫系统-人肺小鼠产生保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 材料和试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 甲型流感病毒的扩增及TCID50 测定 |
| 5.3.2 人源化小鼠模型建立 |
| 5.3.3 人免疫系统-人肺小鼠的建立 |
| 5.3.4 甲型流感病毒经鼻接种 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 单次H1N1病毒接种未能给予人免疫系统-人肺小鼠良好的保护作用 |
| 5.4.2 多次H1N1病毒接种可延长致死剂量H1N1病毒经鼻接种小鼠的生存时间 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 利用全外显子组测序技术筛选ITP致病基因及亚组致病基因 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: rhTPO影响血小板抗体阳性ITP巨核产板的异质性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: ITP患者血小板自身抗体特异性与对rhTPO反应性的相关性研究 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 英文论着Ⅰ |
| 英文论着Ⅱ |
| 英文论着Ⅲ |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）淋巴细胞亚群和CD34+造血干细胞计数的标准化相关问题研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 淋巴细胞亚群计数自制参考物质的评价与应用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 淋巴细胞亚群检测方法 |
| 2.4 参考物质的评价 |
| 2.4.1 均匀性评价 |
| 2.4.2 长期稳定性评价 |
| 2.4.3 定值方案 |
| 2.4.4 标准值的表示 |
| 2.5 参考物质用于检测系统性能验证的研究 |
| 2.5.1 批内精密度 |
| 2.5.2 日间精密度 |
| 2.5.3 线性范围 |
| 2.5.4 正确度 |
| 2.6 参考物质用于室内质量控制的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 参考物质的评价结果 |
| 3.1.1 均匀性评价结果 |
| 3.1.2 长期稳定性评价结果 |
| 3.1.3 定值结果 |
| 3.1.4 标准值的表示 |
| 3.2 检测系统的性能验证结果 |
| 3.2.1 批内精密度 |
| 3.2.2 日间精密度 |
| 3.2.3 线性范围 |
| 3.2.4 正确度 |
| 3.3 室内质量控制的应用结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 CD34+造血干细胞计数的检测现状及参考物质的初步评价 |
| (一) 临床实验室CD34+造血干细胞计数检测现状分析 |
| 1 前言 |
| 2 对象与方法 |
| 2.1 调查对象 |
| 2.2 问卷调查 |
| 2.3 参考物质检测调查 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 结果回报情况 |
| 3.2 问卷调查结果 |
| 3.2.1 流式细胞仪和检测试剂的种类 |
| 3.2.2 实验室对质量控制要求的遵循情况 |
| 3.3 参考物质检测结果 |
| 4 讨论 |
| (二) CD34+细胞计数参考物质均匀性及长期稳定性评价 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.2 CD34+细胞计数检测方法 |
| 2.3 均匀性评价方法 |
| 2.4 长期稳定性评价方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 均匀性评价结果 |
| 3.2 长期稳定性评价结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语 |
| 致谢 |
（4）回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词(表) |
| 综述 |
| 综述一 干细胞在创面修复中的研究进展 |
| 1 表皮干细胞 |
| 2 间充质干细胞 |
| 3 毛囊干细胞 |
| 4 细胞外囊泡 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 回阳生肌法治疗慢性皮肤溃疡的研究进展 |
| 1 疮疡的阴阳辨证 |
| 2 回阳生肌法的现代理论体系 |
| 3 回阳生肌法促进慢性皮肤溃疡愈合的机制 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验一 回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 回阳生肌汤对db/db糖尿病小鼠伤口愈合及BMSCs增殖能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 回阳生肌汤对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 鸡血藤水提物对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 回阳生肌汤和鸡血藤水提物体外对氧化损伤大鼠BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在的问题与不足 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（5）SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究目标 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 第二章 SRC-3 对骨髓造血干细胞稳态的调控作用分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 SRC-3 对骨髓造血干细胞的辐射保护以及功能调控作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 SRC-3 调控骨髓造血干细胞稳态和功能的机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 线粒体能量代谢参与造血干细胞稳态调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）IgD-Fc-Ig融合蛋白对急性T淋巴细胞白血病动物模型的作用及其对mTORC2/Akt信号的调控（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 人外周血标本 |
| 2.2 BALB/c-nu雌性小鼠和C57BL/6小鼠 |
| 2.3 药物与试剂 |
| 2.4 主要溶液配制 |
| 2.5 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 T-ALL患者和健康对照者外周血PBMCs分离 |
| 3.2 流式细胞术检测T-ALL患者和健康对照者外周血中特征性标记物T细胞亚群IgDR表达情况 |
| 3.3 激光共聚焦检测T-ALL患者和健康对照者外周血中CD7+T和IgDR表达 |
| 3.4 流式细胞术检测IgD诱导的T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响 |
| 3.5 流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对 IgD诱导的T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响 |
| 3.6 CCK-8 法检测IgD对 C57BL/6 小鼠胸腺T细胞活力的影响 |
| 3.7 CCK-8法检测IgD对EL-4细胞株活力的影响 |
| 3.8 流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对 IgD诱导的EL-4 凋亡的影响 |
| 3.9 Westernblot检测IgD-Fc-Ig对 IgD诱导的EL-4 细胞株中p-Akt(Ser473)、Akt、mTOR、Rictor蛋白的表达 |
| 3.10 异种移植T-ALL小鼠模型的建立与分组 |
| 3.10.1 细胞培养 |
| 3.10.2 细胞移植 |
| 3.10.3 观察记录 |
| 3.10.4 成模后分组给药 |
| 3.10.5 ELISA技术检测T-ALL小鼠血浆IgD的水平 |
| 3.10.6 外周血和骨髓瑞氏-吉姆萨染色 |
| 3.10.7 流式细胞术检测小鼠脾脏和骨髓中 Jurkat 细胞 |
| 3.10.8 流式细胞术检测外周血淋巴细胞凋亡 |
| 3.10.9 肝脾组织病理学检查 |
| 3.10.10 Western blot 法检测 IgD-Fc-Ig 对 T-ALL 小鼠脾脏细胞 mTOR、Rictor、Akt 和p-Akt(Ser473)蛋白表达的影响 |
| 3.10.11. 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 T-ALL患者和健康对照者外周血中特征性标记物T细胞亚群的IgDR表达 |
| 4.2 T-ALL患者和健康对照者外周血中CD7~+T细胞和IgDR表达情况 |
| 4.3 IgD对 T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响 |
| 4.4 IgD-Fc-Ig对 IgD诱导T-ALL患者外周血中特征性标记物T细胞亚群的影响 |
| 4.5 IgD对 CD57BL/6 小鼠胸腺T细胞活力的影响 |
| 4.6 IgD对 T-ALL鼠源EL-4 细胞株活力的影响 |
| 4.7 IgD-Fc-Ig对 IgD诱导的T-ALL鼠源EL-4 细胞株活力的影响 |
| 4.8 IgD-Fc-Ig对 IgD诱导的EL-4 细胞株凋亡的影响 |
| 4.9 IgD对 EL-4 细胞mTOR、Rictor、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表达的影响及IgD-Fc-Ig的作用 |
| 4.10 T-ALL小鼠模型的建立与评价 |
| 4.10.1 整体观察结果 |
| 4.10.2 外周血、骨髓和脾脏检测结果 |
| 4.10.3 体质量检测结果 |
| 4.10.4 病理组织学检查情况 |
| 4.10.5 免疫组织化学法检测CD3 的表达 |
| 4.11 T-ALL小鼠血清中IgD水平的变化 |
| 4.12 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠体态和体重的影响 |
| 4.13 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠外周血和骨髓中Jurkat细胞的影响 |
| 4.14 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏和骨髓中Jurkat细胞的影响 |
| 4.15 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏中Jurkat细胞IgDR的影响 |
| 4.16 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏和骨髓中IgD型浆细胞的影响 |
| 4.17 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠外周血淋巴细胞凋亡的影响 |
| 4.18 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏、肝脏的影响 |
| 4.19 IgD-Fc-Ig对T-ALL小鼠脾脏mTOR、Rictor、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述:急性 T 淋巴细胞白血病靶向治疗药物研究进展 |
| 参考文献 |
（7）CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 急性髓系白血病(AML)概述 |
| 1.2 AML的治疗现状与面临的挑战 |
| 1.3 CXCR4/CXCL12轴及其在AML耐药复发中的作用 |
| 1.4 CXCR4拮抗剂在AML治疗方面的研究现状 |
| 1.5 纳米药物递送系统在AML治疗方面的研究现状 |
| 1.6 前期相关基础 |
| 1.7 本课题的研究思路 |
| 第2章 材料、仪器设备和实验方法 |
| 2.1 主要材料和试剂 |
| 2.2 主要实验耗材和仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 难治性AML小鼠模型的建立 |
| 2.3.3 CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载胶束的制备和表征 |
| 2.3.4 AML细胞表面CXCR4表达的测定 |
| 2.3.5 竞争性结合实验 |
| 2.3.6 迁移实验 |
| 2.3.7 摄取实验 |
| 2.3.8 细胞活性实验 |
| 2.3.9 Western blot实验 |
| 2.3.10 体内定植实验 |
| 2.3.11 体内动员实验 |
| 2.3.12 体内治疗的给药方案 |
| 2.3.13 药效评价与分析实验 |
| 2.3.14 转录组测序和测序数据分析 |
| 2.3.15 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.16 生存实验 |
| 2.3.17 M-E5体内免疫原性检测 |
| 2.3.18 统计学方法 |
| 第3章 CXCR4拮抗多肽纳米胶束制备及其对难治性AML的治疗作用研究 |
| 3.1 CXCR4拮抗多肽纳米胶束(M-E5)的制备与表征 |
| 3.2 AML小鼠骨髓和脾脏细胞表面CXCR4的表达 |
| 3.3 M-E5抑制CXCR4抗体与AML细胞的结合 |
| 3.4 M-E5抑制CXCL12介导的AML细胞的迁移 |
| 3.5 M-E5抑制AML细胞在脾脏和骨髓中的定植 |
| 3.6 M-E5动员AML细胞到外周血循环 |
| 3.7 M-E5对AML小鼠的治疗作用与机制研究 |
| 3.7.1 对AML小鼠外周血、脾脏和骨髓中AML细胞比例的影响 |
| 3.7.2 对转录组水平基因表达量的影响 |
| 3.7.3 诱导脾脏和骨髓中AML细胞发生凋亡和分化 |
| 3.8 M-E5对AML小鼠生存期的影响 |
| 3.9 M-E5体内免疫原性研究 |
| 3.10 本章结论 |
| 第4章 CXCR4拮抗多肽与化药共载胶束构建及对难治性AML治疗作用研究 |
| 4.1 CXCR4拮抗多肽E5与盐酸阿霉素共载胶束(M-E5-Dox)的制备和表征 |
| 4.2 HL60/A细胞对M-E5-Dox的摄取 |
| 4.3 M-E5-Dox对HL60/A细胞的杀伤作用及胞内信号蛋白的影响 |
| 4.4 M-E5-Dox对AML小鼠的治疗作用与机制研究 |
| 4.5 M-E5-Dox对AML小鼠生存期的影响 |
| 4.7 讨论和本章结论 |
| 第5章 全文结论和展望 |
| 参考文献 |
| 非论文综述 免疫治疗在急性髄系白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2——博士生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺通过抑制Mcl-1及诱发DNA损伤增敏ABT-199对急性髓系白血病的抗肿瘤效应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 低剂量西达本胺联合ABT-199对急性髓系白血病的体外活性研究 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 西达本胺与ABT-199合用对多株白血病细胞系的凋亡诱导作用 |
| 1.4.2 西达本胺与ABT-199合用对多株白血病细胞系的增殖抑制作用 |
| 1.4.3 西达本胺与ABT-199合用迅速减少增殖期白血病细胞 |
| 1.4.4 西达本胺与ABT-199合用明显降低体外肿瘤负荷 |
| 1.4.5 西达本胺与ABT-199合用显着抑制白血病细胞克隆形成能力 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 低剂量西达本胺联合ABT-199对急性髓系白血病的体内活性研究 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 西达本胺与ABT-199合用对急性髓系白血病Molm-13荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 2.4.2 西达本胺与ABT-199合用对急性髓系白血病细胞PDX小鼠模型的治疗作用 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 西达本胺联合ABT-199在AML患者及健康供者原代细胞中的活性研究 |
| 3.1 背景 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 西达本胺联合ABT-199对原代AML细胞而非正常造血细胞具有明显的凋亡诱导作用 |
| 3.4.2 西达本胺联合ABT-199对高白细胞性AML及原发性AML疗效更优 |
| 3.4.3 西达本胺联合ABT-199对具有白血病干祖细胞表型的原代CD34~+CD38~-AML亦具有明显的凋亡诱导作用 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 西达本胺联合ABT-199在急性髓系白血病中的机制研究 |
| 4.1 背景 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 低剂量西达本胺加剧ABT-199诱导的线粒体膜电位的下降 |
| 4.4.2 西达本胺联合ABT-199对AML细胞的凋亡诱导作用仍具有Caspase依赖性 |
| 4.4.3 西达本胺抑制AML细胞系中Mcl-1蛋白的表达水平 |
| 4.4.4 干预Mcl-1水平显着影响西达本胺联合ABT-199的抗肿瘤效应 |
| 4.4.5 西达本胺诱导白血病细胞DNA损伤 |
| 4.4.6 西达本胺所致Mcl-1抑制与其所致DNA损伤无明显相关性 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）双阴性T细胞治疗移植后复发的急性髓系白血病安全性及有效性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 脐带血移植挽救性治疗26例未缓解恶性血液病患者结果分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分：DNT细胞分离体外扩增培养及杀伤实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三部分 改良的DLI(第三方健康供者来源的DNT细胞）治疗allo-HSCT后复发的AMIL单中心的临床研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 无关供体脐带血移植治疗血液系统恶性疾病以及脐血移植后复发的处理 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（10）E6流式细胞仪检测CD34+细胞百分比和绝对计数方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 供者外周血或骨髓干细胞动员 |
| 1.3 流式细胞术测定CD34+细胞百分比和绝对计数 |
| 1.3.1 标本采集 |
| 1.3.2 免疫荧光染色 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 应用E6流式细胞仪设定ISHAGE法测定CD34+细胞百分比和绝对计数的模版 |
| 2.2“流式直接体积法”计数CD34+细胞绝对计数与双平台计算CD34+细胞绝对计数相关性分析 |
| 2.3 两次外周血样本白细胞（WBC）手工计数和CD34+细胞流式计数的相关性分析 |
| 2.4 不同移植方式时CD34+造血干细胞百分比和绝对计数的比较分析 |
| 3 讨论 |
四、流式细胞术三色分析调查成年人外周血CD34~+造血干细胞绝对计数参考范围（论文参考文献）
- [1]利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答[D]. 王亦心. 吉林大学, 2021(01)
- [2]WES筛选ITP致病基因和rhTPO影响ITP巨核产板的异质性研究[D]. 于亚菲. 山东大学, 2021(11)
- [3]淋巴细胞亚群和CD34+造血干细胞计数的标准化相关问题研究[D]. 王宇. 北京协和医学院, 2021
- [4]回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究[D]. 刘青武. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]SRC-3在造血干细胞稳态调控与骨髓放射损伤中的作用与机制研究[D]. 胡梦佳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]IgD-Fc-Ig融合蛋白对急性T淋巴细胞白血病动物模型的作用及其对mTORC2/Akt信号的调控[D]. 张爱君. 安徽医科大学, 2021
- [7]CXCR4拮抗多肽及其与化疗药共载纳米胶束对难治性急性髓系白血病的治疗作用及机制研究[D]. 葛洋洋. 北京协和医学院, 2020
- [8]组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺通过抑制Mcl-1及诱发DNA损伤增敏ABT-199对急性髓系白血病的抗肿瘤效应[D]. 陈凯. 南方医科大学, 2020
- [9]双阴性T细胞治疗移植后复发的急性髓系白血病安全性及有效性研究[D]. 姚雯. 山东大学, 2020(04)
- [10]E6流式细胞仪检测CD34+细胞百分比和绝对计数方法的建立[J]. 付笑迎,张小玲,刘梦桐,余阅,陈诗杨,彭冬,邝雅贤,刘四喜,陈运生. 分子诊断与治疗杂志, 2020(08)