一、微型琼脂糖凝胶电泳槽的简易制作（论文文献综述）
吴迪[1]（2021）在《核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用》文中研究表明病原体引起的传染性疾病,是威胁人类身体健康以及造成社会恐慌的主要因素,因此,对病原体传染病监测和防治的工作意义重大。在面对突发的未知病原体疫情时,如何做到快速而准确的筛查、鉴定以及追踪传染源,为研制相应的药物、疫苗以及挽回患者生命争取宝贵的时间,是一个重要的公共卫生问题。近年来,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术已经被广泛的应用于病原生物学的诊断中,此技术通过体外酶促合成特异性DNA实现生物体外的特异性DNA复制。这种可以将微量的DNA在短时间内大量复制的技术,具有特异性和灵敏度高、产率高、操作快速便捷以及重复性好等优势,被广泛应用于医疗检测、生物科研、食品安全监测、农产品检测等方面。传统的核酸检测流程,一般有采样、样本运输、实验室核酸提取、配制检测试剂、混入样本、送入核酸检测仪进行扩增、产物检测等多个步骤,整个流程耗时较长,且实验操作复杂,对环境及人员要求较高,难以满足病原体即时检测的需求。因此,开发体积小通量低的集成式一体化的PCR检测微装置,不仅可以防止交叉污染,还易于实验操作的进行,使得非专业人士也可以进行检测,从而不局限于专门的实验室和训练有素的实验室工作人员。本论文针对细菌等病原体的即时检测,通过研究了自压式气体扩散微泵、微腔式PCR扩增模块与连续流动式PCR扩增模块,提出了一种一体化PCR方法,并且设计了一种基于核酸提取扩增及检测一体化的PCR扩增新装置,将病原体遗传物质的提取、PCR扩增以及产物检测三部分集成为由程序控制的自动化体系,此方法免除了复杂的实验操作流程,节省了人力物力,提高了检测效率。本文主要开展了以下研究工作:对自压式气体扩散微泵进行了设计及实验研究,包括其三种末端模式,分别为基于材料透气性的自压式气体扩散微泵、基于毛细石英管流阻的自压式气体扩散微泵以及基于多倍拉伸毛细特氟龙管流阻的自压式气体扩散微泵。并且综合考虑流体管阻、芯片透气属性与流道几何形状之间的关系,基于菲克定律建立了自压式气体扩散微泵数学模型,为自压式气体扩散微泵实现流体在微管道内的长时间连续、稳定、匀速流动提供新型的控制机理,并实现了高温条件下的单相微流体在长管道中稳定传输与多相流体稳定传输控制。对PCR扩增微装置进行了研究,主要分为微腔式PCR微装置和连续流动式PCR微装置。基于聚合酶链式反应中的变性-退火-延伸三个基本反应步骤,设计并构建包括基于油浴加热的微腔式PCR微装置、片上恒温单热源连续流动式PCR微装置以及片外恒温单热源连续流动式PCR微装置等满足多场景应用的聚合酶链式反应体系,为PCR仪的小型化与高度集成化奠定了基础。并且基于利用帕尔贴效应的片外恒温单热源连续流动式PCR扩增方法设计并搭建了一套PCR原理样机,该样机利用自压式气体扩散微泵实现单相流体在微管道内的长时间匀速稳定流动,并利用半导体制冷片的帕尔贴效应以及陶瓷的导热特性实现了单一恒温热源,达到了体积小、功耗低的目标。研究并设计了一体化核酸预处理扩增检测的PCR微装置。该装置体积小、便携化、成本低、操作简单,可实现病原体自动化、高特异、高灵敏检测。研发了基于Chelex-100和蛋白酶K的DNA提取方法,结合高温以缩短操作时间,确定了各成分配比与高温时间的最优化分配方案。为满足不同使用场景,结合微流控芯片技术,研究了片上式和片外式的病原体检测方法,开展了病原体检测系列实验,对提取细菌和人类毛发等核酸的性能进行评价,实现了“sample-in-answerout”的检测目标。此外,微装置中的微型凝胶电泳产物检测模块不仅可以应用于病原体核酸扩增后的产物检测,还可以后续应用于流行病序列分析、追踪传染源、基因测序等方面。综上所述,本文针对PCR装置中的微泵模块、扩增模块,以及病原体的核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究,简化了样本检测步骤,降低了样本检测时间,为生命科学的研究提供了一种新的分析方法。
郝新意[2]（2021）在《葡萄卷叶病毒-3检测分析及感病毒植株耐盐性研究》文中研究说明葡萄（Vitis）是经济价值最高的果树之一。葡萄病毒病是制约葡萄产业健康发展的主要因素,葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease,GLD）是危害最严重的病毒病害之一,在全球及我国葡萄产区普遍发生,葡萄卷叶病毒-3（Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRa V-3）是引起葡萄卷叶病的主要病毒之一。陕西是我国葡萄的重要产区,葡萄卷叶病毒在该区广泛发生。盐碱害是危害葡萄产业的主要非生物胁迫。病毒病害和盐碱害葡萄产区常伴发生,给葡萄业带来更为严重的危害。本研究调查了陕西葡萄主栽区葡萄卷叶病毒-3的感染情况,并进行了测序及变异分析;利用微型嫁接指示植物法检测葡萄卷叶病毒-3;研究了葡萄感染卷叶病毒-3对盐胁迫的响应。获得的主要结果如下:（1）调查了陕西葡萄主栽区3个酿酒葡萄品种和4个鲜食葡萄品种感染葡萄卷叶病毒-3的情况。调查发现,酿酒葡萄‘Cabernet Sauvignon’、‘Chardonnay’和‘Riesling’葡萄卷叶病毒-3的感染率分别为92%,88%和70%;鲜食葡萄‘户太八号’、‘Red Globe’、‘Shine-Muscat’和‘Summer Black’的感染率分别为73%,72%,86%和85%。因此陕西地区主栽葡萄品种的平均感染率为81%。对葡萄卷叶病毒-3的测序发现,葡萄卷叶病毒-3全长18026 bp,有14个开放阅读框。与我国已报道的华北地区葡萄卷叶病毒-3株系（GLRa V-3-LN）有85.9%的碱基序列同源性,与巴西的‘ISAB-BR’株系有99.06%的同源性。本研究的葡萄卷叶病毒-3株系定名为‘GLRa V-3-Sau’,登录号为MK988555。生化免疫法对葡萄卷叶病毒-3在茎段中的定位表明,病毒限制分布在维管束韧皮部,在红色品种‘Cabernet Sauvignon’和白色品种‘Chardonnay’的分布是一致的。测序表明,上述两个品种的葡萄卷叶病毒-3的全长序列是一致的。以带毒材料‘Cabernet Sauvignon’为接穗,无毒材料‘Chardonnay’、‘Thompson Seedless’和‘湖南-1’（V.pseudoreticulata）为砧木嫁接传毒结果表明,‘Cabernet Sauvignon’/‘Chardonnay’和‘Cabernet Sauvignon’/‘Thompson Seedless’嫁接组合的传毒效率是一致的,明显高于‘Cabernet Sauvignon’/‘湖南-1’嫁接组合,说明‘湖南-1’对葡萄卷叶病毒-3具有一定的耐性。（2）建立了试管微型嫁接指示植物检测葡萄卷叶病毒-3的方法。以无毒红色品种‘Cabernet Sauvignon’（指示植物,Ca Sa-VF）做砧木,分别嫁接带毒红色品种‘Cabernet Sauvignon’（Cs Sa-IV）和白色品种‘Chardonnay’（Ch-VI）,将嫁接苗培养在添加了MS培养基上。嫁接12周后,指示植物表现葡萄卷叶病毒-3症状的比率分别为80%和20%。为提高指示植物的检测率,嫁接4周后,将砧木（指示植物）从嫁接苗切下,培养在添加75 m M Na Cl的MS培养基上。培养5周后,Ca Sa（VF）/Ca Sa（VI）组合中,87.7%的Ca Sa（VF）表现明显病毒症状,Ca Sa（VF）/Ch（IV）组合中,85.3%的Ca Sa（VF）霞多丽’表现明显病毒症状。在Ca Sa（VF）/Ca Sa（VI）组合中,Ca Sa（VF）表现典型的红色品种带毒症状,即叶片表现红色下卷。而在Ca Sa（VF）/Ch（IV）组合中,Ca Sa（VF）表现典型的白色品种带毒症状,即叶片表现退绿下卷。为解释上述现象,从砧/穗愈合、病毒含量、病毒序列、花色苷合成通路相关基因方面进行了研究。结果表明,不同砧/穗组合的维管组织形成,病毒含量及病毒碱基序列均没有显着性差异。测定花色苷合成通路相关基因,发现在Ca Sa（VF）/Ch（IV）组合中,砧木花色苷合成通路相关基因受到了抑制,其中LDOX、UFGT和MYBA1尤为明显,花色苷水平显着降低。可能是导致Ca Sa（VF）不表现红色带毒品种症状的原因。本研究为指示植物检测葡萄白色品种葡萄卷叶病-3建立了新的方法。（3）本实验以健康和带毒‘Cabernet Sauvignon’试管苗为试材,分别培养在含0 m M、25 m M、50 m M和100 m M Na Cl的1/2 MS培养基上。培养3周后发现,当培养在不含Na Cl培养基上时,健康试管苗的生根率达到100%,而带毒植株为90%。当培养在25 m M、50 m M和100 m M Na Cl的培养基上,健康试管苗的生根率分别为50%,30%和10%,而带毒试管苗分别为80%,60%和60%。在不含Na Cl的培养基上,健康试管苗的各项生长指标均优于带毒植株。但培养在含有25 m M、50 m M和100 m M Na Cl的培养基上,健康植株的各项生长指标低于带毒植株。当培养在不同浓度的Na Cl培养基上,健康植株的可溶性糖和游离脯氨酸含量随Na Cl浓度的升高而升高;可溶性蛋白含量随Na Cl浓度的增加而降低。SOD和POD活性随Na Cl浓度升高而升高,MDA含量也随盐浓度的升高而增加;CAT活性含量没有明显变化。内源激素IAA含量随Na Cl浓度的升高而降低,ABA含量在25 m M Na Cl时明显增加,高于25 m M Na Cl引起ABA含量降低。IAA合成相关合成基因TAR2,TAR3,TAR4和YUC1随着培养时间的延长表现下降趋势;ABA合成相关基因NCED1和NCED2随着培养时间的延长表现下降趋势,ZEP在培养一周是表现出升高,随后下降。带毒植株的可溶性糖和游离脯氨酸含量随盐浓度的升高而升高,可溶性蛋白含量随盐浓度的升高而降低。SOD和CAT活性随Na Cl浓度升高明显上升。POD活性在50 m M Na Cl达到最高值,然后表现下降。MDA含量在25 m M Na Cl时明显高于对照,继续升高Na Cl浓度对MDA含量没有明显影响。内源激素IAA含量在25 m M Na Cl时明显降低,然后又随Na Cl浓度升高（50-100 m M）而升高;ABA含量随Na Cl浓度升高而上升。IAA合成相关合成基因TAR2,TAR3,TAR4和YUC1随着培养时间的延长表现下降趋势。ABA合成相关基因NCED1和NCED2随着培养时间的延长表现下降趋势,ZEP在培养一周是表现出升高,随后下降。上述研究结果表明,在正常条件下,健康葡萄植株的生长情况明显优于带毒植株,在中度盐胁迫（25-50 m M）条件下,带毒植株的生长优于健康植株。生理指标、酶活性及内源激素ABA和IAA含量的测定结果解释了GLRa V-3增强葡萄植株对中度盐胁迫耐性原因。上述研究明确了陕西省葡萄主产区葡萄卷叶病毒-3的感病情况、基因全长序列,确认了该区的葡萄卷叶病毒-3为GLRa V-3-Sau新株系,初步的实验结果表明中国野生葡萄‘湖南-1号’对葡萄卷叶病毒-3具有一定的耐性;建立了简易、高效的试管嫁接指示对红色葡萄品种和白色葡萄品种葡萄卷叶病毒-3的检测技术;揭示了葡萄卷叶病毒-3增强葡萄试管苗对中度盐胁迫具有一定的耐性。上述研究结果对葡萄产业具有重要的理论与生产意义。
吴翠[3]（2021）在《农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究》文中研究说明核酸扩增检测技术具有灵敏度高、特异性强等优点,在农产品安全检测领域发挥着越来越重要的作用。目前基于核酸扩增检测技术的系统普遍以实验室应用为主,存在检测耗时、体积大、成本高等缺点,不宜用于现场检测,严重限制了该技术的推广应用。本文针对快速双温PCR技术、环介导等温扩增技术以及数字核酸扩增技术,研究开发了基于这三种新型技术的核酸快速扩增和荧光检测便携式系统,以两种典型的农产品病原体（大肠杆菌和柑橘黄龙病菌）为检测对象,实现目标物的快速检测。本文主要研究内容及结果如下:（1）为了实现农产品病原体的快速定性分析,研制了一套快速双温PCR可视化检测系统,包括一台快速双温核酸扩增装置和一台便携式温控荧光可视化检测装置。构建了单一电机驱动的摇杆式双温区自动切换装置实现核酸的快速扩增,使得每个PCR循环中待测样品在双温区之间的转移时间小于1 s。针对形态各异的商业化PCR扩增样品容器,设计了适用于常规0.2 m L PCR管、罗氏玻璃毛细管和柔性毛细管的样品固定盘,提高了双温PCR可视化检测系统的通用性。以0.2 m L PCR管和罗氏玻璃毛细管为例,通过理论模拟和实验验证的方法评估了这两种样品容器在高速运动下的快速热传导效果,选用具有良好导热性的罗氏玻璃毛细管作为后续实验样品容器,其管内试剂最大升降温速率可达30℃/s。研究开发了一个便携式温控荧光可视化检测装置,避免了核酸开盖检测造成气溶胶污染等问题。该系统可在4 min内完成大肠杆菌DNA的快速可视化检测,且检测限与传统三温PCR一致,均为10 fg/μL。结果表明,该系统在农产品病原体核酸快速检测中展现出一定的应用潜力。（2）为了进一步实现农产品病原体的现场相对定量分析,提高系统的便携性和检测准确性,构建了可用于现场的便携式核酸扩增及荧光检测系统,包括便携式核酸扩增及荧光检测仪器样机（IF-Device）、一个无源试剂存储盒和一套现场核酸提取设备。该系统具有无源试剂存储、现场核酸提取、精确等温扩增、实时荧光检测等功能。IF-Device具有较强的抗光干扰特性,在三种不同光强（室外太阳光直射、室内白天日光灯照射、室内黑盒子）环境中,荧光信号数值变异系数（CV）均小于1%;较高的检测灵敏度,与进口PCR仪器Quant Studio 3比对结果表明,两者对荧光素钠检测灵敏度相当（检测限为1 n M）;良好的控温精度,设定值为65℃时控温误差只有0.31%,确保适宜的扩增环境和荧光检测信号的稳定。开发的无源环保试剂存储盒在高温（35℃）环境下,内部试剂温度能持续保持在4℃以下长达8 h,确保现场检测的可靠性。与进口仪器Quant Studio 3对标结果表明,本系统对大肠杆菌DNA和柑橘黄龙病菌检测限分别是10 pg/μL和0.2 pg/μL。对柑橘叶片中黄龙病菌的现场检测性能进行评估,该系统从核酸提取至输出检测结果整个过程可在40min内完成。以40个叶片样本为评估对象,该系统的阳性检出率与Quant Studio 3结果一致。研究表明,该便携式系统可适用于农产品病原体的现场快速筛查。（3）为了更进一步实现多种农产品病原体的绝对定量分析,设计了集手动样本分配、核酸扩增和产物检测于一体的双重数字LAMP微流控芯片,实现目标物的快速绝对定量检测。所构建的PDMS-玻璃微流控芯片包括液滴生成区和液滴存储区,总计64个并行出口以提高液滴生成速率,25μL样品可在2 min内完成分配。该芯片对离散相（核酸样品）流速具有较高的鲁棒性,当流速从100μL/hr增加到900μL/hr时,得到液滴的直径均在88-90μm区间内,为手动分配样品提供可能,摆脱了传统样品分配过程对精密设备的依赖。为了实现双重数字LAMP检测,采用荧光探针法进行产物检测。以大肠杆菌为研究对象,在所设计的微流控芯片上可实现DNA浓度从19.8到1980 copies/μL的数字LAMP检测,检测限为19.8 copies/μL（2.5 pg/μL）。采用两种不同波长的荧光基团分别对大肠杆菌DNA和λ噬菌体DNA的LAMP引物FIP进行修饰,实现两者同时绝对定量检测;在不同浓度的大肠杆菌DNA存在的情况下,相同λ噬菌体DNA浓度的测量值几乎保持一致,CV仅为4.54%。研究表明,该微流控芯片可为研发简便快速的便携式数字核酸检测系统提供硬件支持。
吴国芳[4]（2021）在《高丹草低氢氰酸性状主效QTL PA7-1和PA7-2的精细定位及其候选基因分析》文中指出高丹草（Sorghum-sudangrass hybrid）杂种优势强、营养价值高、适口性好、可多次刈割利用,是重要的一年生饲用作物。但因其幼嫩茎叶中含有一定量的氢氰酸,家畜采食过量易产生中毒现象。因而培育低氢氰酸含量的高丹草是重要育种目标。在课题组前期对高丹草低氢氰酸含量性状相关主效QTL PA7-1定位研究基础上,我们用高丹草（散穗高粱×红壳苏丹草）F2分离群体1200个单株对低氢氰酸含量性状定位研究发现了另一个相关的主效QTL PA 7-2。进而采用BSA-SSR方法和低氢氰酸含量目标性状QTL侧翼的SSR标记,从高丹草群体1200个分离单株中筛选建立了等位基因重组QIRs群体,经套袋自交得到F3分离群体,并从中筛选出130个F3重组株构建了精细定位群体。本试验重点对PA 7-1和PA7-2这两个主效QTL进行了精细定位及其候选基因挖掘和功能分析。主要结果如下:1.从散穗高粱×红壳苏丹草的1200个F2群体单株中各选10个低氰与高氰植株的DNA等量混合建立基因池,并以亲本为对照筛选得到SSR适宜引物11对。用这11对引物对F2分离群体1200个单株及其双亲的基因组DNA进行PCR扩增,共得到多态性条带位点253个。2.利用这253个多态性标记构建了一个基于高丹草F2群体的连锁群图谱,其覆盖基因组长度211.5 cM,标记间平均距离为0.84 cM。QTL定位检测到4个与低氢氰酸含量性状相关的QTLs,只有PA 7-1和PA 7-2为主效QTL,其遗传贡献率分别为57.4%和47.1%。3.采用QTL侧翼SSR标记对1200个F2单株进行筛选,分别建立了 2个PA 7-1和PA7-2的QIRs群体,各包含379和121个重组株。利用单粒传法分别获得了 F2:3群体,基于该群体再次进行QTL定位,验证了 PA7-1和PA7-2的稳定性。4.为缩短PA7-1和PA7-2的精细定位区间,利用高丹草130个F3重组单株的精细定位群体分别进行了精细定位。最终将PA7-1确定在标记SORBI4G4-120和SORBI4G4-680之间,包含8个SSR标记;将PA7-2确定在标记Sobic.8g1-600和XM00242-400之间,包含6个SSR标记。5.对PA7-1的8个和PA7-2的6个SSR标记片段进行回收、纯化、测序及与已知的高粱基因组比对分析,首次建立了PA7-1和PA7-2高分辨率的物理图谱。将PA7-1确定在高粱第4号染色体的203.6 kb基因组区域内,该区间包含了 18个候选基因;将PA7-2确定在高粱8号染色体上18.4 kb和25.5 kb的区域内,以及该染色体上克隆BAC 88M4基因AY661656.1上,它们共包含了 5个候选基因。6.通过RT-PCR表达水平验证发现,PA7-1有2个基因XM 021458168.1和XP021313843.1,PA7-2有1个基因AY661656.1,这3个基因在低氰的父本红壳苏丹草和F2植株的苗期、分蘖期和拔节期中均有显着表达,表明它们是调控高丹草低氢氰酸含量性状的重要候选基因。
王琦[5]（2021）在《基于纤维素滤纸条的DNA快速提取法的建立及其在植物样品分子鉴定中的应用》文中提出脱氧核苷酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）是绝大多数生物的遗传物质。基于DNA分离、纯化和扩增的基因检测技术作为分子鉴定的重要手段,被广泛地应用于生物种质鉴定、预防动植物疾病、食品安全监控、转基因生物检测等领域。十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB）方法是经典的DNA提取方法,但是由于其复杂且耗时的操作流程不能满足DNA快速检测的需求。纤维素滤纸法由于能够在短时间内从生物样品中快速获取可扩增的DNA,近年来逐渐受到人们的重视。有关纤维素滤纸的应用多报道于对转基因动物或病菌快速检测的技术中,而在植物的DNA快速提取方面的相关研究还比较少。因此,进一步优化利用纤维素滤纸提取植物样品DNA的方法将有助于推动生物学实验室基础研究、植物种质资源鉴定以及转基因植物、食品和药材鉴定等分子鉴定技术的发展。本研究对已报道的基于纤维素滤纸条的DNA提取法进行了两个方面的优化:首先,针对原方法中滤纸条会变形而带走过多的反应液而导致核酸扩增效率降低的缺点,在吸附DNA的纤维素滤纸条背部增加了聚氯乙烯树脂（Polyvinyl chloride resin,PVC）塑料板支撑。这种优化的方法被命名为EASY DNA（EZD）,意指简单快速地提取DNA（EASY DNA extraction）,相应的经优化的滤纸条被命名为EZ-D试纸条。与原纤维素滤纸条相比,EZ-D试纸条所获得的DNA的PCR扩增效率显着提高。其次,本研究对DNA提取缓冲液进行了优化,使之更加适合于多种植物样品的DNA的快速提取。与传统的CTAB方法相比,EZ-D方法展现了很多的优点:不仅能将DNA提取时间从三个小时缩短至30秒,还能将DNA提取成本从0.9元降低到0.2元。同时,EZ-D方法使DNA提取技术摆脱了仪器的束缚并更加适用于现场分子检测。为了评估EZ-D方法在提取植物DNA的应用效果,本研究对EZ-D从植物样品中获取的DNA的能力以及所提取的DNA的可扩增能力进行了评价。结果显示,EZ-D方法不仅能够成功地从多种植物以及植物组织中提取DNA,而且至少可以从植物组织提取液中提取0.1 ng的DNA用于PCR扩增反应。以EZ-D方法所得到的植物DNA为模板,可用于扩增长度长达3000 bp的DNA片段,或可以用于扩增GC含量高达80%的DNA片段。将EZ-D方法与环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）相结合,可以实现不依赖PCR仪等检测设备,在现场对转基因植物的外源基因进行快速鉴定和中药超微粉的快速分子检测。综上所述,本研究提出了优化的基于纤维素滤纸的DNA提取方法EZ-D。EZ-D在应用中展现了很大的优势,它能够广泛地应用于仪器缺乏却需要快速获得鉴定结果的实验室。EZ-D方法不仅能够丰富利用纤维素滤纸纯化植物DNA的研究,而且能促进纤维素滤纸快速纯化植物DNA方法的应用和推广。
王小奎[6]（2021）在《猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析》文中研究说明目的:轮状病毒是引起婴幼儿及多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原,仔猪感染轮状病毒在我国和世界许多养猪国家普遍存在,由于轮状病毒的感染而花费的治疗和预防等费用以及牲畜的死亡,给世界范围内的养猪业造成了重大的经济损失,接种疫苗是防治病毒性感染的主要措施,研究有效的疫苗对轮状病毒防治有着重要意义。方法:首先选择大肠杆菌BL21（DE3）作为原核表达菌株,以p ET32a质粒为表达载体,以猪轮状病毒VP4的部分基因序列为目的片段,构建p ET32a-VP4重组表达载体,从而获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。其次通过诱导p ET32a-VP4-DE3菌表达目的蛋白,然后进行纯化浓缩,获得足量的目的蛋白VP4。最后以VP4蛋白为抗原免疫实验动物仔猪,通过检测诱导的相关抗体水平,进而分析VP4蛋白的免疫原性。1.根据文献报道的PRV VP4基因主要的抗原位点,通过查阅NCBI的基因库,获得VP4基因序列（Accession No.AY523636）,以其VP4主要抗原位点基因片段为目的基因,分别将其与表达载体p ET32a用HindⅢ酶和XbaⅠ酶双酶切,然后以T4 DNA连接酶连接,获得重组表达载体,而后进行质粒测序鉴定、酶切鉴定以及菌体抗性筛选等一系列实验的验证,鉴定出连接正确的重组表达载体p ET32a-VP4,再转化DE3感受态细胞获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。2.在活化培养后的菌液加入诱导剂,摇床培养,诱导目的蛋白的表达。收集诱导后的菌体沉淀,进行液氮冻融,超声破碎,将超声后的菌液在12000 r/min,4℃的条件下离心收集沉淀,用8 M尿素溶液溶解沉淀,然后将其用0.45μm的滤膜进行过滤,按照纯化的步骤进行上柱纯化,纯化后的VP4蛋白盛于透析带并按照一定浓度梯度的尿素进行复性,然后用蔗糖浓缩,用酶标仪测其浓度。3.实验前设计合适的抗原蛋白免疫剂量,在乳化仪下将VP4蛋白及佐剂共同乳化,用经检测合格的乳化剂免疫仔猪。对照组用PBS免疫,实验组用乳化剂肌肉注射免疫,30d和49 d后进行口服加强免疫。在初次免疫以后的每一周采集仔猪的血液、粪便和唾液样品,ELISA法检测血清中特异性抗体Ig G水平,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4水平,粪便和唾液样品中特异性抗体IgA水平。结果:1.双酶切的方法重组质粒p ET32a-VP4和空载体p ET32a进行鉴定,电泳结果说明,重组质粒p ET32a-VP4经双酶切后,在Marker 1000 bp的下部,有明亮条带,与目的片段792 bp相符合,然后经过测序鉴定,重组质粒p ET32a-VP4构建无误。2.诱导表达后的菌体经过冻融、超声破碎后分离上清和沉淀,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定,电泳结果说明目的蛋白VP4成功表达且蛋白表达在包涵体中,然后过经亲和柱纯化收集后,得到了大量的目标蛋白,并且纯化效果良好,没有发现杂蛋白。3.用ELISA方法检测所有血清样品中特异性Ig G抗体。实验结果说明,经VP4蛋白诱导仔猪血清中产生了特异性Ig G抗体,在首免14 d后,仔猪血清中Ig G抗体水平要明显比对照组高,两次口服加强免疫后血清中特异性Ig G抗体水平有不同程度的升高,而且其水平显着高于对照组水平;ELISA实验检测仔猪粪便和唾液中特异性IgA抗体。三次免疫后,仔猪粪便和唾液中产生了特异性IgA抗体,而且实验动物组特异性IgA抗体水平要显着高于对照组,对照组OD450值维持在较低水平且变化不大;首免49 d后实验组仔猪血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平较对照组高,说明VP4可以诱导仔猪细胞免疫应答反应。在首免49 d后呈现不断降低的趋势,在77 d后实验组的IFN-γ水平依然较对照组高。另外,在首免84 d后实验组的IL-4水平也要高于对照组水平,这说明血清中诱导产生IFN-γ和IL-4后可以维持较长时间。结论:1.本实验构建了重组pET32a-VP4载体,获得了p ET32a-VP4-DE3重组菌株。成功诱导重组菌表达目的蛋白VP4,并经亲和柱纯化后获得大量的VP4蛋白,并测得其纯化浓缩后的浓度为3.34 mg/m L。2.以VP4蛋白为抗原免疫仔猪,检测结果显示,VP4可以诱导仔猪机体高水平的血清Ig G特异性抗体和细胞因子IFN-γ和IL-4,另外,在唾液和粪便样品中也可检测出较高水平的IgA特异性抗体,说明VP4蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导仔猪产生全身免疫应答反应,同时也可以产生肠道的局部粘膜免疫应答反应。
佟昀铮[7]（2021）在《玉米茎腐病生防菌鉴定及其绿色防控关键技术研究》文中研究指明玉米茎腐病（Corn Stalk Rot,CSR）是一种世界性的土传病害,严重影响了玉米的产量和质量。同时,人们对自身健康和食品安全也愈加重视,所以对玉米茎腐病的有效的绿色防控技术研究迫在眉睫。本研究通过2019和2020年吉林省玉米茎腐病的病害发生情况进行调查分析,并分离确定吉林省玉米茎腐病的主要病原菌。以此病原菌为指示菌,在玉米植株残体以及根际土壤中分离真菌,通过对峙培养筛选玉米茎腐病生防菌株并进行形态学和分子生物学鉴定,对生防菌生物学特性和作用机制进行研究并将其应用于绿色防控技术中,为我国玉米茎腐病的的生物防治提供新策略。本研究结果如下:1.玉米茎腐病病原菌的分离与鉴定2019年和2020年在吉林省进行了玉米茎腐病病害发生的调查分析,并对病原进行了采样分离,选取分离频率最高的病原菌。通过形态学鉴定和分子生物学鉴定,结果表明吉林省玉米茎腐病的主要病原菌为禾谷镰孢（Fusarium graminearum）。分离得到180株病原菌,其中禾谷镰孢（F.graminearum）158株,轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）19株,层出镰孢（Fusarium proliferatum）3株。2.玉米茎腐病生防菌株的分离及鉴定在玉米植株残体以及根际土壤中分离14株木霉菌。将这14株木霉菌株与禾谷镰孢（F.graminearum）进行对峙培养初筛,最终得到两株具有显着抑菌效果的菌株CCTH-2和CCTH-6。木霉菌CCTH-2和CCTH-6对禾谷镰孢（F.graminearum）的抑制率分别为82.83%和82.42%。通过木霉菌株CCTH-2和CCTH-6的发酵液、易挥发性代谢产物、难挥发性代谢产物对禾谷镰孢（F.graminearum）的抑制效果以及菌株CCTH-2、CCTH-6对其它植物病原真菌的抑制效果分析,对CCTH-2和CCTH-6的生防效果进行复筛。综合分析后确定木霉菌株CCTH-2的生防效果更好。对木霉菌株CCTH-2进行形态学、分子生物学鉴定及系统发育树分析,结果表明木霉菌株CCTH-2为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。3.生防菌株哈茨木霉CCTH-2的生物学特性研究最适合CCTH-2菌落生长和产孢的培养基是PDA;最适合CCTH-2菌落生长的温度是30℃,最适合CCTH-2产孢的培养基的温度是25℃;最适合CCTH-2菌落生长和产孢的光照条件为全光照;Mn2+和Fe2+对CCTH-2菌落生长和产孢量均有促进作用;CCTH-2菌落生长和产孢量在p H值为7时最佳;CCTH-2具有一定的抗盐能力,在含盐量小于6%时可以继续生长发育。4.哈茨木霉CCTH-2菌株的生防机制研究生防菌株的竞争作用通过CCTH-2与禾谷镰孢的平板对峙实验的观察分析可知,木霉菌丝生长迅速,可以占领更多的生长空间,从而达到抑菌的效果。生防菌株的重寄生作用通过光学显微镜观察CCTH-2与禾谷镰孢对峙培养的菌落可以发现,CCTH-2的菌丝缠绕在禾谷镰孢的菌丝上,木霉对禾谷镰孢的重寄生作用明显。生防菌CCTH-2促进植物生长的作用通过促生效果盆栽实验证实,经过生防菌CCTH-2处理的玉米幼苗的平均鲜重、干重、株高、根长、茎宽均显着高于空白对照。生防菌CCTH-2诱导植物抗性的作用通过防效盆栽实验证实。相对于经过生防菌CCTH-2孢子悬浮液处理的玉米幼苗玉米茎腐病病斑面积为对照组病斑面积的34.78%。探究CCTH-2对玉米植株体内的抗病相关基因PR1、PR5、An2、AOS、LOX10、PAL相对表达量的影响。实验结果表明,在经过生防菌CCTH-2诱导后,玉米的抗病基因PR1、PR5、An2、AOS、LOX10、PAL的表达量有显着提高。5.以耐病品种为核心的绿色防控技术研究通过对吉林省境内不同的玉米品种种植区的玉米抗耐病品种的调查分析,发现目前玉米品种的抗耐性正在被逐渐挖掘,但是玉米品种抗耐性较为单一问题仍会导致玉米因其他病害的影响而产量、质量降低。因此,玉米品种对于玉米病害的抗耐性的广谱性仍需继续深入研究和开发。在通过玉米茎腐病的发生情况,分析调查地区的玉米茎腐病流行的原因并提出防治意见。对筛选得到的生防菌CCTH-2固体发酵的培养基基质进行了初步筛选,为哈茨木霉的菌剂开发提供基础。
胡继盛[8]（2021）在《WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究》文中进行了进一步梳理背景血管的损伤后重构在临床上是常见的血管病理生理学过程,然而该过程往往导致预后不良,比如动脉管腔狭窄,动脉移植后增生,介入手术后血管内膜增生等。血管损伤重构过程不能及时处理,这将间接性的导致心血管疾病以及心血管相关的他并发症的发生。常见的并发症有动脉粥样硬化,心肌梗塞,脑梗塞等。大量的低密度脂蛋白（low-density lipoproteins,LDL）逐渐积累到受损的血管内皮下空间中,被血管壁中的巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cells,SMCs）摄取,摄取了脂质的巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞并逐渐演变成动脉粥样硬化。由脂质介导的炎症诱导了平滑肌细胞的大量增殖并且迁移到血管内膜。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）是血管壁的主要细胞组成部分,在血管受到外力、炎症等刺激后,位于血管中层的平滑肌细胞快速的发生表型转换、增殖,然后向血管内膜迁移,导致内膜增生,这就是新生内膜的形成过程,但是该过程的分子机制仍不清楚。前人的研究表明,VSMCs的增殖和迁移在血管内膜形成过程中有着至关重要的作用。肌动蛋白细胞骨架作为细胞的支撑基础,参与了众多的细胞生物学过程,比如细胞运动,表型转换,细胞的增殖和迁移等。细胞骨架的重构决定着细胞的运动,增殖等一系列的生物学过程。由于聚合的肌动蛋白相对稳定,因此需要特定的肌动蛋白调节蛋白来辅助,并促进肌动蛋白丝的分解。肌动蛋白丝解聚的生理意义不仅在于能够去除旧的肌动蛋白丝,而且解聚后形成肌动蛋白单体还可以补充用于新一轮肌动蛋白组装的肌动蛋白单体库。因此,肌动蛋白组装和解聚的平衡对于细胞骨架尤为重要。肌动蛋白解聚因子（Actin depolymerizing factor,ADF/Cofilin）通过切断肌动蛋白丝并从肌丝上解离肌动蛋白单体来促进肌动蛋白解聚。尽管ADF/Cofilin通常积聚在肌动蛋白细胞骨架动态的亚细胞区域,但是仅ADF/Cofilin单独作用,特别是高浓度时,对驱动肌动蛋白丝的快速解聚并不是十分有效。因此,当需要肌动蛋白单体快速周转时,其他的解聚因子需要与ADF/Cofilin配合来达到肌动蛋白快速解聚的效果。肌动蛋白相互作用蛋白1（Actin interacting protein 1,AIP1）,也称为WD重复结构域1（WD repeat domain 1,WDR1）,即使ADF/Cofilin被肌动蛋白丝饱和,也能强烈增强肌动蛋白丝的分解。作为ADF/Cofilin的主要辅助因子,WDR1介导的肌动蛋白动力学不仅对细胞极性的形成有着重要的调节作用,而且在细胞的增殖和迁移过程有着不可或缺的作用。前人的研究表明,VSMCs的迁移和增殖在血管形成过程中扮演着至关重要的作用,但是WDR1作为细胞骨架解聚因子的辅助因子,其在VSMCs中介导血管重构的作用机制仍不清楚。信号转导和转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription3,STAT3）是Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路的重要因子之一,涉及到炎症以及其他各种细胞生物学过程,例如细胞分裂和细胞增殖等。前人的研究表明在血管损伤后的第七天内,磷酸化形式STAT3的水平显着升高,这表明STAT3对于血管新生内膜的形成至关重要。血管损伤后,STAT3的活化与WDR1的表达呈正相关,但是在VSMCs中,STAT3是否参与WDR1的表达调控还未可知。STAT3的激活和核转运是其发挥转录作用的前提,有研究表明STAT3的核转运是Ran和Importinβ依赖性的。细胞骨架响应于细胞微环境的改变和机械性刺激对众多的细胞生物学过程均有影响。WDR1是细胞骨架重构的重要因子之一,有报道称,在乳腺癌细胞中,Wdr1的缺失影响Importinβ的表达。综合以上几点,STAT3可能会通过促进WDR1的转录进而促进血管内膜的形成,反过来WDR1介导的肌动蛋白动力学也会影响STAT3的核贩运,WDR1-STAT3形成反馈环共同调节血管损伤后重构。目的本研究从分子、细胞、动物水平探究WDR1在血管损伤后重构中的作用机制,并阐释STAT3与WDR1之间的相互作用对血管损伤后重构过程的影响,进一步完善血管损伤后重构的分子调控网络,为临床治疗外周血管疾病提供线索。方法第二章:本研究通过颈总动脉结扎的方式构建小鼠血管损伤模型,在损伤不同天数通过颈椎脱臼法处死小鼠并按照不同实验目的取材。通过免疫组化、RT-PCR、Western blot等生物学方法检测血管损伤不同天数的血管中Wdr1的表达。同时,通过Western blot和明胶酶谱实验分别检测了增殖标志物PCNA的表达和基质金属蛋白酶9的活性。第三章:通过Cre-Loxp系统构建Wdr1条件敲除小鼠,设计引物,通过PCR鉴定小鼠基因型。腹腔注射他莫昔芬（10 mg/kg/天）诱导敲除Wdr1,利用Western blot和RT-PCR分别从蛋白质和RNA水平检测Wdr1的表达。然后通过手术损伤颈总动脉,通过HE染色检测血管内膜增厚情况。在敲降Wdr1后,利用TUNEL检测细胞的凋亡情况,同时通过免疫荧光检测p-H3和SMA的表达。通过明胶酶谱实验检测Wdr1敲除后MMP9的活性。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,体外加入4-OH他莫昔芬诱导原代细胞中Wdr1的敲除。检测细胞敲除效率以及凋亡后,再通过CCK8和划痕实验证实WDR1对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。第四章:过表达WDR1,通过Transwell和CCK8实验进一步证实WDR1对平滑肌细胞迁移和增殖的影响。在损伤不同天数的血管中,通过Western blot检测STAT3的激活,证实STAT3与血管损伤修复间的联系。体外通过AngⅡ和IL-6处理平滑肌细胞模拟血管损伤过程,利用划痕实验和CCK8检测AngⅡ和IL-6处理后的增殖和迁移能力。通过Western bloting和RT-PCR检测不同细胞因子处理后的Wdr1的表达。在平滑肌细胞中敲降STAT3,用AG490处理平滑肌细胞,检测WDR1的表达情况,在敲降STAT3的基础上过表达WDR1,检测细胞的增殖和迁移能力。在敲降Wdr1的基础上过表达Cofilin,免疫荧光实验、CCK8、Western blot和划痕实验证实WDR1介导的肌动蛋白动力学与平滑肌细胞增殖与迁移之间的关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀证实STAT3直接靶向Wdr1的启动子。第五章:敲降和过表达Wdr1后检测STAT3的表达与活化情况,探究WDR1能否对STAT3的表达和活化有影响。通过核质分离证实WDR1对STAT3的核转移的影响,Western blot、核质分离实验探究与STAT3核转移相关因子Ntf2、importinβ、Importinα、Ran的表达和核质分布情况。通过Transwell和CCK8实验验证Ntf2、Importinβ过表达对平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果第二章:HE结果证实颈总动脉结扎可以有效诱导血管内膜增厚,并且免疫组化实验、Western blot和RT-PCR结果显示在损伤不同天数,Wdr1的表达呈现时间依赖性升高,在损伤第14天达到峰值、并且增殖标志物PCNA的表达也是呈时间依赖性升高。明胶酶谱实验结果提示在动脉损伤后MMP9的活性显着性提高。第三章:基因型鉴定结果显示Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠成功构建。Western blot和RT-PCR结果显示,他莫西芬注射后能够成功诱导小鼠动脉细胞中Wdr1的敲除。进一步的研究结果表明,Wdr1的敲除有效抑制血管损伤后血管新生内膜的形成。免疫荧光和明胶酶谱实验表明,在Wdr1敲除后,动脉中的细胞增殖和迁移能力被显着抑制了。TUNEL实验结果表明Wdr1的敲除不影响细胞的凋亡。分离小鼠原代血管平滑肌细胞,Western blot和RT-PCR结果显示4-OH他莫西芬诱导后Wdr1成功敲除。划痕和CCK8实验结果显示Wdr1的敲除抑制了原代平滑肌细胞的增殖和迁移。第四章:Transwell实验和CCK8实验表明,过表达Wdr1增强了HAVSMCs细胞的增殖和迁移能力。在诱导增殖的HAVSMCs和损伤的血管中,Western blot结果显示STAT3的磷酸化水平显着升高。HAVSMCs中敲降STAT3可显着性抑制其增殖和迁移,并且通过JAK2的特异性抑制剂处理HAVSMCs也能得到相同结果。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀结果提示STAT3通过靶向Wdr1来促进其转录的。Western blot和免疫荧光实验结果提示,肌动蛋白动力学是WDR1介导的平滑肌细胞增殖和迁移所必需的。第五章:Western blot结果提示WDR1的缺失并不影响STAT3的表达和激活。核质分离的结果显示,WDR1缺失抑制了活化的STAT3的核转移。进一步的Western blot和核质分离结果显示WDR1的缺失抑制了Importinβ的表达和Ran的核质分布,从而抑制活化的STAT3的核转移。结论血管损伤修复是一个复杂的生物学过程,受到多种因素的影响。各种转录因子,炎症因子等共同构成一个调控网络,参与血管新生内膜的形成。本研究本研究揭示了WDR1调控血管内膜形成的分子机制,主要是STAT3调控Wdr1的表达以及WDR1缺失对STAT3核转运影响的分子机制。STAT3在血流动力学改变和炎症因子刺激的作用下大量激活并转运入核参与血管内膜形成的分子调节过程。高表达Wdr1能够显着促进VSMCs的增殖和迁移,以此来促进血管新生内膜的形成。当抑制STAT3的激活时,Wdr1的表达显着下调,同时平滑肌细胞的增殖和迁移能力显着下降、血管内膜形成也被显着抑制了。随后的荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验结果表明STAT3与Wdr1基因的启动子相结合并促进Wdr1的转录。反过来,WDR1的缺失抑制了核转运因子2（nuclear transport factor 2,NTF2）和Importinβ的表达,进而影响阻碍STAT3的核转运;同时,在敲降Wdr1的平滑肌细胞中,Ran的核质比显着下降,进一步说明WDR1对于STAT3的核转运至关重要。本研究以细胞骨架解聚因子WDR1为切入点,重点阐明了WDR1影响血管新生内膜形成的分子机制,为研究血管内膜增生发生发展的机制提供了新的见解,为临床上治疗术后血管内膜增生提供了线索。
张书东[9]（2021）在《DUSP10基因敲降T98G细胞系构建及其对细胞功能的影响》文中提出[目的]大脑中的胶质瘤是神经系统中最为常见的恶性肿瘤之一,传统的治疗以手术加放化疗为主,但治疗效果差,易复发,患者中位生存期短,特别是中高级别浸润性胶质母细胞瘤,治疗方法一直没有突破,为解决这一难题,研究胶质瘤发病的具有重要意义。双特异性磷酸酶10（DUSP10）,又称有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶5（MKP-5）,属于丝/苏氨酸和酪氨酸双特异性磷酸酶,是DUSP家族中的一员。常通过介导有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的去磷酸化而实现对细胞增殖,细胞分化,细胞存活和细胞死亡的调控,与肿瘤的发生发展有着密切的关系。本试验旨在探究了 DUSP10在胶质瘤和正常脑胶质细胞中的表达差异,并通过慢病毒沉默DUSP10在胶质瘤细胞中的表达,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖能力、迁移能力和凋亡的影响。[方法]一.通过生物信息学相关知识,初步探究DUSP10在胶质瘤细胞和正常细胞中的表达差异,利用TCGA和CGGA数据库进行生存曲线分析,研究DUSP10与胶质瘤的相关性。二.运用 RT-q PCR 和 Western blot 技术对 HAC/T98G/U251/U87细胞进行表达量检测,分别从基因和蛋白水平层面来验证DUSP10在各胶质瘤细胞中的表达水平差异。三.通过酶切,连接、转化、抽提等方法构建出具有沉默DUSP10作用的pLK0.1质粒载体,使用慢病毒转导技术实现对T98G细胞系的DUSP10 RNA进行干扰,设置荧光阳性对照组,验证病毒包装和转染情况,并用嘌呤霉素筛选出稳定转染慢病毒的T98G细胞株,运用RT-q PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白水平来验证胶质瘤细胞T98G经干扰后的敲降的效果。四.将胶质瘤细胞 T98G 分为 shRNA-blank 组、shRNA-NC 组 shRNA-DUSP10-1 组、shRNA-DUSP10-2 组,使用 Cell Counting Kit 8（CCK-8）试剂检测法、Transwell小室迁移测定、流式细胞仪检测等试验技术,对以上各组细胞生物功能进行检测,分析DUSP10对胶质瘤细胞T98G增殖、迁移、凋亡方面的影响。五.试验采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism7软件进行统计分析和制图,P<0.05表示结果具有统计学意义。[结果]DUSP10在不同的胶质瘤WHO分型中表达量存在差异,随着WHO分型的增高,DUSP10的表达量也随之升高（P<0.05）,并在患者生存性分析中,与DUSP10低表达相比,DUSP10高表达呈现出低生存率趋势（P<0.05）。通过慢病毒转染T98G细胞,再经嘌呤霉素筛选与荧光对照组试验对照表明,慢病毒转染的细胞系构建成功。经 Real-timePCR 和 WesternBlot 试验检测,与 shRNA-blank 组和 shRNA-NC组相比,shRNA-DUSP10-1组和shRNA-DUSP10-2组细胞DUSP10的表达下降（P<0.05）,结果表明RNA干扰效果成功;CCK8试验检测并绘制各组细胞的生长曲线发现,沉默DUSP10后T98G的增殖活性在第二、三天明显下降（P<0.05）;通过Transwell法来检测各不同组T98G的迁移能力,我们发现shRNA-blank组和shRNA-NC组、shRNA-DUSP10-1组、shRNA-DUSP10-2组透过小室细胞均有意义,各组每个视野细胞分别为64±4个、61 ±5个、21±4个和19±4个,与空白对照组和阴性对照组相比,DUSP10两个干扰组的迁移细胞数显着减少,差距有统计学意义（p<0.01）;经流式细胞技术检测细胞凋亡率结果显示:shRNA-blank组、shRNA-NC 组 shRNA-DUSP10-1 组、shRNA-DUSP10-2 组的晚期凋亡率分别为（4.79±0.68）%、（5.13± 1.03）%和（8.94±0.7）%,（8.98±0.85）%,DUSP10 干扰组的晚期凋亡率比空白组和阴性对照组明显增加,差距具有统计学意义（p<0.05）。[结论]DUSP10在各级分型病人中表达存在差异,随着WHO分级的增高而增高,并与患者生存率存在紧密相关,DUSP10表达量越高,患者生存率越低。通过细胞试验我们可以得出,DUSP10在胶质瘤细胞中表达量较正常脑胶质细胞高,沉默DUSP10后可抑制胶质瘤细胞T98G细胞的增殖能力、迁移能力,并能诱导细胞凋亡。
孔帅[10]（2021）在《高产L-异亮氨酸菌种选育及其发酵特性研究》文中研究指明L-异亮氨酸作为人体八大必需氨基酸之一,因其特殊的结构和功能,在人类生命代谢中具有重要地位,因而被广泛应用于医药、化妆品、食品和饲料等领域。L-异亮氨酸的生产方法有三种,分别为蛋白质水解法、化学合成法和发酵法,目前,在工业上应用最常见的是发酵法。高产L-异亮氨酸菌种的选育及发酵控制模式的优化是利用发酵法生产L-异亮氨酸的关键。以L-异亮氨酸的生物合成路径为理论基础,设计合理得筛选方法及优化发酵模式能快速获得高产L-异亮氨酸菌株及提高L-异亮氨酸产量。基于代谢途径分析的高产L-异亮氨酸菌株获取和发酵调控对实现L-异亮氨酸产业化意义重大。本文进行了如下四个方面的研究:（1）建立磺胺胍抗性标记和茚三酮多孔板检测的高通量筛选策略。原始菌株Coryne bacterium glutamicum 23798经过ARTP诱变处理180 s后,接种到含有0.4 mg/m L磺胺胍的培养基中培养2～3天,挑选出单菌落较大的菌株,然后接种至24孔板液体培养基培养,利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行96孔酶标仪高通量筛选,选育出一株优势突变菌株Corynebacterium glutamicum B1。该菌株在500 m L摇瓶中发酵培养48 h,L-异亮氨酸产量较原始菌株提高了62.0%,且遗传性状稳定。但本章建立的筛选方法周期加长,且耗费人工,不适宜大规模的进行筛选,后期将对筛选方法进行改进。（2）建立筛选高产L-异亮氨酸突变株的新方法。新发明的液滴生成器结合微孔板中添加临界致死浓度的α-氨基丁酸的筛选方法,成功的筛选出一株L-异亮氨酸产量提高了16.2%的优势突变株Corynebacterium glutamicum K5。本章建立的新型筛选方法相比第二章的挑菌株的方法在筛选周期上缩短了近一半的时间,从效率上明显得到了提升。但是,Corynebacterium glutamicum K5在发酵罐中培养之后,发现L-苏氨酸的产量达到了3.5 g/L,处于相对较高水平,通过分析L-异亮氨酸的生物合成路径,苏氨酸脱水酶能将L-苏氨酸转化成α-酮基丁酸,进而生成L-异亮氨酸,说明苏氨酸脱水酶活力有待加强。（3）考察了在不同时期时期添加不同浓度的前体物质α-氨基丁酸和α-酮基丁酸对L-异亮氨酸发酵性质的影响。由实验得在培养至8 h时添加α-氨基丁酸和α-酮基丁酸,两者的摩尔转化率均达到最高,分别达到42.5%和84.1%,可能是此时菌体的生长状态最好,体内相关酶系的活力也最为旺盛。同时添加α-酮基丁酸时达到的最大摩尔转化率相比添加α-氨基丁酸时达到的最大摩尔转化率提高了近一倍,由此可以看出,α-酮基丁酸的转化效果较好,也可判断出Corynebacterium glutamicum K5的脱氨能力有待提升。随着添加α-氨基丁酸和α-酮基丁酸的浓度增加,L-异亮氨酸产量的产量有所提高,但是摩尔转化率却显着降低,说明单纯的添加前体物质并不能实质性的提高菌株生产L-异亮氨酸的能力,需要从菌株自身相关酶系出发,增加自身代谢生成α-酮基丁酸的能力,进而增强生产L-异亮氨酸的能力。（4）苏氨酸脱水酶与L-异亮氨酸合成关系的研究。通过以Corynebacterium glutamicum K5基因组为模板,并设计引物,将苏氨酸脱水酶的控制基因扩增之后,将其与质粒PET-28a相连接,成功构建出具有苏氨酸脱水酶控制基因的重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌后成功表达,其酶活活力达到2 U/m L。苏氨酸脱水酶能将苏氨酸催化生成α-酮基丁酸进而生成L-异亮氨酸,若苏氨酸脱水酶在菌体内总的活力增强将有利于生成L-异亮氨酸。若将重组质粒利用电转化法导入进Corynebacterium glutamicum K5体内诱导其表达,有可能会使L-异亮氨酸的产量得到进一步提高。
二、微型琼脂糖凝胶电泳槽的简易制作（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微型琼脂糖凝胶电泳槽的简易制作（论文提纲范文）
（1）核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.1.1 PCR技术的发展 |
| 1.1.2 微流控技术的发展 |
| 1.2 研究进展及现状分析 |
| 1.2.1 微流体控制技术 |
| 1.2.2 集成式PCR方法 |
| 1.2.3 核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置 |
| 1.3 本论文主要研究内容 |
| 1.4 本论文章节安排 |
| 第2章 PCR技术中的流体自发传输 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 自压式气体扩散微泵的流体传输原理 |
| 2.2.1 基于材料透气性的微泵流体传输原理 |
| 2.2.2 基于毛细管流阻的微泵流体传输原理 |
| 2.3 自压式气体扩散微泵的设计与搭建 |
| 2.3.1 基于材料透气性的自压式气体扩散微泵 |
| 2.3.2 基于毛细管流阻的自压式气体扩散微泵 |
| 2.4 实验设计及操作 |
| 2.4.1 基于材料透气性的微泵搭建 |
| 2.4.2 基于毛细管流阻的微泵搭建 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 基于材料透气性的微泵流体传输性能 |
| 2.5.2 基于毛细石英管流阻的微泵流体传输性能 |
| 2.5.3 基于多倍拉伸毛细特氟龙管流阻的微泵流体传输性能 |
| 2.5.4 微液滴的自动生成与传输 |
| 2.5.5 高温下微流体长距离稳定传输 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 基于油浴控温的微腔式PCR微装置设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 微装置的结构及设计 |
| 3.2.1 微装置的搭建 |
| 3.2.2 微装置操作流程 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 实验设备 |
| 3.3.2 实验试剂与耗材 |
| 3.3.3 实验方案 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 PCR微装置的温度控制 |
| 3.4.2 PCR质粒检测 |
| 3.4.3 PCR细菌检测 |
| 3.4.4 不同管径PCR检测效率 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 恒温单热源连续流动PCR微装置设计 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 微装置的控温原理及操作 |
| 4.2.1 温度控制方案 |
| 4.2.2 进样方法 |
| 4.3 微装置的搭建 |
| 4.3.1 片上式单一热源分区加热CF-PCR微装置 |
| 4.3.2 片外式单一热源CF-PCR微装置 |
| 4.3.3 基于帕尔贴效应的片外式CF-PCR微装置 |
| 4.4 材料与方法 |
| 4.4.1 实验设备、试剂与耗材与引物设计 |
| 4.4.2 实验样品准备 |
| 4.4.3 PCR反应实验与产物检测 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 片上式CF-PCR微装置病原体检测 |
| 4.5.2 基于PDMS传热的片外式CF-PCR微装置病原体检测 |
| 4.5.3 基于帕尔贴效应CF-PCR微装置温度控制及病原体检测 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置设计 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 微装置的方案选择 |
| 5.2.1 基于Chelex-100 法核酸预处理方法 |
| 5.2.2 产物检测微型电泳模块的搭建 |
| 5.2.3 片上式一体化PCR微装置 |
| 5.2.4 片外式一体化PCR微装置 |
| 5.3 材料与方法 |
| 5.3.1 实验设备 |
| 5.3.2 实验试剂与耗材 |
| 5.3.3 实验样品准备 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 Chelex-100 法预处理结果 |
| 5.4.2 片上式一体化PCR微装置病原体检测 |
| 5.4.3 片外式一体化PCR微装置病原体检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 论文工作总结 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）葡萄卷叶病毒-3检测分析及感病毒植株耐盐性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 我国葡萄产业现状概况 |
| 1.2 葡萄卷叶病 |
| 1.2.1 葡萄卷叶病的症状 |
| 1.2.2 葡萄卷叶病毒种类、传播方式及分布区域 |
| 1.2.3 葡萄卷叶病毒的危害 |
| 1.2.4 葡萄卷叶病毒的检测 |
| 1.3 葡萄卷叶病毒的防控 |
| 1.4 植物病毒与盐碱的互作研究 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 陕西地区葡萄卷叶病毒-3 的检测分析 |
| 2.1 试验材料、试剂和设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 主要设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验样品收集 |
| 2.2.2 试验样品进行病毒检测 |
| 2.2.3 试验样品病毒的测序 |
| 2.2.4 试管微嫁接 |
| 2.2.5 嫁接苗嫁接部位组织学观察与病毒定位 |
| 2.2.6 嫁接苗砧木病毒含量的测定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 待检样品感染GLRa V-3 情况 |
| 2.3.2 葡萄卷叶病毒-3 的测序分析 |
| 2.3.3 葡萄卷叶病毒-3 的嫁接传毒后的变异分析 |
| 2.3.4 葡萄卷叶病毒-3 的嫁接传播葡萄品种耐毒性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 微型嫁接指示植物法检测葡萄卷叶病毒-3 的研究 |
| 3.1 试验材料、试剂和设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 葡萄试管苗体系的建立 |
| 3.2.2 试验材料感病情况确认 |
| 3.2.3 葡萄组培苗的微型嫁接 |
| 3.2.4 观察砧木单芽在不同培养基上的变化 |
| 3.2.5 嫁接部位的形态学观察 |
| 3.2.6 GLRaV-3 的定量分析 |
| 3.2.7 GLRaV-3 病毒的测序分析 |
| 3.2.8 花色苷相关基因定量分析 |
| 3.2.9 试验设计和数据分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 植株感病情况确认 |
| 3.3.2 葡萄试管苗微型嫁接 |
| 3.3.3 砧木单茎段在三种培养基上的症状观察 |
| 3.3.4 嫁接部位组织学观察 |
| 3.3.5 GLRaV-3 的相对定量分析 |
| 3.3.6 GLRaV-3 的测序分析 |
| 3.3.7 花色苷合成通路上相关基因表达量的分析 |
| 3.3.8 嫁接植株砧木叶片花色苷含量的分析 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 第四章 GLRaV-3 侵染提高葡萄试管苗对盐耐性的研究 |
| 4.1 试验材料、试剂和设备 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 葡萄试管苗体系的建立 |
| 4.2.2 葡萄试管苗带毒情况的确认 |
| 4.2.3 NaCl诱导盐胁迫的葡萄试管苗培养 |
| 4.2.4 健康和感病的‘Cabernet Sauvignon’在四种培养基上的生长状况观察 |
| 4.2.5 健康和感病的‘Cabernet Sauvignon’生理代谢分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 健康和感病毒‘Cabernet Sauvignon’在4 种培养基上的症状表现 |
| 4.3.2 健康和感病毒‘Cabernet Sauvignon’在4 种培养基上生长指标统计 |
| 4.3.3 生理指标的分析 |
| 4.3.4 氧化酶活性和丙二醛含量的分析 |
| 4.3.5 内源激素ABA和 IAA含量的分析 |
| 4.3.6 内源激素ABA和 IAA生物合成相关基因的分析 |
| 4.3.7 感病葡萄植株叶片体内花色苷含量分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 食源性致病菌及其检测技术 |
| 1.1.2 柑橘黄龙病菌及其检测技术 |
| 1.2 核酸扩增检测技术 |
| 1.2.1 快速双温PCR技术 |
| 1.2.2 环介导等温扩增技术 |
| 1.2.3 数字核酸扩增技术 |
| 1.3 核酸扩增和荧光检测系统的研究 |
| 1.3.1 核酸扩增和荧光检测系统概述 |
| 1.3.2 商业化核酸扩增检测系统 |
| 1.3.3 核酸扩增检测系统的国内外研究进展 |
| 1.4 国内外研究中尚存在的问题 |
| 1.4.1 快速PCR系统 |
| 1.4.2 便携式实时等温核酸检测系统 |
| 1.4.3 数字LAMP检测系统 |
| 1.5 研究目的、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 快速双温PCR系统及荧光可视化检测方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 系统功能 |
| 2.3 系统设计 |
| 2.3.1 系统结构设计 |
| 2.3.2 系统硬件设计 |
| 2.3.3 系统软件设计 |
| 2.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 2.4.1 材料和试剂 |
| 2.4.2 仪器设备 |
| 2.4.3 实验方法 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 快速双温PCR装置性能评估 |
| 2.5.2 可视化荧光检测装置可行性评估 |
| 2.5.3 快速双温PCR扩增及可视化系统在大肠杆菌检测中的应用 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 单重实时荧光便携式等温检测系统研究及其应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 检测系统功能 |
| 3.3 检测系统设计 |
| 3.3.1 系统硬件设计 |
| 3.3.2 系统软件设计 |
| 3.3.3 系统外观设计 |
| 3.4 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 3.4.1 材料和试剂 |
| 3.4.2 仪器设备 |
| 3.4.3 系统性能评估方法 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 便携式系统性能评估 |
| 3.5.2 柑橘黄龙病Las型实际样品测量评估 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 双重数字等温扩增微流控芯片研究及其应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 微流控芯片研发 |
| 4.2.1 双重数字LAMP芯片功能 |
| 4.2.2 双重数字LAMP芯片设计 |
| 4.3 实验材料、试剂、仪器和方法 |
| 4.3.1 材料和试剂 |
| 4.3.2 仪器设备 |
| 4.3.3 芯片制作 |
| 4.3.4 系统评估方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 数字微流控芯片性能评估 |
| 4.4.2 数字LAMP检测体系的优化 |
| 4.4.3 双重数字LAMP微流控芯片在大肠杆菌检测中的应用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（4）高丹草低氢氰酸性状主效QTL PA7-1和PA7-2的精细定位及其候选基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 高丹草概述 |
| 1.2 氢氰酸 |
| 1.2.1 非生氰糖苷类氰化物 |
| 1.2.2 生氰糖苷类氰化物 |
| 1.3 QTL定位 |
| 1.3.1 QTL定位原理及步骤 |
| 1.3.2 QTL定位的方法 |
| 1.3.3 QTL定位验证 |
| 1.3.4 QTL精细定位 |
| 1.3.5 精细定位区间候选基因分析 |
| 1.4 高丹草QTL定位研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义和技术路线 |
| 1.5.1 本研究的目的及意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 2 高丹草低氢氰酸含量QIRs群体构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料与种植 |
| 2.1.2 氢氰酸含量测定 |
| 2.1.3 DNA提取及BSA基因池的建立 |
| 2.1.4 SSR适宜引物的筛选及PCR扩增 |
| 2.1.5 数据统计与处理 |
| 2.1.6 高丹草低氢氰酸含量相关SSR分子标记的开发 |
| 2.1.7 遗传群图谱的构建和QTL定位分析 |
| 2.1.8 高丹草低氢氰酸含量QIRs等位基因重组群体的构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 氢氰酸含量测定 |
| 2.2.2 基因组DNA纯度的电泳检测 |
| 2.2.3 高丹草低氢氰酸含量相关SSR引物的筛选及多态性分析 |
| 2.2.4 高丹草低氢氰酸含量相关SSR分子标记的获得 |
| 2.2.5 高丹草遗传图谱构建及氢氰酸含量QTL定位 |
| 2.2.6 QIRs群体获得 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BSA法评价 |
| 2.3.2 SSR分子标记及遗传图谱研究 |
| 2.3.3 QTL定位准确性 |
| 2.3.4 等位基因重组株QIRs分析 |
| 2.4 小结 |
| 3 高丹草低氢氰酸含量主效QTL PA7-1 的精细定位 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 群体构建 |
| 3.1.2 精细定位区间内标记的开发 |
| 3.1.3 F_3精细定位群体DNA提取、氢氰酸含量测定 |
| 3.1.4 高丹草连锁群构建 |
| 3.1.5 主效QTL PA7?1 的精细定位 |
| 3.1.6 主效QTL精细定位区间候选基因序列测定和分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 散穗高粱×红壳苏丹草F_(2:3)群体氢氰酸含量性状分析 |
| 3.2.2 F_(2:3)群体氢氰酸含量性状QTL定位 |
| 3.2.3 F_3群体氢氰酸含量性状变异 |
| 3.2.4 PA7?1 精细定位区间内标记的SSR特异引物的筛选 |
| 3.2.5 基于高丹草F_3精细定位群体连锁群构建及QTL定位 |
| 3.2.6 PA7?1 的精细定位 |
| 3.2.7 精细定位区间候选基因序列测定和分析 |
| 3.2.8 精细定位区间序列比对、物理图谱建立与候选基因分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 主效QTL PA7?1 的稳定性 |
| 3.3.2 主效QTL PA7?1 精细定位的准确性 |
| 3.3.3 低氢氰酸含量性状候选基因 |
| 3.4 小结 |
| 4 高丹草低氢氰酸含量主效QTL PA7-2 的精细定位 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 群体构建 |
| 4.1.2 精细定位区间内标记的开发 |
| 4.1.3 F_3精细定位群体DNA提取、氢氰酸含量测定 |
| 4.1.4 高丹草连锁群构建 |
| 4.1.5 主效QTL PA7?2 的精细定位 |
| 4.1.6 主效QTL精细定位区间候选基因序列测定和分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 散穗高粱×红壳苏丹草F_(2:3)群体氢氰酸含量性状分析 |
| 4.2.2 F_(2:3)群体氢氰酸含量性状QTL定位 |
| 4.2.3 F_3群体氢氰酸含量性状变异 |
| 4.2.4 PA7?2 精细定位区间内标记的SSR特异引物的筛选 |
| 4.2.5 基于高丹草F_3精细定位群体连锁群构建及QTL定位 |
| 4.2.6 PA7?2 的精细定位 |
| 4.2.7 精细定位区间候选基因序列测定和分析 |
| 4.2.8 PA7?2 精细定位区间序列比对、物理图谱构建与候选基因分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 PA7?1 和PA7?2 的加性效应 |
| 4.3.2 精细定位可行性分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 PA7?1 和PA7?2 精细定位区间候选基因表达水平验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 植物总RNA的提取 |
| 5.1.3 cDNA的合成 |
| 5.1.4 半定量RT?PCR |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 氢氰酸含量差异 |
| 5.2.2 总RNA的提取和检测 |
| 5.2.3 候选基因的RT?PCR表达验证 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 6.1 高丹草低氢氰酸含量主效QTL PA7?1 的精细定位和候选基因分析 |
| 6.2 高丹草低氢氰酸含量主效QTL PA7?2 的精细定位和候选基因分析 |
| 6.3 主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
（5）基于纤维素滤纸条的DNA快速提取法的建立及其在植物样品分子鉴定中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 DNA提取方法概述 |
| 1.1.1 基于液相萃取的DNA提取方法 |
| 1.1.1.1 CTAB提取法 |
| 1.1.1.2 SDS提取法 |
| 1.1.1.3 PVP提取法 |
| 1.1.1.4 尿素提取法 |
| 1.1.1.5 高盐低pH值法 |
| 1.1.2 基于固相载体吸附的DNA提取方法 |
| 1.1.2.1 利用二氧化硅基质提取DNA |
| 1.1.2.2 磁珠法提取DNA |
| 1.1.2.3 采用阴离子交换树脂提纯DNA |
| 1.2 快速的DNA提取方法 |
| 1.2.1 煮沸法 |
| 1.2.2 碱裂解法 |
| 1.2.3 碱性溶液研磨法 |
| 1.2.4 载体转移法 |
| 1.3 利用纤维素滤纸快速制备DNA |
| 1.3.1 利用纤维素滤纸制备 DNA 的研究进展 |
| 1.3.2 纤维素滤纸条在快速分子鉴定实验中的应用 |
| 1.3.3 纤维素滤纸条提取方法亟待探究的问题 |
| 1.4 本研究的内容和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EZ-D试纸条和Z试纸条的制作方法 |
| 2.2.2 采用EZ-D方法提取植物组织DNA |
| 2.2.3 采用改良的CTAB方法提取植物组织DNA |
| 2.2.4 EZ-D方法的DNA提取能力评价 |
| 2.2.5 PCR引物设计及扩增反应条件 |
| 2.2.6 LAMP-HNB核酸检测技术 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EZ-D试纸条与Z试纸条的比较 |
| 3.2 DNA提取液的选择和优化 |
| 3.3 EZ-D方法与CTAB方法的比较 |
| 3.4 EZ-D方法所提取的植物DNA的可扩增能力的探究 |
| 3.5 EZ-D方法的DNA提取能力评价 |
| 3.6 EZ-D方法所提取的DNA的可使用次数的评价 |
| 3.7 EZ-D方法在多种类型的植物材料上的应用 |
| 3.8 EZ-D方法与LAMP技术相结合应用于现场DNA检测 |
| 4 小结和讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士期间的科研成果 |
（6）猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 部分缩写符号中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 轮状病毒概述 |
| 1.2 RV的生物学结构 |
| 1.3 RV的分类 |
| 1.4 RV的基因组及病毒蛋白 |
| 1.5 RV病毒蛋白 |
| 1.5.1 RV的核心蛋白 |
| 1.5.2 RV的结构蛋白 |
| 1.5.3 RV的非结构蛋白 |
| 1.6 RV相关疫苗 |
| 1.6.1 RV口服减毒疫苗 |
| 1.6.2 RV亚单位疫苗 |
| 1.6.3 RV核酸疫苗 |
| 1.6.4 RV口服转基因植物疫苗 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 1.8 试验技术路线 |
| 第二章 轮状病毒VP4 蛋白的原核表达及其纯化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配置 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 猪轮状病毒VP4 基因的合成 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pET32a-VP4 的鉴定 |
| 2.2.4 pET32a-VP4-DE3 菌诱导后目的蛋白的表达 |
| 2.2.5 SDS-PAGE检测VP4 蛋白的纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 PRV VP4 蛋白的免疫原性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 血清中特异性抗体Ig G测定 |
| 3.2.2 粪便中特异性抗体IgA测定 |
| 3.2.3 唾液中特异性抗体IgA测定 |
| 3.2.4 血清中细胞因子IFN-γ和 IL-4 测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（7）玉米茎腐病生防菌鉴定及其绿色防控关键技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 玉米茎腐病的研究现状 |
| 1.1 玉米茎腐病的发生及危害 |
| 1.2 玉米茎腐病的病原菌 |
| 1.3 玉米茎腐病的病害循环 |
| 1.4 玉米茎腐病流行原因 |
| 2 玉米茎腐病的防治现状 |
| 2.1 农业防治 |
| 2.2 化学防治 |
| 2.3 生物防治 |
| 3 木霉菌的研究现状及其作用机制 |
| 3.1 竞争作用 |
| 3.2 抗生作用 |
| 3.3 重寄生作用 |
| 3.4 诱导系统抗病性 |
| 3.5 促进植物生长 |
| 3.6 协同拮抗作用 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 玉米茎腐病病原菌的分离与鉴定 |
| 1 实验材料试剂及仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂及培养基 |
| 1.3 实验仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病原菌的采集 |
| 2.2 病原菌的分离纯化 |
| 2.3 病原菌的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 形态学鉴定 |
| 3.2 分子生物学学鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 玉米茎腐病生防菌株的分离及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株及样品 |
| 1.2 试剂及培养基 |
| 1.3 实验仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 供试菌株的分离和纯化 |
| 2.2 生防木霉菌株的筛选 |
| 2.3 生防木霉菌株的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 供试菌株的分离和纯化 |
| 3.2 生防木霉菌株的筛选 |
| 3.3 生防木霉菌株的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 生防菌株哈茨木霉CCTH-2的生物学特性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 实验仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 不同类型的培养基对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 2.2 不同的温度对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 2.3 不同的光照类型对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 2.4 不同微量元素对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 2.5 不同pH值对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 2.6 不同的含盐量对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同类型的培养基对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3.2 不同的温度对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3.3 不同的光照类型对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3.4 不同微量元素对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3.5 不同pH值对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 3.6 不同的含盐量对哈茨木霉CCTH-2菌丝生长和产孢的影响 |
| 4 讨论 |
| 第五章 哈茨木霉CCTH-2菌株的生防机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株及植物材料 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 实验试剂和仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 哈茨木霉CCTH-2菌株对禾谷镰孢的竞争作用观察 |
| 2.2 哈茨木霉CCTH-2菌株对禾谷镰孢的重寄生作用观察 |
| 2.3 哈茨木霉CCTH-2菌株对玉米植株的促生作用研究 |
| 2.4 哈茨木霉CCTH-2菌株诱导玉米植株抗病的研究 |
| 2.5 哈茨木霉CCTH-2菌株诱导玉米抗茎腐病机制研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生防木霉菌对禾谷镰孢的竞争作用观察结果 |
| 3.2 生防木霉菌对禾谷镰孢的重寄生作用观察结果 |
| 3.3 生防木霉菌对玉米植株的促生作用研究 |
| 3.4 生防木霉菌诱导玉米植株抗病的研究 |
| 3.5 实时荧光定量PCR结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第六章 以耐病品种为核心的绿色防控技术研究 |
| 1 玉米抗耐病品种的调查 |
| 1.1 调查的目的与意义 |
| 1.2 调查方法与过程 |
| 1.3 调查结果 |
| 1.4 玉米抗耐病品种的分析 |
| 2 玉米茎腐病大发生以及流行性原因分析和防治建议 |
| 2.1 玉米茎腐病大发生以及流行性原因分析 |
| 2.2 玉米茎腐病的防治建议 |
| 3 生防菌CCTH-2固体发酵培养基基质的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肌动蛋白概述 |
| 1.2 WDR1的结构和actin切割 |
| 1.3 WDR1的生物学功能 |
| 1.3.1 WDR1与癌症 |
| 1.3.2 WDR1与内皮发育 |
| 1.3.3 WDR1与肌节组装 |
| 1.3.4 WDR1与血液疾病 |
| 1.4 本课题研究内容 |
| 1.4.1 血管损伤模型构建 |
| 1.4.2 探究血管损伤与WDR1的相关性 |
| 1.4.3 体外证实WDR1对平滑肌细胞的影响 |
| 1.4.4 STAT3与WDR1相互调控的分子机制 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 WDR1在血管损伤模型中的表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成功构建颈动脉损伤的小鼠模型 |
| 2.3.2 颈动脉结扎后Wdr1表达水平呈时间依赖性增高 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Wdr1的缺失抑制血管新生内膜的形成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 成功构建Wdr1条件性敲除小鼠 |
| 3.3.2 Wdr1条件性敲除抑制了血管内膜的增厚 |
| 3.3.3 敲除Wdr1抑制平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 3.3.4 原代血管平滑肌细胞敲降Wdr1抑制细胞的增殖和迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 STAT3直接调控Wdr1的转录来促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移 |
| 4.3.2 活化的STAT3参与动脉损伤修复过程 |
| 4.3.3 STAT3 的激活是WDR1介导的平滑肌细胞的增殖和迁移所必需 |
| 4.3.4 WDR1促进平滑肌细胞的增殖和迁移需要ADF/Cofilin介导的肌动蛋白动力学的参与 |
| 4.3.5 STAT3直接结合Wdr1的启动子调节其转录活性 |
| 4.3.6 体内抑制JAK2/STAT3途径可降低Wdr1的表达和新内膜形成 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 Wdr1的缺失抑制STAT3的核转移 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HAVSMCs中Wdr1的缺失不影响STAT3 的表达和活化 |
| 5.3.2 WDR1介导pSTAT3的核转移 |
| 5.3.3 WDR1通过调控Importinβ的表达和Ran的核质分布来影响p STAT3 的核 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究内容的创新与应用 |
| 6.3 本研究中的不足以及下一步的工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
（9）DUSP10基因敲降T98G细胞系构建及其对细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 DUSP10在肿瘤疾病中的研究现状与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）高产L-异亮氨酸菌种选育及其发酵特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-异亮氨酸概述 |
| 1.2 L-异亮氨酸的生物合成及代谢调控 |
| 1.3 L-异亮氨酸的研究现状 |
| 1.3.1 L-异亮氨酸菌种选育现状 |
| 1.3.2 L-异亮氨酸的发酵过程研究现状 |
| 1.4 选题意义与研究内容 |
| 1.4.1 选题意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 ARTP诱变选育L-异亮氨酸优势菌株 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 仪器与设备 |
| 2.2.5 分析检测 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株的活化及培养 |
| 2.3.2 优势突变菌株筛选流程 |
| 2.3.3 生长曲线的测定 |
| 2.3.4 菌株的ARTP诱变时间的考察 |
| 2.3.5 磺胺胍对菌株Corynebacterium glutamicum23798生长的影响 |
| 2.3.6 优势菌株的高通量筛选 |
| 2.3.7 摇瓶扩大培养 |
| 2.3.8 遗传稳定性考察 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 生长曲线 |
| 2.4.2 ARTP最佳诱变时间的确定 |
| 2.4.3 不同浓度的磺胺胍对Corynebacterium glutamicum 23798致死情况的考察 |
| 2.4.4 高产L-异亮氨酸诱变菌株的高通量筛选 |
| 2.4.5 高产L-异亮氨酸诱变菌株的发酵培养复筛 |
| 2.4.6 高产L-异亮氨酸诱变菌株的遗传稳定性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 筛选高产L-异亮氨酸菌株新方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 仪器与设备 |
| 3.2.5 分析检测 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株的活化及培养 |
| 3.3.2 生长曲线的测定 |
| 3.3.3 菌株的ARTP诱变时间的考察 |
| 3.3.4 简易液滴生成器及微液滴的制作 |
| 3.3.5 结构类似物临界致死浓度考察 |
| 3.3.6 优势菌株的高通量筛选 |
| 3.3.7 优势菌株的分离纯化 |
| 3.3.8 摇瓶、发酵罐的扩大培养 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Corynebacterium glutamicum B1的生长曲线 |
| 3.4.2 ARTP最佳诱变时间的确定 |
| 3.4.3 α-氨基丁酸对Corynebacterium glutamicum B1的临界致死浓度考察 |
| 3.4.4 优势菌株的高通量筛选 |
| 3.4.5 优势菌株的分离纯化 |
| 3.4.6 摇瓶、发酵罐的扩大培养 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 添加前体物质对L-异亮氨酸发酵性质的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株的活化及培养 |
| 4.3.2 样品处理及分析 |
| 4.3.3 Corynebacterium glutamicum K5 在发酵罐水平的生长情况的曲线绘制 |
| 4.3.4 考察在不同时间添加α-氨基丁酸及不同浓度的α-氨基丁酸对Corynebacterium glutamicum B1生成L-异亮氨酸的影响 |
| 4.3.5 考察在不同时间添加α-酮基丁酸及不同浓度α-酮基丁酸的对Corynebacterium glutamicum B1生产L-异亮氨酸的影响 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Corynebacterium glutamicum K5 在发酵罐水平的生长情况的曲线绘制 |
| 4.4.2 关于在对数生长期添加α-氨基丁酸及不同浓度的α-氨基丁酸Corynebacteriumg clutamicum K5生成L-异亮氨酸的影响 |
| 4.4.3 关于在对数生长期添加α-酮基丁酸及不同浓度的α-酮基丁酸对Corynebacterium glutamicum K5生成L-异亮氨酸的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 L-异亮氨酸发酵过程中关键酶苏氨酸脱水酶的表达与纯化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 培养条件 |
| 5.3.2 基因组DNA、质粒的提取 |
| 5.3.3 引物设计 |
| 5.3.4 PCR扩增目的基因及产物纯化 |
| 5.3.5 目的基因与质粒的连接 |
| 5.3.6 重组质粒的转化 |
| 5.3.7 阳性转化子的鉴定 |
| 5.3.8 重组菌的蛋白表达及纯化 |
| 5.3.9 苏氨酸脱水酶酶活测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 目的基因PCR扩增产物的鉴定 |
| 5.4.2 重组质粒的构建 |
| 5.4.3 苏氨酸脱水酶编基因的克隆表达 |
| 5.4.4 苏氨酸脱水酶酶活检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、微型琼脂糖凝胶电泳槽的简易制作（论文参考文献）
- [1]核酸预处理扩增检测一体化PCR微装置的研究及应用[D]. 吴迪. 中国科学院大学(中国科学院长春光学精密机械与物理研究所), 2021(08)
- [2]葡萄卷叶病毒-3检测分析及感病毒植株耐盐性研究[D]. 郝新意. 西北农林科技大学, 2021
- [3]农产品病原体的核酸快速扩增和荧光检测系统研究[D]. 吴翠. 浙江大学, 2021(01)
- [4]高丹草低氢氰酸性状主效QTL PA7-1和PA7-2的精细定位及其候选基因分析[D]. 吴国芳. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [5]基于纤维素滤纸条的DNA快速提取法的建立及其在植物样品分子鉴定中的应用[D]. 王琦. 浙江大学, 2021(01)
- [6]猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析[D]. 王小奎. 石河子大学, 2021
- [7]玉米茎腐病生防菌鉴定及其绿色防控关键技术研究[D]. 佟昀铮. 吉林大学, 2021(01)
- [8]WDR1在血管平滑肌细胞中参与血管损伤后重构过程的作用研究[D]. 胡继盛. 武汉科技大学, 2021(12)
- [9]DUSP10基因敲降T98G细胞系构建及其对细胞功能的影响[D]. 张书东. 昆明医科大学, 2021(01)
- [10]高产L-异亮氨酸菌种选育及其发酵特性研究[D]. 孔帅. 三峡大学, 2021(01)
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