一、猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文文献综述）
王小奎[1]（2021）在《猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析》文中研究说明目的:轮状病毒是引起婴幼儿及多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原,仔猪感染轮状病毒在我国和世界许多养猪国家普遍存在,由于轮状病毒的感染而花费的治疗和预防等费用以及牲畜的死亡,给世界范围内的养猪业造成了重大的经济损失,接种疫苗是防治病毒性感染的主要措施,研究有效的疫苗对轮状病毒防治有着重要意义。方法:首先选择大肠杆菌BL21（DE3）作为原核表达菌株,以p ET32a质粒为表达载体,以猪轮状病毒VP4的部分基因序列为目的片段,构建p ET32a-VP4重组表达载体,从而获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。其次通过诱导p ET32a-VP4-DE3菌表达目的蛋白,然后进行纯化浓缩,获得足量的目的蛋白VP4。最后以VP4蛋白为抗原免疫实验动物仔猪,通过检测诱导的相关抗体水平,进而分析VP4蛋白的免疫原性。1.根据文献报道的PRV VP4基因主要的抗原位点,通过查阅NCBI的基因库,获得VP4基因序列（Accession No.AY523636）,以其VP4主要抗原位点基因片段为目的基因,分别将其与表达载体p ET32a用HindⅢ酶和XbaⅠ酶双酶切,然后以T4 DNA连接酶连接,获得重组表达载体,而后进行质粒测序鉴定、酶切鉴定以及菌体抗性筛选等一系列实验的验证,鉴定出连接正确的重组表达载体p ET32a-VP4,再转化DE3感受态细胞获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。2.在活化培养后的菌液加入诱导剂,摇床培养,诱导目的蛋白的表达。收集诱导后的菌体沉淀,进行液氮冻融,超声破碎,将超声后的菌液在12000 r/min,4℃的条件下离心收集沉淀,用8 M尿素溶液溶解沉淀,然后将其用0.45μm的滤膜进行过滤,按照纯化的步骤进行上柱纯化,纯化后的VP4蛋白盛于透析带并按照一定浓度梯度的尿素进行复性,然后用蔗糖浓缩,用酶标仪测其浓度。3.实验前设计合适的抗原蛋白免疫剂量,在乳化仪下将VP4蛋白及佐剂共同乳化,用经检测合格的乳化剂免疫仔猪。对照组用PBS免疫,实验组用乳化剂肌肉注射免疫,30d和49 d后进行口服加强免疫。在初次免疫以后的每一周采集仔猪的血液、粪便和唾液样品,ELISA法检测血清中特异性抗体Ig G水平,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4水平,粪便和唾液样品中特异性抗体IgA水平。结果:1.双酶切的方法重组质粒p ET32a-VP4和空载体p ET32a进行鉴定,电泳结果说明,重组质粒p ET32a-VP4经双酶切后,在Marker 1000 bp的下部,有明亮条带,与目的片段792 bp相符合,然后经过测序鉴定,重组质粒p ET32a-VP4构建无误。2.诱导表达后的菌体经过冻融、超声破碎后分离上清和沉淀,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定,电泳结果说明目的蛋白VP4成功表达且蛋白表达在包涵体中,然后过经亲和柱纯化收集后,得到了大量的目标蛋白,并且纯化效果良好,没有发现杂蛋白。3.用ELISA方法检测所有血清样品中特异性Ig G抗体。实验结果说明,经VP4蛋白诱导仔猪血清中产生了特异性Ig G抗体,在首免14 d后,仔猪血清中Ig G抗体水平要明显比对照组高,两次口服加强免疫后血清中特异性Ig G抗体水平有不同程度的升高,而且其水平显着高于对照组水平;ELISA实验检测仔猪粪便和唾液中特异性IgA抗体。三次免疫后,仔猪粪便和唾液中产生了特异性IgA抗体,而且实验动物组特异性IgA抗体水平要显着高于对照组,对照组OD450值维持在较低水平且变化不大;首免49 d后实验组仔猪血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平较对照组高,说明VP4可以诱导仔猪细胞免疫应答反应。在首免49 d后呈现不断降低的趋势,在77 d后实验组的IFN-γ水平依然较对照组高。另外,在首免84 d后实验组的IL-4水平也要高于对照组水平,这说明血清中诱导产生IFN-γ和IL-4后可以维持较长时间。结论:1.本实验构建了重组pET32a-VP4载体,获得了p ET32a-VP4-DE3重组菌株。成功诱导重组菌表达目的蛋白VP4,并经亲和柱纯化后获得大量的VP4蛋白,并测得其纯化浓缩后的浓度为3.34 mg/m L。2.以VP4蛋白为抗原免疫仔猪,检测结果显示,VP4可以诱导仔猪机体高水平的血清Ig G特异性抗体和细胞因子IFN-γ和IL-4,另外,在唾液和粪便样品中也可检测出较高水平的IgA特异性抗体,说明VP4蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导仔猪产生全身免疫应答反应,同时也可以产生肠道的局部粘膜免疫应答反应。
常新见[2]（2020）在《华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究》文中认为猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,Po RV）引起的一种以厌食、腹泻、呕吐、脱水为特征的急性传染病。该病多发于寒冷季节,呈地方性流行,各生长阶段的猪均可感染,感染率最高可达90%～100%,给养猪业带来巨大经济损失。目前,Po RV出现了新的基因型,导致现有疫苗对其保护效果不理想。因此,开展Po RV的分子流行病学调查,明确其流行的病毒基因型,研制安全有效的新型疫苗,对防控该病具有重要的意义。鉴于此,本论文开展了以下三方面的研究内容:1.华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查:采用本实验室已建立的Po RV RT-PCR检测方法对2017～2019年间华东地区35个规模猪场的594份样品进行检测。结果显示,2017～2019年间华东地区Po RV的平均检出率为16.8%（100/594）;在不同类型的样品中,肠道样品的Po RV检出率最高为19.5%（68/349）;在不同生长阶段猪中,仔猪的Po RV检出率最高为18.5%（70/379）。同时,扩增阳性样品的VP7和VP4基因并测序,进行序列比对、同源性比较及遗传进化分析。结果显示,5个Po RV基因型均为A群G9P7型,与参考毒株NMTL相比,VP7蛋白第100、122、180、309位有氨基酸突变;与参考毒株OSU相比,VP4蛋白在30、137、686、774位有氨基酸突变,且两者均无氨基酸位点插入和缺失。遗传进化分析结果显示,不同地区流行毒株基因型相同,表明G9P7型Po RV可能是主要的流行基因型。2.猪轮状病毒VP4蛋白间接ELSA抗体检测方法的建立:针对VP4蛋白的保守区设计并合成引物,通过PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*。将该质粒转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS PAGE和Western blot鉴定了该蛋白的表达,利用Ni柱纯化蛋白。以纯化的重组480-VP4*蛋白为抗原建立间接ELISA方法,确定了该方法的最佳包被浓度为2.56μg/m L,待检血清的最佳稀释度为1:80,酶标二抗最佳稀释度为1:10 000。建立的方法与病毒中和试验的总符合率达80.0%;用该方法初步检测了华东地区的临床血清,结果显示华东地区Po RV抗体阳性检出率为87.8%。通过该试验建立的间接ELISA检测方法为Po RV的血清学调查和后续疫苗免疫后的抗体评价提供了一种新的技术手段。3.猪轮状病毒不同截短VP4蛋白免疫原性研究:VP4蛋白具有较好免疫原性,是疫苗研究的主要靶蛋白,本研究分别构建3种截断的VP4蛋白的原核表达载体,同时将破伤风毒素的通用T细胞表位（P2）作为分子佐剂与三个截断VP4蛋白融合表达,成功构建了6个重组原核表达质粒p ET28a-480-VP4*、p ET28a-618-VP4*、p ET28a-1428-VP4*、p ET28a-P2-480-VP4*、p ET28a-P2-618-VP4*及p ET28a-P2-1428-VP4*,将它们分别转化到E.coli BL21（DE3）,利用SDS-PAGE和Western blot确定了蛋白表达,利用Ni柱纯化6个重组蛋白。将6个纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂以1:1体积混合后制备成亚单位疫苗,通过肌肉注射免疫6周龄小鼠,间隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后2周,扑杀小鼠,并采集免疫前后小鼠血清,利用ELISA检测免疫前后抗体水平的变化,中和试验检测中和抗体水平。结果显示,6个蛋白免疫原性较好,小鼠血清中能产生特异性的抗体,3个截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为618-VP4*、1428-VP4*、480-VP4*,3个融合P2的截断VP4蛋白的免疫原性强弱依次为P2-1428-VP4*、P2-618-VP4*、P2-480-VP4*,但是6个蛋白诱导的中和抗体水平均偏低。将P2导入VP4蛋白后,1428-VP4*的蛋白免疫原性得到增强。通过该试验对不同截断VP4蛋白的免疫原性的研究,为后期研发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了良好的基础。
郭倩妤[3]（2020）在《猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用》文中指出猪消化道类病毒性疫病是近年来生猪养殖生产实践中最为普遍和突出的疾病,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多国内外的研究表明:猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastro enteritis virus,TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）、猪轮状病毒A型（Porcine rotavirus groupA,PoRVA）和猪轮状病毒C型（Porcine rotavirus group C,PoRV C）是临床上引起猪消化道腹泻的主要病毒性病原,且常呈现出混合感染或继发感染,导致猪群的高发病率和高死亡率,加大了诊断和防治的难度。为了实现临床对猪消化道主要病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的五重RT-PCR检测方法并进行了初步应用,为猪消化道病毒性疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段和理论参考依据。主要研究内容如下:1.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一RT-PCR检测方法的建立及检测参照Gen Bank上PEDVN（KT323979）、TGEVN（EU074218）、PDCoVN（MH715491）、PoRVAVP6（MH320796）、PoRV CVP6（KJ814472）等基因的部分序列片段,采用Primer Select等相关软件和平台,分别设计了5对用于扩增PEDVN、TGEVN、PDCoVN、PoRVAVP6和PoRV CVP6基因的部分片段的引物,大小分别为799 bp、375 bp、271 bp、525 bp和184 bp。将实验室检测呈PEDV、TGEV、PoRVA阳性的粪便样品及肠道组织等病料提取核酸和生物公司合成的含PDCoVN基因和PoRV C基因的部分片段的阳性质粒,分别以阳性病料的核酸和合成的质粒作为模板,通过对5种病毒单一RT-PCR扩增产物的鉴定,结果扩增出与预期相符的条带。将PEDV、TGEV、PoRVA的RT-PCR产物进行胶回收,并将胶回收后的产物与p MD-19T载体进行连接并转化入感受态细胞,通过对阳性克隆菌的筛选后提取相应的重组质粒,并以其中的5种重组质粒作为反应模板优化对单一病毒的PCR反应退火温度,并对敏感性进行检测,建立了能够用于PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒快速诊断的单一RT-PCR检测方法。结果显示:（1）最佳反应体系:5对引物浓度均为10μmo L/L,TGEV、PDCoV和PoRV C上下游引物各1μL,PEDV和PoRVA上下游引物1.5μL,模板各2μL,金牌Mi X（Green）补足25μL。（2）最佳反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;在51.0～60.5℃之间的退火温度条件下,PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一病毒RT-PCR均可扩增出特异的条带,但55.1℃45 s退火温度最佳;72℃45 s延伸,35个循环;72℃延伸10 min。（3）敏感性结果表明,上述5种病毒模板的最低核酸检测量分别为:PEDV 0.39 pg、TGEV 0.34 pg、PDCoV 0.35pg、PoRVA 0.37 pg和PoRV C 0.34 pg。2.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的建立在上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的五种病毒单一RT-PCR基础上,对PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR反应的体系进行调整,通过不断摸索模板和引物的用量、浓度以及退火温度的优化,并对五重RT-PCR的特异性、敏感性及重复性进行探索,建立了一种能够同时快速的鉴别PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒性疫病的五重RT-PCR检测方法。结果表明:（1）50μL体积是RT-PCR的最佳反应总体系。两步法的PCR体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,金牌Mi X（Green）补足50μL;一步法反应体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,2×1 Step Buffer 25μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,RNase free water 8.5μL。（2）反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;55.1℃45 s（退火）;72℃45s（延伸）,35个循环;72℃10min（延伸）是最佳反应条件。（3）特异性、敏感性和重复性试验结果表明:五重RT-PCR能扩增出PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的特异性片段,分别为799 bp、525 bp、271 bp、375 bp和184 bp,未扩增出CSFV、JEV、PCV2、PRV及正常细胞组织的DNA/RNA;五重RT-PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PEDV 39 pg、TGEV34 pg、PDCoV35 pg、PoRVA37pg、PoRVC 34 pg。3.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的初步应用应用所建立的猪主要消化道病毒五重RT-PCR检测方法对2017～2020年间采集自贵州省内不同地区、不同规模化养猪场、农户散养等的临床病料共计523份进行了相关的检测。通过对病料进行检测,比较多重RT-PCR与单一RT-PCR的检测情况,结果表明:来自贵州省不同猪场的523份样品中,阳性率分别为PEDV 26.96%（141/523）、PoRVA13.96%（73/523）、TGEV 1.72%（9/523）、PDCoV 1.53%（8/523）,未检测到PoRV C感染。PEDV+TGEV的二重感染阳性率为1.72%（9/523）,PEDV+PDCoV的二重感染阳性率为1.53%（8/523）,PEDV+PoRVA的二重感染阳性率为1.91%（10/523）,未检测到三重及以上的感染现象,五重RT-PCR检测结果与单一RT-PCR方法的检测结果一致。
王宁[4]（2020）在《食淀粉乳杆菌在干预猪轮状病毒感染中对IκB/NF-κB通路的调控机制》文中进行了进一步梳理益生菌是一类活的对机体有益且能在肠道内稳定定植的微生物,相关研究表明益生菌具有抗病毒、调节机体免疫的作用。轮状病毒（Rotavirus,RV）主要引起病毒性肠胃炎,是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻甚至死亡的重要原因,对婴幼儿健康成长和养殖业的发展产生巨大威胁。RV所编码的非结构蛋白1（Nonstructural protein 1,NSP1）主要功能就是在RV感染初期帮助病毒逃避机体的先天性免疫,其是RV感染前期产生作用的关键蛋白。已有研究指出,在RV感染过程中,经酪蛋白激酶II（Casein kinase II,CKII）磷酸化的NSP1可与核转录因子-kB的抑制因子（Inhibitor of nuclear factor-kappa B,IkB）竞争结合β-转导重复相容蛋白（β-transducin repeat-containing proteins,β-Trc P）来抑制核转录因子-kB（Nuclear factorkappa B,NF-кB）的激活从而达到逃避宿主先天性免疫的目的。食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）属于益生菌中乳酸杆菌的一种,已知食淀粉乳杆菌能够有效减轻RV感染,其活菌和代谢产物都可在不同方向不同程度上阻止RV在肠组织细胞中的粘附、复制等。但是食淀粉乳杆菌及其分泌上清在参与消除、阻遏、或削弱病毒过程中是否通过IкB/NF-кB途径发挥作用尚未见报道,其对NSP1的影响亦不明确,有待进一步研究。据此,本研究在体内外试验中使用食淀粉乳杆菌及其分泌上清,设置正常组和RV感染组为对照,主要探究食淀粉乳杆菌及其分泌上清预防性干预和治疗性干预下对RV NSP1以及IκB/NF-κB调控作用,初步探测食淀粉乳杆菌及其分泌上清对CKII产生及功效的影响。试验设计先后完成食淀粉乳杆菌及其分泌上清体内外抗RV能力分析;重组猪轮状病毒NSP1蛋白的表达、鉴定和免疫原性测定;食淀粉乳杆菌及其分泌上清预防和治疗性干预下NSP1和IкB、NF-кB在m RNA和蛋白水平的变化,对CKII在m RNA水平的调控作用。研究结果显示,体外试验中,食淀粉乳杆菌分泌上清预防性干预组（S.BI组）中NSP1含量显着低于RV组（P<0.05）;食淀粉乳杆菌分泌上清治疗性干预组（S.AI组）NSP1含量在m RNA水平显着低于RV组（P<0.05）,在蛋白水平与RV组相比无显着性差异（P>0.05）。IкB和NF-кB在m RNA水平的趋势相似,BI组NF-kB m RNA与RV组差异显着（P<0.05）,处于一个持续稳定的上调状态。在蛋白水平上,RV组存在大量p-IкB积累,但是p-NF-кB的表达量却很少,S.BI组p-NF-кB与RV组相比表达量高差异显着（P<0.05）。体内试验中食淀粉乳杆菌灌胃乳鼠的预防性干预组（BI组）在感染RV的前三天能够显着上调NF-кB的m RNA水平（P<0.05）,与RV组和食淀粉乳杆菌灌胃乳鼠的治疗性干预组（AI组）对比鲜明;RV组、BI组和AI组的IкB m RNA水平在感染RV的1d后显着上升随后呈下降态势（P<0.05）,到7 d时与正常组相比无显着差异（P>0.05）,各组间比较差异性较小。体内外试验均表示食淀粉乳杆菌及其分泌上清能够有效抑制CKII m RNA水平上调,与RV组相比差异显着（P<0.05）;用TBB（CKII抑制剂）抑制RV组的CKII发挥作用,结果表明p-NSP1蛋白水平无表达,此结果与S.BI组相比佐证了食淀粉乳杆菌及其分泌上清可以减轻CKII表达减轻NSP1磷酸化水平,保证NF-кB通路有效激活。综上所述,食淀粉乳杆菌及其分泌上清可以有效抑制RV对肠道组织细胞的感染。食淀粉乳杆菌及其分泌上清能够抑制NSP1高表达、通过降低CKII含量抑制NSP1磷酸化产生生物学活性、有效激活IкB/NF-кB通路从而阻止RV通过NSP1逃避先天性免疫。该研究为益生菌及其分泌产物在调控机体先天性免疫通路、预防和减轻病毒感染方面的益生菌抗病毒作用机制的提供了一定的参考和依据。
王先松[5]（2020）在《渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析》文中研究表明仔猪零星死亡是目前养猪生产中十分常见的现象,多发生于仔猪的哺乳期和断奶后保育阶段,因其累积死亡数量较大,对养猪业造成的损失和潜在威胁较大,已逐渐引起人们的关注和重视。重庆西部地区畜牧业发达,有日全农牧、新希望六和等众多国内着名农牧企业入驻。随着渝西地区养猪规模的日益扩大,其中哺乳仔猪零星死亡现象频频发生,且存在难预防、难控制等问题。猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒A型和新型猪Delta冠状病毒病,均可引起仔猪腹泻、脱水等症状,疾病流行迅速,属于现代生猪养殖业中重点防控的疫病范畴。为探究渝西地区零星死亡哺乳仔猪的死亡原因,本研究于2017年7月至2018年8月对渝西部分地区8个规模猪场仔猪零星死亡情况进行了调查。将随机采集的零星死亡哺乳仔猪样本246份,采用病理剖检、石蜡切片镜检进行病理学观察,分析了零星死亡哺乳仔猪消化道病理变化特征和规律;利用分子生物学诊断技术,对病料中猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒A型和新型猪Delta冠状病毒进行了核酸检测。结果显示:（1）被调查猪场总产仔猪57346头,零星死亡3299头,平均零星死亡率为5.75%;其中春季零星死亡率最高,达8.18%,夏季最低,为4.01%。（2）消化道病理学检查显示,出现肠系膜淋巴结肿大、出血和小肠管充气、肠壁变薄现象的样本最多,达39.8%以上,有24.3%的样本存在消瘦、脱水,15.4%的样本小肠黏膜出血;且上述病变冬春季节多于夏秋两季。病理切片显示,被检仔猪小肠绒毛萎缩,黏膜上皮细胞坏死、脱落,且脱落后呈扁平或方形的未成熟细胞。（3）病毒核酸检测显示,猪轮状病毒感染率最高,为6.50%,其次是猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒,分别为4.88%和3.66%,猪Delta冠状病毒未检出;前三者混合感染检出数量占总样本数的3.66%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒合感染检出率为0.84%。为了解渝西地区猪轮状病毒基因型流行情况,以及该地区流行毒株VP7蛋白结构和功能特征,分析优势抗原表位。本研究对6株病毒VP4和VP7基因进行克隆测序,并通过生物信息学初步分析,结果显示:（1）成功扩增6株猪轮状病毒VP7基因,命名为CQ-2019/VP7-16,通过NCBI数据库对比分析得出渝西流行株均为G9基因型,未扩增到VP4基因。（2）多序列比对显示,CQ-2019/VP7-16基因序列相似度为99.92%,该基因序列与同型TM-a毒株同源性最不低于为93.7%,与不同G型代表毒株同源性最高仅为79.7%;基因进化树分析,CQ-2019/VP7-16毒株和同型毒株TM-a、NMTL在同一进化亚枝。（3）CQ-2019/VP7-16基因的ORF翻译出同一条氨基酸序列（CQ-2019/VP7）,包含326个氨基酸残基;双序列比对结果显示CQ-2019/VP7与同型代表毒株似度为93.7%,与不同型代表毒株相似性最高为85.89%,进化树分析CQ-2019/VP7与同型毒株处在同一进化分支;此外,CQ-2019/VP7与重庆人源轮状病毒VP7蛋白氨基酸序列同源性最低为93.58%,且与之存在9个氨基酸变异。（4）CQ-2019/VP7蛋白一级结构预测显示,该蛋白含有115个疏水性氨基酸和121个亲水性氨基酸,属于稳定蛋白,不能分泌信号肽,为二次跨膜蛋白;二级结构预测,该蛋白主要由α螺旋、β转角和无规则卷曲组成。（5）潜在N、O糖基化位点、潜在磷酸化位点预测,CQ-2019/VP7蛋白存在1个潜在的N-糖基化位点和24个潜在的磷酸化位点;抗原表位预测结果显示CQ-2019/VP7蛋白存在5个优势抗原表位区域。渝西地区调查猪场哺乳仔猪平均零星死亡率达到5.75%,以冬、春季最严重;调查的四种病毒性腹泻病中,猪轮状病毒核酸检出率最高（6.5%）,猪轮状病毒、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎三种病毒混合感染检测率达3.66%。试验基于猪轮状病毒CQ-2019/VP7基因的生物信息学分析,渝西地区猪场仔猪猪轮状病毒流行的基因型为G9,与G9型中的TM-a毒株亲缘关系最近,预测CQ-2019/VP7蛋白有5个优势抗原表位区域。本试验结果为渝西地区哺乳仔猪零星死亡现象的防控提供了一定科学依据。
黄安妮[6]（2019）在《基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征》文中认为我国生猪生产和消费始终占世界总量的一半,养猪业产值超过1.5万亿元,是影响国计民生的重要产业。“猪粮安天下”,但目前仍然存在许多制约我国猪养殖业持续健康发展的因素,其中仔猪腹泻致使猪抵抗力降低,死亡率增高,尤以病毒性感染引起的腹泻最为常见且致死率高。病毒性腹泻病原感染还导致生猪屠宰率下降、受污染猪肉进一步成为疾病感染源,造成严重的食品安全及相关公共卫生问题。本研究样本采集自广东某生猪养殖场,在2017年4月及7月发生的两起疑似病毒性腹泻疫情中分别采集仔猪的粪便样本和小肠内容物样本,进行病毒的测定,再运用Illumina MiSeq高通量测序技术检测健康仔猪和特定年龄的病毒性腹泻仔猪肠道菌群。具体内容如下:1、2017年4月收集到1-3周龄哺乳仔猪粪便样本,其中腹泻仔猪与健康仔猪各有20头;2017年7月收集到13头7日龄仔猪的小肠内容物样本,其中10头腹泻仔猪,3头健康仔猪。采用免疫胶体金技术和RT-PCR技术对样本进行针对猪流行性腹泻病毒、轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的检测。检测发现健康仔猪均未检出病毒,可作对照样本;4月收集到的20头腹泻仔猪粪便样本中猪流行性腹泻病毒检出率为90%,18头病毒感染猪作流行性腹泻仔猪粪便菌群研究样本;7月收集到的腹泻小肠内容物样本中轮状病毒阳性率为40%,阳性样本作猪轮状病毒感染仔猪肠道菌群研究。2、研究1-3周龄流行性腹泻仔猪粪便菌群动态变化发现,由猪流行性腹泻病毒感染引起的菌群失调,导致埃希氏-志贺菌属（Escherichia-Shigella）,肠球菌属（Enterococcus）,梭菌属（Fusobacterium）和韦荣球菌属（Veillonella）等与疾病相关菌属的丰度显着增加（P<0.05）。特别的,腹泻仔猪中梭菌属和韦荣球菌属丰度呈现与周龄相关的显着增长（P<0.05）。某些产短链脂肪酸菌,如瘤胃球菌科UGG-002（RuminococcaceaeUGG-002）,Butyricimonas和Alistipes,作为核心菌属存在于所有健康仔猪中,但在特定周龄的腹泻仔猪中存在缺失现象。此外,通过COG功能预测得到流行性腹泻病毒严重扰乱各年龄段仔猪粪便菌群正常生理功能。3、通过对7日龄轮状病毒感染仔猪与健康仔猪肠道菌群的对比研究发现,作为新生健康仔猪小肠内优势菌属的埃希氏-志贺菌属,肠球菌属和葡萄球菌属（Staphylococcus）,在患病仔猪肠道内丰度显着降低（P<0.05）。特别的,食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）等对某些病毒有抑制作用的乳酸菌,在疾病组中丰度极显着增加（P<0.01）。猪轮状病毒的感染导致肠道内部分菌属间相关性减弱甚至消失,使仔猪正常稳定的肠道菌群结构遭到破坏,肠道正常生理功能受损。本研究结果表明,猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒感染引起了猪肠道微生物群结构和功能被严重扰乱,同时,根据不同年龄段仔猪有益菌群的缺乏情况进行针对性的补充,可能是一种预防或治疗病毒性腹泻的有效方法。
黄晓星[7]（2019）在《猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用》文中研究说明猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一,主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水。猪轮状病毒一般不引起成年猪发病,可以使成年猪呈现隐性感染,持续排毒,从而导致病毒水平传播。若与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及致病性大肠杆菌混合感染会使病情加重,导致高死亡率,从而给养猪业造成严重的经济损失。A群轮状病毒（RVA）属于一种无囊膜包被的病毒,它由11个分节段的双股正链RNA组成,分别编码6个结构蛋白（VP1-VP4,VP6-7）和5/6个非结构蛋白（NSP1-5/6）。VP7和VP4蛋白能够诱导产生血清型特异性中和抗体,在免疫保护和疫苗开发方面起重要作用,至今已在人类和动物中确立了 27个G血清型和37个P血清型。猪轮状病毒最常见的基因型组合为G3、G4、G5、G11和P[6]、P[7]的基因型组合。先前鉴定的在猪中主要的G血清型是G3,G4,G5和G11,与之相关的P血清型是P[6]和P[7]。本研究通过构建PoRV-VP7基因在杆状病毒表达系统中表达的rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白,制备了针对rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白的单克隆抗体;构建了以rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白为包被抗原,具有高特异性、灵敏度的PoRV抗体检测方法。1.猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建为了获得PoRV-VP7蛋白在杆状病毒表达系统中表达的融合蛋白。本研究以实验室分离并全基因测序分析后保存的一株猪轮状病毒GD-01-2015株为模板,用PCR方法扩增出vp7基因,克隆到pFast-Bac-HTA真核表达供体质粒中,然后将含有目的基因的重组供体质粒转座DH10BacTM感受态细胞,获得重组杆状质粒rBacmid-PoRV-VP7;最后在脂质体LipofectamineTM 3000的介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7。间接免疫荧光（IFA）试验结果表明,重组杆状病毒表达的融合蛋白可以被抗猪轮状病毒抗体所识别且表达为胞浆蛋白。Western-Blot结果表明,重组杆状病毒表达的分子量大小为37kDa融合蛋白可以被His标签抗体特异性识别。2.抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备为了获得可以用于建立PoRV快速检测方法的单克隆抗体,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7为免疫原,免疫6～8周龄的Balb/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,利用间接免疫荧光（IFA）方法筛选出3株能够稳定分泌抗PoRV-VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Mab-PoRV-1G3、Mab-PoRV-2B10和Mab-PoRV-2D2;分别对筛选获得的单克隆抗体特异性及亚类特性进行鉴定。Western-Blot结果表明,这三株单克隆抗体都是PoRV-VP7蛋白特异性抗体,只与PoRV发生特异性反应;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,Mab-PoRV-2B10为IgG,其余2株均为IgM。3.猪轮状病毒免疫猪血清抗体ELISA检测方法的建立为了建立有较好的特异性强和灵敏度的抗PoRV抗体快速检测方法,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒表达蛋白作为包被抗原,HRP-羊抗猪IgG作为酶标抗体,建立了检测抗PoRV-VP7抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,所建立的ELISA检测方法只与所检测的已知PoRV阳性猪血清反应,而与已知PEDV阳性猪血清和已知TGEV阳性猪血清均无交叉反应。灵敏度试验结果显示,该ELISA检测方法最低能够检测出经过1:6400稀释的本研究方法所使用的的已知PoRV 阳性猪血清。分别用三种方法对92份临床猪血清样品进行检测并比对检测结果,结果显示商品化试剂盒检测和间接免疫荧光检测结果与本研究所建立的检测方法的总符合率分别为76%和91.3%。因此,本研究所建立的方法能够有效用于检测免疫猪血清所含抗PoRV抗体,该ELISA检测方法将具有一定的应用前景。
乔成鹏[8]（2019）在《2015～2016年中国部分地区猪轮状病毒感染检测及病毒分离与鉴定》文中研究说明猪轮状病毒病是由猪轮状病毒（porcine rotavirus,PoRV）引起的一种以腹泻、呕吐、厌食、脱水为临床症状的急性胃肠炎传染病。猪轮状病毒是导致世界范围内仔猪剧烈腹泻的主要病原之一,给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪轮状病毒感染具有潜伏期短、传染性强、流行范围广、发病率高等特征,常与其他细菌、病毒混合感染而使病情加重,导致患病猪群死亡率升高,严重制约了我国养猪业的健康发展。为调查20152016年中国部分地区猪A群轮状病毒（porcine group A rotavirus,GARV）、猪B群轮状病毒（porcine group B rotavirus,GBRV）和猪C群轮状病毒（porcine group C rotavirus,GCRV）的流行情况,本研究利用巢式RT-PCR方法对2015年1月至2016年12月从我国部分地区采集的321份仔猪腹泻病料和42份健康仔猪粪便进行检测分析,结果显示GARV、GBRV、GCRV阳性率分别为44.10%、2.75%和6.61%;将检测为强阳性的腹泻病料,用胰酶处理后接种Vero细胞,进行病毒的传代培养。然后,对产生明显细胞病变（cytopathic effect,CPE）的分离毒株进行了鉴定,命名为HJ-2016,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序和分析。结果显示,该分离株为猪A群轮状病毒,基因型为G5P[7]I5。将本试验所分离的GARV HJ-2016株对未采食母乳的2日龄仔猪进行感染试验,利用本研究建立的SYBR GreenⅠ定量RT-PCR方法检测GARV对攻毒仔猪的组织嗜性,以探索其致病性。结果显示,攻毒组仔猪肺脏和回肠组织中猪轮状病毒核酸载量最高,达到104105copies/μL,肠道组织出现明显的病理变化,GARV HJ-2016株有致病性。本研究明确了20152016年中国部分地区猪A群、B群、C群轮状病毒感染情况,分离出一株猪A群轮状病毒HJ-2016,并建立了SYBR GreenⅠ定量RT-PCR方法,初步探讨了HJ-2016毒株的致病性及感染机制,为我国猪A群轮状病毒病的分子生物学特性研究、疫苗开发、致病性和综合防控提供理论依据。
王睿敏[9]（2019）在《猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究》文中研究表明猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪轮状病毒（PRoV）是仔猪常见的重要病毒性腹泻病原,临床上均以呕吐、厌食、腹泻、脱水为主要特征,仔猪的发病率和死亡率较高,给养猪业造成重大经济损失。尤其是PEDV变异株,是近年来仔猪腹泻的主要病原。由于临床症状极其相似,难以区分,只能借助实验室手段加以鉴别诊断。建立PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV快速鉴别检测方法,开展PEDV分子流行病学研究,对仔猪病毒性腹泻的诊断和防控具有重要意义。1.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,本研究分别针对PEDV N基因、TGEVM基因、PDCoVN基因和PRoVVP6基因设计特异性引物,经过优化反应条件,建立了同时检测并区分4种病毒的多重RT-PCR方法。结果,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其他主要病毒无交叉反应,具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出下限分别为1.57×102拷贝/μL、1.57×103拷贝/μL、1.57×102拷贝/μL、1.57×102拷贝/μL,具有很高的敏感性;在相同条件下进行重复性试验,获得结果一致。应用所建立的方法检测临床采集的270份腹泻病料,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%1.85%,并且存在混合感染现象。表明,本研究建立的多重RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段2.PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用为鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,分别针对PEDVN基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和PRoV VP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测并区分4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其他主要病毒无交叉反应,具有很强的特异性;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的最低检出量分别为2.06×102拷贝/μL、2.06×102拷贝/μL、2.06×101拷贝/μL、2.06×103拷贝/μL,具有很高的敏感性;组内与组间重复性试验的变异系数均小于1.1%,具有良好的重现性。应用所建立的方法检测临床采集的243份腹泻病料,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为11.93%、15.64%、9.05%、9.47%,并且存在混合感染现象。应用上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR方法对相同病料进行检测,结果PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为10.29%、13.17%、7.82%、7.40%,两者的符合率为96.71%。表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法为临床样品中PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。3.2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究为掌握广西PEDV流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻病料,应用所建立的PEDV、TGEV、PDCoV及PRoV多重RT-PCR检测方法进行检测,对PEDV阳性样品随机抽取部分样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果,共检测2017-2019年采集的病料1454份,PEDV阳性157份,阳性率10.80%。经扩增、克隆、测序,获得PEDV S基因23株、M基因和N基因各25株。同源性分析表明,广西流行株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因分别为90.7%-100%和85.0%-100%,在M基因分别为97.5%-100%和97.4%-100%,在N基因分别为96.3%-100%和97.1%-100%。序列比对分析表明,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、变异和插入现象,且广西各毒株之间存在差异。进化速率分析表明,PEDV S基因进化速度最快。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株在GⅠa、GⅠb、GⅡa、GⅡb亚群均有分布,主要集中在GⅠb、GⅡa亚群。表明,PEDV广西流行毒株均有遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。
丁光明[10]（2019）在《猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立应用及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定》文中指出病毒性腹泻严重损害了养猪业,在世界范围内造成了巨大的经济损失。引起腹泻的主要病毒有猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（PRV-A）,近年来,也发现了一些新出现的病毒,如猪库布病毒（PKV）、猪札幌病毒（PSaV）和猪丁型冠状病毒（PDCoV）。由于肠道病原体的多样性以及肠道病毒感染引起的临床症状和病理变化的高度相似性,对猪病毒性腹泻的鉴别诊断具有重要的意义。为建立一种快速检测和鉴别上述病毒的多重RT-PCR方法,我们针对TGEV、PEDV和PDCoV的N基因、PRV-A的VP7基因以及PKV和PSaV的多聚蛋白设计了特异性引物。成功地建立并优化了用于检测6种腹泻病毒多重RT-PCR技术,并且具有较高的敏感性和特异性。最后,采用多重RTPCR法对382份腹泻标本进行分析,结果表明,在2015年10月至2017年4月期间,PDCoV、PSaV和PEDV在中国养猪场主要流行,由两种或三种猪肠内病毒共同感染。多重RT-PCR方法特异性地针对在我国猪场流行的主要猪肠道病毒,为临床诊断实验室提供有价值的工具。之前结果表明PEDV在我国猪场主要流行,故取多重RT-PCR检测结果PEDV阳性cDNA再采用针对PEDV N基因扩增该基因片段的引物,并且成功扩增出该目的片段。从山东烟台某猪场的腹泻样本中检测获得了一株PEDV,并对该毒株进行全基因测序,分析该毒株与流行毒株的关系以及S基因的遗传进化关系。所有分析结果均表明:与经典毒株相比,本研究分离获得的PEDV毒株发生了较大变化为变异毒株。该结果警示我们,对当前流行的PED防控不能采用早年分离的毒株制作的疫苗,须以当下流行毒株为背景来研制新的PEDV疫苗。为建立PEDV血清学检测方法,制备针对PEDV-N蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从PEDV YT1401株中扩增其N基因片段,构建原核表达重组质粒pET30a-PEDV-N,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中并进行条件优化诱导表达、SDS-PAGE、Western Blotting试验。结果表明,SDS-PAGE检测获得了约57 kDa的表达产物,与目的蛋白大小符合;且具有良好的免疫学活性。
二、猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文提纲范文）
（1）猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 部分缩写符号中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 轮状病毒概述 |
| 1.2 RV的生物学结构 |
| 1.3 RV的分类 |
| 1.4 RV的基因组及病毒蛋白 |
| 1.5 RV病毒蛋白 |
| 1.5.1 RV的核心蛋白 |
| 1.5.2 RV的结构蛋白 |
| 1.5.3 RV的非结构蛋白 |
| 1.6 RV相关疫苗 |
| 1.6.1 RV口服减毒疫苗 |
| 1.6.2 RV亚单位疫苗 |
| 1.6.3 RV核酸疫苗 |
| 1.6.4 RV口服转基因植物疫苗 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 1.8 试验技术路线 |
| 第二章 轮状病毒VP4 蛋白的原核表达及其纯化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配置 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 猪轮状病毒VP4 基因的合成 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pET32a-VP4 的鉴定 |
| 2.2.4 pET32a-VP4-DE3 菌诱导后目的蛋白的表达 |
| 2.2.5 SDS-PAGE检测VP4 蛋白的纯化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 PRV VP4 蛋白的免疫原性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 血清中特异性抗体Ig G测定 |
| 3.2.2 粪便中特异性抗体IgA测定 |
| 3.2.3 唾液中特异性抗体IgA测定 |
| 3.2.4 血清中细胞因子IFN-γ和 IL-4 测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（2）华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 轮状病毒形态及分子生物学特征研究 |
| 1.1 轮状病毒形态 |
| 1.2 轮状病毒分子生物学特征 |
| 2 猪轮状病毒的诊断方法研究进展 |
| 2.1 猪轮状病毒的临床诊断方法 |
| 2.2 猪轮状病毒实验室诊断方法 |
| 3 猪轮状病毒病流行现状 |
| 4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 4.1 猪轮状病毒灭活苗 |
| 4.2 猪轮状病毒弱毒活疫苗 |
| 4.3 猪轮状病毒新型疫苗 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 1.5 VP7 和VP4 基因克隆与序列鉴定 |
| 1.6 VP7 基因和VP4 基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 华东地区猪轮状病毒病流行病学调查 |
| 2.2 VP7 和VP4 基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 PoRV480-VP4*基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.4 重组480-VP4*蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 1.5 重组480-VP4*蛋白浓度测定 |
| 1.6 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 1.7 间接ELISA的临界值 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与中和抗体检测的比对试验 |
| 1.12 间接ELISA检测临床猪血清样品 |
| 2 结果 |
| 2.1 Po RV480-VP4*基因原核表达载体的构建 |
| 2.2 重组Po RV480-VP4*蛋白SDS PAGE和 Western Blot试验 |
| 2.3 间接ELISA最佳反应条件的筛选 |
| 2.4 间接ELISA的临界值 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 敏感性试验 |
| 2.7 重复性试验 |
| 2.8 与中和抗体检测的比对试验结果 |
| 2.9 间接ELISA检测临床猪血清样品结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪轮状病毒不同截短VP4 蛋白免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计及目的基因扩增 |
| 1.4 不同的重组基因原核表达载体的构建与转化 |
| 1.5 重组蛋白诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.6 纯化的重组蛋白浓度测定 |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 试验动物及免疫接种 |
| 1.9 血清ELISA抗体检测 |
| 1.10 血清中和抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒RT-PCR产物及双酶切产物电泳结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.4 纯化的重组蛋白Western Blot试验 |
| 2.5 纯化的重组蛋白浓度测定结果 |
| 2.6 血清ELISA抗体检测结果 |
| 2.7 血清中和抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪主要消化道类病毒概述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 PEDV病原学特征及基因组结构 |
| 1.1.2 PEDV编码蛋白 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.2.1 TGEV病原学特征及基因组结构 |
| 1.2.2 TGEV编码蛋白 |
| 1.3 猪德尔塔冠状病毒 |
| 1.3.1 PDCoV病原学特征及基因组结构 |
| 1.3.2 PDCoV编码蛋白 |
| 1.4 猪轮状病毒 |
| 1.4.1 PoRV病原学特征及基因组结构 |
| 1.4.2 PoRV编码蛋白 |
| 1.4.3 PoRV分群 |
| 2 猪消化道类病毒分子生物学检测方法研究进展 |
| 2.1 猪消化道病毒性疫病常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.1 猪流行性腹泻病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.2 猪传染性胃肠炎病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.3 猪德尔塔冠状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.4 猪轮状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2 猪消化道病毒性疫病实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.2 猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.3 猪德尔塔冠状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.4 猪轮状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.3 猪消化道病毒性疫病环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.1 猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.2 猪传染性胃肠炎病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.3 猪德尔塔冠状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.4 猪轮状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.4 猪消化道病毒性疫病重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.1 猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.2 猪传染性胃肠炎病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.3 猪德尔塔冠状病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.5 猪消化道病毒性疫病基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.1 猪流行性腹泻病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.2 猪传染性胃肠炎病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.3 猪轮状病毒因芯片检测方法研究进展 |
| 2.6 猪消化道病毒性疫病多重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.1 二重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.2 三重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.3 四重及以上PCR检测方法研究进展 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA及 PoRVC单重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 病料来源 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 病毒核酸的提取及cDNA模板的制备 |
| 2.4 病毒核酸的PCR扩增 |
| 2.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 2.5.1 目的基因的回收纯化 |
| 2.5.2 目的基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.5.3 重组质粒的转化 |
| 2.5.4 重组质粒的抽提及鉴定 |
| 2.6 单一病毒PCR检测方法的建立 |
| 2.6.1 单一病毒PCR反应体系的建立 |
| 2.6.2 单一病毒PCR反应条件的优化 |
| 2.6.3 单一病毒PCR的敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 3.2 单一病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 单一病毒RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.2.2 单一病毒RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.3 单一病毒的RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 单一病毒RT-PCR敏感性检测 |
| 3.3 单一RT-PCR检测方法对临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 规模化猪场猪消化道主要病毒五重RT-PCR方法的建立与初步应用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 模板来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 试验使用的主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.2 五重RT-PCR反应退火温度的优化 |
| 2.2.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 2.2.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.5 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.6 五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 2.3 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.1.1 五重RT-PCR最佳反应体系 |
| 3.1.2 五重RT-PCR退火温度的优化 |
| 3.1.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 3.1.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 3.1.5 五重RT-PCR反应重复性试验 |
| 3.2 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 4 猪消化道主要病毒五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 4.1 阳性对照的制备 |
| 4.2 阴性对照的制备 |
| 4.3 反应液的制备 |
| 4.4 试剂盒说明 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文 |
| 附录二 攻读硕士学位期间参与的课题 |
| 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
（4）食淀粉乳杆菌在干预猪轮状病毒感染中对IκB/NF-κB通路的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 益生菌概述 |
| 1.1.1 益生菌的定义和分类 |
| 1.1.2 益生菌的功能特性 |
| 1.1.3 益生菌抗病毒概况 |
| 1.1.4 食淀粉乳杆菌及其抗病毒机制研究进展 |
| 1.2 轮状病毒概述 |
| 1.2.1 轮状病毒的基本特性 |
| 1.2.2 RVA中 NSP1 的结构和功能 |
| 1.2.3 先天性免疫系统概述 |
| 1.2.4 病毒逃避宿主先天性免疫作用机制 |
| 1.2.5 NSP1 降解β-TrcP调控NF-кB信号通路的机理 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、病毒、细胞和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IPEC-J2细胞的复苏和传代 |
| 2.2.2 PRV 的增殖与毒力测定 |
| 2.2.3 食淀粉乳杆菌分泌上清的制备 |
| 2.2.4 CCK8 法测定食淀粉乳杆菌分泌上清抗 PRV 能力 |
| 2.2.5 重组猪轮状病毒NSP1蛋白的表达 |
| 2.2.6 rPoRV-NSP1 多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.7 食淀粉乳杆菌分泌上清对 NSP1 及 IkB/NF-kB 通路相关因子影响 |
| 2.2.8 食淀粉乳杆菌对体内 NSP1 及 IkB/NF-kB 通路相关因子检测 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 食淀粉乳杆菌抗猪轮状病毒功能测定 |
| 3.1.1 IPEC-J2细胞活力测定 |
| 3.1.2 猪轮状病毒的毒力测定 |
| 3.1.3 食淀粉乳杆菌分泌上清的细胞毒性测定 |
| 3.1.4 食淀粉乳杆菌分泌上清对 PRV 的抑制率 |
| 3.2 制备 PRVNSP1 多克隆抗体 |
| 3.2.1 克隆RVNSP1全长基因 |
| 3.2.2 重组质粒p Clone007-NSP1 的构建与鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒 BL21/pET-32a-NSP1 的构建与鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白BL21/p ET32a-NSP1 的表达 |
| 3.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.6 NSP1多克隆抗体效价检测 |
| 3.2.7 NSP1多抗血清间接免疫荧光检测 |
| 3.2.8 NSP1 多抗血清Western-blot鉴定 |
| 3.3 食淀粉乳杆菌分泌上清对NSP1的影响 |
| 3.4 食淀粉乳杆菌分泌上清对NF-kB/IkB通路的影响 |
| 3.4.1 食淀粉乳杆菌分泌上清作用于正常IPEC-J2对NF-kB的 m RNA水平的影响 |
| 3.4.2 IkB、NF-kB mRNA水平测定 |
| 3.4.3 b-TrcP mRNA水平测定 |
| 3.4.4 食淀粉乳杆菌分泌上清对 IkB、NF-kB 蛋白表达的影响 |
| 3.5 食淀粉乳杆菌分泌上清对CKII的影响 |
| 3.5.1 CKII mRNA水平测定 |
| 3.5.2 抑制 CKII 活性对 NSP1 和 p-IkB 蛋白水平影响 |
| 3.6 乳鼠感染 PRV 初步检测 |
| 3.6.1 乳鼠体重变化 |
| 3.6.2 乳鼠粪便中PRV定量ELISA检测 |
| 3.7 食淀粉乳杆菌对乳鼠体内NSP1的影响 |
| 3.7.1 NSP1 mRNA水平测定 |
| 3.7.2 NSP1蛋白水平测定 |
| 3.8 食淀粉乳杆菌对乳鼠体内 IkB、NF-kB mRNA 水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 食淀粉乳杆菌及其分泌上清抗 PRV 作用 |
| 4.2 食淀粉乳杆菌对NSP1及其相关因素调节作用分析 |
| 4.2.1 食淀粉乳杆菌及其分泌上清对体内外NSP1的调节作用分析 |
| 4.2.2 食淀粉乳杆菌及其分泌上清对体内外 IkB/NF-kB 通路的调节作用分析 |
| 4.3 食淀粉乳杆菌对CKII调控作用分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:中英文缩略词表 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 猪流行性腹泻 |
| 1.3 猪传染性胃肠炎 |
| 1.4 猪Delta冠状病毒病 |
| 1.5 猪轮状病毒病 |
| 1.6 猪轮状病毒VP4、VP7蛋白 |
| 1.7 小结 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究技术路线 |
| 第3章 渝西地区零星死亡哺乳仔猪4种病毒性腹泻调查 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第4章 猪轮状病毒分离株基因型及VP7基因序列生物信息学分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 分析讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 病原学特征 |
| 1.1.2 流行特点 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 发病机理 |
| 1.1.5 检测技术 |
| 1.2 猪轮状病毒 |
| 1.2.1 病原学特征 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 发病机理 |
| 1.2.5 检测技术 |
| 1.3 猪肠道微生物 |
| 1.3.1 影响猪肠道菌群组成的因素 |
| 1.3.2 肠道菌群的作用 |
| 1.4 16SrRNA基因高通量测序技术 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 第二章 样本采集及病毒的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 样品的采集与处理 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫金标试剂盒检验 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 病毒RNA的提取 |
| 2.3.4 一步法RT-PCR扩增 |
| 2.3.5 检测PCR产物 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 粪便样本的病毒检测结果 |
| 2.4.2 小肠内容物样本的病毒检测结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 不同周龄的流行性腹泻仔猪粪便菌群动态变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样本 |
| 3.3.2 总DNA提取 |
| 3.3.3 PCR扩增 |
| 3.3.4 Illumina Miseq测序 |
| 3.3.5 数据处理 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 测序数据与菌群多样性 |
| 3.4.2 健康与PEDV感染仔猪粪便菌群组成结构分析 |
| 3.4.3 不同周龄的PEDV感染仔猪粪便菌群组成结构动态变化分析 |
| 3.4.4 健康仔猪与PEDV感染仔猪核心菌群差异 |
| 3.4.5 通过功能预测分析比较健康与PEDV感染仔猪的差异 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 健康与猪轮状病毒感染仔猪肠道菌群差异研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样本 |
| 4.3.2 总DNA提取 |
| 4.3.3 PCR扩增 |
| 4.3.4 Illumina Miseq测序 |
| 4.3.5 数据处理 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 测序数据与菌群多样性 |
| 4.4.2 菌群群落结构门水平组成分析 |
| 4.4.3 菌群群落结构属水平组成分析 |
| 4.4.4 健康与PoRV感染仔猪肠道菌群物种差异分析 |
| 4.4.5 健康与PoRV感染仔猪肠道菌群物种相关性分析 |
| 4.4.6 通过功能预测分析比较健康与PoRV感染仔猪的差异 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 轮状病毒概况 |
| 1. 病原学 |
| 1.1 轮状病毒的形态结构 |
| 1.2 轮状病毒的外衣壳蛋白及功能 |
| 1.3 轮状病毒分型 |
| 1.4 理化性质 |
| 2. 流行病学 |
| 3. 发病机制和病理变化 |
| 4. 猪轮状病毒感染的诊断与预防 |
| 4.1 临床诊断 |
| 4.2 实验室诊断 |
| 4.3 预防和治疗 |
| 5. 研究目的与意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 PCR引物设计 |
| 2.2 PCR扩增PoRV-vp7基因序列 |
| 2.3 重组质粒pGEM-T-PoRV-VP7的构建和鉴定 |
| 2.4 重组供体质粒pFastBacHTA-PoRV-VP7的构建和鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒穿梭载体的构建和鉴定 |
| 2.6 重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7的制备 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Vero细胞增殖PoRV病毒 |
| 3.2 杆状病毒转移载体的构建 |
| 3.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 杂交瘤细胞的制备 |
| 2.3 阳性克隆筛选(间接免疫荧光法(IFA))方法的建立 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光(IFA)筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆及建株 |
| 2.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 2.7 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 2.8 腹水的制备以及纯化 |
| 3. 结果 |
| 3.1 阳性克隆筛选(间接免疫荧光法(IFA))方法的建立 |
| 3.2 IFA方法筛选阳性克隆并建株 |
| 3.3 单克隆抗体生物学特性鉴定 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 猪血清中抗猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 包被抗原的制备 |
| 2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 2.4 间接ELISA方法特异性试验 |
| 2.5 间接ELISA方法灵敏度试验 |
| 2.6 间接ELISA方法重复性试验 |
| 2.7 临床检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 包被抗原的制备 |
| 3.2 间接ELISA方法的建立 |
| 3.3 间接ELISA方法临界值的确定 |
| 3.4 间接ELISA方法特异性试验 |
| 3.5 间接ELISA方法灵敏度试验 |
| 3.6 间接ELISA方法重复性试验 |
| 3.7 临床检测 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）2015～2016年中国部分地区猪轮状病毒感染检测及病毒分离与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪轮状病毒病原学特征 |
| 1.1.1 病毒形态及分子特征 |
| 1.1.2 结构蛋白 |
| 1.1.3 非结构蛋白 |
| 1.1.4 轮状病毒的分型 |
| 1.2 猪轮状病毒的诊断方法 |
| 1.2.1 经典病原诊断方法 |
| 1.2.2 免疫学诊断方法 |
| 1.2.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.3 猪轮状病毒流行病学调查进展 |
| 1.4 猪轮状病毒疫苗研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 2015～2016 年中国部分地区猪轮状病毒感染检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 引物合成 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 临床样本处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 反转录生成c DNA |
| 2.2.4 GARV、GBRV、GCRV目的基因RT-nPCR扩增 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 GARV、GBRV、GCRV目的基因PCR扩增结果 |
| 2.3.2 腹泻病料与健康粪便中PoRV病原检测结果 |
| 2.3.3 2015 ～2016 年中国南北方部分地区PoRV的感染检测结果 |
| 2.3.4 2015 ～2016 年中国6 个地区PoRV的感染检测结果 |
| 2.3.5 2015 年、2016 年不同年份的PoRV感染检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 猪轮状病毒的分离与鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 样品来源、细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 病料处理 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 病毒的分离培养 |
| 3.2.4 病毒的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病毒分离结果 |
| 3.3.2 巢式RT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.3.4 电镜鉴定结果 |
| 3.3.5 VP4、VP6和VP7 基因的RT-PCR扩增 |
| 3.3.6 VP4、VP6和VP7 基因重组质粒鉴定 |
| 3.3.7 VP4、VP6和VP7 基因序列测序结果 |
| 3.3.8 HJ-2016 分离株VP6 基因遗传进化树分析 |
| 3.3.9 HJ-2016 分离株VP4和VP7 基因遗传进化树分析 |
| 3.3.10 TCID50 的测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 GARV实时荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 病毒核酸样品和阳性对照质粒 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 标准曲线的建立 |
| 4.2.2 特异性试验 |
| 4.2.3 敏感性试验 |
| 4.2.4 重复性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 阳性质粒的PCR鉴定 |
| 4.3.2 标准曲线的建立 |
| 4.3.3 特异性、重复性试验结果 |
| 4.3.4 敏感性试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 猪A群轮状病毒HJ-2016 株致病性试验 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 病毒和试验动物 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 仔猪分组与攻毒 |
| 5.2.2 临床症状观察 |
| 5.2.3 粪便拭子采集及RT-qPCR检测 |
| 5.2.4 肠道组织病理学检测 |
| 5.2.5 GARV组织嗜性检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 攻毒仔猪的临床症状 |
| 5.3.2 猪A群轮状病毒感染的病理变化 |
| 5.3.3 猪A群轮状病毒感染的病理组织学观察 |
| 5.3.4 临床症状指标变化结果 |
| 5.3.5 GARV组织嗜性检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（9）猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 综述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 |
| 1.1.1 PEDV流行病学 |
| 1.1.2 PEDV基本特征 |
| 1.1.3 PEDV基因组结构与功能 |
| 1.1.4 PEDV主要编码蛋白及其功能 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.3 猪轮状病毒概述 |
| 1.4 猪Delta冠状病毒概述 |
| 1.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测技术及其研究进展 |
| 1.5.1 免疫荧光法(IF) |
| 1.5.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.3 免疫组织化学(IHC) |
| 1.5.4 病毒分离鉴定 |
| 1.5.5 胶体金免疫层析技术 |
| 1.5.6 环介导等温扩增技术(LAMP) |
| 1.5.7 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 1.5.8 荧光定量PCR检测法 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 重组质粒标准品的构建 |
| 2.2.2.1 腹泻病料的处理 |
| 2.2.2.2 RNA的反转录及PCR的扩增 |
| 2.2.2.3 目的基因的纯化 |
| 2.2.2.4 目的基因的克隆转化 |
| 2.2.2.5 重组质粒的制备 |
| 2.2.3 多重RT-PCR反应条件的优化 |
| 2.2.4 多重RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验 |
| 2.2.5 多重RT-PCR方法的临床应用 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组质粒标准品的构建 |
| 2.3.2 多重RT-PCR退火温度的优化 |
| 2.3.3 引物浓度的优化 |
| 2.3.4 循环数的优化 |
| 2.3.5 多重RT-PCR反应条件的确定 |
| 2.3.6 多重RT-PCR特异性试验 |
| 2.3.7 多重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.3.7.1 单重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.3.7.2 多重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.3.8 多重RT-PCR重复性试验 |
| 2.3.9 多重RT-PCR方法的临床应用 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 3. PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 临床病料和病毒株 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 引物和TaqMan探针的设计 |
| 3.1.4 核酸的抽提和RNA反转录 |
| 3.1.5 重组质粒标准品的制备 |
| 3.1.6 反应条件的优化和标准曲线的制作 |
| 3.1.7 多重TaqMan荧光定量PCR特异性、敏感性、重复性试验 |
| 3.1.8 多重TaqMan荧光定量PCR方法的临床应用 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的构建 |
| 3.2.2 TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件的确定 |
| 3.2.3 TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制 |
| 3.2.4 特异性分析 |
| 3.2.5 敏感性分析 |
| 3.2.6 重复性分析 |
| 3.2.7 临床样品的检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4. 2017-2019年广西PEDV分子流行病学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病料及病毒株 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 4.1.3 引物设计与合成 |
| 4.1.4 腹泻病料的处理 |
| 4.1.5 cDNA的合成及PCR的扩增 |
| 4.1.6 目的基因的纯化 |
| 4.1.7 目的基因的克隆转化 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 病料的检测 |
| 4.2.2 S、M、N基因序列 |
| 4.2.3 S、M、N基因同源性分析 |
| 4.2.3.1 PEDV S基因同源性分析 |
| 4.2.3.2 PEDV M基因同源性分析 |
| 4.2.3.3 PEDV N基因同源性分析 |
| 4.2.4 遗传进化树的绘制 |
| 4.2.4.1 PEDV S基因序列分析和遗传进化树分析 |
| 4.2.4.2 PEDV M基因遗传进化树分析 |
| 4.2.4.3 PEDV N基因序列分析和遗传进化树分析 |
| 4.2.5 PEDV S1氨基酸序列分析 |
| 4.2.6 S、M、N基因进化速率的分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及专利情况 |
（10）猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立应用及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立和应用 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒分子生物学特性 |
| 1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性 |
| 1.1.3 猪轮状病毒病毒分子生物学特性 |
| 1.1.4 猪丁型冠状病毒分子生物学特性 |
| 1.1.5 猪札幌病毒分子生物学特性 |
| 1.1.6 病毒检测技术 |
| 1.2 研究的目的与意义 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 病毒 |
| 1.3.2 实验病料 |
| 1.3.3 病料的处理 |
| 1.3.4 引物设计与合成 |
| 1.3.5 主要试剂 |
| 1.3.6 主要仪器设备 |
| 1.3.7 分子生物学分析软件和网站 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 病毒RNA抽提 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 单项RT-PCR |
| 1.4.4 单项RT-PCR引物浓度 |
| 1.4.5 单项RT-PCR灵敏性实验 |
| 1.4.6 多重RT-PCR的引物浓度的确定 |
| 1.4.7 多重RT-PCR的特异性实验 |
| 1.4.8 多重RT-PCR的敏感性实验 |
| 1.4.9 多重RT-PCR的重复性实验 |
| 1.4.10 多重RT-PCR的最终体系的确定 |
| 1.4.11 多重RT-PCR检测临床样品 |
| 1.5 结果 |
| 1.5.1 单项RT-PCR引物浓度的确定 |
| 1.5.2 单项RT-PCR敏感性实验 |
| 1.5.3 三重RT-PCR方法的扩增及优化 |
| 1.5.4 四重RT-PCR方法的扩增及优化 |
| 1.5.5 五重RT-PCR方法的扩增及优化 |
| 1.5.6 六重RT-PCR方法的扩增及优化 |
| 1.5.7 六重RT-PCR最终体系 |
| 1.5.8 多重RT-PCR敏感性 |
| 1.5.9 多重RT-PCR重复性 |
| 1.5.10 多重RT-PCR特异性 |
| 1.5.11 多重RT-PCR检测临床样品 |
| 1.6 讨论 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒YT1401株分离、鉴定及分子进化特征分析 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病料 |
| 2.2.2 工具酶和主要试剂 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 病毒RNA抽提 |
| 2.2.5 PEDV鉴定及全基因克隆 |
| 2.2.6 PEDV YT1401株全基因组及S基因序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 分离病毒的PCR鉴定结果 |
| 2.3.2 PEDV YT1401全基因扩增基序列测定、拼接 |
| 2.3.3 PEDV YT1401株全基因组的遗传进化分析 |
| 2.3.4 PEDV YT1401株S基因遗传进化分析 |
| 2.3.5 PEDV YT1401株S蛋白分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 pET-30a与PEDV-N基因克隆构建、原核表达、纯化鉴定 |
| 3.1 研究的目的与意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 质粒与表达载体 |
| 3.2.2 实验菌株 |
| 3.2.3 主要酶与试剂 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.2.5 pET-30a载体制备 |
| 3.2.6 PEDV N基因外源片段制备 |
| 3.2.7 双酶切及纯化 |
| 3.2.8 重组质粒的构建 |
| 3.2.9 pET-N蛋白原核表达 |
| 3.2.10 SDS-PAGE分析 |
| 3.2.11 包涵体的纯化 |
| 3.2.12 Western Blotting分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pET-30a质粒准确性验证 |
| 3.3.2 PEDV N基因全长的扩增 |
| 3.3.3 EcoR V和 BamH I双酶切N质粒 |
| 3.3.4 阳性重组质粒pET-N的鉴定 |
| 3.3.5 阳性重组质粒pET-N挑单克隆菌液PCR鉴定 |
| 3.3.6 37℃、25℃、18℃诱导结果 |
| 3.3.7 咪唑梯度洗脱蛋白鉴定结果 |
| 3.3.8 Western Blotting分析 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究（论文参考文献）
- [1]猪轮状病毒VP4亚单位疫苗的制备及免疫原性分析[D]. 王小奎. 石河子大学, 2021(02)
- [2]华东地区猪轮状病毒分子流行病学调查及亚单位疫苗初步研究[D]. 常新见. 西藏大学, 2020(12)
- [3]猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用[D]. 郭倩妤. 贵州大学, 2020
- [4]食淀粉乳杆菌在干预猪轮状病毒感染中对IκB/NF-κB通路的调控机制[D]. 王宁. 东北农业大学, 2020(04)
- [5]渝西地区零星死亡哺乳仔猪四种腹泻病调查及RVA VP7基因生物信息学分析[D]. 王先松. 西南大学, 2020(01)
- [6]基于高通量测序技术研究病毒性腹泻仔猪肠道菌群特征[D]. 黄安妮. 华南理工大学, 2019
- [7]猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用[D]. 黄晓星. 扬州大学, 2019
- [8]2015～2016年中国部分地区猪轮状病毒感染检测及病毒分离与鉴定[D]. 乔成鹏. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [9]猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究[D]. 王睿敏. 广西大学, 2019(01)
- [10]猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立应用及猪流行性腹泻病毒的分离鉴定[D]. 丁光明. 兰州大学, 2019(08)