一、非病毒基因治疗载体的研究进展（论文文献综述）
张伟莉,杜秋杰,朱嘉懿,王浩民,乔可欣,王天云,赵春澎,张玺,王小引[1]（2021）在《用于基因治疗的非病毒附着体载体研究进展》文中进行了进一步梳理基因转移载体在基因治疗中起着关键的作用。非病毒附着体载体可以附着而非整合到宿主细胞染色体上,克服了病毒载体及整合载体带来的副作用,是目前安全、理想的可用于基因治疗的表达载体。然而,其低克隆形成率、低表达量和低拷贝数限制了其在基因治疗中的应用。自第一代非病毒附着体载体构建以来,采用截短核基质附着区（matrix attachment region,MAR）元件、减少CpG岛的数量、选择合适的启动子、使用调控元件等一系列措施调控其表达水平和稳定性,不仅提高了非病毒附着体载体的转染效率,而且使其表现出了高表达水平和高稳定性。目前,该载体已经广泛应用于各个系统疾病的基因治疗研究。该文综述了非病毒附着体载体的各种优化策略的研究进展,并对其在基因治疗中的潜在应用价值进行了讨论。
李光照,陈锐,贾洪林,任利玲[2]（2022）在《组织工程血管化基因治疗的研究进展》文中指出背景:在大块工程化移植物内部迅速形成功能性血管系统,是其在宿主体内成功存活的基本前提。利用基因工程技术实现工程组织血管化具有治疗效果好、费用低、安全性高等优点,开展工程组织血管化基因治疗的相关研究对实现长期有效的组织修复有着重大意义。目的:综述目前组织工程血管化基因治疗的种子细胞、目的基因和基因载体的研究现状及存在的主要问题,以期进一步探讨基因治疗在组织工程血管化中的应用前景。方法:在Pub Med、Web of Science、CNKI上进行了文献检索,并以"Tissue engineering;Vascularization;Gene therapy;Seed cells;Target genes;Vectors"作为英文检索词,以"组织工程;血管化;基因治疗;种子细胞;目的基因;载体"作为中文检索词,对最终纳入的61篇文献进行了归纳总结。结果与结论:间充质干细胞、血管内皮细胞及内皮祖细胞是组织工程血管化基因治疗中最具潜力的种子细胞,不仅具有良好的血管诱导性,而且有利于多种病毒和非病毒载体的导入及血管化目的基因的表达。血管内皮生长因子、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2、缺氧诱导因子1α等血管化目的基因,主要通过双/多基因联合、成骨与成血管耦合及上游基因调控等方式在工程化移植物内部构建出高效、稳定的血管网络。由于不同的病毒和非病毒载体具有各自的优缺点,因此在应用时主要根据基因转染效率、生物安全性、成本等方面来选择合适的载体。目前,尽管基因治疗在组织工程血管化中的应用研究已取得很大进展,但是要真正应用于临床实践,还需要突破众多技术瓶颈,例如如何提高目的因子的释放靶向性和降低安全风险等,这也是未来组织工程血管化基因治疗的研究方向和热点。
卫星[3]（2021）在《非病毒载体在遗传性视网膜变性基因治疗中的应用》文中提出遗传性视网膜变性（IRD）发病机制复杂多样, 常常导致不可逆盲, 目前尚缺乏有效的治疗方法。近年来, 针对IRD的基因治疗显示出广阔的应用前景, 而如何将基因药物递送至靶细胞并安全、高效地表达成为目前研究发展的关键点。病毒载体系统转染效率较高, 但具有潜在的免疫反应和生物安全等问题, 其临床应用的局限性使非病毒载体系统的开发应运而生。DNA纳米复合体是新型非病毒载体的研究热点之一, 这种聚合物/DNA复合物纳米粒子由多肽、脂质、多糖等物质压缩和包裹DNA而成, 在IRD的应用上取得了较大的进展。此外, 非病毒载体在成本、制备难易度、包装容量及安全性上均显示出其优势, 为视网膜色素变性、Stargardt病、先天性视网膜劈裂、Leber先天性黑蒙等IRD的基因治疗提供了新的研究思路。本文对近年来非病毒载体系统在转染效率、靶向性和安全性等方面的进展及其在IRD基因治疗中的应用进行综述。
路艳杰[4]（2021）在《锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究》文中提出聚乙烯亚胺（PEI）是一类应用广泛的非病毒基因载体,其表面带有许多在生理条件pH环境下可发生质子化的氨基,使其具有较好的细胞摄取能力和内小体逃逸能力。但未经过改性的PEI正电荷密度会随着分子量增大而增多,从而导致细胞毒性增大、血液相容性差等缺点,严重限制其临床应用。本实验开发新型的PEI类聚合物（SIPEI）,将含羧酸的锍类化合物（SI）和低分子量PEI经过酰胺键连接,得到具有可降解、正电荷密度小等优点的PEI修饰产物,以期望改进PEI性质,获得低毒高转染活性的基因递送载体。本实验以3种不同链长SI和4个低分子量PEI为原料,通过3种用量配比缩合获得36个聚合物SIPEI,并经红外光谱、核磁共振氢谱进行鉴定。通过凝胶电泳阻滞实验对SIPEI与DNA的复合能力进行研究,通过纳米粒度、电动电势检测SIPEI/DNA复合物的粒径大小和Zeta电势,使用MTT法评价SIPEI的细胞毒性,采用荧光显微镜观察SIPEI/DNA复合物在细胞内分布情况及转染效果。通过红外谱图和核磁氢谱分析,SIPEI成功缩合,同时PEI的改性程度随反应物比例呈正向变化。通过溶解度检测,筛选出16个溶解性较好的SIPEI。经过凝胶电泳阻滞实验,得到10个与DNA质粒具有复合能力的SIPEI。对SIPEI/DNA复合物的粒径大小及Zeta电势检测发现,各复合物的粒径在150～300 nm之间,Zeta电势多数为正电势,在+5～+25 m V之间。对10个SIPEI进行细胞毒性检测,结果显示各聚合物的细胞毒性均与对照PEI 25k无显着差异,并且各聚合物随着给药浓度或时间增加,其细胞毒性也随之增加。细胞内分布实验结果表明,7个SIPEI的DNA复合物能有效被细胞摄取且大部分分布在细胞核的周围,之后对其转染性能进行研究,筛选出4个转染效果较PEI 1.8k强的SIPEI化合物,分别为5SIPEI 1.8k-0.25、5SIPEI 1.8k-0.5、8SIPEI 1.8k-0.25、10SIPEI 1.8k-0.25,这4个SIPEI的转染效果与PEI 25k相当。本实验发现,SI官能团上的正电荷可以与DNA中磷酸根有效键合,使修饰后的低分子量PEI能复合DNA形成纳米颗粒,可达到提高转染效率的目的。但是修饰后产物细胞毒性较低分子量PEI有所升高,表明SI官能团毒性较强,需要进一步优化结构,从而得到细胞毒性低,转染效率高的基因载体。
严丽丽[5]（2021）在《载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达》文中提出背景与目的:随着基因组学的发展,许多疾病发病的基因机制逐渐阐明,基因药物越来越受到关注。然而基因载体系统的发展相对落后,严重制约了基因治疗的发展,基因药物的载体面临着稳定性差、缺乏靶向性、难以进入细胞和在细胞内难以释放等一系列难题。尤其是胃肠道系统给药还面临着诸多消化酶、胃酸的降解和破坏使其更加困难。所以,采用优良的载体将目的基因导入,这是解决胃肠道疾病基因治疗的关键问题。炎症性肠病（IBD）是结肠的一种慢性炎症性疾病,粘膜免疫异常在其发生发展中起重要作用。现有的免疫调节药物如抗TNF-α单抗类及抗IL-12/IL-23单抗等均为全身给药,有许多副作用,如能通过胃肠黏膜靶向给药将会提高治疗效果和安全性。壳聚糖（CS）是一种阳离子聚合物可通过与核酸之间静电吸附的相互作用形成纳米粒,作为非病毒载体装载基因的纳米载体,已广泛用于基因和药物的递送。本文制备了壳聚糖纳米粒（CS-NPs）和甘露糖化壳聚糖纳米粒（MCS-NPs）,并装载TLRs信号通路相关的负性调控因子（SIGIRR、Tyro3）基因,研究其在基因递送系统中纳米粒复合物的各项性能指标以及在体内外的毒性和转染效率,小鼠胃肠道的定位和表达,以期为IBD的基因治疗提供工具。方法:1.甘露糖化壳聚糖（MCS）的合成和表征分析:将壳聚糖溶解在1%的乙酸中,按照甘露糖10%的取代度进行物料投放,在DMF溶液中进行反应,透析、纯化后真空冷冻干燥得MCS。采用红外光谱以及核磁共振对MCS进行表征分析。2.MCS-NPs、CS-NPs的制备和性能分析:采用离子凝胶法制备空白纳米粒MCS-NPs、CS-NPs,通过粒度和电位测量仪检测纳米粒的粒径、PDI及稳定性分析。3.载基因纳米粒的制备及性能分析:（1）重组质粒的构建:将酶切后的载体与目的基因进行连接得到过表达的重组质粒GV492-SIGIRR和GV643-Tyro3;再经过聚合酶链式反应对目的基因和绿色荧光蛋白报告基因（p EGFP-N1）进行测序分析,序列验证无误后提取质粒,再进行浓度、纯度检测。（2）复凝聚法制备载基因纳米粒:根据不同的N/P采用复凝聚法制备各组纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs、MCS-Tyro3-NPs、CS-Tyro3-NPs）。（3）载基因纳米粒性能检测:通过粒度和电位测量仪检测各组纳米粒复合物的粒径、PDI、电位和稳定性;超微量分光光度计检测其包裹率;琼脂糖凝胶电泳检测其DNA结合能力、核酸酶保护实验;以及利用透射电子显微镜观察纳米粒复合物的形态特征,从而优选制备条件。4.载基因纳米粒体外转染试验:纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）转染293T细胞,转染48h后采用倒置荧光显微镜观察各实验组基因在体外的转染效率。5.载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达:（1）将C57BL/6J小鼠分组:1)空白对照组:自由饮食饮水,不做任何实验处理2)阴性对照组:p EGFP-N1裸质粒3)阴性对照组:SIGIRR裸质粒4)阴性对照组:Tyro3裸质粒5)实验组1:CS-p EGFP-N1-NPs6)实验组2:MCS-p EGFP-N1-NPs7)实验组3:CS-SIGIRR-NPs8)实验组4:MCS-SIGIRR-NPs9)实验组5:CS-Tyro3-NPs10)实验组6:MCS-Tyro3-NPs除空白对照组外,其他各实验组均分为灌肠、灌胃处理,每组3只,正常饮食饮水,连续给药10天后,用乙醚麻醉小鼠处死。（2）将处死的小鼠进行解剖,取大概5mm×5mm的块状胃组织和结肠组织进行冰冻切片,冰冻切片后利用正置荧光显微镜观察各组纳米粒复合物在小鼠体内胃肠道的定位及表达。6.载基因纳米粒体外细胞毒性试验:利用CCK-8试剂盒检测纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）对细胞毒性。7.载基因纳米粒体内毒性试验:（1）血清生化指标检测:将灌胃组、灌肠组利用CS-Tyro3-NPs、MCS-Tyro3-NPs作为载基因纳米粒的代表检测其在体内的毒性作用,通过灌胃、灌肠连续给药10天,用乙醚麻醉后处死小鼠。将收集的小鼠血液离心后取上清,利用相应的生化试剂盒进行肝肾功能各项生化指标的检测。（2）苏木精-伊红染色:将处死后的小鼠进行解剖,取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、结肠组织,组织经10%中性福尔马林固定液固定后,进行组织脱水、包埋、石蜡切片,再进行苏木精-伊红染色,观察各组小鼠各组织的病理学结构。结果:1.MCS的合成及表征分析核磁共振氢谱图显示,甘露糖、CS、MCS在3.28-3.87ppm均有多重信号峰,该处的信号峰为甘露糖和壳聚糖中的质子峰重叠;红外光谱图中显示有壳聚糖和糖类的特征吸收峰;甘露糖化壳聚糖合成后具有氨基甲酸酯结构,也显示有特征吸收峰。2.MCS-NPs、CS-NPs的制备和性能分析通过对溶液pH、材料浓度及质量比的优化,用离子凝胶法制备的MCS-NPs、CS-NPs经经粒度和电位测量仪结果显示,粒径在120nm左右,PDI均小于0.3,5天内的稳定性良好,粒径及PDI均无明显变化。3.载基因纳米粒的制备及性能分析（1）重组质粒的构建:重组质粒GV492-SIGIRR和GV643-Tyro3经菌落PCR鉴定为阳性的克隆子提取质粒后进行测序比对,结果显示无误。（2）载基因纳米粒粒径及稳定性检测结果:根据不同N/P用复凝聚法制备的各组纳米粒复合物经粒度和电位测量仪检测后结果显示,纳米粒复合物粒径分布在100nm-200nm之间,PDI均小于0.3,zeta电位均呈正电势;5天内肉眼未见纳米粒悬液的聚集和沉降。粒径、PDI及zeta电位均无明显变化。（3）载基因纳米粒DNA结合能力:琼脂糖凝胶电泳显示,被包裹在纳米粒中的质粒p EGFP-N1、SIGIRR均滞留在加样孔中并呈现出明亮条带。而阴性对照组的裸质粒p EGFP-N1、SIGIRR均跑出加样孔,在泳道上显示出相应的DNA片段。（4）载基因纳米粒抗核酸酶降解能力:在37℃条件下分别将载基因纳米粒、裸质粒与DNase I酶孵育,经琼脂糖凝胶电泳显示,纳米粒复合物组的质粒仍然滞留在加样孔,未跑出泳道,可见明亮的条带,再次证实了上述DNA结合实验;而阴性对照组的加样孔及泳道均无DNA条带,DNA已被DNase I酶降解,完全消失。（5）载基因纳米粒包裹率:数据显示,在不同N/P条件下制备的纳米粒复合物,计算得MCS、CS对质粒p EGFP-N1、SIGIRR的平均包裹率都达到了70%以上。（6）载基因纳米粒透射电子显微镜结果:用复凝聚法制备下的各组载基因纳米粒（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）,用透射电子显微镜观察到纳米粒形态大部分呈圆球形、椭圆形颗粒,表面平滑,且纳米粒粒径大小与粒度和电位测量仪检测下相符,均在100nm-200nm左右。4.载基因纳米粒在体外的细胞转染效果将各组载基因纳米粒（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）对293T细胞进行转染48h后,用倒置荧光显微镜观察转染效率,结果显示载基因纳米粒和Lip3000组均能在293T细胞中看到绿色荧光。5.载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达取各组小鼠的胃和结肠组织,进行冰冻切片。结果显示,各组小鼠的胃、结肠组织经DAPI染色后在显微镜下均能看到显蓝色荧光的细胞核。各实验组的胃、结肠组织在显微镜下均能观察到绿色荧光,阴性对照组和空白对照组中几乎没有绿色荧光。将DAPI染色图片和绿色荧光图片进行重叠,结果显示蓝色荧光和绿色荧光能够融合。6.载基因纳米粒体外细胞毒性试验用CCK-8试剂盒检测纳米粒复合物对细胞的毒性作用,结果显示,不论是在时间还是剂量上,载基因纳米粒均无明显毒性作用。而Lip3000转染试剂对细胞增殖具有明显的抑制作用,有较大毒性。将载基因纳米粒组与Lip3000组比较均具有统计学意义（P<0.05）。7.载基因纳米粒体内毒性试验（1）肝肾功能相关生化指标:取空白对照组、灌胃组和灌肠组小鼠血清,测定肝肾功能相关生化指标,结果显示,丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（CREA）、尿素（Urea）、尿酸（UA）等各项指标在所有组间均正常。（2）苏木精-伊红染色:将各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、结肠组织脱水、包埋、石蜡切片后进行苏木精-伊红染色,结果显示,与空白对照组相比,载基因纳米粒灌胃组、灌肠组的组织病理学结构形态、质地、颜色均无明显变化。结论:1.成功构建了载基因的壳聚糖纳米粒和甘露糖化壳聚糖纳米粒,各组载基因纳米粒的各项性能指标均呈现良好,达到了基因载体的要求。2.构建的载基因纳米粒在体外可有效的进入细胞内并表达装载的基因。3.构建的载基因纳米粒通过灌肠、灌胃处理,能够在小鼠的胃肠道黏膜定位并表达装载的基因。4.构建的载基因纳米粒在体内外的毒性均很低。
王李娟[6]（2021）在《透明质酸-多胺靶向聚多糖基因载体的构筑及其生物活性研究》文中研究表明基因治疗在癌症、艾滋病、糖尿病等疾病的治疗方面显示出巨大潜力,基因治疗成功的关键是制备安全高效的载体将基因递送至靶标部位。当前基因载体的构筑面临水溶性差、毒性高、制备过程复杂等挑战。本文通过超分子主客体作用构筑了基于透明质酸（HA）的新型靶向基因载体,开发了一种简捷构筑基因载体的模块化组装方法,具体研究内容如下:（1）HA-ADA/TEPA-CD的构筑及其性能表征:分别将四乙烯五胺（TEPA）和金刚烷（ADA）通过共价键修饰到环糊精（CD）和透明质酸（HA）上,二者通过CD与ADA之间的超分子主客体相互作用自组装为以透明质酸为外壳的球形纳米粒子,粒径在100 nm左右,表面电势为-17.5 m V。该纳米组装体的临界聚集浓度为6μ mol/L,具有很好的稳定性。实验表明,该纳米组装体能够在N/P=80时完全凝聚pDNA,并能够响应于透明质酸酶实现p DNA的有效释放。该纳米组装体的基因转染能力与市售转染试剂聚乙烯亚胺(PEI25k)相近,但细胞毒性远小于PEI25k,即使在浓度为1 mmol/L时,细胞相对存活率仍高于80%。（2）HA-CD/PEI-ADA的构筑及其性能表征:分别将CD和ADA通过酰胺缩合反应修饰到HA和PEI25k上,二者则通过CD与ADA之间的超分子主客体相互作用自组装为以透明质酸为外壳的球形纳米粒子,粒径在300 nm左右,表面电势为-18m V。实验表明,该纳米组装体能够在N/P=16时完全凝聚p DNA。与PEI25k相比,纳米组装体的生物相容性得到显着改善,即使在最高浓度2 mmol/L的条件下,细胞的相对存活率也在80%以上,但基因转染效率并未降低。（3）模块化组装方法:以金刚烷修饰的透明质酸和阳离子聚合物修饰的环糊精为构筑模块,将二者混合便可构筑以透明质酸为外壳的高效低毒基因载体。
韩旭[7]（2021）在《活性氧响应的新型阳离子共聚物构建及其基因递送性能研究》文中指出基因治疗的概念自提出以来备受关注,但是其发展受到递送载体的限制。生物相容性好,转染效率高的基因可控释放非病毒基因载体是实现基因治疗大规模临床应用的关键。基于此背景,本研究拟设计及制备一种新型细胞微环境活性氧触发基因释放的非病毒载体并对其性能进行研究,具体研究内容及结果为:（1）新型细胞微环境活性氧触发基因释放载体（pM-pBD）的合成及结构表征本研究以具有良好生物相容性的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（MPC）与带有阳离子的（2-丙烯酰基）乙基（硼酸苄基）二乙基溴化铵（BD）为单体,基于可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）反应制备具有细胞微环境活性氧响应性质的阳离子嵌段共聚物pM-pBD作为基因载体。经过核磁共振氢谱、高分辨质谱及凝胶渗透色谱对阳离子共聚物的结构进行表征,结果表明载体成功合成。随后,利用HPLC验证了阳离子共聚物pM-pBD的活性氧（如H2O2）响应性。（2）纳米复合物的制备及理化性质表征通过静电作用,阳离子共聚物pM-pBD能够与带负电荷的DNA以分子自组装的方式形成pM-pBD/p DNA纳米复合物。其中,阳离子p BD片段具有活性氧触发电荷反转的特性,有助于活性氧触发的静电组装复合体结构解离,从而实现基因的可控释放。对纳米复合物pM-pBD/p DNA进行粒径、ζ电位的测量（DLS）,并通过透射电子显微镜（TEM）进行形貌观察分析。结果表明,pM-pBD与p DNA静电复合后能够形成粒径为88 nm～230 nm,ζ电位为+6 m V～+30 m V,显微形貌近似球形的纳米复合物。在10%胎牛血清存在的情况下,pM-pBD/p DNA纳米复合物表现出良好的胶体稳定性。pM-pBD/p DNA纳米复合物在N/P为3时的平均直径约为99.1 nm,ζ电位约为+13.8 m V。然而,在1 mmol/L H2O2存在下孵育60分钟后,由于p BD具有活性氧触发的电荷反转特性,N/P=3的pM-pBD/p DNA纳米复合物的直径扩大到330 nm,并且ζ电位反转到-3.91 m V。凝胶电泳阻滞分析表明,即使在高浓度肝素的存在下,pM-pBD仍可通过静电相互作用牢固地结合p DNA。将1 mmol/L H2O2孵育的pM-pBD/p DNA纳米复合物进行凝胶电泳阻滞实验,结果表明pM-pBD能够响应活性氧释放载荷DNA并且对DNA的结构基本不会产生影响。（3）纳米复合物细胞内转染实验研究溶血实验及细胞毒性实验结果表明,pM-pBD/p DNA纳米复合物具有良好的生物相容性及生物安全性,即使在N/P高达16时,MTT法检测的细胞存活率仍在80%以上。利用流式细胞仪检测pM-pBD/p DNA纳米复合物的摄取及转染效率,结果显示,N/P=3时,pM-pBD/p DNA纳米复合物的摄取效率为88.9%,转染效率为25.9%。加入可以刺激过氧化氢产生的抗坏血酸后,pM-pBD/p DNA纳米复合物在He La细胞中的转染效率是未加抗坏血酸时的1.5倍（38.8%）。上述结果表明,活性氧触发的基因释放能够显着提升载体的转染效率。因此,本研究创制的阳离子共聚物pM-pBD为基因递送系统的基因可控释放提供了新的解决方案。
马剑鹤[8]（2021）在《内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究》文中提出基因治疗是利用基因来预防或治疗疾病的独特技术。基因治疗技术通过将基因插入患者细胞而不是使用药物或手术来治疗疾病。基因递送系统对于疾病的基因治疗是必不可少的。病毒类载体和非病毒类载体是目前用于基因递送的主要载体。其中病毒类载体具有很高的基因转染效率,但因其具有较高毒性、基因负载能力低等缺点,限制了病毒类载体真正走向市场。聚乙烯亚胺（PEI）是目前广泛应用的非病毒类载体之一。PEI具有较好的质子缓冲能力,可以通过“质子海绵”效应从内体中逃逸。大分子量的PEI具有很强的细胞毒性,小分子量的PEI毒性很小,但转染效率也差。所以,开发兼具高转染效率和低毒性的非病毒载体是一个重要的研究方向。内质网是连续的膜状结构,它与多种细胞器（核膜、高尔基体等）均有联系,尤其是与核膜直接相连。所以,基于内质网靶向基因载体的开发具有很广阔的应用前景。受内质网荧光染料结构的启发,本论文将内质网靶向分子4-[2-（4-氨磺酰基-苯基）-乙基氨基甲酰基]-丁酸（SPEBA）与小分子量PEI结合,通过优化筛选,得到了内质网靶向基因递送系统PEI-ER。研究结果:（1）一系列理化性质的表征证明了材料的成功合成,得出了结合比例,验证了它具有良好的DNA复合能力和质子缓冲能力。（2）体外实验表明,PEI-ER具有良好的溶血性和细胞毒性,并且SPEBA和PEI以0.5:1摩尔比制得的材料具有最好的转染效率,不同分子量PEI修饰后的转染实验证明了SPEBA的修饰能够增加转染效率。（3）细胞摄取实验结果说明大部分PEI-ER/DNA复合物经小窝蛋白介导的内吞进入细胞,然后靶向内质网并释放DNA。综上所述,本研究制备了一种内质网靶向基因递送系统（PEI-ER）,PEI-ER/DNA复合物通过小窝蛋白介导的内吞进入细胞,然后靶向内质网并释放DNA,最终借助内质网与核膜的密切联系实现转染过程。该载体结构简单,毒性低,基因转染效率高,有很大的应用前景。
马琳钰[9]（2021）在《经吡咯烷酮基修饰的聚酰胺胺基因传递系统的构建及其生物性能评价》文中进行了进一步梳理聚酰胺胺（Poly（amino amine）s,PAAs）作为一类非病毒基因载体在近年来受到了研究者们的广泛关注,该类基因载体是由具有酰胺单体和胺单体的两类化合物通过迈克尔加成反应一步合成的一种拟肽聚合物。其中,具有二硫键的酰胺单体与胺单体反应合成的PAAs是一种更具优势的PAAs,这类PAAs又被称为聚二硫胺（Poly（disulfide amine）,SS-PAAs）。一种以N,N’-胱胺双丙烯酰胺（N,N’-cystaminebisacrylamide,CBA）为酰胺单体,N-Boc-1,6-二氨基己烷（N-Boc-1,6-hexanediamine,N-Boc-1,6-DAH）为胺单体的SS-PAAs（p（CBA-DAH））,是SS-PAAs家族中具有代表性的聚合物,表现出较高的DNA转染能力。目的:本研究将具有血清耐受性、无毒性作用的富含吡咯烷酮基的聚乙烯基吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP）按照一定比例修饰到p（CBA-DAH）的侧链氨基上,在降低p（CBA-DAH）对细胞的毒性的同时,改善其对血清的耐受性。将含吡咯烷酮基团的N-（3’-丙胺基）-2-吡咯烷酮（N-（3’-Aminopropyl）-2-pyrrolidinone,APP）作为胺单体与CBA反应生成主链上含吡咯烷酮基的SS-PAAs,以评价这两种含吡咯烷酮的SS-PAAs作为基因载体时在性能方面的差异性。方法:（1）通过迈克尔加成反应合成聚合物p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）,利用RAFT聚合反应合成分子量确定的具有功能性基团的PVP-COOH;将p（CBA-DAH）的末端氨基与PVP-COOH的羧基反应合成聚合物p（CBA-DAH）-g-PVP,并对各聚合物进行红外光谱（Infrared Spectroscopy,IR）和核磁共振氢谱（Proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR）的表征。（2）p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP压缩和释放DNA的能力利用凝胶电泳实验和粒度仪进行考察;各聚合物的缓冲能力采用p H酸度计进行考察。（3）采用MTT法考察不同浓度的聚合物以及不同重量比的聚合物/DNA复合物对Bel-7402、He La、Hep G2和NIH3T3细胞的毒性研究;利用DNA Ladder实验和Annexin V-FITC/PI双染法实验考察聚合物对Bel-7402细胞的凋亡情况;利用倒置荧光显微镜和流式细胞术考察聚合物在不同重量比、不同细胞系以及有无血清的条件下对DNA的转染能力;运用细胞通道抑制剂处理细胞的方法和荧光标记染色法对聚合物将目标DNA递送至Bel-7402细胞中的机制进行研究。结果:成功合成了p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）、p（CBA-DAH）-g-PVP聚合物并进行了结构表征。各聚合物p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）、p（CBA-DAH）-g-PVP分别与DNA形成复合物,在重量比为3:1、2:1和3:1时能完全压缩DNA,并且各复合物经谷胱甘肽和十二烷基磺酸钠处理后均能释放出DNA。主链和侧链结构中吡咯烷酮基的引入大大降低了聚合物对细胞的毒性,其对细胞的毒性依次为:p（CBA-APP）<p（CBA-DAH）-g-PVP<p（CBA-DAH）<PEI 25 k Da,且上述聚合物均不能诱导Bel-7402细胞凋亡。p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP均能将DNA转染到Bel-7402、He La、Hep G2和NIH3T3细胞中,用荧光显微镜就能观察到绿色荧光蛋白的表达。p（CBA-DAH）-g-PVP/DNA重量比为9:1时在Bel-7402细胞中的转染效率为36.63%,与阳性对照PEI 25k Da/DNA重量比为1:1时的转染效率（37.91%）无显着性差异。p（CBA-DAH）、p（CBA-APP）和p（CBA-DAH）-g-PVP均是通过网格蛋白依赖的内吞途径将目标DNA递送至Bel-7402细胞中,并经溶酶体逃逸后进入细胞核。结论:作为基因载体材料,p（CBA-DAH）、p（CBA-DAH）-g-PVP和p（CBA-APP）均具有良好的物理化学性能和生物特性。与p（CBA-DAH）相比,含吡咯烷酮基的p（CBA-DAH）-g-PVP和p（CBA-APP）均表现出较好的DNA压缩能力和较低的细胞毒性,尤其是侧链引入吡咯烷酮基的p（CBA-DAH）-g-PVP。PVP的引入虽然使p（CBA-DAH）对DNA的转染能力有所降低,但在Bel-7402细胞中,最优重量比的p（CBA-DAH）-g-PVP对DNA的转染能力与PEI 25 k Da相似。综上,p（CBA-DAH）-g-PVP可以作为一种优良的基因载体继续进行研究。
陈亮[10]（2020）在《含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用》文中提出治疗药物的高效负载和安全有效地输运到肿瘤组织是癌症高效治疗的关键。然而,传统的肿瘤化疗药物通常存在稳定性和水溶性差、毒副作用大,新型的基因药物存在体内易降解等问题,使药物难以在肿瘤部位有效富集。此外,金属离子型药物如顺铂（Pt）被证明对肿瘤具有较好的抑制治疗效果,但其潜在的不稳定性和易氧化性极大地限制了其在肿瘤治疗的应用。纳米科学与技术的快速发展使高效治疗成为了可能。合适的纳米药物载体可以克服以上不同药物的内在负载和输运问题。近年来,各种纳米载体如脂质体、介孔硅、纳米凝胶、胶束、聚合物等被开发出来并广泛地用于负载造影剂和药物等进行肿瘤的诊断和治疗。然而,构建稳定、高效、安全的载体用于肿瘤的高效治疗依然存在着巨大的挑战。聚酰胺-胺树状大分子由于其独特的物理化学特性如结构规整、内部空腔和表面大量官能团等,使其作为纳米载体在肿瘤的诊断和治疗中备受青睐。然而,其外部大量的氨基使其对正常细胞具备一定毒性,通常需要进行表面修饰改善其生物相容性。此外,作为基因载体,其自身还存在刚性不足的问题,通常需要在其内部包裹金属纳米颗粒以保证暴露出足够DNA结合位点,使其具有较高的DNA压缩能力。与生命活动息息相关的元素磷,以其独特的生物学特性逐渐被用于纳米材料领域。在树状大分子结构中（核心、分支单元、内部分支、脊骨和表面）引入含磷单元（如六氯环三聚磷腈和硫代磷）预计可以综合两种材料的优势,使其既具有传统树状大分子高度支化、对称的结构和高度均一的分子量分布,又具有磷元素引起的生物学特性,如良好的生物相容性。因此,本论文拟设计一系列离子型含磷树状大分子用于基因药物的负载和金属离子的络合、构建两亲性树冠大分子形成胶束用于疏水抗癌药物负载,并探索负载药物的含磷树状大分子在肿瘤高效治疗的应用前景,为开发新型稳定、安全、高效药物载体提供新的设计思路和理论基础。本论文的主要研究内容如下:（1）第二章中,基于不同代数的含磷树状大分子,制备了多种不同表面修饰的阳离子型含磷树状大分子,系统化地研究了其作为基因载体在基因治疗的治疗效果,并筛选出具有最佳转染效率的基因载体。首先,以编码绿色荧光蛋白的质粒DNA为报告基因,通过体外基因转染实验,研究了含磷树状大分子的代数和表面官能基团种类对基因转染效率的影响,筛选出具有最佳转染效率的基因载体:表面修饰有质子化吡咯烷的第一代含磷树状大分子（1-G1）。然后,以1-G1为载体负载具有抑癌基因p53的质粒,研究了其在体外和体内的基因治疗效果。实验结果显示,1-G1能够有效地转染质粒DNA并使其在细胞内部进行转录和翻译,表达的p53蛋白具有良好的生物学活性且能够有效地引起细胞周期阻滞,但对正常组织器官没有毒副作用。（2）第三章中,在优化了代数的含磷树状大分子中引入金属离子及烷基长链,制备了金属离子型含磷树冠大分子用于肿瘤的金属化疗药物治疗。我们以六氯环三聚磷腈为内核,首先通过取代和缩合反应制备得到具有疏水烷基长链的含磷树冠大分子,而后在其表面修饰配位基团并络合Au（III）或Cu（II）,得到金属离子型含磷树冠大分子,最后对其治疗效果进行了评价。结果显示,在络合相同金属离子（Au（III）或Cu（II））条件下,随着烷基链长度的减少,对细胞的毒性有所增加;经材料（10μM）处理后,可以明显地观察到4T1细胞内出现了颗粒状的凋亡小体并发生S期阻滞;用Au（III）取代Cu（II）可以显着地提高金属离子型含磷树冠大分子的抗增殖活性,同时经络合有Cu（II）的含磷树冠大分子处理后的细胞显示出Caspase-3非依赖性细胞凋亡,而络合有Au（III）的含磷树冠大分子组的细胞则显示Caspase-3依赖性细胞凋亡。（3）第四章中,以第二章优化的阳离子含磷树状大分子为基础引入疏水烷基长链,制备了阳离子型两性含磷树冠大分子（1-C12G1）,并形成胶束负载化疗药物阿霉素（DOX）、复合基因药物mi R-21抑制剂,用于三阴性乳腺癌的化疗和基因治疗的体外协同治疗。我们以六氯环三聚磷腈为内核,首先通过取代和缩合反应制备得到具有十二氧基苯甲酸的含磷树冠大分子,而后在其表面修饰吡咯烷并质子化,得到两性含磷树冠大分子并形成胶束负载化疗药物和基因药物,评价其体外对三阴性乳腺癌的协同治疗效果。结果显示,1-C12G1具有良好胶束的稳定性和药物负载能力（DOX包封率最高为99.81%;载药量最高为82.1%）。此外负载化疗药物和基因药物的1-C12G1@DOX/mi R-21i复合物在不同生理盐水和细胞培养液中均具有良好的稳定性且该复合物在酸性条件具有良好的药物缓释效果。同时该复合物中的DOX和mi R-21i对三阴性乳腺癌细胞表现出协同治疗效果。
二、非病毒基因治疗载体的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、非病毒基因治疗载体的研究进展（论文提纲范文）
（1）用于基因治疗的非病毒附着体载体研究进展（论文提纲范文）
| 1 非病毒附着体载体 |
| 2 非病毒附着体载体的附着机制 |
| 3 非病毒附着体载体的优化 |
| 3.1 载体骨架优化 |
| 3.2 启动子的优化 |
| 3.3 使用调控元件 |
| 4 非病毒附着体载体在基因治疗中的应用 |
| 5 总结 |
（2）组织工程血管化基因治疗的研究进展（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 筛选标准 |
| 1.3 文献的提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 基因治疗中的成血管种子细胞 |
| 2.2 基因治疗中的促血管化目的基因 |
| 2.3 基因治疗中的载体 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（4）锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 病毒型基因载体 |
| 1.2.1 逆转录病毒(RV) |
| 1.2.2 腺病毒(AV) |
| 1.2.3 腺相关病毒(AAV) |
| 1.2.4 慢病毒(LV) |
| 1.2.5 单纯疱疹病毒(HSV) |
| 1.3 非病毒型基因载体 |
| 1.3.1 阳离子脂质体 |
| 1.3.2 阳离子聚合物 |
| 1.4 锍类化合物研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 菌株及细胞株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 锍类聚合物的设计 |
| 2.2.2 锍类聚合物结构表征 |
| 2.2.3 锍类聚合物性能测试 |
| 2.2.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 2.2.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 2.2.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 锍类聚合物的合成及表征 |
| 3.1.1 化合物SI合成及表征 |
| 3.1.2 聚合物SIPEI合成及表征 |
| 3.2 锍类聚合物与DNA复合能力测定 |
| 3.3 锍类聚合物与 DNA复合物粒径大小与Zeta电势测定 |
| 3.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 3.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 3.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 锍类聚合物的合成 |
| 4.1.1 化合物SI的合成 |
| 4.1.2 聚合物SIPEI的合成 |
| 4.1.3 聚合物SIPEI的表征 |
| 4.2 纳米粒子制备通法 |
| 4.3 琼脂糖凝胶阻滞实验 |
| 4.4 锍类聚合物细胞毒性测定 |
| 4.5 锍类聚合物细胞内分布情况测定 |
| 4.6 锍类聚合物转染能力测定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 实验小鼠 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 MCS的合成及表征分析 |
| 2.2.2 空白纳米粒的制备及性能分析 |
| 2.2.3 载基因纳米粒的制备及性能分析 |
| 2.2.4 载基因纳米粒体外转染试验 |
| 2.2.5 载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达 |
| 2.2.6 载基因纳米粒体外细胞毒性试验 |
| 2.2.7 载基因纳米粒体内毒性试验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 MCS的合成及表征分析 |
| 3.2 MCS-NPs、CS-NPs的粒径、PDI及稳定性结果 |
| 3.2.1 MCS-NPs、CS-NPs的粒径、PDI |
| 3.2.2 MCS-NPs、CS-NPs稳定性 |
| 3.3 载基因纳米粒的制备及性能分析 |
| 3.3.1 质粒p EGFP-N1 转化和序列比对 |
| 3.3.2 重组质粒GV492-SIGIRR和 GV643-Tyro3 的构建 |
| 3.3.3 载基因纳米粒粒径和电位 |
| 3.3.4 载基因纳米粒的包裹率 |
| 3.3.5 载基因纳米粒的DNA结合能力 |
| 3.3.6 载基因纳米粒抗核酸酶降解能力 |
| 3.3.7 载基因纳米粒的稳定性 |
| 3.3.8 载基因纳米粒电镜检测 |
| 3.4 载基因纳米粒在体外的细胞转染结果 |
| 3.5 载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位和表达 |
| 3.6 载基因纳米粒体外细胞毒性作用 |
| 3.7 载基因纳米粒体内毒性作用 |
| 3.7.1 载基因纳米粒对小鼠血清肝肾生化指标的影响 |
| 3.7.2 载基因纳米粒对小鼠各组织结构的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 载基因壳聚糖纳米粒制备条件及优化结果 |
| 4.2 载基因纳米粒特性研究 |
| 4.3 载基因纳米粒体内外转染及胃肠道定位和表达 |
| 4.4 载基因纳米粒体内外毒性 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 综述 甘露糖化壳聚糖纳米粒靶向巨噬细胞的应用研究进展 |
| 参考文献: |
（6）透明质酸-多胺靶向聚多糖基因载体的构筑及其生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 基因载体 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 非病毒载体 |
| 1.1.3 刺激响应性基因载体 |
| 1.1.4 基因载体的靶向性 |
| 1.2 超分子化学 |
| 1.3 植物与多糖 |
| 1.4 选题意义及研究内容 |
| 2 基于透明质酸的刺激响应性靶向聚多糖基因载体的构筑 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 实验原料的预处理 |
| 2.2.3 单体化合物的合成 |
| 2.2.4 HA-ADA/TEPA-CD的构筑 |
| 2.2.5 HA-ADA/TEPA-CD的临界聚集浓度 |
| 2.2.6 HA-ADA/TEPA-CD的稳定性检验 |
| 2.2.7 HA-ADA/TEPA-CD的形貌表征 |
| 2.2.8 HA-ADA/TEPA-CD的粒径与电势 |
| 2.2.9 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.10 酶响应释放实验 |
| 2.2.11 细胞毒性实验 |
| 2.2.12 体外基因转染实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 关于单体合成与组装体构筑的讨论 |
| 2.3.2 组装体对pDNA的凝聚及酶响应释放能力 |
| 2.3.3 细胞毒性 |
| 2.3.4 基因转染 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 基于PEI的高效低毒基因载体的构筑 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器与试剂 |
| 3.2.2 单体的合成 |
| 3.2.3 HA-CD/PEI-ADA的构筑 |
| 3.2.4 HA-CD/PEI-ADA的形貌表征 |
| 3.2.5 HA-CD/PEI-ADA的粒径与电势 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.7 细胞毒性实验 |
| 3.2.8 体外基因转染 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 HA-CD/PEI-ADA对pDNA的凝聚能力 |
| 3.3.2 HA-CD/PEI-ADA及其与DNA复合物的形貌表征 |
| 3.3.3 细胞毒性 |
| 3.3.4 基因转染 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）活性氧响应的新型阳离子共聚物构建及其基因递送性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 基因治疗概述 |
| 1.2 基因治疗的发展及现状 |
| 1.3 基因治疗载体 |
| 1.3.1 病毒载体 |
| 1.3.2 非病毒载体 |
| 1.4 刺激响应型纳米递送载体 |
| 1.4.1 内源性刺激响应型纳米递送载体 |
| 1.4.2 外源性刺激响应型纳米递送载体 |
| 1.5 靶向给药 |
| 1.5.1 被动靶向 |
| 1.5.2 主动靶向 |
| 1.6 基因治疗亟需解决的问题 |
| 1.7 本论文的选题依据及研究内容 |
| 2 阳离子共聚物pM-pBD的合成与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 阳离子共聚物pM-pBD的合成 |
| 2.3.2 核磁共振氢谱(~1H NMR) |
| 2.3.3 高分辨质谱(MS) |
| 2.3.4 凝胶渗透色谱(GPC) |
| 2.3.5 阳离子共聚物pM-pBD的 ROS响应性 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 单体BD的结构表征 |
| 2.4.2 链转移剂pMPC_(39)的结构表征 |
| 2.4.3 阳离子共聚物pM-pBD的结构表征 |
| 2.4.4 阳离子共聚物pM-pBD对 ROS响应性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 纳米复合物的制备及理化性质表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试剂和仪器 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pM-pBD/p DNA纳米复合物的制备 |
| 3.3.2 pM-pBD/p DNA纳米复合物的粒径及ζ电位测定 |
| 3.3.3 pM-pBD/p DNA纳米复合物的透射电子显微镜观察 |
| 3.3.4 pM-pBD/p DNA纳米复合物的血清稳定性测定 |
| 3.3.5 pM-pBD/p DNA纳米复合物响应ROS后粒径及电位变化测定 |
| 3.3.6 阳离子共聚物pM-pBD结合p DNA的能力测定 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pM-pBD/p DNA纳米复合物的粒径及ζ电位 |
| 3.4.2 pM-pBD/p DNA纳米复合物形貌观察结果 |
| 3.4.3 pM-pBD/p DNA纳米复合物的血清稳定性 |
| 3.4.4 pM-pBD/p DNA纳米复合物响应ROS后粒径及电位变化结果分析 |
| 3.4.5 阳离子共聚物pM-pBD结合p DNA的能力 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 纳米复合物细胞水平评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试剂及仪器 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶血实验 |
| 4.3.2 细胞毒性实验 |
| 4.3.3 pM-pBD/pDNA纳米复合物的细胞摄取实验 |
| 4.3.4 抗坏血酸产生ROS实验 |
| 4.3.5 抗坏血酸细胞毒性实验 |
| 4.3.6 有/无抗坏血酸对pM-pBD/pDNA纳米复合物体外转染的影响 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 体外生物相容性分析 |
| 4.4.2 细胞摄取pM-pBD/p DNA纳米复合物的结果分析 |
| 4.4.3 抗坏血酸产生ROS的实验结果分析 |
| 4.4.4 抗坏血酸细胞毒性结果分析 |
| 4.4.5 有/无抗坏血酸的体外转染结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 基因治疗载体 |
| 1.2.1 病毒载体 |
| 1.2.2 非病毒载体 |
| 1.3 内质网靶向药物递送系统 |
| 1.3.1 基于分子的ER靶向 |
| 1.3.2 基于多肽的ER靶向 |
| 1.3.3 基于载体的ER靶向 |
| 1.4 本课题研究目的和意义 |
| 2 内质网靶向基因载体的构建及理化性质表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 2.2.1 实验试剂和材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 合成SPEBA |
| 2.3.2 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的合成实验 |
| 2.3.3 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的核磁表征 |
| 2.3.4 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的紫外吸收光谱表征 |
| 2.3.5 PEI-ER内质网靶向基因递送载体的质子缓冲能力表征 |
| 2.3.6 PEI-ER/DNA纳米复合物的粒径电位表征 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.0 SPEBA的合成及表征 |
| 2.4.1 PEI-ER内质网靶向基因载体的合成 |
| 2.4.2 PEI-ER的紫外吸收光谱 |
| 2.4.3 PEI-ER的质子缓冲能力 |
| 2.4.4 PEI-ER/DNA复合物的粒径电位表征 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 PEI-ER外源基因递送效率研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂、材料和仪器 |
| 3.2.1 实验试剂和材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 3.3.2 PEI-ER的溶血试验 |
| 3.3.3 PEI_(25K)-ER的合成实验 |
| 3.3.4 细胞培养 |
| 3.3.5 MTT比色法测定PEI-ER的细胞毒性 |
| 3.3.6 PEI-ER/DNA复合物的转染效果研究 |
| 3.3.7 流式细胞仪对转染结果的定量分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳实验结果 |
| 3.4.2 溶血实验结果 |
| 3.4.3 细胞毒性实验结果 |
| 3.4.4 PEI-ER介导的基因转染实验 |
| 3.4.5 PEI_(25K)-ER介导的基因转染实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 PEI-ER内化机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂、材料及仪器 |
| 4.2.1 实验试剂和材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 FITC标记PEI-ER实验 |
| 4.3.2 细胞摄取机制研究 |
| 4.3.3 转染实验验证摄取结果 |
| 4.3.4 内质网共定位实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 PEI-ER和 PEI细胞摄取机制研究 |
| 4.4.2 转染实验验证摄取结果 |
| 4.4.3 内质网荧光共定位 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）经吡咯烷酮基修饰的聚酰胺胺基因传递系统的构建及其生物性能评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.2 传递基因的载体 |
| 1.2.1 病毒基因载体 |
| 1.2.2 非病毒基因载体 |
| 1.3 聚乙烯基吡咯烷酮在基因载体中的应用 |
| 1.4 本研究的目的、意义、内容 |
| 第二章 含吡咯烷酮基聚酰胺胺的合成和结构表征 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 P(CBA-DAH)-G-PVP、P(CBA-DAH)、P(CBA-APP)聚合物的合成 |
| 2.2.1 p(CBA-DAH)聚合物的合成 |
| 2.2.2 p(CBA-APP)的合成 |
| 2.2.3 p(CBA-DAH)-g-PVP的合成 |
| 2.3 各聚合物的结构表征 |
| 2.3.1 红外光谱(IR)检测 |
| 2.3.2 核磁共振氢谱(~1H-NMR)进行结构分析 |
| 2.3.3 分子量评估 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 红外谱图解析 |
| 2.4.2 核磁共振氢谱(~1H-NMR)谱图解析 |
| 2.4.3 聚合物分子量计算 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 聚合物P(CBA-DAH)、P(CBA-DAH)-G-PVP和 P(CBA-APP)与DNA复合物的制备及其理化性质的研究 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶剂制备 |
| 3.2.2 报告基因pEGFP的提取 |
| 3.2.3 聚合物/DNA复合物的制备 |
| 3.2.4 聚合物/DNA复合物凝胶阻滞实验 |
| 3.2.5 聚合物/DNA复合物粒径测定 |
| 3.2.6 各聚合物缓冲能力考察 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 目标质粒浓度与纯度测定 |
| 3.4.2 聚合物压缩DNA能力分析 |
| 3.4.3 聚合物缓冲能力分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 聚合物P(CBA-DAH)、P(CBA-DAH)-G-PVP和 P(CBA-APP)与DNA复合物体外细胞毒性研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 溶剂制备 |
| 4.2.2 细胞培养 |
| 4.2.3 聚合物细胞毒性研究 |
| 4.2.4 聚合物诱导细胞凋亡考察 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 各聚合物浓度对细胞产生的毒性 |
| 4.4.2 不同重量比聚合物与DNA复合物对不同细胞的毒性考察 |
| 4.4.3 细胞凋亡实验分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 聚合物P(CBA-DAH)、P(CBA-DAH)-G-PVP和 P(CBA-APP)与DNA复合物体外转染能力研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 溶液制备 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 目标聚合物/DNA复合物的转染研究 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 不同重量比聚合物/DNA复合物在Bel-7402 细胞中对DNA的转染能力 |
| 5.4.2 目标聚合物/DNA复合物在不同细胞中对DNA的转染能力 |
| 5.4.3 血清对目标聚合物/DNA复合物的细胞转染效率的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 聚合物/DNA复合物胞内传递机制研究 |
| 6.1 材料与仪器 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 溶剂制备 |
| 6.2.2 细胞培养 |
| 6.2.3 聚合物/DNA复合物跨膜途径研究 |
| 6.2.4 激光共聚焦显微镜观察聚合物/DNA复合物在细胞内的分布 |
| 6.3 统计学分析 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 细胞摄取抑制剂对聚合物/DNA复合物跨膜途径考察 |
| 6.4.2 激光共聚焦观察复合物在细胞内的分布 |
| 6.5 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（10）含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 含磷树状大分子的概况 |
| 1.2.1 经典含磷树状大分子的简介 |
| 1.2.2 以HCCP为内核的含磷树状大分子的构建 |
| 1.2.3 离子型含磷树状大分子的构建 |
| 1.3 离子型含磷树状大分子的生物学应用 |
| 1.3.1 阳离子型含磷树枝状大分子作为基因传递载体 |
| 1.3.2 阳离子型含磷树状大分子在神经退行性疾病中的应用 |
| 1.3.3 阴离子型含磷树状大分子与单核细胞的相互作用 |
| 1.3.4 金属离子型含磷树状大分子作为有效的抗肿瘤药物 |
| 1.4 本论文的研究目的、主要内容和创新点 |
| 1.4.1 本论文的研究目的 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 1.4.3 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 阳离子型含磷树状大分子作为非病毒载体的优化及其在肿瘤治疗中的应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.2 阳离子型含磷树枝状大分子的合成与表征 |
| 2.2.3 阳离子型含磷树枝状大分子/pDNA复合物的制备与表征 |
| 2.2.4 细胞转染实验 |
| 2.2.5 体外基因治疗实验 |
| 2.2.6 体内基因治疗实验 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 阳离子型含磷树状大分子的合成与表征 |
| 2.3.2 阳离子型含磷树枝状大分子/pDNA-EGFP复合物的表征 |
| 2.3.3 细胞毒性实验结果 |
| 2.3.4 细胞转染实验结果 |
| 2.3.5 载体/pDNA-p53复合物的表征 |
| 2.3.6 细胞周期检测结果 |
| 2.3.7 实时定量反转录PCR及蛋白免疫印迹实验结果 |
| 2.3.8 体内基因治疗实验结果 |
| 2.3.9 生物安全性评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 金属离子型含磷树冠大分子的制备及其抗肿瘤特性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.2 金属离子型含磷树冠大分子的合成与表征 |
| 3.2.3 金属离子型含磷树冠大分子的稳定性实验 |
| 3.2.4 细胞吞噬实验 |
| 3.2.5 硫氧还蛋白还原酶活性表征 |
| 3.2.6 CCK-8法检测细胞毒性 |
| 3.2.7 细胞结构骨架观察 |
| 3.2.8 细胞周期分析 |
| 3.2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 金属离子型含磷树冠大分子的表征 |
| 3.3.2 金属离子型含磷树冠大分子的稳定性测试结果 |
| 3.3.3 金属离子型含磷树冠大分子的细胞毒性试验结果 |
| 3.3.4 4T1细胞对金属离子型含磷树冠大分子的吞噬实验结果 |
| 3.3.5 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞中硫氧还蛋白还原酶活性的影响 |
| 3.3.6 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞结构形貌及细胞周期的影响 |
| 3.3.7 金属离子型含磷树冠大分子对4T1细胞周期的影响 |
| 3.3.8 蛋白免疫印迹实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 两亲性含磷冠大分子传递miR-21i和阿霉素用于三阴性乳腺癌的协同治疗研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料与仪器设备 |
| 4.2.2 两性含磷树冠大分子的合成与表征 |
| 4.2.3 负载阿霉素纳米胶束的制备及表征 |
| 4.2.4 1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的制备与表征 |
| 4.2.5 材料的水动力学直径和表面电势测定 |
| 4.2.6 药物缓释实验 |
| 4.2.7 细胞培养及细胞活性相容性实验 |
| 4.2.8 材料复合物的细胞吞噬实验 |
| 4.2.9 细胞凋亡实验 |
| 4.2.10 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 两性含磷树冠大分子的表征 |
| 4.3.2 1-C12G1@DOX复合物的制备与表征 |
| 4.3.3 1-C12G1@DOX/miR-21i复合物的制备与表征 |
| 4.3.4 复合物的细胞毒性实验结果 |
| 4.3.5 复合物的细胞吞噬实验结果 |
| 4.3.6 细胞凋亡实验结果 |
| 4.3.7 体外蛋白印迹实验结果评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 攻读学位期间的研究成果目录 |
| 致谢 |
四、非病毒基因治疗载体的研究进展（论文参考文献）
- [1]用于基因治疗的非病毒附着体载体研究进展[J]. 张伟莉,杜秋杰,朱嘉懿,王浩民,乔可欣,王天云,赵春澎,张玺,王小引. 中国细胞生物学学报, 2021(12)
- [2]组织工程血管化基因治疗的研究进展[J]. 李光照,陈锐,贾洪林,任利玲. 中国组织工程研究, 2022(28)
- [3]非病毒载体在遗传性视网膜变性基因治疗中的应用[J]. 卫星. 中华实验眼科杂志, 2021(08)
- [4]锍修饰的PEI化合物的合成及其作为基因载体能力的研究[D]. 路艳杰. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [5]载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达[D]. 严丽丽. 南昌大学, 2021(01)
- [6]透明质酸-多胺靶向聚多糖基因载体的构筑及其生物活性研究[D]. 王李娟. 内蒙古农业大学, 2021
- [7]活性氧响应的新型阳离子共聚物构建及其基因递送性能研究[D]. 韩旭. 大连理工大学, 2021(01)
- [8]内质网靶向基因递送系统的构建及转染性能研究[D]. 马剑鹤. 常州大学, 2021(01)
- [9]经吡咯烷酮基修饰的聚酰胺胺基因传递系统的构建及其生物性能评价[D]. 马琳钰. 广东药科大学, 2021(02)
- [10]含磷树状大分子纳米载体的设计及其肿瘤治疗应用[D]. 陈亮. 东华大学, 2020