一、癌基因MDM2与异构酶PIN1的交互作用（论文文献综述）
杨斓[1]（2021）在《基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究》文中研究表明目的:特发性肺纤维化是一种慢性的致命性肺部疾病,主要影响老年群体,至今为止,其发病机制尚不完全明确,药物治疗手段有限。本研究应用生物信息学方法,通过特发性肺纤维化病人的转录组学数据探索疾病机制,比较与联系不同病人群体的疾病机制特征;从网络药理学的研究角度阐释古方人参平肺散对特发性肺纤维化的网络调控机制特点,比较与联系不同病人群体的作用机制;通过计算机模拟分子对接研究和体外实验研究,验证人参平肺散及其拆方干预特发肺纤维化的作用机制。方法:1.从美国国立生物技术信息中心GEO数据库下载GSE150910临床试验中肺移植手术病例的RNA测序原始数据,使用基因集富集分析（GSEA）挖掘特发性肺纤维化潜在的调控基因集,使用Reactome通路数据库富集分析关键通路与反应,使用R语言差异基因分析特发性肺纤维化与正常健康人的差异表达基因,分析关键基因的表达状态。2.使用加权基因共表达网络（WGCNA）分析挖掘特发性肺纤维化不同病人群体关联的基因模块,使用Reactome通路数据库富集分析不同病人群体的关键通路与反应,比较分析其共性与不同,使用文氏图分析分布在不同特征关联基因模块中的差异表达基因。3.基于网络药理学的研究策略,使用已发表研究、TCMSP、SwissTargetPrediction和Pharmapper等资源平台预测古方人参平肺散的潜在靶点,以GSEA分析得到的基因集作为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库预测人参平肺散干预特发性肺纤维化疾病的网络调控机制;以WGCNA分析得到的高、中年特征关联基因模块为疾病靶点,通过蛋白质相互作用网络和Reactome通路数据库分别预测人参平肺散对高、中年特征的网络调控机制。4.选择前述人参平肺散的网络调控机制中较为突出的TGF-β信号通路为研究对象。选择人参平肺散中的代表成分如 Ginsenoyne D、Ginsenoside 20-Glc-Rf、Notoginsenoside R1、Ginsenoside Rg1、6-Acetylacetonide、Caffeic acid、Timosaponin A1、Timosaponin B Ⅱ、Resveratrol、Rosmarinic acid、Xuelianlactone、Tectorigenin、sarsasapogenin、isomeranzin、glycyrol和Liquiritigenin作为配体,以TGF-β信号通路相关的靶点蛋白HDAC1、XPO1、HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2、ESR1、TGFB1、SMAD2、SMAD3和COL1A1为靶点,使用AutoDock进行拟分子虚对接,验证人参平肺散主要成分与靶点蛋白的结合能力。5.采用体外实验方法探讨人参平肺散全方及各拆方组（补益组、清肺组、化痰组）对TGF-β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5表型转化的影响。使用PCR和Western Blot方法检测TGF-β通路的成分Smad2/3、上皮间质转化标志α-SMA、细胞外基质1型胶原COL1A1和NADPH 4型氧化酶NOX4的基因、蛋白表达水平的变化。结果:1.GSEA分析得到9个基因集,分别为HALLMARK上皮间质转化、Kras下游信号、糖酵解、血管生成、G2/M检查点、凝血、Myc靶点V2版、E2F靶点和细胞连接基因集,以及对应的485个领先基因;疾病机制主要富集于细胞外基质、细胞衰老、细胞有丝分裂周期异常、凝血、DNA修复缺陷、细胞连接、糖类代谢和程序性死亡缺陷等;信号通路集中于Ras下游的PIK3/AKT、MAPK6/MAPK4通路,Ras家族通路Rho GTPase,酪氨酸激酶受体通路,TGF β家族和TP53转录调控通路等;衰老相关性分泌表型（SASP）因子主要为白介素4和白介素13家族。差异基因分析显示衰老表型相关基因CCND2、CDKN2A、TERT、GDF15、E2F8等均在疾病组显着上调。2.WGCNA分析富集得到疾病机制主要有细胞外基质、细胞应激、免疫、有丝分裂异常、凝血、细胞连接、肌肉收缩和糖脂蛋白代谢等机制,与GSEA分析的富集结果大部分吻合。WGCNA分析得到高龄特征（65岁以上）相关基因1076个,中年特征（55-65岁）相关基因422个,两组的机制都富集在细胞外基质、免疫系统、Ras下游信号系统、TP53细胞周期调控和TGF-β信号通路等。不同的是细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫等反应在中年特征中更为显着;细胞衰老、未折叠蛋白质反应和内质网应激等在高龄特征中更显着富集。与高、中年特征关联的差异基因分别有203个和39个,其中有4组差异基因具有高度相关性,且与高龄特征相关,分别是（1）CDH2、SFRP1、SERPINE2、CXCL12、SFRP4和GEM,与上皮间质转化活动密切相关。（2）GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4,与上皮间质转化活动密切相关;（3）SLC7A5和HIF1A,与G2/M检查点活动有关;（4）UGT2B17和SLC12A3,与Kras下游信号密切相关。3.靶点整理共获取人参平肺散的药理靶点608个,与GSEA分析得到的基因集进行蛋白质相互作用网络分析得到核心靶点152个,机制主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、TP53和FOXO为代表的转录调控活动、氧化应激和致癌基因诱导的衰老、SASP、固有凋亡途径、分子伴侣介导的自噬、细胞因子、固有免疫系统、雌激素受体介导的信号系统、Ras下游信号和TGF-β1信号通路等。人参平肺散成分与中、高年特征相关基因的核心干预靶点各有83个和90个,分别富集后,机制都主要涉及蛋白质翻译后修饰、细胞周期、TP53为主的转录调控活动、DNA修复、分子伴侣介导的自噬、氧化应激诱导的细胞衰老、SASP、免疫反应、Ras下游信号通路和TGF-β信号通路等。不同之处在于高龄组中金属蛋白酶的泛素化反应,SKP2介导的p27/p21的降解反应,获得性免疫反应尤为显着,此外致癌基因诱导的衰老、SASP和固有凋亡等也显着富集。中年组中FOXO、E2F6为主的转录调控活动和Toll样受体3层级反应为主的固有免疫反应尤为突出,此外囊泡运输、血小板聚集、焦亡和坏死也富集明显。4.经过计算机模拟对接验证,除了人参成分Ginsenoyne D的结合分数略低以外,其它成分与TGF-β通路成分HDAC1、XPO1、TGFB1、SMAD2和SMAD3蛋白的结合分数都达到了-5 kcal mol-1 以下。除知母成分Timosaponin AI、Timosaponin BⅡ对HS90A蛋白,人参成分Ginsenoyne D对HS90B和EGFR蛋白,桑白皮成分Xuelianlactone对LRRK2蛋白的结合分数较低,其它成分对TGF-β通路的间接作用靶点HS90B、HS90A、A4、1433G、FYN、SRC、EGFR、LRRK2和ESR1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。所有成分与COL1A1蛋白结合能力都达到了-5 kcal mol-1以下。5.体外实验发现与模型组相比,全方组和各拆方组可明显降低α-SMA和COL1A1的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和各拆方组可以影响α-SMA和COL1A1基因的转录水平和转录后调控;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD2的mRNA和蛋白表达水平,提示全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组和化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组和清肺组可显着降低p-SMAD3的mRNA和蛋白表达水平,补益组可显着降低mRNA水平,但蛋白表达无差异,说明全方组和清肺组对该基因的转录水平和转录后调控都有明显疗效,补益组对该基因的转录水平有明显调控作用,化痰组对该基因的转录无明显调控作用;全方组及各拆方组均可显着降低NOX4的mRNA和蛋白表达水平,说明全方组和各拆方组可以影响该基因的转录水平和转录后调控。结论:1.研究发现特发性肺纤维化病人的疾病机制与上皮间质转化、凝血、血管生成和糖酵解有关,并存在p16、TERT、CCND2和GDF15等细胞衰老表型,推测可能与Kras、Myc致癌基因诱导的衰老机制有关。研究既肯定了以往特发性肺纤维化异常基因与机制的研究,也发现了新的疾病机制特点和分子标志,如细胞周期异常、固有免疫和获得性免疫反应在55-65岁人群更为显着,细胞衰老、线粒体应激和未折叠蛋白质反应在65岁以上人群更为显着,得到了具有高度关联性,且与65岁以上特征相关的差异基因如GREM1、VCAM1、PTHLH和RGS4等。这些结果可能成为疾病的潜在靶点。2.人参平肺散可能通过蛋白质翻译后修饰、细胞周期、DNA修复、基因转录调控、氧化应激和致癌基因诱导的细胞衰老和免疫反应等机制干预特发性肺纤维化;可能通过金属蛋白酶降解,SKP2介导的p27/p21的降解反应和获得性免疫反应等机制干预65岁以上的病人;可能通过FOXO、E2F6的转录调控活动和固有免疫反应等机制干预55-65岁的病人。这些结果可能为进一步的实证研究提供理论依据。3.人参平肺散的代表成分与TGF-β信号通路中的成分蛋白和间接反应蛋白结合能力良好,为实证研究提供了理论基础。本章体外实验显示,人参平肺散全方和各拆方组可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞间质标志α-SMA的升高,从而抑制成纤维细胞的表型转化。人参平肺散全方及拆方组均可减少TGF-β1诱导的成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白COL1A1的表达,从而抑制细胞外基质的沉积。人参平肺散全方和各拆方组均可下调TGF-β1诱导的成纤维细胞的促ROS生成酶NOX4的升高,从而抑制氧化应激压力。此外,人参平肺散全方和清肺组均可以抑制TGFβ的通路成分SMAD2/3的磷酸化。综上所述,人参平肺散可改善TGF-β1诱导后肺成纤维细胞的表型转化,可能是通过下调TGF-β通路中的SMAD2/3的磷酸化从而抑制了间质转化、细胞外基质沉积和氧化应激而作用。这些结果为进一步的实证研究提供了一定的依据。
张楠[2]（2021）在《Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肝癌侵袭转移和耐药是不良预后及进展的主要原因,肝癌是典型的富血管恶性肿瘤且存在血管生成拟态。Regorafenib于2017年被FDA批准用于不可切除肝癌的二线治疗药物,但是Regorafenib在肝癌转移中的治疗功效及作用机制尚不清楚。本论文第一部分旨在考察Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移及VM形成的影响并探明相关分子机制。长期用药,Regorafenib面临耐药风险,前期我们已筛选肝癌Regorafenib耐药细胞,但其耐药机制尚需深入研究。本论文第二部分旨在表征肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移和VM形成等特征,筛选潜在逆转耐药靶点并探讨相关机制。上述研究将为临床上肝癌复发转移治疗及Regorafenib的合理用药提供有效策略。方法:1、第一部分:（1）分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Regorafenib对肝癌细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的影响。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证Regorafenib治疗肝癌的潜在靶标,采用CETSA和基因敲减、回补实验证明ID1是Regorafenib的靶标。（3）采用Western blot、免疫组化、CD34-PAS双染等方法分析肝癌样本中ID1与EMT、VM蛋白表达相关性。（4）采用基因sh RNA和过表达等实验探讨ID1调节Snail介导肝癌细胞增殖、迁移侵袭和VM形成的作用机制,进一步采用裸鼠尾静脉肺转移模型进行体内验证。（5）采用肝癌PDX模型,体内考察Regorafenib对肿瘤中EMT及VM的影响。2、第二部分:（1）采用低浓度梯度间歇诱导筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验分析耐药细胞的耐药性、增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达等特征。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证CD90是肝癌Regorafenib耐药细胞的重要靶标。（3）采用裸鼠皮下成瘤和CD34-PAS双染考察耐药细胞的肿瘤生长及VM结构,采用Western blot及免疫组化考察肿瘤组织中CD90及EMT、VM相关蛋白表达。（4）采用基因sh RNA实验考察CD90敲减对耐药细胞特征的影响,并进一步在裸鼠肺转移模型中验证。（5）采用GEPIA数据库分析临床肝癌样本中CD90与Pin1表达相关性,采用Western blot检测耐药细胞中CD90敲减对Pin1表达的影响。（6）采用Western blot分析肝癌标本中Pin1与Gli1表达相关性,进一步采用基因sh RNA、过表达及点突变,Co-IP、GST-pull down、CHX等实验探讨Pin1/Gli1信号轴对耐药细胞特征的影响及作用机制。（7）采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Dasatinib对耐药细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的逆转情况。结果:1、第一部分:（1）肝癌细胞经Regorafenib预处理48 h,细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,而细胞增殖能力不受影响;Regorafenib抑制EMT相关蛋白Snail、Vimentin及VM相关蛋白VE-cadherin表达。（2）基于RNA-seq筛选并验证Regorafenib显着下调ID1表达;CETSA实验结果表明Regorafenib与ID1结合后热稳定性增强,ID1敲减降低了Regorafenib对肝癌细胞迁移能力的抑制作用,ID1回补可以恢复Regorafenib对细胞迁移能力的影响,表明ID1是Regorafenib的直接靶标。（3）在临床肝癌标本中ID1与Vimentin及VE-cadherin表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关;ID1高表达的肝癌组织中CD34-PAS+的VM阳性结构多于ID1低表达组织。（4）ID1与Snail表达呈正相关;ID1敲减后,肝癌细胞迁移侵袭、VM形成及体内转移能力减弱,Snail过表达可增强sh ID1细胞的迁移侵袭及VM形成能力,并恢复其EMT及VM相关蛋白表达;ID1过表达增强肝癌细胞EMT、VM相关生物学行为及蛋白表达,Snail敲减可抑制其功能。（5）在肝癌PDX模型中,经15 mg/kg Regorafenib治疗后,肿瘤体积变小、VM结构减少;Regorafenib显着抑制肿瘤组织中ID1、Vimentin、Snail、VE-cadherin表达并促进E-cadherin表达。2、第二部分:（1）成功筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,耐药细胞具有增殖、迁移侵袭及VM形成能力增强,EMT及VM相关蛋白表达增加等特征。（2）基于RNA-seq筛选并验证肝癌Regorafenib耐药细胞中CD90异常高表达,提示CD90是逆转肝癌Regorafenib耐药的重要靶标。（3）肝癌Regorafenib耐药细胞的体内成瘤能力增强,组织中CD34-PAS+结构增多,CD90、Snail、Vimentin及VE-cadherin表达增加。（4）CD90敲减使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,体内肺转移能力降低,并下调Snail、Vimentin及VE-cadherin表达。（5）GEPIA数据库分析表明CD90与Pin1表达呈正相关,CD90敲减可降低Pin1表达。（6）Pin1敲减使耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,并下调EMT及VM相关蛋白;Pin1过表达增强肝癌细胞EMT及VM相关生物学行为并上调其相关蛋白表达;肝癌标本中Pin1与Gli1呈正相关,Pin1与Gli1相互作用并调控Gli1蛋白稳定性介导耐药细胞迁移侵袭、VM形成及相关蛋白表达。（7）Dasatinib使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,下调CD90/Pin1/Gli1信号轴及下游EMT、VM相关蛋白,提示其可用于逆转肝癌Regorafenib耐药。结论:Regorafenib通过靶向ID1介导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移及VM形成,为Regorafenib用于肝癌转移治疗提供理论支撑。CD90调节Pin1表达进而调控肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移及VM形成,Dasatinib可通过抑制CD90/Pin1/Gli1轴逆转肝癌Regorafenib耐药,揭示了Regorafenib耐药的新型分子机制。本研究为肝癌复发转移提供治疗策略,对临床上Regorafenib的合理用药及其耐药逆转具有指导意义。
李源[3]（2021）在《G蛋白偶联受体激酶3（GRK3）调控胃癌发生及腹膜转移的机制研究》文中提出目的:胃癌在全球范围内仍旧是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,并在2020年引起超过1000000例新增病例和大约783000的死亡病例（相当于全球每12例死亡病例中有1例死于胃癌）。在我国,胃癌的发病率呈逐年上升的趋势。尽管近年来在胃癌的流行病学、病理学、分子机制以及治疗选择和策略的理解和研究上都取得了重要进展,但胃癌对公共卫生的威胁程度仍然很高。G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor,GPCR）在信号传递中起着核心作用,从而影响多种细胞功能。越来越多的证据表明,GPCR及其配体在肿瘤生物学不同方面发挥着十分重要的作用。G蛋白偶联受体激酶（G-protein-coupled receptor Kinase,GRK）作为AGC（蛋白激酶A/G/C样）激酶的一个亚家族,最初被确定为GPCR信号的调节剂,目前正在成为潜在的相关肿瘤调节剂。GRKs是包含7种丝氨酸/苏氨酸蛋白的激酶家族,可特异性磷酸化激活GPCR。哺乳动物的GRKs由3个具有相似序列的亚组组成,包括视紫红质激酶（GRK1[rhodopsin激酶]和GRK7[cone opsin激酶]）,β-ARK亚组（GRK2和GRK3）和GRK4亚组（GRK4,GRK5,和GRK6）。众所周知,GRK3可以使β-肾上腺素和相关的GPCR的激动剂磷酸化,从而广泛调节受体功能。GRK3是GRKs的同工型,可以使GPCR磷酸化和脱敏。GRK3在不同的肿瘤类型中显示出不同的表达水平和功能。例如,GRK3的表达下调与胶质母细胞瘤细胞的增殖能力增强有关,并与胰腺癌和肝细胞癌的不良预后有关。相反,GRK3在前列腺癌和结肠癌中呈高表达,并通过诱导血管生成促进了肿瘤的生长和转移。但是,GRK3在胃癌中的作用仍不清楚,尚属空白,亟需更多的研究。方法:我们首先在23对来自中国医科大学附属第一医院肿瘤外科和MD Anderson肿瘤中心消化内科的胃癌及配对癌旁组织中进行q PCR实验,同时我们对来自中国医科大学附属第一医院肿瘤外科的包含393对胃癌组织及配对癌旁非癌组织的组织芯片进行免疫组化实验。结合临床病理资料和随访信息,对免疫组化结果进行分析。并且通过数据库分析进行验证。接下来,我们应用胃癌病人来源的腹水肿瘤细胞建立动物模型（Patient-derived Xenograft,PDX）,对小鼠皮下原位肿瘤和小鼠腹水肿瘤细胞中GRK3的表达情况进行检测。最后在病人腹水细胞中进行GRK3免疫荧光染色,评价其在腹膜转移细胞中表达情况。敲除和过表达GRK3,进行MTS和集落形成实验探索GRK3对胃癌细胞增殖的影响。利用药物库筛选GRK3抑制剂LD2,对肿瘤细胞进行体外处理,进行MTS、集落形成和Transwell实验,探索抑制剂对肿瘤增殖和迁移能力的影响。小鼠体内皮下成瘤实验,应用抑制剂处理小鼠,研究抑制GRK3后对肿瘤生长的影响。为进一步解释GRK3影响腹膜转移行为的机制,我们应用RPPA实验,探索GRK3抑制后下游靶点的改变情况。在胃癌、癌旁及腹水肿瘤细胞中应用q PCR对GRK3及YAP1表达相关性进行验证。在同一批胃癌组织芯片的连续切片中对YAP1进行免疫组化实验,验证GRK3和YAP1的相关性。敲除、过表达GRK3后利用q PCR、Western blot在RNA水平和蛋白水平验证YAP1的表达是否受GRK3的影响。LD2处理细胞后,利用q PCR、Western blot在RNA水平和蛋白水平验证YAP1的表达。LD2处理细胞,应用肿瘤成球实验和流式标记ALDH1A1,分析GRK3对肿瘤细胞干性的影响。使用LD2对腹水野生型细胞和YAP1敲除的单克隆细胞进行处理,利用MTS实验验证LD2抑制肿瘤细胞增殖的YAP1依赖性。结果:研究结果发现在胃癌及配对癌旁组织中,GRK3在癌组织中表达高于对应癌旁非癌组织。胃癌组织芯片免疫组化结果显示胃癌组织中GRK3的阳性率为61.1%（240/393）,癌旁非癌组织中,GRK3的阳性率仅为32.3%（127/393）（P<0.01）。胃癌组织中GRK3高表达与较差的分化程度（P=0.044）、Lauren分型（弥漫型）（P=0.010）、淋巴结转移（P=0.001）和更高的TNM分期（P=0.043）显着相关。GRK3高表达的病人术后生存时间显着低于GRK3低表达病人（P=0.002）。数据库分析了包含876例胃癌病人的队列,结果显示GRK3高表达同样与较短的生存期和较高的死亡风险显着相关（P<0.001,HR=1.74）。PDX小鼠模型中发现GRK3在腹水细胞中的表达明显高于其对应的原位皮下成瘤组织。对胃癌腹水细胞切片免疫荧光染色发现,有90%的胃癌病人的腹水肿瘤细胞表现出较强的GRK3荧光信号。在胃细胞系中,可见GRK3在正常胃黏膜上皮细胞系几乎不表达,在原位肿瘤细胞系中呈现强弱不等的阳性表达,而在四个胃癌病人腹水肿瘤细胞中,GRK3均呈较高的表达水平。我们发现敲除GRK3后,肿瘤细胞增殖能力受到抑制。过表达GRK3后,肿瘤细胞的增殖能力增强。筛选GRK3特异性抑制剂LD2,可显着抑制GRK3在胃癌细胞中的表达。且肿瘤细胞的增殖、迁移能力也被抑制。小鼠皮下成瘤实验后应用LD2处理小鼠,与对照组相比,LD2治疗组的肿瘤体积和肿瘤重量明显降低。通过RPPA实验发现GRK3被抑制后,Hippo/YAP1通路中的转录因子YAP1表达水平降低。PCR及免疫组化实验结果显示,GRK3与YAP1的表达水平呈正相关。敲除胃癌细胞中的GRK3或应用LD2处理细胞后,发现YAP1的表达水平下调。过表达GRK3后,YAP1表达上调。应用LD2处理细胞,显着抑制了胃癌干细胞特性。LD2对野生型细胞的抑制作用显着强于YAP1敲除的细胞。结论:GRK3在胃癌组织中表达高于对应癌旁组织,且与胃癌分化程度、转移、较差的TNM分期及胃癌病人术后的不良预后相关。GRK3在胃癌细胞系及胃癌病人腹水肿瘤细胞中高表达。敲除GRK3使肿瘤增殖能力降低;过表达GRK3增强肿瘤细胞增殖能力;GRK3抑制剂LD2有效抑制GRK3表达及肿瘤增殖、迁移能力。GRK3通过调控转录因子YAP1来调节肿瘤细胞干性及促进腹膜转移的发生。
李佳林[4]（2020）在《FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究》文中研究指明第一部分FOXD3蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:肺癌分别是全球男女性发病率排名第二的恶性肿瘤;骨转移尤其是脊柱转移是导致肺癌不良预后的重要因素。肿瘤干细胞与肿瘤发生发展、侵袭转移密切相关。FOXD3与胚胎发育及恶性瘤发生有相关性,但其对肺癌的作用机制有待进一步探究。同时FOX（forkhead box）蛋白家族是常用临床药物治疗靶点,本研究的目的是探究FOXD3对肺癌干细胞的调控机制及对骨转移相关恶性生物学行为影响,为临床药物开发提供理论支持。研究方法:本研究利用前期实验室构建的特异性脊柱转移肺癌细胞系,评估此细胞系的肿瘤干细胞特性,通过癌球形成和再分化实验、细胞耐药性分析和细胞迁移实验对FOXD3在肺癌肿瘤干细胞内的功能进行分析评价;通过细胞实验及载瘤动物模型进一步将FOXD3对肿瘤恶性生物学行为影响进行探究,同时使用全基因组RNASeq和Ch IP-Seq分析来预测FOXD3在肺癌干细胞中的直接作用靶基因位点,并通过双荧光素酶报告系统及细胞功能实验验证其相互作用及参与调控的信号通路。结果:肺癌脊柱转移细胞具有肿瘤干细胞特征;FOXD3在脊柱转移细胞及肿瘤干细胞内表达下调。同时发现,FOXD3在体外和体内水平均与肿瘤干细胞的扩增和迁移、肿瘤细胞耐药性以及骨转移灶破骨细胞分化呈负相关关系。FOXD3通过对WDR5的转录阻遏,实现对其表达调控的作用,最终达到对肺癌干细胞相关生物学功能调控。结论:本研究揭示了FOXD3作为肺癌肿瘤抑制因子的作用机制,我们证明了FOXD3可以通过抑制WDR5在肺癌中的表达来抑制肿瘤干细胞的积累,从而影响肺癌生物学进程,进而参与肺癌骨转移、骨破坏等恶性生物学行为发生与发展的调控。WDR5做为临床常用药物开发靶点,该研究为进一步探索肺癌治疗,特别针对骨转移相关事件的靶向药物治疗提供了潜在靶点及理论基础。第二部分乙酰化依赖的SCF-β-TRCP1功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤性疾病,是全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因。SCF-β-TRCP1泛素化系统与结直肠癌关系密切,可通过泛素化降解β-catenin等癌基因实现对结直肠癌调控。本研究主要探讨β-TRCP1的乙酰化调节途径对结直肠癌恶性生物学行为的影响,探索β-TRCP1新的调节途径,为结直肠癌治疗提供可行的靶点与思路。研究方法:我们通过WB实验、免疫共沉淀、泛素化实验、CHX蛋白降解等实验找到参与β-TRCP1乙酰化调控的相关乙酰化/去乙酰化酶,进而通过细胞功能实验探究β-TRCP1乙酰化水平对结直肠癌恶性生物学行为的影响,并通过临床标本免疫组化染色进行验证;最后找到β-TRCP1反向调控乙酰化酶稳定性的具体机制,构建完整反馈调节环路。结果:本研究阐明GCN5-SIRT1系统介导的SCF-β-TRCP1乙酰化修饰路径:乙酰化酶GCN5参与β-TRCP1乙酰化过程,去乙酰化酶SIRT1参与β-TRCP1去乙酰化过程。乙酰化影响β-TRCP1蛋白稳定性的同时增强结肠癌中β-TRCP1的抑癌功能;β-TRCP1可通过CKⅡ磷酸化依赖的泛素化途径降解SIRT1,同时这种效果可以被Pin1蛋白所拮抗。这项研究阐明了控制β-TRCP1稳定性及其E3连接酶功能活性的新上游途径。结论:研究揭示TRCP/GCN5/SIRT1相互作用的新机制,由此GCN5/SIRT1可以以乙酰化依赖性的方式调控β-TRCP1的功能与蛋白稳定性。除充当调节剂外,SIRT1还充当β-TRCP1的底物,进而影响自身乙酰化过程;GCN5/SIRT1活性的启动推动了反馈回路的产生,影响β-TRCP1功能。在β-TRCP1调节过程中,CKⅡ磷酸化通路和SIRT1乙酰化途径之间存在潜在的联系,CKⅡ可以磷酸化SIRT1,介导其被β-TRCP1识别并通过泛素化途径降解从而影响去乙酰化酶活性。该研究确定了乙酰化依赖的β-TRCP1功能调控新机制,并提供了有关乙酰化系统调控E3连接酶活性的新线索。
徐欣[5]（2020）在《利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白》文中指出细胞程序性死亡（Programmed Cell Death,PCD）是生物体为维持内环境稳定而产生的一种特殊的细胞死亡机制,是基本的生物学现象。PCD过程由多种基因控制,此类基因在多种动植物之间都非常保守。抗细胞凋亡基因（Defender against Apoptotic Death,DAD）就是其中之一。该基因编码寡糖基转移酶（OST）复合物中的一个亚基,是内质网中催化N-糖基化的主要核心成分,负向调控PCD过程的进行,在植物正常发育和抵御各类胁迫中发挥作用。本课题组前期的研究发现,在异源四倍体陆地棉（Gossypium hirsutum L.,基因组为AADD）中,DAD基因由于多倍化和选择性剪接等原因共产生3个转录本,分别命名为Dt1,Dt2和At,这3个转录本间具有明显表达分化。为了进一步揭示这3个转录本在陆地棉内的并存方式和抗凋亡机制,本研究从蛋白互作的角度,对陆地棉DAD基因3个转录本编码蛋白的互作谱进行了初步筛查,主要结果如下:1、成功构建了3个转录本的诱饵载体以异源四倍体陆地棉叶片组织的cDNA为模板,利用特异性引物与分子克隆技术得到了Dt1、Dt2和At转录本的编码区全长序列;分别构建了用于酵母双杂交的诱饵载体Dt1-p GBKT7、Dt2-p GBKT7和At-p GBKT7;诱饵载体转化Y2H Gold菌株后酵母生长结果表明这3个转录本编码蛋白均对酵母细胞无毒性且无自我激活活性。2、成功构建了酵母双杂交cDNA表达文库以陆地棉的叶片、花和棉纤维组织为样品,构建了一个用于蛋白互作网络筛选的高质量c DNA表达文库。初级文库库容量大于2.6×106 cfu,平均插入片段长度大于1.0 kb,百万级扩增文库质粒浓度为1.0 mg/m L。3、初筛3个转录本编码蛋白的互作蛋白诱饵载体Dt1-pGBKT7、Dt2-pGBKT7和At-pGBKT7分别与cDNA表达文库共转化Y2H Gold菌株。共转化效率在7.15×104-1.25×105 cfu/μg之间。通过酵母菌落PCR和测序鉴定,初步筛选到与Dt1互作的蛋白5个,与Dt2互作的蛋白4个,与At互作的蛋白3个。筛选到的蛋白中有5个蛋白分别参与植物体内不同组织关于PCD调控的机制,另外发现DUF538 family protein能够与Dt1和Dt2互作。而Dt1、Dt2与At转录本编码蛋白之间目前还未筛选到共享互作蛋白。这暗示陆地棉DAD基因的3个转录本可能参与不同的代谢途径并出现功能分化。
汪文杰[6]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中研究指明背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
赵帅阳[7]（2018）在《环形泰勒虫裂殖体与宿主细胞互作分子的筛选及功能研究》文中研究说明热带泰勒虫病（Tropical theileriasis）是由环形泰勒虫（Theileria annulata）感染引起的蜱传性血液原虫病,患病动物通常表现出体表淋巴结肿大、高热、贫血、消瘦等临床症状。环形泰勒虫裂殖体感染的宿主单核/巨噬细胞、树突状细胞及B淋巴细胞在体外培养时能够无限增殖,表现出癌细胞的生长特性,即转化特性;当感染细胞用抗寄生虫药物布帕伐醌（Buparvaquone,BW720c）处理后,宿主细胞恢复正常细胞的生长及凋亡特性。参考环形泰勒虫基因组、蛋白组数据,同时结合相关文献,本研究选取可能参与细胞转化的环形泰勒虫裂殖体膜蛋白或分泌蛋白,利用酵母双杂交技术,筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白。对环形泰勒虫裂殖体感染的细胞系TaNM1细胞进行siRNA干扰及药物处理后,检测信号通路关键分子基因的表达及蛋白磷酸化水平,从而了解互作蛋白分子对宿主细胞信号通路的影响,为阐明环形泰勒虫调节宿主细胞转化的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1.成功构建环形泰勒虫的7个转化相关基因TaSP、SVSP2、EMM、Glu、CP、URP及Cyp1的pET30a原核表达载体,经诱导表达后,纯化获得浓度在0.3 mg/mL左右单一条带的重组蛋白。用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得这7种蛋白的兔源多克隆抗体。亚细胞定位结果表明Cyp1、Glu及URP内源性蛋白主要分布在裂殖体内部,表面也有少许分布,而SVSP2主要分布在裂殖体细胞核附近;EMM及CP主要分布在裂殖体周围。这些蛋白的分布表明它们可能通过与宿主细胞蛋白分子的相互作用进而调节细胞转化。2通免疫磁珠分选方法,从健康牛的PBMCs中分离出高纯度的B淋巴细胞,经流式细胞仪鉴定纯度为95.3%;构建牛B淋巴细胞cDNA文库,文库鉴定结果显示:读码框1、2和3的初级文库容量分别大于2.6×106 cfu、1.1×106 cfu及2.0×106 cfu,文库扩增基数大于150万cfu,其中读码框1、2和3中插入片段大小,分别为1000?3500 bp、750?2250 bp及600?3500 bp,表明构建的B淋巴细胞文库具有较高的质量,可用于转化相关分子与宿主细胞相互作用分子的筛选。同时成功构建这7种转化相关基因的pGBKT7重组诱饵质粒,并对这7个诱饵质粒进行酵母的自激活性与毒性试验,结果表明所有诱饵质粒均无自激活性与毒性,可作为诱饵质粒用于双杂交筛选。3.通过对环形泰勒虫CP及Cyp1的功能结构域预测及SWISS-Model同源建模,成功构建TaCP及TaCyp1高级结构模型,并显示出结构域与蛋白二级结构的分布关系,为蛋白相互作用位点的预测提供依据。此外酵母蛋白的western blot结果表明CP及Cyp1在酵母细胞中获得正确表达。通过酵母双杂交筛选,首次证明宿主细胞分子CRBN和Ppp4C与CP之间存在相互作用,MED21及SEC31A与Cyp1之间存在相互作用,这为研究CP及Cyp1与宿主细胞之间的相互作用提供了有效靶分子。4.通过GST-pull down进一步验证MED21与Cyp1之间的相互作用。TaNM1细胞的MED21干扰及BW720c药物处理实验结果表明:药物处理后细胞中IκBα及IκBβ的磷酸化水平明显降低,表明NF-κB信号通路活性降低;MED21基因被干扰后,核转录因子NF-κB1及NF-κB2的基因表达量明显下降,但P105及P52蛋白表达量无明显变化,至于其分子机制还需进一步研究。
韦伊芳[8]（2017）在《NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究》文中研究指明乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,近年来乳腺癌的发病率呈现逐年上升的趋势,而且发病年龄趋于年轻化。乳腺癌的死亡率占女性癌症15%,占居女性恶性肿瘤死亡率首位,严重威胁女性的生理和心理健康,甚至危及生命。近年来,随着科研和医疗水平的不断发展,乳腺癌治疗方式有很多种包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗、分子生物靶向治疗和中医药治疗等,但综合治疗法已成为其基本原则及主流治疗模式。其中,化疗在乳腺癌的综合治疗过程中发挥重要作用,可以缩小乳腺癌的原发病灶,增加手术治疗的机会,并延长患者的长期生存率和提高生存质量。化疗药物耐药是制约化疗药物应用的重要原因,同时,它也是导致患者临床治疗失败、甚至患者最终死亡的重要原因之一。研究发现:乳腺癌的化疗耐药与DNA损伤修复,mi RNA,凋亡耐药,肿瘤微环境,抑癌分子p53,RB等多种因素有关,其中抑癌分子p53的研究较为广泛。人NDRG2基因（N-Myc downstream-regulated gene 2）是我们实验室首先发现的基因。1999年,邓燕春博士等在研究神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异时,发现一个新基因,在肿瘤组织中呈现低表达,当时命名为SLYD（Gen Bank登录AF159092）。人NDRG2基因染色体定位于14q11.2,含有16个外显子,15个内含子。人NDRG2基因的m RNA全长为2121 bp,有一个ORF,编码的蛋白质含有357个氨基酸,分子量为40.7 KD。近年来,大量基因功能研究表明,NDRG2是一个抑癌候选分子。我们研究发现:化疗药物阿霉素引起的细胞DNA损伤可以明显促进NDRG2表达水平的提高,通过分析其启动子序列发现ATM和ATR等DNA损伤相关基因可能参与对NDRG2的调控。同时,我们还发现,NDRG2可以直接被抑癌基因p53转录激活,NDRG2在p53介导的细胞凋亡中发挥着重要作用,是可以增强肿瘤细胞化疗敏感性的新基因,但是具体的机制仍不明。【目的】1.分析并验证NDRG2与乳腺癌阿霉素耐药是否存在相关性;2.阐明NDRG2促进乳腺癌细胞阿霉素敏感性与p53活性的关系;3.明确NDRG2促进乳腺癌细胞凋亡的分子机制;4.揭示NDRG2促进乳腺癌细胞阿霉素耐药依赖于p53的分子机制。【方法和结果】1.NDRG2在乳腺癌耐阿霉素（adriamycin,ADR）细胞中的低表达状态分析我们首先用RT-q PCR和Western Blot检测NDRG2在亲本细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR中的表达,结果显示,NDRG2在MCF-7/ADR细胞中呈现低表达;我们进一步在MCF-7/ADR细胞中过表达NDRG2,MTT实验和流式细胞仪测细胞凋亡结果显示NDRG2过表达可以明显促进MCF-7/ADR细胞的凋亡和阿霉素的敏感性。这提示NDRG2可能促进乳腺癌对阿霉素的敏感性。2.NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性我们构建了三株NDRG2过表达的乳腺癌细胞,MTT实验和流式细胞仪检测细胞凋亡发现,只有在p53野生型的乳腺癌细胞MCF-7中,NDRG2可以明显促进细胞的凋亡和对阿霉素的敏感性;而在p53突变型乳腺癌细胞T47D和MDA-MB-231中,NDRG2过表达不发挥作用。在MCF-7细胞中干涉NDRG2的表达,细胞对阿霉素的敏感性明显降低;进一步在MCF-7/NDRG2细胞中干涉p53的表达可中和NDRG2对乳腺癌细胞阿霉素的敏感性。由此可见,NDRG2促进乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性依赖于p53的活性。3.NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应阿霉素刺激细胞通常造成DNA的损伤,进而诱导细胞对损伤DNA的修复。我们进一步检测NDRG2对乳腺癌细胞DNA损伤和修复的影响。Western Blot结果显示,在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,NDRG2可明显促进γH2AX的表达,抑制RAD51的表达;而在T47D和MDA-MB-231细胞中却无此现象。激光共聚焦显微镜检测RAD51的表达结果与Western Blot一致。我们进一步用p DR-GFP,I-Sce I系统检测NDRG2对细胞DNA损伤同源重组修复的影响。结果显示,NDRG2可以明显抑制MCF-7细胞的同源重组修复;抑制p53的表达可以中和NDRG2对细胞同源重组修复的抑制作用。因此,NDRG2可以促进p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的DNA损伤,并抑制其DNA损伤修复能力。4.NDRG2通过提高Bad的表达促进细胞的凋亡前几部分的研究表明NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,我们用Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2家族成员的表达。发现NDRG2可促进MCF-7细胞中促凋亡分子Bad的表达;利用si RNA干涉Bad的表达可以显着抑制NDRG2的促凋亡能力。进一步的机制分析,发现NDRG2不改变Bad的m RNA水平,利用蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制蛋白降解,放线菌酮（CHX）抑制蛋白合成,分析Bad的蛋白质降解过程,发现NDRG2可以抑制Bad的蛋白酶体-泛素化降解,促进其蛋白稳定性。5.NDRG2促进线粒体p53与Bad复合物的形成,抑制p53的核定位由于NDRG2促进乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性均依赖于野生型p53,我们对其分子机制进行探究。RT-q PCR和Western Blot结果显示NDRG2对p53的Mrna以及蛋白表达没有明显改变;细胞核蛋白和细胞质蛋白分离检测发现,NDRG2明显抑制p53蛋白进入细胞核,增加其在细胞质中的含量;同时,对p53直接转录激活的下游靶基因m RNA水平的检测,证实p53进入细胞核减少;利用线粒体蛋白分离和激光共聚焦技术,我们进一步发现NDRG2可以促进p53在线粒体的定位;最后,Co-IP实验证实p53与Bad存在相互作用。因此,NDRG2通过促进p53定位于线粒体,诱导p53非转录依赖的细胞凋亡。同时,p53进入细胞核的蛋白量降低,抑制其DNA损伤修复过程,导致DNA损伤加剧。【结论】通过本课题的研究,我们发现NDRG2可以促进p53野生型乳腺癌对化疗药物阿霉素的敏感性,而且,NDRG2抑制Bad的泛素化降解维持蛋白稳定性,进而诱导细胞的凋亡;同时NDRG2可以促进p53与Bad的相互作用,且定位于线粒体。因此,我们的研究不仅明确了NDRG2在化疗药物阿霉素敏感性中的作用,更进一步揭示了NDRG2对p53的调控,为NDRG2在乳腺癌治疗中的应用提供了强有力的依据。
王磊[9]（2017）在《RNF113A在哈萨克族食管鳞癌中的作用及其功能研究》文中指出目的:探讨环指蛋白113A（RNF113A）基因参与食管癌细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响及在食管癌中的作用;通过分析哈族食管鳞癌组织中RNF113A表达水平与食管癌临床恶性表型间的关系,为新疆哈萨克族食管癌临床早期诊断及个体化治疗奠定理论基础。方法:1)采用免疫组织化学法在组织水平检测117例哈萨克族食管鳞癌组织及配对癌旁正常食管组织中RNF113A的表达,及RNF113A的表达与p53表达的关系;实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测41例哈族食管鳞癌组织及配对癌旁正常食管组织RNF113A的mRNA表达情况。分析RNF113A的表达与各临床病理参数（患者年龄、性别、分化程度、T分期、淋巴结转移、组织类型、肿瘤部位）的关系。分析RNF113A的表达与哈萨克族食管鳞癌预后的相关性;2)针对RNF113A的cDNA序列,我们合成了小干扰RNA（siRNA）和真核过表达载体,并转染食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系;运用qRT-PCR技术和western-blot技术检测转染干扰和过表达载体后RNF113A表达水平的变化;运用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;运用Transwell实验和细胞划痕实验检测RNF113A干扰和过表达后对ESCC细胞系迁移的变化,运用Transwell实验检测RNF113A干扰或过表达后ESCC细胞系侵袭的变化;3)构建了RNF113A慢病毒干扰载体,转染Eca109细胞,建立了稳定转染RNF113A敲低的Eca109细胞系。分别将转染有sh-scramble及sh-RNF113A细胞及正常培养的Eca109细胞接种于裸鼠皮下,构建Eca109细胞裸鼠皮下荷瘤模型,每周称重1次,并观察瘤块的生长情况。瘤块长出后,用游标卡尺测量裸鼠瘤块长径（A）及垂直横径（B）,按公式V=A×B2/2计算裸鼠肿瘤体积,并绘制肿瘤体积增长曲线及体质量曲线。处死后采用qRT-PCR和免疫组织化学法检测裸鼠瘤块组织中RNF113A的表达。结果:第一部分:免疫组织化学检测RNF113A蛋白表达情况。在117哈族ESCC组织中,74例（63.25%）RNF113A呈阳性表达,RNF113A在哈萨克族食管鳞癌组织中呈现高表达,明显高于配对癌旁正常食管组织（P=0.000）。RNF113A和p53的表达在哈族食管鳞癌组织呈显着正相关（P=0.035）。qRT-PCR检测41例哈族食管鳞癌组织及配对癌旁正常食管组织RNF113A的mRNA表达情况,癌组织中表达量是癌旁正常组织中表达量均值的2倍。哈族食管癌组织中RNF113A表达与临床病理指标间的相关性分析显示,分化程度（P=0.008）和T分期（P=0.000）、淋巴结转移（P=0.017）与RNF113A表达显着相关,而RNF113A表达与性别、年龄、组织类型、肿瘤部位之间差异无统计学意义。Kaplan Meier的生存曲线表明,RNF113A阴性表达的食管癌患者比RNF113A阳性表达的患者生存期长。采用Cox比例风险单因素分析表明RNF113A表达和T分期、淋巴结转移是影响哈族ESCC的预后因素。多因素分析表明RNF113A表达、淋巴结转移是哈萨克族食管癌患者总生存率的独立危险因素。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默RNF113A基因后,G0/G1期细胞数显着增加,S期细胞数显着减少,G2/M期细胞显着减少,抑制增殖;过表达RNF113A基因后,G0/G1期细胞数显着减少,S期细胞数变化不明显,G2/M期细胞显着增加,促进增殖。RNF113A siRNA转染Eca109及EC9706细胞后细胞凋亡率显着上升;RNF113A过表达质粒转染后,各组间细胞凋亡率无差异。干扰RNF113A能抑制Eca109、EC9706细胞的迁移和侵袭能力;过表达RNF113A能显着促进ESCC细胞的迁移和侵袭能力。第三部分:通过人食管癌Eca109细胞株裸鼠移植瘤动物模型的成功建立,结果显示sh-RNF113A组裸鼠的瘤块体积及重量都比对照组小,说明干扰RNF113A的表达后减缓了裸鼠的成瘤能力。sh-RNF113A组裸鼠瘤块组织中RNF113A的蛋白和mRNA表达明显降低,提示RNF113A能提高食管癌细胞的生长能力,促进肿瘤细胞生长。结论:RNF113A在哈萨克族食管鳞癌中高表达,RNF113A表达与分化程度、T分期和淋巴结转移、预后显着相关。RNF113A能抑制食管鳞癌细凋亡,影响细胞周期,促进增殖、迁移和侵袭。在裸鼠荷瘤的动物水平,RNF113A在体内能够促进肿瘤生长,发挥着癌基因的作用。
邓成敏[10]（2016）在《蛋白激酶Cβ/衔接蛋白氧化应激通路在实验性氟中毒中枢神经系统损伤中的作用》文中进行了进一步梳理目的:观察慢性氟中毒大鼠脑组织以及体外培养SH-SY5Y细胞中蛋白激酶Cβ（Protein kinase Cβ,PKCβ）/衔接蛋白（p66shc）氧化应激通路中PKCβ、肽基脯氨酰顺反异构酶（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,Pin1）、p66shc及磷酸化p66shc（phospho-p66shc）蛋白的表达,探讨PKCβ/p66shc氧化应激通路在实验性氟中毒神经损伤机制中的作用。方法:建立慢性氟中毒动物模型:SD大鼠30只,雌雄各半,随机分为3组,即正常对照组、低氟组（饮水氟含量10mg/L,加入氟化钠配制）、高氟组（饮水氟含量50 mg/L）;实验期为6个月。用氟离子选择电极法测定大鼠尿氟含量;用Morris水迷宫方法测定大鼠学习记忆能力;苏木精伊红（Hematoxylin eosin,HE）染色后光镜下观察大鼠脑组织皮质形态学变化;免疫组织化学方法检测大鼠脑组织皮质神经元特异性标志物神经核抗原（Neuron-specific nuclear antigen,Neu N）的表达;用蛋白印迹（Western blotting）方法检测动物脑组织中PKCβ、Pin1、p66shc和phospho-p66shc的蛋白表达水平。建立氟中毒细胞模型:体外培养SH-SY5Y细胞,分为3组,即正常对照组、染氟组（500?mol/L Na F）、PKCβ抑制组（500?mol/L Na F和0.2?mol/L PKCβ抑制剂LY333531）。用CCK-8法检测SH-SY5Y细胞活性,Western blotting方法检测SH-SY5Y细胞中PKCβ、Pin1、p66shc和phospho-p66shc的蛋白表达水平,生化方法测定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活性及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）试剂盒检测ROS水平,线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果:动物实验:低氟组和高氟组大鼠尿氟含量明显升高,逃避潜伏期较对照组显着延长、空间探索总次数显着减少（P<0.05）;各组大鼠脑组织皮质HE染色未见明显病理形态改变。免疫组化结果显示,低、高氟组大鼠脑组织中Neu N蛋白阳性表达较对照组明显减少（P<0.01）。Western blotting结果显示低、高氟组大鼠脑组织中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表达均高于对照组。体外培养SH-SY5Y细胞实验:CCK-8细胞活性结果显示,不同浓度Na F培养细胞48小时后,500?mol/L Na F及以上浓度可明显降低SH-SY5Y细胞活性（P<0.01）,细胞活性与染氟剂量呈负相关关系。与对照组比较,染氟组细胞活性明显降低（P<0.01）,而PKCβ抑制组细胞活性明显改善（P<0.05）。染氟组细胞中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表达均高于对照组（P<0.05）;PKCβ抑制组细胞中PKCβ、Pin1、phospho-p66shc蛋白表达均低于染氟组（P<0.05）。染氟组细胞SOD活性明显低于对照组（P<0.01）,MDA含量明显高于对照组（P<0.01）,PKCβ抑制组改变不如染氟组明显（P<0.05）。与对照组相比,染氟组细胞ROS水平增加,线粒体膜电位降低,细胞凋亡率增加（P<0.05）;与染氟组相比,PKCβ抑制组细胞ROS水平降低,线粒体膜电位增加,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论:氟中毒大鼠脑组织及过量氟暴露的体外培养神经细胞中PKCβ/p66shc氧化应激通路被激活,导致细胞毒性损伤;经PKCβ抑制剂处理后减弱氟的毒性作用。PKCβ/p66shc氧化应激通路可能是过量氟蓄积导致中枢神经系统损伤的机制之一。
二、癌基因MDM2与异构酶PIN1的交互作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、癌基因MDM2与异构酶PIN1的交互作用（论文提纲范文）
（1）基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述 |
| 综述一 特发性肺纤维化发病机制的研究进展 |
| 综述二 生物信息学和网络药理学的主要研究方法及原理 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于特发性肺纤维化转录组数据的生物信息学研究 |
| 第一节 特发性肺纤维化的基因集富集研究 |
| 1 特发性肺纤维化的GSEA基因集富集分析 |
| 2 特发性肺纤维化关键基因的差异表达基因分析 |
| 3 讨论 |
| 第二节 特发性肺纤维化不同临床特征的加权基因共表达网络研究 |
| 1 特发性肺纤维化的基因共表达特征 |
| 2 特发性肺纤维化不同临床特征的基因共表达特征 |
| 3 特发性肺纤维化的分子特征 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络药理学研究 |
| 第一节 人参平肺散干预特发性肺纤维化的网络调控机制研究 |
| 第二节 人参平肺散干预中、高年龄特发性肺纤维化的网络调控机制比较研究 |
| 1 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化高龄特征的网络机制 |
| 2 人参平肺散成分干预特发性肺纤维化中年特征的网络机制 |
| 3 讨论 |
| 第三节 人参平肺散对特发性肺纤维化调控机制的虚拟对接研究 |
| 1 以TGF β信号通路为例的通路靶点选择 |
| 2 人参平肺散靶点的计算机模拟对接研究 |
| 3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 人参平肺散干预TGF-β_1诱导肺成纤维细胞MRC-5细胞表型转化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 主要内容和结果 |
| 2 创新点 |
| 3 问题与展望 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 攻读博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 Regorafenib通过靶向ID1 介导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移及VM形成 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系和免疫缺陷小鼠 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 慢病毒表达系统 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要抗体 |
| 1.6 主要仪器及耗材 |
| 1.7 主要溶液及配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 慢病毒制备 |
| 2.4 慢病毒感染肝癌细胞 |
| 2.5 倒置荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.6 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 2.7 qRT-PCR法检测基因敲减或过表达效率 |
| 2.8 CCK8 检测细胞活力及增殖能力 |
| 2.9 生长曲线法检测细胞生长能力的变化 |
| 2.10 划痕实验检测细胞迁移能力的变化 |
| 2.11 Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力的变化 |
| 2.12 管状形成实验检测细胞VM形成能力 |
| 2.13 转录组测序分析寻找差异基因 |
| 2.14 CETSA实验检测药物与靶蛋白结合 |
| 2.15 PDX模型的复苏及移植 |
| 2.16 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.17 细胞免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.18 组织免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.19 HE染色 |
| 2.20 免疫组化染色 |
| 2.21 CD34-PAS双染鉴定VM结构 |
| 2.22 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.Regorafenib抑制肝癌细胞迁移侵袭、VM形成及相关蛋白表达 |
| 1.1 Regorafenib有效抑制肝癌细胞活力 |
| 1.2 Regorafenib抑制肝癌细胞迁移侵袭能力 |
| 1.3 Regorafenib抑制肝癌细胞VM形成能力 |
| 1.4 Regorafenib抑制肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 2.Regorafenib显着抑制ID1 表达 |
| 2.1 转录组测序分析Regorafenib可显着抑制ID1 表达水平 |
| 2.2 mRNA及蛋白水平验证Regorafenib抑制ID1 表达 |
| 3.分析临床肝癌样本中ID1与EMT及 VM蛋白标记物表达相关性 |
| 3.1 ID1与EMT及 VM相关蛋白表达呈线性相关 |
| 3.2 ID1 高表达增加临床肝癌样本中VM结构 |
| 3.3 Western blot及免疫组化证明临床肝癌样本中ID1与EMT及 VM蛋白标记物表达相关 |
| 4.ID1 敲减抑制肝癌细胞侵袭转移、VM形成及EMT相关蛋白表达 |
| 4.1 sh ID1 显着下调ID1 蛋白表达水平 |
| 4.2 ID1 敲减抑制了肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 4.3 ID1 敲减抑制肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 4.4 ID1 敲减抑制肝癌细胞体内转移能力 |
| 5.ID1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭、VM形成能力及EMT、VM相关蛋白表达 |
| 5.1 ID1 过表达对肝癌细胞增殖能力没有影响 |
| 5.2 ID1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.3 ID1 过表达促进了肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 6.ID1是Regorafenib的靶标 |
| 6.1 ID1 敲减后减弱了Regorafenib对肝癌细胞迁移能力的抑制 |
| 6.2 ID1 回补恢复了Regorafenib对肝癌细胞迁移侵袭能力的抑制 |
| 6.3 CETSA实验证明ID1是Regorafenib的靶标 |
| 7.ID1 调控Snail影响肝癌细胞迁移、侵袭及VM形成能力 |
| 7.1 临床肝癌样本中Snail与 ID1 表达成正相关 |
| 7.2 Snail过表达不影响sh ID1 肝癌细胞的增殖能力 |
| 7.3 Snail过表达增强了sh ID1 肝癌细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.4 Snail敲减不影响OE-ID1 肝癌细胞的增殖能力 |
| 7.5 Snail敲减抑制了OE-ID1 肝癌细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 8.Regorafenib有效抑制肿瘤生长及VM形成 |
| 8.1 Regorafenib有效抑制肿瘤生长 |
| 8.2 Regorafenib有效抑制肿瘤形成VM结构 |
| 8.3 Regorafenib有效抑制肿瘤组织中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 CD90 调节Pin1 影响肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移及VM形成能力 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系和免疫缺陷小鼠 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 慢病毒表达系统 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要抗体 |
| 1.6 主要仪器及耗材 |
| 1.7 主要溶液及配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 慢病毒制备 |
| 2.4 慢病毒感染肝癌细胞 |
| 2.5 倒置荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.6 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 2.7 q RT-PCR法检测基因敲减或过表达效率 |
| 2.8 CCK8 检测细胞活力及增值能力 |
| 2.9 生长曲线法检测细胞生长能力的变化 |
| 2.10 划痕实验检测细胞迁移能力的变化 |
| 2.11 Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力的变化 |
| 2.12 管状形成实验检测细胞VM形成能力 |
| 2.13 转录组测序分析寻找差异基因 |
| 2.14 CHX试验检测蛋白稳定性 |
| 2.15 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.16 细胞免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.17 HE染色 |
| 2.18 免疫组化染色 |
| 2.19 CD34-PAS双染鉴定VM结构 |
| 2.20 Co-immunoprecipitation检测蛋白相互作用 |
| 2.21 GST-pull down检测蛋白相互作用 |
| 2.22 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.肝癌细胞Regorafenib耐药后迁移侵袭及VM形成能力增强 |
| 1.1 MHCC-97H/Rego耐药细胞株的筛选及鉴定 |
| 1.2 MHCC-97H细胞Regorafenib耐药后增殖能力增强 |
| 1.3 MHCC-97H细胞Regorafenib耐药后迁移侵袭能力增强 |
| 1.4 肝癌细胞Regorafenib耐药后VM形成能力增强 |
| 1.5 肝癌细胞Regorafenib耐药后EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 2.CD90 在肝癌Regorafenib耐药细胞中高表达 |
| 2.1 转录组测序分析肝癌细胞Regorafenib耐药后CD90 高表达 |
| 2.2 mRNA及蛋白水平验证肝癌细胞Regorafenib耐药后CD90 表达上调 |
| 3.肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤组织中VM结构增多且EMT及 VM相关蛋白发生改变 |
| 3.1 肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤增殖能力增强 |
| 3.2 肝癌细胞Regorafenib耐药使肿瘤组织中EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 3.3 肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤组织中VM结构增多 |
| 4.CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭、VM形成及体内转移能力 |
| 4.1 CD90 敲减不影响肝癌Regorafenib耐药细胞的增殖能力 |
| 4.2 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭能力 |
| 4.3 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的VM形成能力 |
| 4.4 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 4.5 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的体内转移能力 |
| 4.6 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的体内EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 5.CD90 调节Pin1 影响肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.1 CD90 调节Regorafenib耐药细胞中Pin1 表达 |
| 5.2 Pin1 敲减抑制了肝癌Regorafenib耐药细胞的VM形成能力 |
| 5.3 Pin1 过表达使肝癌细胞形态发生改变 |
| 5.4 Pin1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.5 Pin1 过表达使肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 6.Pin1 上调Gli1 促进肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 6.1 肝癌临床标本中Gli1与Pin1 蛋白表达正相关 |
| 6.2 Pin1与Gli1 相互作用 |
| 6.3 Pin1 调控Gli1 蛋白稳定性 |
| 6.4 Gli1 敲减抑制Flag-Pin1 细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.Dasatinib可逆转肝癌Regorafenib耐药 |
| 7.1 Dasatinib对肝癌Regorafenib耐药细胞活力的影响 |
| 7.2 Dasatinib抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.3 Dasatinib抑制肝癌Regorafenib耐药细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞癌中VM形成的主要机制及靶向治疗 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）G蛋白偶联受体激酶3（GRK3）调控胃癌发生及腹膜转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:GRK3在胃癌及腹膜转移肿瘤细胞中表达水平升高 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病人资料 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 裸鼠 |
| 2.1.4 主要试剂及药物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 引物序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 胃癌组织芯片制作 |
| 2.2.2 免疫组化实验 |
| 2.2.3 免疫组化染色结果评分及ROC曲线 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 cDNA反转录实验 |
| 2.2.6 实时定量PCR |
| 2.2.7 胃癌病人腹水细胞富集 |
| 2.2.8 PDX模型的建立 |
| 2.2.9 腹水细胞石蜡包埋 |
| 2.2.10 蛋白提取及定量 |
| 2.2.11 Western Blot实验 |
| 2.2.12 免疫荧光 |
| 2.2.13 数据库分析KM-plot |
| 2.2.14 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 GRK3在胃癌组织中高表达且与高侵袭性胃癌表型和不良预后相关 |
| 3.2 GRK3表达上调与胃癌腹膜转移相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:GRK3促进胃癌细胞增殖、迁移以及靶向抑制剂的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病人资料 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 SCID小鼠 |
| 2.1.4 主要试剂及药物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 引物序列 |
| 2.1.7 相关载体序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.0 腹水肿瘤细胞原代培养 |
| 2.2.1 质粒转化 |
| 2.2.2 生产病毒 |
| 2.2.3 细胞系转染 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 cDNA反转录实验 |
| 2.2.6 实时定量PCR |
| 2.2.7 蛋白提取及定量 |
| 2.2.8 Western Blot实验 |
| 2.2.9 细胞培养 |
| 2.2.10 细胞增殖实验(MTS实验) |
| 2.2.11 集落形成实验 |
| 2.2.12 细胞迁移实验(Transwell实验) |
| 2.2.13 小鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.14 免疫荧光实验 |
| 2.2.15 抑制剂筛选 |
| 2.2.16 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 GRK3在胃癌细胞系中表达情况 |
| 3.2 敲除或过表达GRK3影响腹水肿瘤细胞增殖 |
| 3.3 GRK3小分子抑制药物抑制肿瘤细胞功能 |
| 3.4 GRK3抑制剂抑制小鼠皮下肿瘤生长 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:GRK3通过调控YAP1促进胃癌腹膜转移 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及药物 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA反转录实验 |
| 2.2.4 实时定量PCR |
| 2.2.5 蛋白提取及定量 |
| 2.2.6 Western Blot实验 |
| 2.2.7 细胞增殖实验(MTS实验) |
| 2.2.8 肿瘤球形成实验 |
| 2.2.9 免疫组化实验 |
| 2.2.10 免疫组化染色结果评分及ROC曲线 |
| 2.2.11 流式细胞术 |
| 2.2.12 RPPA实验 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 胃癌细胞中GRK3与YAP1表达相关 |
| 3.2 GRK3调节YAP1及Hippo/YAP1通路下游基因 |
| 3.3 GRK3通过调控YAP1从而调节肿瘤细胞干细胞特性 |
| 3.4 GRK3通过调节YAP1来影响肿瘤功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 G蛋白偶联受体激酶在肿瘤发生和癌症进展中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 FOXD3 蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:FOXD3在肺癌骨转移细胞及肿瘤干细胞中表达状况研究 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章:FOXD3对肺癌相关恶性生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章:FOXD3调控肺癌干细胞的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 乙酰化依赖的 SCF-β-TRCP1 功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响的相关机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:乙酰化修饰系统参与β-TRCP1功能调节相关研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 β-TRCP1乙酰化修饰对结直肠癌恶性生物学功能影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 β-TRCP1 对去乙酰化酶SIRT1 反馈调节机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 FOX 蛋白家族在恶性肿瘤调控中的作用 |
| 综述二 SKP1-cullin-1-F-box-protein(SCF)E3 泛素连接酶复合体中 F-box 蛋白在肿瘤发生过程中作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一章 综述 |
| 1.1 蛋白质互作概况 |
| 1.1.1 蛋白质互作研究意义 |
| 1.1.2 酵母双杂交的发现及原理 |
| 1.1.3 酵母双杂交的应用 |
| 1.2 选择性剪接概述 |
| 1.2.1 选择性剪接的定义 |
| 1.2.2 选择性剪接的类型 |
| 1.2.3 选择性剪接异构体的定义 |
| 1.3 细胞程序性死亡概述 |
| 1.3.1 细胞程序性死亡简介 |
| 1.3.2 DAD基因研究进展 |
| 1.4 棉花概述 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 陆地棉DAD基因不同转录本诱饵载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 实验用药品和试剂 |
| 2.1.4 实验用主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验用主要溶液、培养基配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉栽培种叶片总RNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA的完整度、浓度以及纯度检测 |
| 2.2.3 RNA反转录为cDNA |
| 2.2.4 DAD基因转录本Dt1,Dt2,At的引物设计 |
| 2.2.5 DAD基因3 个转录本CDS全长的PCR扩增 |
| 2.2.6 DAD基因3个转录本的纯化回收 |
| 2.2.7 DAD基因3 个转录本连接T-Vector pMD19(Simple) |
| 2.2.8 Dt1-T、Dt2-T、At-T连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.2.9 菌液PCR检测及测序验证 |
| 2.2.10 重组质粒Dt1-T、Dt2-T、At-T质粒的提取 |
| 2.2.11 陆地棉DAD基因转录本Dt1、Dt2、At诱饵载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 陆地棉总RNA提取 |
| 2.3.2 DAD基因3 个转录本Dt1、Dt2和AtCDS全长的PCR扩增及测序结果 |
| 2.3.3 转录本Dt1、Dt2和At的克隆结果分析 |
| 2.3.4 Dt1-T、Dt2-T、At-T质粒的提取及鉴定 |
| 2.3.5 Dt1、Dt2和At诱饵载体的构建及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 陆地棉酵母双杂交cDNA表达文库构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株和载体 |
| 3.1.3 实验用主要试剂 |
| 3.1.4 实验用主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 陆地棉混合样品总RNA的提取与检测 |
| 3.2.2 陆地棉混合样品cDNA表达文库构建 |
| 3.2.2.1 cDNA的合成 |
| 3.2.2.2 均一化处理及合成cDNA |
| 3.2.2.3 均一化cDNA的纯化、酶切处理及去除短片段 |
| 3.2.2.4 初级cDNA表达文库的构建、库容及插入片段检测 |
| 3.2.2.5 初级cDNA表达文库的百万克隆扩增及质粒提取 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 陆地棉混合样品总RNA质量及完整度检测 |
| 3.3.2 全长双链cDNA的合成结果检测 |
| 3.3.3 全长双链cDNA的均一化处理检测 |
| 3.3.4 均一化后dscDNA的纯化、酶切及过柱去除短片段检测 |
| 3.3.5 初级表达文库的库容计算、插入片段检测 |
| 3.3.6 96克隆测序结果 |
| 3.3.7 初级表达文库的百万克隆扩增及质粒提取结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 利用酵母双杂交文库初筛DAD的互作蛋白 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与载体 |
| 4.1.2 实验用主要药品和试剂 |
| 4.1.3 实验用主要仪器设备 |
| 4.1.4 实验用主要溶液及酵母培养基配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 目的基因诱饵质粒和pGADT7-文库质粒共转化酵母感受态细胞 |
| 4.2.2 阳性克隆鉴定及测序验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 共转化效率计算 |
| 4.3.2 阳性克隆的初步显色筛选 |
| 4.3.3 Dt1阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.4 Dt2阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.5 At阳性克隆生物学功能分析 |
| 4.3.6 Dt1、Dt2、At阳性克隆的蛋白质三级结构预测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（6）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）环形泰勒虫裂殖体与宿主细胞互作分子的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原的形态 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 蛋白质相互作用研究 |
| 1.4.1 GST-pulldown |
| 1.4.2 免疫共沉淀 |
| 1.4.3 Far-Westernblot |
| 1.4.4 双分子荧光互补实验 |
| 1.4.5 酵母双杂交 |
| 1.4.6 蛋白质芯片 |
| 1.4.7 串联亲和纯化 |
| 1.5 环形泰勒虫组学研究 |
| 1.6 环形泰勒虫裂殖体阶段蛋白的研究现状 |
| 1.6.1 环形泰勒虫表面蛋白(T.annulatasurfaceprotein,TaSP) |
| 1.6.2 环形泰勒虫分泌蛋白(T.annulatasecretoryprotein,TaSE) |
| 1.6.3 糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-anchoredprotein,gp34) |
| 1.6.4 环形泰勒虫AT-hook结合蛋白(Ta.AT-HooKbindingprotein,TashATfamily) |
| 1.6.5 亚端粒编码的可变分泌蛋白(subtelomere-encodedvariablesecretedprotein,SVSPs) |
| 1.6.6 环形泰勒虫裂殖体主要表面蛋白P104 |
| 1.6.7 热休克蛋白90(Heat-shockprotein90,HSP90) |
| 1.6.8 环形泰勒虫肽酰脯氨酰异构酶PIN1(T.annulatapeptidyl-prolylisomerasePIN1,TaPIN1) |
| 1.7 环形泰勒虫参与的信号通路 |
| 1.7.1 NF-κB信号通路 |
| 1.7.2 JNK信号通路 |
| 1.7.3 PI3-K/AKT信号通路 |
| 1.7.4 Notch信号通路 |
| 1.7.5 c-Myc介导的信号通路 |
| 1.8 .研究展望 |
| 1.9 研究意义 |
| 第二章 环形泰勒虫7种转化相关基因的克隆表达及抗体制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TaNM1细胞的培养 |
| 2.2.2 TaNM1细胞TotalRNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 pET30a重组表达载体的构建 |
| 2.2.6 目的蛋白的表达鉴定及纯化 |
| 2.2.7 兔源抗体的制备 |
| 2.2.8 兔源抗体的纯化 |
| 2.2.9 亚细胞定位 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 7种转化相关基因的信号肽及跨膜区预测 |
| 2.3.2 重组质粒的构建及目的蛋白的表达纯化 |
| 2.3.3 兔源抗体的纯化及鉴定 |
| 2.3.4 亚细胞定位 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 牛B淋巴细胞酵母文库构建及诱饵蛋白的自激活性和毒性验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 健康牛PBMCs的分离 |
| 3.2.2 B淋巴细胞的分离及鉴定 |
| 3.2.2.1 B淋巴细胞的磁性标记 |
| 3.2.2.2 B淋巴细胞的磁性分离 |
| 3.2.3 诱饵质粒的构建 |
| 3.2.4 质粒的提取 |
| 3.2.5 诱饵质粒自激活性和毒性验证 |
| 3.2.5.1 Y2HGold酵母感受态细胞的制备 |
| 3.2.5.2 质粒的转化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛B淋巴细胞的分离与鉴定 |
| 3.3.2 酵母文库质量鉴定 |
| 3.3.3 诱饵质粒的构建 |
| 3.3.4 诱饵质粒的自激活性及毒性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 TACP与牛B淋巴细胞相互作分子的筛选 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 TaCP蛋白结构功能分析 |
| 4.2.2 诱饵质粒转化效率的鉴定 |
| 4.2.3 诱饵质粒在Y2HGold细胞中的表达鉴定 |
| 4.2.4 TaCP的酵母双杂交筛选 |
| 4.2.4.1 Y2HGold酵母感受态细胞的制备 |
| 4.2.4.2 酵母双杂交筛选 |
| 4.2.5 诱饵质粒与文库质粒的相互作用鉴定 |
| 4.2.5.1 酵母质粒的提取 |
| 4.2.5.2 文库质粒的PCR鉴定 |
| 4.2.5.3 诱饵质粒与文库质粒的共转化 |
| 4.2.6 相互作用分子序列分析及功能预测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TaCP蛋白结构功能分析 |
| 4.3.2 诱饵质粒转化子鉴定 |
| 4.3.3 诱饵蛋白的表达鉴定 |
| 4.3.4 相互作用分子的鉴定 |
| 4.3.5 相互作用分子序列分析及功能预测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 TACYP1与宿主细胞互作分子的筛选及功能鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Tayp1蛋白结构功能分析 |
| 5.2.2 诱饵质粒在Y2HGold细胞中的表达鉴定 |
| 5.2.3 TaCP的酵母双杂交筛选 |
| 5.2.4 诱饵质粒与文库质粒的相互作用鉴定 |
| 5.2.5 相互作用分子序列分析及功能预测 |
| 5.2.6 TaNM1细胞的培养 |
| 5.2.7 GST-pulldown验证 |
| 5.2.7.1 蛋白原核表达 |
| 5.2.7.2 GST-pulldown |
| 5.2.8 siRNA转TaNM1细胞条件的摸索 |
| 5.2.9 siRNA干扰效率的检测 |
| 5.2.10 BW720C药物处理及RNAi实验 |
| 5.2.11 RT-qPCR及Westernblot检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 TaCyp1蛋白结构功能分析 |
| 5.3.2 诱饵蛋白的表达鉴定 |
| 5.3.3 相互作用分子的鉴定 |
| 5.3.4 相互作用分子序列分析及功能预测 |
| 5.3.5 GST-pulldown验证 |
| 5.3.5.1 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 5.3.5.2 GST-pulldown验证 |
| 5.3.6 siRNA转染条件的摸索 |
| 5.3.7 siRNA干扰效率的检测 |
| 5.3.8 目的基因的RT-qPCR检测 |
| 5.3.9 NF-κB信号通路相关蛋白的表达分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 简历 |
（8）NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 NDRG2在乳腺癌耐阿霉素细胞中的低表达状态分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MCF-7/ADR细胞的培养 |
| 2.2 NDRG2过表达细胞的构建 |
| 2.3 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.4 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.5 蛋白定量检测 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCF-7/ADR细胞耐药性验证分析 |
| 3.2 NDRG2在MCF-7/ADR细胞中呈现低表达 |
| 3.3 MCF-7/ADR-NDRG2细胞的构建及验证 |
| 3.4 NDRG2促进MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蛋白定量检测 |
| 2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2过表达乳腺癌细胞的构建及验证 |
| 3.2 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的阿霉素敏感性 |
| 3.3 干涉NDRG2的表达抑制p53野生型乳腺癌细胞的阿霉素敏感性 |
| 3.4 干涉p53的表达抑制MCF-7/NDRG2细胞的阿霉素敏感性 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蛋白定量检测 |
| 2.2 间接免疫荧光 |
| 2.3 DNA同源性重组效率的检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应 |
| 3.2 NDRG2抑制p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤修复能力 |
| 3.3 NDRG2抑制p53野生型乳腺癌细胞的同源重组修复能力 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 NDRG2通过提高Bad的表达促进细胞的凋亡 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.3 蛋白定量检测 |
| 2.4 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.5 Bad siRNA的转染 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2促进促凋亡分子Bad的表达 |
| 3.2 干涉Bad的表达抑制NDRG2促进细胞凋亡过程 |
| 3.3 NDRG2不改变Bad的mRNA水平 |
| 3.4 NDRG2促进Bad的蛋白稳定性 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 NDRG2促进线粒体p53与Bad复合物的形成，抑制p53的核定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.2 蛋白定量检测 |
| 2.3 间接免疫荧光 |
| 2.4 胞核蛋白分离 |
| 2.5 线粒体分离 |
| 2.6 免疫共沉淀（Co-IP） |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2不改变p53的蛋白表达量 |
| 3.2 NDRG2抑制p53的转位入核能力 |
| 3.3 NDRG2促使p53定位于线粒体 |
| 3.4 NDRG2促使p53/Bad复合物的形成 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历与研究成果 |
| 致谢 |
（9）RNF113A在哈萨克族食管鳞癌中的作用及其功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 RNF113A在哈萨克族食管鳞癌（ESCC）中的表达及与临床表型的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 患者临床组织样本特征 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 RNF113A对食管鳞癌增殖、迁移、侵袭的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系来源 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 食管癌细胞中敲降RNF113A对体内成瘤性的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 生物信息学技术在食管癌中的临床应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）蛋白激酶Cβ/衔接蛋白氧化应激通路在实验性氟中毒中枢神经系统损伤中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文略缩词表 |
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
四、癌基因MDM2与异构酶PIN1的交互作用（论文参考文献）
- [1]基于生物信息学和网络药理学整合策略的人参平肺散干预特发性肺纤维化的机制研究[D]. 杨斓. 南京中医药大学, 2021
- [2]Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究[D]. 张楠. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]G蛋白偶联受体激酶3（GRK3）调控胃癌发生及腹膜转移的机制研究[D]. 李源. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究[D]. 李佳林. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [5]利用酵母双杂交文库初筛陆地棉DAD基因不同转录本的互作蛋白[D]. 徐欣. 曲阜师范大学, 2020(01)
- [6]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [7]环形泰勒虫裂殖体与宿主细胞互作分子的筛选及功能研究[D]. 赵帅阳. 中国农业科学院, 2018(01)
- [8]NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究[D]. 韦伊芳. 第四军医大学, 2017(02)
- [9]RNF113A在哈萨克族食管鳞癌中的作用及其功能研究[D]. 王磊. 新疆医科大学, 2017(08)
- [10]蛋白激酶Cβ/衔接蛋白氧化应激通路在实验性氟中毒中枢神经系统损伤中的作用[D]. 邓成敏. 贵州医科大学, 2016(02)