一、膜转运蛋白与白念珠菌抗药（论文文献综述）
于淑颖[1]（2021）在《中国多中心侵袭性感染毛孢子菌流行病学、致病力和唑类耐药机制及乙酰转移酶调控因子Gcn5对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制研究》文中研究说明背景:毛孢子菌是侵袭性感染的重要致病菌,病死率高,预后极差。唑类药物作为治疗侵袭性毛孢子菌感染的最后一道防线,耐药性已经开始发展。本研究旨在调查中国多中心侵袭性感染毛孢子菌的分子流行病学和致病力分布特征及对唑类药物的耐药机制。方法:选取2009年8月至2016年7月CHIF-NET监测网七年间43个监测中心收集的133株侵袭性感染毛孢子菌。利用基因测序分析实现菌种的准确鉴定和基因分型,按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法检测菌株的体外抗真菌药物敏感性,并试验性的建立了我国阿萨希毛孢子菌的流行病学折点（ECV）。同时评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对毛孢子菌的鉴定效能以及Sensititre YeastOne显色药敏板的检测性能。基于体外试验,对毛孢子菌的胞外酶活性分布以及生物膜的形成能力、结构和耐药性展开了调查。联合基因分型,进行聚类分析,寻找致病力分布规律。基于临床分离的多重唑类高度耐药阿萨希毛孢子菌,同时从外排泵活性、唑类耐药相关基因的测序和表达分析以及转录组测序分析,探索阿萨希毛孢子菌的唑类耐药机制。结果:中国多中心侵袭性毛孢子菌感染中,共分离到10个菌种,阿萨希毛孢子菌是主要的致病菌（81.2%）,血液是最常见的标本类型（36.8%）。利用IGS1序列,将108株阿萨希毛孢子菌分为5个型别,基因型1型（41.7%）、4型（31.5%）和3型（23.1%）是我国主要的基因型。体外药物敏感性结果显示,阿萨希毛孢子菌对两性霉素B的MIC值的总体分布高于非阿萨希毛孢子菌,GM值分别是1.36μg/ml和0.7 μg/ml。47.2%的阿萨希毛孢子菌（51/108株）对两性霉素B的MIC值≥2 μg/ml,而全部非阿萨希毛孢子菌（25株）对两性霉素B的MIC值小于1 μg/ml。25%的阿萨希毛孢子菌（27/108株）、2株T.dohaenes、1株星形毛孢子菌、1株粘质毛孢子菌和1株T.faecale对氟康唑呈现较高的MIC值（≥8 μg/ml）。伏立康唑对毛孢子菌呈现出最有效的体外抗真菌活性,GM值为0.09μg/ml。我国阿萨希毛孢子菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和泊沙康唑的ECV值分别采用16μg/ml、0.25μg/ml、1μg/ml和1μg/ml,而对两性霉素B和5-氟胞嘧啶的ECV值均采用4 μg/ml。总体来看,Bruker Biotyper对非阿萨希毛孢子菌的鉴定效能优于Vitek MS,两种系统的鉴定正确率分别为52%和32%（P=0.152）。Sensititre YeastOne药敏板对阿萨希毛孢子菌药物敏感性的检测能力与微量肉汤稀释法具有较高的一致性。毛孢子菌中至少70%以上的菌株具有DNA酶、溶血酶和酯酶活性,而产生磷脂酶、酪蛋白酶和明胶酶的比例相对较少,分别为54.1%、5.3%和59.4%。阿萨希毛孢子菌中,基因型3型菌株产生溶血酶能力较强,4型菌株分泌酯酶活性较强,而产生明胶酶能力较强的3株菌株均属于基因型1型。血流感染中,阿萨希毛孢子菌具有DNA酶、溶血酶、酪蛋白酶和明胶酶活性的菌株比例均高于非血流感染。本研究中,仅有5株菌株无法形成生物膜,包括4株阿萨希毛孢子菌和1株T.dohaense。阿萨希毛孢子菌中,生物膜形成能力中等以上的菌株百分比高达73.2%,基因型1型中生物膜形成能力弱的菌株比例（40%）高于3型（12%,P=0.015）和4型（11.8%,P=0.005）,具有统计学意义。无论生物膜形成能力的强弱,毛孢子菌的生物膜对4种唑类药物均高度耐药,MBIC50>1024 μg/ml。唑类药物耐药机制方面,临床耐药菌16G1229的外排泵活性明显增高,外源性物质转运ATP酶编码基因A1Q106164和多效性耐药型转运蛋白Pdr11编码基因PDR11,氟康唑诱导下的表达水平显着上调,FPKM值分别为367.94±14.41和339.99±16.9,可能是导致外排泵蛋白活性增加、唑类耐药发生的原因。多效性耐药型转运蛋白Pdr11中S1343T氨基酸置换可能是PDR11过表达的原因。无论是否存在氟康唑压力,ERG11基因的表达水平显着增高,可能在唑类耐药中发挥重要作用。结论:本研究阐明了中国多中心侵袭性感染毛孢子菌的分子流行病学和致病力分布特征,调查了抗真菌药物敏感性分布情况,并试验性建立了我国阿萨希毛孢子菌的流行病学折点。首次发现外排泵编码基因表达上调和EGR11的过表达,可能在阿萨希毛孢子菌的唑类耐药中发挥作用。背景:光滑念珠菌是引起侵袭性念珠菌病常见的致病菌,光滑念珠菌天然对唑类药物的敏感性降低,同时对棘白菌素的耐药性惊人地上升。Gcn5是最具代表性的赖氨酸乙酰转移酶,是真核生物转录调控所必需的物质。本研究旨在通过基因敲除,探讨GCN5对光滑念珠菌抗真菌药物敏感性和致病力的作用以及相应调控基因和通路的动态表达。方法:利用Alt-R CRISPR-Cas9系统,对光滑念珠菌ATCC 2001中的GCN5基因进行敲除和回补。通过（联合）药敏试验和连续稀释生长试验,检测GCN5缺失对光滑念珠菌抗真菌药物和压力物质敏感性的影响。利用时间-杀菌动力试验,观察米卡芬净和氟康唑对gcn5Δ的杀菌和抑菌活性,分析光滑念珠菌的耐药发生频率和功能获得性突变情况。通过Western blot分析,检测GCN5缺失对光滑念珠菌组蛋白乙酰化水平的影响。在转录水平,探索GCN5缺失对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制。THP-1巨噬细胞感染试验,观察GCN5缺失对光滑念珠菌在巨噬细胞内生存能力的影响。结果:光滑念珠菌敲除GCN5后,对棘白菌素的敏感性增加了 2-4倍,对唑类和SCY048的敏感性增加了 2倍,对FK506（4 μg/ml）+米卡芬净和APX001A的敏感性增加了 8倍以上。GCN5的缺失使棘白菌素耐药相关性FKS突变体对棘白菌素类药物和FK506的耐药性降低了 2-4倍。而联合FK506（4 μg/ml）的作用下,GCN5的缺失完全或接近完全逆转了 Fks介导的棘白菌素耐药性。GCN5的缺失显着增加了米卡芬净和氟康唑对光滑念珠菌的杀菌或抑菌活性。敲除GCN5能够降低光滑念珠菌的耐药发生频率和功能获得性突变。与WT和gcn5Δ::GCN5相比,gcn5Δ菌株H3K9和H3K14的乙酰化水平显着下降,分别约为WT菌株的0.6倍和0.45倍。GCN5调控特定的转录网络,差异表达基因在细胞粘附、细胞膜组分的生物合成、跨膜转运和跨膜转运蛋白活性方面发挥关键作用。光滑念珠菌敲除GCN5后,氟康唑压力下无法驱动跨膜转运蛋白活性、细胞壁组分和外排泵蛋白编码基因的表达。米卡芬净压力下,gcn5Δ需要调动更多的基因来维持生存,差异表达基因主要表现为表达下调,主要与细胞壁生物合成相关。gcn5△对THP细胞的杀伤作用更为敏感,GCN5的缺失显着降低了光滑念珠菌在THP细胞内的生存能力。结论:光滑念珠菌组蛋白乙酰转移酶Gcn5在抗真菌药物的敏感性、压力应激反应和致病机制中发挥关键作用。GCN5的缺失能够降低光滑念珠菌的耐药性和致病力,是潜在的抗真菌药物靶点。本研究为新型抗真菌药物的研发和真菌感染的干预提供新的思路。
王胜强[2]（2020）在《基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制》文中研究表明真菌病害严重影响农业丰产,潜在威胁食品安全和人类健康。柑橘采后储运与销售阶段易发生多种真菌病害。指状青霉（绿霉）、意大利青霉（青霉）和皮落青霉引发柑橘腐烂,导致采后损失严重,是制约柑橘产业发展的主要病原真菌。与青绿霉相比,皮落青霉宿主广泛,除柑橘外还感染多种瓜果和食品加工原料,危害更广。甾醇去甲基化酶抑制剂（DMI）类化学药物如咪鲜胺广泛用于真菌病害防控,但是抗药菌株频繁出现,药效逐渐下降。皮落青霉咪鲜胺抗性显着高于青绿霉菌,相对低抗菌株少。青绿霉咪鲜胺抗性机制已有比较转录组学研究,但皮落青霉由于缺乏抗性合适的对照菌株而未见报道。真菌病毒普遍存在于柑橘青绿霉菌,导致宿主毒力或抗药性下降,即产生弱毒或“药物条件弱毒”菌株。染毒真菌抗性降低可作为抗药机制研究的必要材料。研究皮落青霉病毒及其对宿主的抗药调控,为真菌病毒研究提供新资料,有助于深入认识青霉属病原真菌抗药机制和药物条件弱毒机制。本研究以两株咪鲜胺抗性水平显着差异的皮落青霉高抗菌株（CQ1和CQ15）为材料,运用转录组结合RT-qPCR解析咪鲜胺抗性基因及其作用机制。分离鉴定皮落青霉病毒并研究其对宿主真菌咪鲜胺抗性的影响。构建皮落青霉人工染毒菌株CQ1V。进一步运用转录组结合RT-qPCR 比较CQ1V、CQ1以及病毒自然宿主CQ15在咪鲜胺施药下的基因转录模式,鉴定病毒参与宿主抗药调控的靶基因及其功能。获得下列主要研究结果。1.转录组解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制以咪鲜胺抗性差异显着的皮落青霉菌CQ1和CQ15为材料,转录组测序与生物信息学解析咪鲜胺抗性基因及其综合代谢背景。根据两者基因表达模式差异,运用COG、KOG、GO和KEGG数据库富集分类技术,筛选获得皮落青霉抗药基因包括CYP51靶标酶基因、MFS和ABC药泵蛋白基因、细胞色素b5基因、甾醇生物合成关键酶基因（ERG3、ERG4、ERG5、ERG11、ERG24和ERG27）、脂肪酸代谢关键酶基因、细胞壁多糖代谢基因、GSH抗氧化损伤相关酶基因以及细胞呼吸、氧化磷酸化关键酶基因。RT-qPCR验证了上述DEG的差异表达模式。证明皮落青霉咪鲜胺抗性机制不仅包括P450、药泵蛋白等传统靶标基因,还涉及以细胞膜抗逆反应如GSH抗氧化损伤为中心的碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢调控。为生物学功能实验深入研究青霉属病原真菌DMI抗性机制提供了重要的线索。2.皮落青霉病毒分离、鉴定与咪鲜胺抗性调控作用从咪鲜胺抗性相对较低的皮落青霉菌CQ15中分离获得一株双链（ds）RNA病毒,运用高通量测序结合随机引物PCR克隆了全部四个节段的病毒基因组dsRNA。病毒基因组包括四个节段（dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3和dsRNA4）,全长依次为 3600、3177、3078 和 2808 bp。它们各自包含一个开放阅读框,依次编码依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp,含1113个氨基酸残基）、衣壳蛋白（CP,含981个氨基酸残基）和两个未定功能的蛋白质（分别包含912和847个氨基酸残基）。根据RdRp序列同源比对结果构建分子进化树证明该病毒属于产黄病毒科和产黄病毒属,命名为Penicillium crustosum chrysovirus 1（PcCV1）。这是第一例皮落青霉dsRNA病毒,为产黄科病毒家族增加了新成员。制备CQ15的PcCV1脱毒株CQ15C,证明CQ15C咪鲜胺抗性（EC50=4.6±0.3 mg·L-1）高于CQ15（EC50=2.5±0.4mg·L-1）。构建了皮落青霉人工染毒株 CQ1V,证明 CQ1V 咪鲜胺抗性（EC50=5.9±0.6 mg·L-1）低于 CQ1（10.5±1.9 mg·L-1）。表明PcCV1导致宿主真菌药物条件弱毒,即病毒感染可以增强咪鲜胺对皮落青霉的防控效率。3.转录组解析皮落青霉病毒调控宿主咪鲜胺抗性机制运用转录组测序与生物信息学解析CQ1V与未染毒亲本CQ1咪鲜胺处理条件下的基因表达模式,比较了 CQ1V和病毒自然宿主CQ15施药条件下的基因表达模式以及不施药条件下抗性基因的本底表达模式。根据基因表达模式差异,运用COG、KOG、GO和KEGG富集分类技术结合RT-qPCR证明PcCV1具有抑制咪鲜胺对皮落青霉抗药基因的诱导作用,即削弱了宿主对药物胁迫的适应能力。药物诱导作用被病毒削弱的抗性基因包括CYP51靶标酶、MFS和ABC药泵蛋白、细胞色素b5、甾醇生物合成关键酶以及细胞膜抗逆相关碳、氮、脂、氧化磷酸化综合代谢酶及转运蛋白基因。证明PcCV1通过调控宿主的咪鲜胺抗性基因而导致药物条件弱毒。综上所述,本研究采用转录组结合真菌病毒解析皮落青霉咪鲜胺抗性机制,在综合代谢层面揭示了皮落青霉普遍高抗的分子机制,为深入认识青霉属病原真菌抗药机制以及真菌病毒参与抗药调控提供了新的转录组证据,为新靶标真菌药物设计提供必要的理论依据。
邓稀仁[3]（2018）在《白念珠菌耐药基因的筛选》文中指出目的:收集、分离和纯化江西地区白念珠菌临床菌株,监测白念珠菌对临床常用的氟康唑（Fluconazole,FLU）、伊曲康唑（Itraconazole,ITR）、酮康唑（Ketoconazole,KETO）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine,5-FC）和两性霉素B（Amphotericin B,Am B）等5种抗真菌药物的敏感性,获得主要流行型别中的耐药菌株,也为临床白念珠菌感染诊治提供一定的依据。通过RNA-seq技术获得耐药菌株5508（对FLU、ITR、KETO和5-FC耐药）在5-FC、ITR和5-FC联用ITR药物处理下分别对比无药处理的差异表达基因,进一步采用融合PCR介导的LEU-HIS-ARG基因敲除策略、Spot assay和生长曲线实验等探讨差异表达基因（QDR1基因）与白念珠菌耐药性的关系,为下一步探索白念珠菌耐药机制奠定基础。方法:1.收集、分离和纯化临床菌株,利用CHROMagar显色培养基和多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,M-PCR）鉴定法对念珠菌临床标本进行鉴定,获得白念珠菌临床菌株;2.依照美国临床试验标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）推荐的《酵母微量稀释抗真菌药物敏感性试验参考方法第三版》（M27-A3）指南对随机挑选的116株白念珠菌对FLU、ITR、KETO、Am B和5-FC这5种临床常用抗真菌药物敏感性进行检测;3.利用随机扩增多态性（Random Amplified Polymorphic,RAPD）对随机挑选的116株白色念珠菌进行基因分型,并使用NTsys 2.10e软件按照相似系数为0.75对RAPD分型结果进行聚类分析;4.通过液氮研磨-Trizol法提取耐药白念珠菌5508在不同药物处理及无药处理下的总RNA,并进行RNA质量验证,利用RNA-seq测序技术进行m RNA测序,获得各实验组差异表达基因,并通过生物信息学分析差异表达基因,挖掘出耐药相关基因;5.通过融合PCR介导的LEU-HIS-ARG基因敲除策略构建基因缺失突变株,以及通过体外抗真菌药物敏感性实验、生长动力学实验、Spot Assay等初步探讨目的基因与白念珠菌耐药性的关系。结果:1.本研究共分离、纯化和鉴定出751株念珠菌,按照菌种分布分析发现白念珠菌260株（34.62%）、克柔念珠菌230株（30.63%）、光滑念珠菌122株（16.25%）、热带念珠菌133株（17.71%）和其他念珠菌6株（0.80%）;按照标本来源分析发现来自痰液的有247株（32.89%）,来自粪便的有170株（22.64%）,来自分泌物的有157株（20.91%）,来自尿液的有72株（9.59%）,来自血液的有69株（9.19%）,采集自其他部位的有36株（4.79%）。2.116株白念珠菌对FLU、ITR、KETO、5-FC和Am B这5种抗真菌药物的耐药率分别为3.45%、4.31%、1.72%、0.86%和0.00%,发现一株多药耐药菌株5508（对FLU、ITR、KETO和5-FC耐药）;按照相似系数为0.75将随机挑选的116株临床白念珠菌分为了10类,其中Ⅰ类59株（50.86%）,Ⅱ类17株（14.66%）,Ⅲ类14株（12.07%）,Ⅳ类9株（0.78%）,Ⅴ类5株（0.43%）,Ⅵ类和Ⅶ类各4株（0.34%）,Ⅷ类3株（0.26%）,Ⅸ类和Ⅹ类各1株（0.07%）。ATCC90028和5508被分在了Ⅰ类。前期发现的白念珠菌耐药菌株大多分在Ⅰ类,包括多药耐药菌株5508,但17515这株菌（对ITR和KETO耐药）却被分在了Ⅲ类。3.对RNA-seq结果进行基因差异表达分析发现:（1）无药处理组和5-FC处理组（N vs C）对比,有7个差异表达的基因,其中有3个基因表达上调,4个基因表达下调;（2）无药处理组与ITR处理组（N vs I）对比发现了371个差异表达基因（301个基因表达上调,70个基因表达下调）;（3）无药处理组与5-FC联用ITR处理组（N vs L）对比分析筛选到367个差异表达基因（290个基因表达上调,77个基因表达下调）。（4）将所有的差异基因汇总去重后共获得407个基因（详见附录1）,其中表达上调的基因有318个（新发现269个可能与白念珠菌耐药相关的基因,如ERG5、ERG7、ERG9、QDR1和POT1等）,表达下调的基因有89个（新发现74个可能与白念珠菌耐药相关的基因,如NAG3、NAG4、SOD1和SOD2等）;4.对上述差异基因进行GO（Gene Ontology）分析发现:（1）N vs C组与其他两组不同,该组GO分类主要在生物学过程（Biological Process,BP）和基因的分子功能（Molecular Function,MF）有分布,在BP分类中,主要涉及到细胞进程（Cell process）、代谢过程（Metabolic process）、单组织过程（Single-organism process）、多组织过程（Multi-organism process）和刺激反应（Response to stimulate）,并且下调基因多于上调基因;在MF分类中,差异基因主要分布在结合活动（Binding）;提示经5-FC处理后菌细胞成分和代谢活动有所改变;（2）N vs I和N vs L分类结果大致相同,但与N vs C组不同的是,这两组的上调基因多于下调基因,在BP分类中,单组织过程（Single-organism process）、代谢过程（Metabolic process）和细胞进程（Cell process）为最多的3级GO功能类别;在细胞的组件作用（Cellular Component,CC）分类中,分布最多的分类为细胞（Cell）、细胞组件（Cell part）、细胞膜（Membrane）和细胞膜组件（Membrane part）;在MF分类中,催化活动（Catalytic activity）和结合活动（Binding）分布最多;提示耐药菌株5508经ITR处理后菌细胞内成分和膜成分发生了变化。5.差异基因的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析发现:（1）N vs C组有一个基因PUT1富集到精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine and proline metabolism）这一条代谢途径;（2）N vs I组差异基因主要富集到类固醇生物合成（Steroid biosynthesis,包括ERG2、ERG5、ERG6、ERG7、ERG9、ERG24、ERG25、ERG26和ERG27,其中ERG5、ERG7、ERG9、ERG25、ERG26和ERG27为新发现的可能的耐药相关基因）、过氧化物酶体（Peroxisome,包括SOD1、SOD2、SOD3、PXP2、CAT1、CTN3、FAA22、IDP2、POX1、POT1、PEX6和ECI1基因,其中SOD3、PXP2、CTN3、FAA22、IDP2、POX1、POT1、PEX6和ECI1为新发现的可能的耐药相关基因）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、ABC转运蛋白家族（ATP-binding Cassette transporters,SNQ2基因为新发现的可能的耐药相关基因）、MFS转运蛋白家族（Major facilitator superfamily transporters,QDR1基因为新发现的可能的耐药相关基因）;（3）N vs L组与N vs I组几乎相同,但N vs L组还富集到了磷脂酶D信号通路（Phospholipase D signaling pathway）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、催产素信号通路（Oxytocin signaling pathway）和粘附连接通路（Adherens junction）等通路中。6.对白念珠菌QDR1两条等位基因分别进行敲除发现,该基因缺失对白念珠菌对ITR和KRTO的耐药性有一定影响,但不影响白念珠菌的生长。结论:1.白念珠菌仍为临床上念珠菌感染最主要的菌种,且非白念珠菌感染有上升的趋势;白念珠菌总体耐药率稳定。2.通过转录组测序分析,筛选到一些新的可能与白念珠菌耐药相关的基因,如ERG5、ERG7、ERG9、ERG25、ERG26、ERG27、SOD3、PXP2、CTN3、FAA22、IDP2、POX1、POT1、PEX6、ECI1、SNQ2和QDR1等,涉及到的通路主要有类固醇生物合成、过氧化物酶体、ABC转运蛋白和MFS转运蛋白等。3.白念珠菌QDR1基因对ITR和KETO的耐药有一定关系。
李德东,管少兴,胡静,单文治,刘屏,孙艳[4]（2016）在《1970–2015年白念珠菌耐药机制的文献计量分析》文中指出目的:利用文献计量学的方法对白念珠菌耐药机制的相关文献进行统计分析,增强人们对白念珠菌耐药机制的全面认识。方法:检索PubMed、Embase、SCI和CNKI数据库,对白念珠菌耐药机制的相关文献进行汇总,对纳入研究的文献年份分布、作者、语种、文献类型、药物类型、耐药机制分类等进行统计分析。结果:共纳入相关文献726篇,文献数量自20世纪90年代以来呈逐年递增趋势。从文献发表语种和作者来看,英文文献数量最多（466篇）,同时中文文献近年来增长迅速（197篇）,国内相关研究整体水平偏低但也不乏亮点。所纳入文献中研究涉及最多的药物是唑类药物（357篇）,其中以氟康唑耐药机制相关的文献数量为最多（236篇）。关于耐药机制的研究主要集中在药物外排泵表达变化及药物作用靶酶结构变异或含量变化等方面。结论:唑类药物耐药仍是白念珠菌耐药研究领域的重点,其主要的耐药机制是药物外排泵的表达增加和药物作用靶酶结构变异或含量增加。
徐宁[5]（2014）在《白念珠菌铁稳态系统相关基因的功能研究》文中研究表明白念珠菌是人体最常见的一种条件致病性真菌,能够以共生和致病两种状态存在于宿主微环境内。通常情况下,白念珠菌广泛存在于自然界及人体皮肤、口腔、生殖道及胃肠道粘膜表面,当机体免疫机能下降或正常寄居部位微生境失调时,容易引起浅层皮肤粘膜感染或者侵袭性感染,甚至危及生命。随着白念珠菌比较基因组学和功能基因组学的快速发展,对白念珠菌的致病机理和耐药机制的研究取得了较大进展,鉴定和阐述了多个重要毒力决定因素,包括酵母型-菌丝型形态转换、white-opaque形态转换、对宿主细胞的粘附和侵袭、胞外水解酶的分泌、生物膜的形成、pH感应和调控能力、接触感应、向触性生长和环境压力应答能力等,其中许多细胞应答过程与胞内铁稳态密切相关。铁是绝大部分生物体必需的基本营养元素,能够作为调控信号刺激生物体对外界环境作出应答。一方面,从外环境中摄取铁的能力是白念珠菌在宿主中定殖、存活和致病过程的重要影响因素；另一方面,胞内过量铁离子也容易通过芬顿反应,产生氧自由基等活性氧簇,对细胞产生毒害作用。因此,白念珠菌逐渐进化出一系列严谨的铁离子获得、储存、转运和调控系统来维持胞内铁稳态,避免铁离子浓度波动对细胞产生损伤。近年来,关于白念珠菌胞外铁离子获得系统的研究取得了较大的进展,许多铁离子获得相关基因的生物学功能已逐渐得到阐释,但是白念珠菌胞内铁离子储存转运系统的研究仍处于空白阶段。此外,尽管本实验室前期研究发现Aft2转录因子具有潜在的铁应答调控效应,但对其调控机理及参与的代谢过程尚不清楚。本研究针对以上几个问题,鉴定并阐释了白念珠菌胞内铁离子储存转运系统和Aft2转录因子介导的铁应答调控系统,同时探究其在白念珠菌压力应答、形态发生和致病过程中的重要作用,为临床上治疗白念珠菌感染和新型抗真菌药物开发提供重要的参考价值。本研究主要结果如下：（1）采用生物信息学和分子细胞生物学方法,在白念珠菌基因组数据库中检索并鉴定出线粒体膜转运蛋白Mrs4、液泡膜转运蛋白Ccc1和液泡膜转运蛋白Smf3。研究发现,Mrs4蛋白属于线粒体转运蛋白家族成员,定位于线粒体膜上,在维持线粒体形态结构及调节线粒体铁转运方面中发挥着重要作用。Ccc1蛋白主要负责向液泡中转运铁,而Smf3蛋白主要负责将液泡中储存铁释放到胞质中。三种转运蛋白能够形成Mrs4-Ccc1-Smf3（MCS）途径,协同调控白念珠菌胞内铁离子的分配和转运,在胞内铁应答和利用等代谢过程中发挥着重要作用。（2）采用PCR介导的同源重组技术,分别构建了mrs4Δ/Δ、ccc1Δ/Δ、smf3Δ/Δ单基因缺失菌株和mrs4Δ/Δsm/3Δ/Δ、mrs4A/AccclΔ/Δ双基因缺失菌株。研究发现,MRS4基因的缺失会扰乱白念珠菌胞内铁离子稳态,提高细胞膜铁获得相关基因的表达水平,降低线粒体铁利用相关基因的表达水平,从而增强细胞从胞外环境中获得铁的能力,并最终导致胞内铁含量水平的升高。在,nrs4A/A缺失菌株基础上进一步敲除液泡铁转出蛋白Smf3后,会进一步加重胞内铁含量水平的积累,而在mrs4A/A缺失菌株基础上进一步敲除液泡铁转入蛋白Ccc1后,能显着降低胞内铁含量水平,使其恢复至野生型水平。此外,MCS途径在白念珠菌适应性生长、低铁和高铁应答、离子稳态、氧化胁迫、线粒体呼吸、铁硫簇合成、mtDNA稳定性、线粒体膜电势稳定性、细胞壁完整性、抗真菌药物耐受性、形态转换、上皮细胞粘附侵染和毒力等细胞过程中发挥着重要作用。上述结果提示,MCS途径能维持胞内铁离子的稳态,可能作用机理：MCS途径协同调控胞内铁稳态过程,Mrs4负责向线粒体中转入铁以供细胞利用,Ccc1负责向液泡中转入铁以供细胞储存,而Smf3负责将液泡中铁活化释放至胞质中。胞内铁稳态的破坏会严重削弱菌株应答外界环境信号的能力,并导致线粒体功能的失调,从而引发一系列的相互作用的损伤,影响许多重要的细胞过程,如细胞壁完整性、抗真菌药物耐受性、形态发生和毒力等。（3）白念珠菌Aft2转录因子在维持胞内铁稳态过程中具有重要作用。采用原子吸收光谱技术研究发现,AFT2基因的缺失会降低菌株在低铁条件下胞内铁含量水平。Real-Time PCR结果显示,Aft2是一种低铁应答转录因子,具有双重调控作用,既能作为转录激活因子促进FTR1、FET3、FRP1、CFL1和FET34等铁代谢基因表达,也能作为转录抑制因子阻遏MRS4、SIT1、SMF3和HAP43等铁代谢基因的表达。通过定点突变技术和构建LacZ报告质粒方法,研究发现Aft2转录因子能够以基因剂量依赖的方式,通过CACCC保守应答元件负向调控MRS4铁应答基因的表达,从分子水平上初步揭示了Aft2转录因子调控铁代谢基因表达的可能机理。蛋白定位实验表明,在低铁条件下,白念珠菌Aft2转录因子能够从胞浆转运至细胞核内,从细胞水平上提供了Aft2转录因子参与铁代谢基因表达调控的又一证据。（4）除参与调控铁稳态过程外,白念珠菌Aft2转录因子在环境压力应答及形态发生过程中也发挥着重要作用。研究发现,Aft2转录因子以非铁依赖性机制参与氧化压力应答过程。在氧化压力条件下,AFT2基因的缺失导致胞内ROS的聚集,并诱导SOD酶活性,提示生长缺陷可能是由于胞内ROS过度聚集而无法有效清除造成的。采用絮凝实验、疏水性测定以及粘附能力测定实验,发现AFT2基因的缺失影响白念珠菌细胞表面特性,不仅会引起菌株絮凝能力的增强,同时也增强菌株细胞表面的疏水性以及对聚苯乙烯等材料的吸附能力。菌丝诱导实验表明,Aft2转录因子既能作为正向调控因子参与固体诱导条件下的琼脂侵入和形态发生过程,也能作为负向调控因子参与液体诱导条件下的形态发生过程。菌丝诱导信号能够上调白念珠菌AFT2基因mRNA和蛋白表达水平,也能引起Aft2蛋白细胞学定位的改变,使其细胞质中被转运至细胞核内并聚集,为发挥调控作用提供必要条件。在嵌入应答过程中,Aft2转录因子主要作为Czfl途径的下游组分参与激活应答过程,Efg1主要作为负向调控因子抑制Czfl和Aft2的激活活性。免疫共沉淀实验揭示,在YPD正常条件下,Efg1蛋白和Czfl蛋白都能和Aft2蛋白具有物理性相互作用,当诱导信号出现时,Czfl与Aft2蛋白仍然保持相互作用而Efg1与Aft2蛋白间相互作用出现解离。在white-opaque形态转换过程中,Czf1途径可能并不完全依赖于Aft2转录因子,CZF1基因的过表达在一定程度上能够绕开Aft2转录因子,参与未知下游组分的激活,从而促进opaque细胞的形成。本研究发现和鉴定的MCS途径和Aft2转录因子都是重要的毒力决定相关因素,对白念珠菌的生理代谢过程非常重要,为临床抗真菌药物开发以及白念珠菌感染的治疗提供了一个有前景的潜在药物靶点。
杜玮[6]（2010）在《白念珠菌CaRCH1基因的功能研究》文中研究指明白念珠菌RCH1基因的ORF.长为1236 bp,编码一个411个氨基酸的蛋白,由于该基因的缺失株对氟康唑有抗性表型,所以曾经命名为CaFSP1。在课题研究中,我们发现rch1Δ/rch1Δ缺失株和pmc1Δ/pmc1Δ缺失株具有类似的表型,都对钙离子敏感,对LiCl和氟康唑有抗性的表型。我们知道环孢霉素A（CsA）可以抑制钙调磷酸酶,阻断白念珠菌Ca2+/钙调磷酸酶途径。于是,首先我们将CsA加入CaCl2的固体培养基中,rch1Δ/rch1Δ缺失株可以回复到野生型的生长状态。第二,胞外低浓度的Mg2+能够抑制pmc1Δ/pmc1Δ缺失株对钙离子的敏感表型,我们将Mg2+加入CaCl2培养基中,rch1Δ/rch1Δ缺失株对CaCl2敏感的表型消失。第三,我们构建了pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株,发现该缺失株与pmc1Δ/pmc1Δ缺失株相比,对钙离子更加敏感,而对LiCl和氟康唑的表型没有明显的差异。此外,钙调磷酸酶影响白念珠菌菌落的形态和菌丝的形成,我们发现pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株在血清诱导下,菌丝的形成受到抑制。然而,在体内实验中,我们发现白念珠菌仅缺失PMC1基因,就会大大减弱细胞的毒力。最后,我们又构建了pCK-RCH1质粒,该质粒可以过量表达RCH1基因,将其转入pmc1Δ/pmc1Δ缺失株中,但未能弥补pmc1Δ/pmc1Δ缺失株的表型。以上实验可以说明CaRch1p具有调节细胞内钙离子稳态的作用,因此我们将该基因重新命名为CaRCH1即C. albicans regulator of calcium homeostasis。
许懿[7]（2010）在《小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究》文中进行了进一步梳理白念珠菌对氟康唑（FLC）的耐药性是临床抗真菌治疗失败的主要原因。本课题组前期的研究结果显示小檗碱（BBR）与FLC合用对耐药白念珠菌具有显着的协同抑菌作用。在本研究中,我们利用蛋白质二维电泳分析了临床耐药白念珠菌0304103、01010在FLC和BBR单用及合用前后的蛋白表达谱,所得结果经real-time RT-PCR验证,得到一批与能量代谢、氧化应激及其他功能相关的差异表达蛋白。此外,我们通过线粒体膜电位测定、细胞内ATP浓度测定、ATP合酶活性测定、内源性活性氧生成量测定、棋盘式微量液基稀释法考察还原剂的加入对两药协同效果的影响等实验进一步研究了BBR和FLC协同抗耐药白念珠菌的机制,结果显示两药合用后线粒体有氧呼吸增强,ATP生成量减少,ATP合酶活性受到抑制,内源性活性氧（ROS）生成大量增加,我们推断FLC与BBR合用是通过增强耐药白念珠菌的三羧酸循环、抑制ATP合酶活性使细胞内ROS生成大量增多,ROS通过氧化损伤作用杀伤耐药白念珠菌。这一“活性氧机制”可能是FLC与BBR协同抗耐药白念珠菌的重要分子机制之一。为深入研究BBR与FLC协同抗耐药白念珠菌的分子机制,我们利用cDNA芯片技术比较了临床耐药白念珠菌（0304103、01010、632）在FLC与BBR单用及合用前后的差异表达基因。通过对3株菌两药合用前后各自的差异表达基因取交集,共得到70个共同差异表达基因。所得差异表达基因均通过real-time RT-PCR进行验证。我们将70个共同差异基因进行了生物信息学分析及文献调研,发现两药合用后的差异表达基因主要与能量代谢、基因信息传递（复制、转录、翻译）及空泡形成三种生物学功能有关。其中,能量代谢相关基因的表达趋势与蛋白质组结果一致。根据芯片结果,我们推测:两药合用最终杀伤真菌细胞的核心机制可能是BBR的DNA损伤作用;白念珠菌可通过将BBR转运至其空泡内贮存从而起到对BBR的天然耐药作用。为探索“FLC + BBR”协同的关键环节,发现可能的“活性氧前”机制,根据蛋白质组及基因芯片结果提示,我们利用电镜及激光共聚焦显微镜观察BBR在白念珠菌细胞内的定位情况,发现BBR确实能贮存于空泡中并使空泡变大。通过琼脂点板实验,棋盘式微量液基稀释法及real-time RT-PCR等实验的结果提示,我们提出如下假说:白念珠菌可通过“囊泡运输”机制以胞吞的形式将BBR转运至空泡中贮存从而对其产生耐药现象;当合用FLC后,由于FLC的破膜作用可将空泡膜破坏从而释放出BBR,BBR的细胞毒作用导致胞内ROS生成大量增多,同时导致DNA损伤,进而而发挥抗耐药白念珠菌作用,该“空泡”机制可能是“FLC + BBR”协同抗耐药的关键环节。本课题为抗耐药白念珠菌的研究提供了新的思路。
郭娜[8]（2009）在《呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究》文中认为真菌性感染是临床上重要的感染性疾病。然而随着抗真菌剂的广泛应用,临床耐药菌株不断增多,使得真菌耐药性问题日趋严重,因此急需开发新型抗真菌药物和寻找新型治疗方案。目前,从中草药中寻找有效抗真菌成分已成为研究热点。本研究旨在明确植物白鲜皮的活性成分呋喃喹啉类生物碱白鲜碱的体外抗真菌活性,考察其与常用抗真菌制剂氟康唑对白色念珠菌和红色毛癣菌等致病真菌协同抗菌效果,并以模式真菌酿酒酵母为研究对象力求从分子生物学角度阐明其作用机制。首先通过微量稀释法药物敏感性实验、棋盘式微量稀释实验、体外琼脂扩散实验和时间-杀菌曲线研究了白鲜碱对临床分离耐药真菌的体外敏感性。在此基础上,针对模式真菌酿酒酵母,运用基因芯片技术、实时荧光定量PCR、Western blotting技术、药物荧光吸收检测、激光扫描共聚焦、流式细胞术等研究了白鲜碱对模式真菌的作用机制。本研究在国内外首次将白鲜碱与氟康唑联合应用抗临床分离致病性真菌,结果表明,两药联合对26株耐药白色念珠菌中的20株菌具有显着协同效果,对红色毛癣菌和酿酒酵母菌株也具有显着的协同作用,FICI（Fractional inhibitory concentration index）值在0.25-1.5之间;两药合用药片的抑菌圈直径明显扩大且抗真菌活性的增强大于2 log10 CFU/mL。本研究在国际上首次利用DNA芯片技术从全基因组水平评价白鲜碱对模式真菌酿酒酵母基因表达谱的影响,揭示白鲜碱的抗菌作用分子机制,结果表明在白鲜碱诱导下,酵母细胞中的889个基因差异表达（表达倍数≥2）,511个上调,378个下调,其中多药耐药、脂质生物合成、DNA复制和重组等pathway受到白鲜碱的影响。实时荧光定量RT-PCR和western blotting从基因水平和蛋白水平较好的检测了部分芯片结果。本研究还表明,白鲜碱能促使酿酒酵母细胞中若丹明6G外排增加,这与PDR5基因表达增高相关;64μg/mL的白鲜碱能明显提高酵母DNA含量（P<0.05）,与DNA复制和重相关基因高表达相一致;32和64μg/mL的白鲜碱能显着破坏酿酒酵母细胞膜（P<0.05）,这与细胞膜麦角固醇基因ERG高表达的芯片结果相一致。本研究为临床治疗真菌感染提供了新型治疗方案,为白鲜碱临床应用打下良好的基础。
阎澜[9]（2009）在《白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制》文中进行了进一步梳理白念珠菌易于感染、难以防治的主要原因在于其具有“高适应性”的特点,主要表现为高致病性和高耐药性。近年来,白念珠菌适应氧化刺激的机制受到日益关注。本课题前期研究结果提示,白念珠菌线粒体氧化呼吸功能的改变在其适应性耐药性形成过程中可能也发挥着重要作用,即白念珠菌耐药子代的线粒体氧化呼吸功能减弱,代偿性加强细胞质内糖酵解、乙醛酸循环等代谢途径以供能,从而使氟康唑不能有效促进其内源性活性氧升高,使其对氟康唑的敏感性下降。因此,深入研究白念珠菌线粒体呼吸功能与其药物敏感性的关系对进一步阐明白念珠菌耐药机制具有重要意义。目的从多方面、多层次地阐明我们所提出的“线粒体氧化呼吸抑制”假说:一方面,使用线粒体呼吸链抑制剂阻断或抑制白念珠菌线粒体氧化呼吸,考察菌株对唑类药物的敏感性是否降低。另一方面,通过抑制糖酵解的酶活性,阻断糖酵解代谢通路,或者使用氧化磷酸化解偶联剂,进而增强线粒体氧化呼吸,考察白念珠菌对唑类药物的敏感性是否升高。同时,通过靶向敲除和原位高表达线粒体醛脱氢酶ALD5基因,考察该基因对于白念珠菌线粒体呼吸、对唑类药物敏感性的影响,从而间接证明线粒体呼吸功能在白念珠菌耐药性形成中的作用。此外,考察白念珠菌ERG3、ERG11、TAC1基因耐药相关特异性突变位点;考察白念珠菌新基因ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518的耐药相关功能。方法（一）通过点板实验和抑菌圈实验,分别考察氰化钾和水杨基氧肟酸作用下,白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。通过抑菌圈实验,考察白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌分别在氰化钾和水杨基氧肟酸作用下,对唑类药物敏感性的变化。通过荧光染色,检测白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌在咪康唑或苯菌灵作用下的细胞内活性氧水平。通过棋盘式微量液基稀释法检测氟康唑与水杨基氧肟酸联合用药的抑菌效果。通过抑菌圈实验,分别考察氧化磷酸化解偶联剂、7%乙醇、6-磷酸海藻糖作用下,白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。（二）采用Ura-blast策略,构建含有目的基因上、下游同源重组片段的URA3-HisG-URA3敲除盒,醋酸锂法转染白念珠菌,通过两次同源重组,使亲本菌的ALD5基因被敲除盒同源重组,从而构建ALD5基因缺失菌,并通过基因组DNA的套式PCR和southern杂交验证。构建ALD5基因高表达质粒,将ALD5基因完整开放阅读框置于pCaEXP高表达载体中MET3启动子的控制下;醋酸锂法转染白念珠菌ALD5基因缺失菌,PCR鉴定ALD5基因的原位整合,实时定量PCR筛选ALD5基因表达量明显升高的菌株。利用微量液基稀释法和点板法考察ALD5基因缺失菌在不同碳源培养基上对唑类药物的敏感性是否改变;通过流式细胞仪检测ALD5基因敲除菌的细胞周期;通过荧光显微镜检测ALD5基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态;分别使用不同培养条件,考察ALD5基因敲除菌的菌丝形成能力和生物膜形成能力;与哺乳动物巨噬细胞共孵育,考察ALD5基因敲除菌对巨噬细胞的敏感性;通过荧光染料检测ALD5基因敲除菌的线粒体膜电位和内源性活性氧水平。（三）以白念珠菌敏感亲本y0109S和耐药子代y0109R基因组DNA为模板,PCR扩增ERG3、ERG11、TAC1基因全长开放阅读框,并与白念珠菌基因组数据库比对,分析基因突变位点。（四）分别构建含有目的基因ORF19.1510上、下游同源重组片段的HIS1、LEU2敲除盒,醋酸锂法转染白念珠菌,通过两次同源重组,使亲本菌的ORF19.1510基因被敲除盒同源重组,从而构建ORF19.1510基因插入失活缺失菌,并通过基因组DNA套式PCR验证。按照同样方法,分别构建ORF19.3216、ORF19.5518基因插入失活缺失菌。通过荧光显微镜分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态;分别使用不同培养条件,考察ORF19.1510基因敲除菌的菌丝形成能力;利用微量液基稀释法和点板法分别考察ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因缺失菌对唑类药物、盐刺激、渗透刺激、过氧化氢刺激、DNA抑制剂的敏感性是否改变;通过流式细胞仪分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌的细胞周期。结果（一）氰化钾作用下,含唑类药物培养基上存活菌落数量增加、含唑类药物纸片周围抑菌圈明显缩小,即菌株对唑类药物的敏感性降低。水杨基氧肟酸作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。白念珠菌交替氧化酶AOX1b基因缺失菌在氰化钾作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈缩小,但是缩小程度弱于亲本菌和AOX1a基因缺失菌。咪康唑或苯菌灵作用下,AOX基因缺失菌的细胞内活性氧升高程度明显高于亲本菌,而AOX基因高表达菌的细胞内活性氧升高程度明显低于亲本菌。水杨基氧肟酸与氟康唑体外联合使用,能明显降低氟康唑的最低抑菌浓度,对白念珠菌特别是耐药菌株,产生明显协同抑菌作用。氧化磷酸化解偶联剂作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。7%乙醇作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。6-磷酸海藻糖作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈无明显变化,即菌株对唑类药物的敏感性未改变。（二）分别通过PCR扩增、酶切、测序验证ALD5基因敲除盒构建正确;通过基因组DNA套式PCR和Southern杂交验证ALD5基因一条等位基因敲除菌、两条等位基因敲除菌构建正确。通过酶切和测序验证ALD5基因高表达质粒构建正确;通过PCR验证ALD5基因高表达菌株构建正确,并通过实时定量PCR筛选得到一株ALD5基因表达量相对较高的菌株。在非发酵碳源的培养基内,ALD5基因敲除菌的生长倍增时间延长;ALD5基因敲除菌呈椭圆球形,以一端或两端极化出芽生长;在液体和固体培养条件下,ALD5基因敲除菌的菌丝形成能力与亲本菌相当,生物膜形成能力略增强;ALD5基因敲除菌在巨噬细胞存在时的存活率与亲本菌相当;ALD5基因敲除菌的线粒体膜电位水平与亲本菌无明显差别;在含有过氧化氢、氯化钠、山梨醇的培养基上,ALD5基因敲除菌的存活菌落数量与亲本菌相当。随着孵育时间的延长,ALD5基因敲除菌对唑类药物的敏感性明显降低;在乙醇、乙酸等非发酵碳源培养基上,ALD5基因敲除菌对唑类药物的敏感性略降低;咪康唑作用下,ALD5基因敲除菌细胞内活性氧升高程度明显低于亲本菌。（三）敏感亲本y0109S和耐药子代y0109R的ERG11基因均无点突变;耐药子代y0109R的ERG3基因存在D19E突变;耐药子代y0109R的TAC1基因存在L47K和N977K突变。（四）通过融合PCR扩增得到含有目的基因ORF19.1510上下游同源重组片段和标记HIS1、LEU2的敲除盒,通过基因组DNA套式PCR验证ORF19.1510基因一条等位基因敲除菌、两条等位基因敲除菌构建正确。按照同样方法和原理,成功构建ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌。与亲本菌相比,ORF19.1510基因缺失菌在完全培养基和极限培养基中对数生长期的倍增时间无明显变化;ORF19.1510基因缺失菌单个细胞增大,可从细胞表面多个方位不规则出芽生长;ORF19.1510基因缺失菌在各种诱导条件下菌丝形成能力明显降低;ORF19.1510基因缺失菌对唑类药物、氯化钠的敏感性明显升高;ORF19.1510基因缺失菌对过氧化氢、山梨醇的敏感性无明显变化;ORF19.1510基因缺失菌对DNA单链抑制剂甲磺酸甲酯、羟基脲的敏感性明显降低,对DNA双链抑制剂腐草霉素的敏感性升高;ORF19.1510基因缺失菌的细胞周期在G2/S期转变发生阻滞。与亲本菌相比,ORF19.3216、ORF19.5518基因缺失菌形态、菌丝形成能力、细胞周期、对唑类药物、盐刺激、过氧化氢刺激、渗透刺激的敏感性等表型均无明显变化。结论（一）白念珠菌经典氧化呼吸通路（细胞色素途径）受到抑制或阻断,转而使用交替氧化为主要电子传递通路时,可明显降低菌株对唑类药物的敏感性;使用氧肟酸化合物抑制白念珠菌交替氧化呼吸通路,可明显升高菌株对唑类药物的敏感性。白念珠菌在唑类药物作用下,其交替氧化酶可被药物作用后升高的内源性活性氧所诱导高表达,从而发挥电子分流作用,在一定程度上减少真菌细胞内活性氧水平,削弱药物的抑菌作用,进而降低菌株对唑类药物的敏感性。这是白念珠菌耐药性产生的新机制之一。白念珠菌根据生存环境变化及时调节电子在细胞色素途径和交替呼吸途径的流量,并减少活性氧产生,是其高适应性的表现之一。（二）白念珠菌醛脱氢酶Ald5p主要参与细胞内乙醛代谢,不改变细胞周期进展,有助于维持真菌细胞在非发酵碳源环境中的生存。CaAld5p有助于维持白念珠菌细胞呈圆球形形态,略降低菌株的生物被膜形成能力;但是不改变细胞以一端或两端为主的极化出芽生长方式,不改变酵母态细胞向菌丝态细胞的转变,不改变菌株对哺乳动物巨噬细胞的敏感性,也不改变白念珠菌对外源性氧化刺激、盐刺激、渗透刺激的敏感性。白念珠菌Ald5p不影响其线粒体膜电位水平,但是,可以增加将线粒体内乙醛转变为乙酸时产生的还原态NADPH,从而增加细胞内活性氧水平,增加菌株对唑类药物的敏感性。（三）白念珠菌TAC1基因可因N977K突变而使转录因子Tac1p活化,并调控其靶基因CDR1、CDR2、PDR17等高表达,进而表现出对唑类药物敏感性降低。白念珠菌ERG3基因可因D19E突变而使Erg3p功能受到抑制,并改变白念珠菌甾醇代谢通路,麦角甾醇含量减少,中间代谢产物和麦角甾醇替代物含量增加,进而表现出对唑类药物敏感性降低。（四）白念珠菌新基因ORF19.1510有助于维持菌株的细胞周期G2/S期转变,有助于白念珠菌由酵母态向菌丝态的转变;可明显降低菌株对唑类药物、盐刺激、DNA双链抑制剂的敏感性,明显升高菌株对DNA单链抑制剂的敏感性。白念珠菌新基因ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518的功能有待进一步研究。
李妙海[10]（2009）在《白念珠菌新基因MRF1的耐药相关功能研究》文中研究表明白念珠菌疾病易于感染、难以防治的特点使其在临床治疗中表现为强烈的致病性和高耐药性。前期研究显示白念珠菌耐药性形成过程中可能伴随着线粒体氧化呼吸功能的改变,并发现与线粒体呼吸相关的基因MRF1在耐药株中表达上调。为了确证白念珠菌耐药形成的“呼吸体抑制”假说,进一步阐明白念珠菌的耐药形成机制。本课题采用Ura-Blaster基因敲除策略靶向敲除和pCaEXP质粒异位表达线粒体呼吸功能相关的基因MRF1,构建了MRF1基因缺失菌和高表达菌。将构建好的菌株通过比浊法测定生长曲线；通过spot assay和微量液基实验来考察MRF1缺失菌对唑类药物的敏感性及过氧化氢的刺激耐受性是否改变；通过荧光染料检测MRF1基因缺失菌的线粒体膜电位、ATP产生和内源性活性氧水平（ROS）,通过实时定量PCR考察了MRF1基因高表达后,其他已知耐药相关基因表达量的变化；又考察了MRF1缺失菌生物被膜、菌丝的形成能力、细胞膜甾醇成份和外排能力的改变情况,较全面的研究了MRF1基因的相关功能。结论：成功构建白念珠菌MRF1基因缺失菌和基因高表达菌；MRF1基因缺失后：菌株线粒体膜电位、ATP含量略降低,菌株生长速度延缓、对氧化刺激敏感性略增加、ROS产生略增多。酿酒酵母中MRF1编码的Ybr026p为2-烯酰硫酯还原酶,它催化线粒体脂肪酸合成通路Ⅱ的最后一步反应,产生作为线粒体膜成份之一的脂肪酸及合成硫辛酸的前体。由于白念MRF1p与Ybr026p同源,因此我们推测上述结果是因为MRF1缺失后不能正常合成2-烯酰硫酯还原酶,造成线粒体膜一定程度上的破损,细胞色素内容物降低,进而减弱呼吸作用而导致的。但我们通过测定基因缺失菌的药物MIC80值和spot assay实验,发现其对唑类药物的耐药性并没有显着性的改变,也不影响细胞膜的甾醇含量和外排能力,这一现象在Real-time结果中也得以证实。由于线粒体膜的功能维持涉及了大量的编码因子,推测MRF1基因非其决定性因素,所以其缺失不能对白念线粒体呼吸产生明显的抑制作用。此外,本研究发现白念珠菌MRF1基因能明显抑制细胞菌丝和被膜的形成,激光共聚焦实验也验证了这一现象,具体机制有待进一步探讨。
二、膜转运蛋白与白念珠菌抗药（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、膜转运蛋白与白念珠菌抗药（论文提纲范文）
（1）中国多中心侵袭性感染毛孢子菌流行病学、致病力和唑类耐药机制及乙酰转移酶调控因子Gcn5对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要一 |
| Abstract 1 |
| 中文摘要二 |
| Abstract 2 |
| 课题一、中国多中心侵袭性感染毛孢子菌流行病学、致病力和唑类耐药机制研究 |
| 引言 |
| 第一部分 毛孢子菌的流行病学与药物敏感性 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器设备及试剂材料 |
| (一) 主要仪器设备 |
| (二) 主要试剂材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 菌株来源 |
| (二) 测序和分型分析 |
| (三) MALDI-TOF MS鉴定分析 |
| (四) 抗真菌药物敏感性分析 |
| 结果 |
| 一、中国多中心侵袭性感染毛孢子菌流行病学分布 |
| (一) 总述 |
| (二) 临床流行病学特征分布 |
| 二、评价不同鉴定方法对毛孢子菌的鉴定效能 |
| (一) 分子鉴定方法 |
| (二) MALDI-TOF MS的鉴定 |
| (三) 分子分型 |
| 三、毛孢子菌体外抗真菌药物敏感性 |
| (一) 微量肉汤稀释法 |
| (二) 试验性临床流行病学折点的建立 |
| (三) 评估Sensititre YeastOne显色药敏板 |
| 四、罕见菌种Trichosporon dohaense导致的侵袭性感染 |
| (一) 病例调查 |
| (二) 菌株鉴定 |
| (三) 抗真菌药物敏感性 |
| (四) 文献综述 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 毛孢子菌致病力的分布特征 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器设备及试剂材料 |
| (一) 主要仪器设备 |
| (二) 主要试剂材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 试验菌株 |
| (二) 毛孢子菌的胞外酶 |
| (三) 毛孢子菌的生物膜 |
| (四) 数据和统计学分析 |
| 结果 |
| 一、侵袭性感染毛孢子菌的胞外酶活性分布 |
| (一) 总体分布 |
| (二) 阿萨希毛孢子菌的胞外酶活性分布 |
| 二、侵袭性感染毛孢子菌的生物膜 |
| (一) 生物膜形成能力的分布 |
| (二) 生物膜的药物敏感性分布 |
| (三) 生物膜的生长曲线 |
| (四) 生物膜的形成过程 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 阿萨希毛孢子菌唑类药物耐药机制 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器设备及试剂材料 |
| (一) 主要仪器设备 |
| (二) 主要试剂材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 试验菌株 |
| (二) 生长曲线 |
| (三) 唑类耐药相关基因的测序分析 |
| (四) 唑类外排泵蛋白编码基因的表达分析 |
| (五) 外排泵活性的检测 |
| (六) 转录组测序分析 |
| 结果 |
| 一、生长曲线 |
| 二、唑类耐药相关基因的测序结果 |
| 三、唑类外排泵蛋白编码基因的表达分析 |
| 四、外排泵的活性分析 |
| 五、转录组测序分析 |
| (一) 原始数据整理、过滤及质量评估 |
| (二) 表达差异分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 课题二、乙酰转移酶调控因子Gcn5对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要仪器及试剂材料 |
| (一) 主要仪器设备 |
| (二) 主要试剂材料 |
| 二、实验方法 |
| (一) 试验菌株 |
| (二) GCN5突变体的构建 |
| (三) 生长曲线和倍增时间的检测 |
| (四) (联合)药敏试验 |
| (五) 连续稀释生长试验 |
| (六) 时间-杀菌动力试验 |
| (七) Western blot分析 |
| (八) RNA提取、RT-PCR和转录组测序分析 |
| (九) THP-1吞噬试验 |
| 结果 |
| 一、生长曲线 |
| 二、GCN影响细胞壁的合成 |
| 三、敲除GCN5增加光滑念珠菌对抗真菌药物的敏感性 |
| 四、敲除GCN5降低光滑念珠菌的组蛋白乙酰化 |
| 五、GCN5调控特定的转录网络 |
| 六、氟康唑压力下转录组的改变 |
| 七、米卡芬净压力下转录组的改变 |
| 八、缺失GCN5降低光滑念珠菌在THP细胞中的生存能力 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 毛孢子菌研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 CRISPR-Cas9基因编辑技术在念珠菌中的应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章: 文献综述 |
| 1.1 柑橘病原真菌与皮落青霉 |
| 1.1.1 柑橘真菌病害 |
| 1.1.2 青霉属植物病原真菌 |
| 1.1.3 皮落青霉 |
| 1.2 抗真菌药物分类与真菌抗药性 |
| 1.2.1 抗真菌药物 |
| 1.2.2 真菌抗药性 |
| 1.3 真菌药物DMIs抗性机制 |
| 1.3.1 唑类药物靶标突变或过量表达 |
| 1.3.2 药泵蛋白参与真菌抗药机制 |
| 1.3.3 转录因子与代谢调控 |
| 1.3.4 甾醇生物合成与真菌抗药 |
| 1.3.5 脂代谢调控细胞膜应激反应与真菌抗药 |
| 1.3.6 碳-氮基础代谢与营养调控 |
| 1.3.7 真菌抗性机制的组学研究 |
| 1.4 真菌病毒及其生物学效应 |
| 1.4.1 真菌病毒的分类与一般特征 |
| 1.4.2 真菌病毒弱毒效应及其机制研究 |
| 1.5 真菌病毒感染对宿主真菌的抗逆影响 |
| 1.5.1 真菌病毒感染对宿主真菌的非药物抗逆影响 |
| 1.5.2 真菌病毒感染对宿主真菌的药物条件弱毒 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 转录组解析柑橘病原真菌皮落青霉的咪鲜胺抗性机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 真菌材料培养与药物处理 |
| 2.2.2 咪鲜胺EC50检测 |
| 2.2.3 转录组样品处理与RNA制备 |
| 2.2.4 转录组cDNA文库构建与测序 |
| 2.2.5 转录组序列组装与基因(Unigene)功能注释 |
| 2.2.6 基因表达量(转录量)计算与差异表达基因(DEG)鉴定 |
| 2.2.7 DEG功能富集与分类 |
| 2.2.8 荧光定量PCR检测基因转录量 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 皮落青霉菌CQ1和CQ15咪鲜胺抗性分析 |
| 2.3.2 转录组样品RNA质量评估 |
| 2.3.3 转录组测序质量评价 |
| 2.3.4 单基因(Unigene)组装与质量分析 |
| 2.3.5 差异表达基因(DEG)分析 |
| 2.3.6 DEG的COG和KOG富集与功能分类 |
| 2.3.7 DEG的GO富集分析 |
| 2.3.8 DEG的KEGG富集分析 |
| 2.3.9 实时荧光定量PCR验证皮落青霉菌咪鲜胺抗性基因 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 皮落青霉dsRNA病毒分离鉴定与咪鲜胺抗性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 真菌材料与培养 |
| 3.2.2 基因工程菌株与质粒 |
| 3.2.3 培养基及相关试剂 |
| 3.2.4 真菌基因组DNA提取 |
| 3.2.5 病毒dsRNA提取与鉴定 |
| 3.2.6 病毒基因组dsRNA基因组高通量测序与拼接 |
| 3.2.7 病毒基因组dsRNA克隆测序与末端序列扩增 |
| 3.2.8 病毒基因组序列生物信息学分析 |
| 3.2.9 真菌病毒粒子提取与透射电镜观察 |
| 3.2.10 病毒粒子结构蛋白的检测 |
| 3.2.11 病毒dsRNA分子杂交(Northe blot) |
| 3.2.12 皮落青霉脱毒株与染毒株的制备 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 皮落青霉菌CQ15病毒核酸的电泳分析 |
| 3.3.2 皮落青霉菌CQ15病毒dsRNA高通量测序与分析 |
| 3.3.3 PcCV1系统进化分析 |
| 3.3.4 PcCV1病毒粒子鉴定 |
| 3.3.5 PcCV1生物学效应分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 转录组解析PcCV1调控皮落青霉咪鲜胺抗性机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 真菌材料培养与药物处理 |
| 4.2.2 咪鲜胺EC_(50)检测 |
| 4.2.3 转录组样品处理与RNA制备 |
| 4.2.4 转录组cDNA文库构建与测序 |
| 4.2.5 转录组序列组装与基因(Unigene)功能注释 |
| 4.2.6 基因表达量(转录量)计算与差异表达基因(DEG)鉴定 |
| 4.2.7 DEG功能富集分类与代谢通路分析 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测基因转录量 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 皮落青霉染毒株CQ1V咪鲜胺抗性分析 |
| 4.3.2 转录组样品RNA质量评估 |
| 4.3.3 转录组测序质量与unigene组装 |
| 4.3.4 差异表达基因(DEG)分析 |
| 4.3.5 DEG的COG、KOG和GO富集与功能分类 |
| 4.3.6 DEG的KEGG富集分类与代谢通路分析 |
| 4.3.7 实时荧光定量PCR验证PcCV1抗性调控相关基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩写中英文对照表 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（3）白念珠菌耐药基因的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 白念珠菌 |
| 1.2 白念珠菌转录组测序 |
| 1.3 白念珠菌基因敲除 |
| 1.4 本论文的主要内容 |
| 1.5 本论文的研究意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 培养基和缓冲液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养及保存 |
| 2.2.2 临床念珠菌标本的鉴定 |
| 2.2.2.1 多重PCR鉴定 |
| 2.2.2.2 科玛嘉显色培养基鉴定 |
| 2.2.3 体外抗真菌药物敏感性实验 |
| 2.2.3.1 药敏板的配制 |
| 2.2.3.2 菌悬液的制备与接种 |
| 2.2.3.3 孵育及结果判读 |
| 2.2.4 白念珠菌RAPD基因分型实验 |
| 2.2.5 白念珠菌总RNA的提取 |
| 2.2.6 高通量测序及转录组分析 |
| 2.2.6.1 菌株处理和总RNA的提取 |
| 2.2.6.2 cDNA文库构建和测序 |
| 2.2.6.3 测序数据处理与分析 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 酸化玻璃微珠法提取白念珠菌基因组DNA |
| 2.2.9 PCR介导的同源重组基因敲除组件构建 |
| 2.2.9.1 PCR同源臂和筛选标记 |
| 2.2.9.2 PCR片段切胶回收 |
| 2.2.9.3 融合PCR扩增同源重组基因敲除组件 |
| 2.2.9.4 乙醇沉淀纯化DNA片段 |
| 2.2.10 乙酸锂法转化白念珠菌 |
| 2.2.11 同源重组基因敲除突变株阳性克隆的验证 |
| 2.2.11.1 营养型鉴定阳性克隆 |
| 2.2.11.2 PCR鉴定阳性克隆 |
| 2.2.12 白念珠菌细胞计数 |
| 2.2.13 质粒小量抽提 |
| 2.2.14 白念珠菌生长曲线测定 |
| 2.2.15 SpotAssay |
| 2.2.16 生物信息学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 白念珠菌耐药菌株的获得 |
| 3.1.1 临床念珠菌的分离、纯化和鉴定 |
| 3.1.2 临床白念珠菌抗真菌药物敏感性 |
| 3.1.3 临床白念珠菌RAPD基因分型 |
| 3.2 白念珠菌转录组测序 |
| 3.2.1 白念珠菌总RNA的提取与文库构建 |
| 3.2.2 测序数据整理及质量评估 |
| 3.2.3 参考基因组注释与基因组定位分析 |
| 3.2.4 比对分析 |
| 3.2.5 基因表达差异分析 |
| 3.2.6 差异表达基因的GO分析 |
| 3.2.7 差异表达基因的KEGG分析 |
| 3.2.8 转录组测序结果的荧光定量PCR验证 |
| 3.3 QDR1基因与白念珠菌耐药性关系初探 |
| 3.3.1 QDR1基因缺失突变株的构建 |
| 3.3.1.1 敲除组件的PCR扩增 |
| 3.3.1.2 对QDR1基因缺失突变株的鉴定 |
| 3.3.3 QDR1基因对白念珠菌抗真菌药物敏感性的影响 |
| 3.3.4 QDR1基因对菌株生长的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 白念珠菌耐药菌株的获得 |
| 4.2 白念珠菌的转录组学 |
| 4.3 QDR1基因与白念珠菌耐药性的关系 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
| 综述 |
（4）1970–2015年白念珠菌耐药机制的文献计量分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 纳入和排除标准 |
| 1.2 检索策略和方法 |
| 1.3 评价内容 |
| 2 结果 |
| 2.1 各年份白念珠菌耐药机制相关文献发表的数量变化 |
| 2.2 白念珠菌耐药机制相关文献发表作者、期刊、语言及引用频次 |
| 2.3 白念珠菌耐药机制相关文献类型分析 |
| 2.4 白念珠菌耐药机制文献所涉及的抗菌药物 |
| 2.5 白念珠菌耐药机制分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 检索范围与途径 |
| 3.2 白念珠菌耐药机制发表年份 |
| 3.3 白念珠菌耐药机制相关文献类型、发表作者、期刊和语言 |
| 3.4 对白念珠菌耐药的相关药物 |
| 3.5 白念珠菌耐药机制研究现状 |
（5）白念珠菌铁稳态系统相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 白念珠菌的生物学特性及其致病性 |
| 1.1.1 白念珠菌的生物学特性 |
| 1.1.2 白念珠菌的致病特性 |
| 第二节 白念珠菌铁获得、转运和储存系统研究进展 |
| 1.2.1 白念珠菌铁获得系统 |
| 1.2.2 白念珠菌胞内铁转运系统 |
| 1.2.3 白念珠菌胞内铁储存系统 |
| 第三节 白念珠菌铁稳态转录调控系统研究进展 |
| 1.3.1 同源Aft-型转录因子调控系统 |
| 1.3.2 转录因子Sef1-Sfu1-Hap43调控回路 |
| 1.3.3 细胞器调控系统 |
| 1.3.4 其他调控系统 |
| 第四节 白念珠菌的信号转导和形态发生 |
| 1.4.1 形态发生诱导信号 |
| 1.4.2 Yeast-hyphae形态转换信号通路 |
| 1.4.3 White-opaque形态转换信号通路 |
| 第五节 选题依据和技术路线 |
| 1.5.1 选题依据和研究意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 MCS途径在白念珠菌铁代谢调控中的功能 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液 |
| 2.1.5 培养基 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态的制备和转化 |
| 2.2.3 白念珠菌及酿酒酵母基因组的提取 |
| 2.2.4 白念珠菌醋酸锂转化法 |
| 2.2.5 酿酒酵母醋酸锂转化法 |
| 2.2.6 PCR反应体系 |
| 2.2.7 酶切体系 |
| 2.2.8 连接体系 |
| 2.2.9 白念珠菌RNA的提取 |
| 2.2.10 RNA样品中基因组DNA的消化 |
| 2.2.11 cDNA合成和纯度鉴定 |
| 2.2.12 实时定量PCR |
| 2.2.13 白念珠菌总蛋白的提取 |
| 2.2.14 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度 |
| 2.2.15 Western blotting |
| 2.2.16 白念珠菌单基因敲除菌株的构建 |
| 2.2.17 白念珠菌双基因敲除菌株的构建 |
| 2.2.18 Southern blotting |
| 2.2.19 白念珠菌细胞学定位研究 |
| 2.2.20 白念珠菌液泡的分离和纯化 |
| 2.2.21 白念珠菌铁代谢相关指标测定 |
| 2.2.22 白念珠菌生长适应性研究 |
| 2.2.23 生物信息学分析 |
| 第三节 结果与分析 |
| 2.3.1 白念珠菌线粒体铁转运蛋白Mrs4的鉴定 |
| 2.3.2 白念珠菌MRS4基因敲除菌株及其回补菌株的构建 |
| 2.3.3 白念珠菌MRS4基因的缺失对线粒体形态的影响 |
| 2.3.4 MRS4基因的缺失对白念珠菌生长特性的影响 |
| 2.3.5 MRS4基因的缺失对白念珠菌铁代谢调控的影响 |
| 2.3.6 白念珠菌Mrs4-Ccc1-Smf3(MCS)途径的鉴定和功能研究 |
| 第四节 讨论 |
| 2.4.1 白念珠菌MCS途径的鉴定 |
| 2.4.2 白念珠菌MCS途径在维持胞内铁稳态中的作用 |
| 2.4.3 白念珠菌MCS途径在铁应答和利用中的作用 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 MCS途径在白念珠菌压力应答和形态发生中的功能 |
| 第一节 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液 |
| 3.1.5 培养基 |
| 第二节 实验方法 |
| 3.2.1 梯度稀释点板实验 |
| 3.2.2 菌丝诱导实验 |
| 3.2.3 顺乌头酸酶(Aconitase)活力测定 |
| 3.2.4 线粒体DNA(mtDNA)拷贝数测定 |
| 3.2.5 线粒体膜电势的测定(△Ψm) |
| 3.2.6 白念珠菌Acol蛋白C端FLAG标记 |
| 3.2.7 抗真菌药物敏感性测定 |
| 3.2.8 白念珠菌对口腔上皮细胞粘附实验 |
| 3.2.9 白念珠菌对Hela细胞侵染实验 |
| 3.2.10 小鼠系统性感染模型 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.3.1 MRS4基因缺失对白念珠菌氧化压力应答的影响 |
| 3.3.2 MRS4基因缺失对白念珠菌离子压力应答的影响 |
| 3.3.3 MRS4基因缺失对白念珠菌菌丝发育的影响 |
| 3.3.4 MCS途径对白念珠菌压力应答能力的影响 |
| 3.3.5 MCS途径对白念珠菌线粒体功能的影响 |
| 3.3.6 MCS途径对白念珠菌抗真菌药物敏感性的影响 |
| 3.3.7 MCS途径对白念珠菌菌丝发育能力的影响 |
| 3.3.8 MCS途径对白念珠菌感染上皮细胞能力的影响 |
| 3.3.9 MCS途径对白念珠菌毒力的影响 |
| 第四节 讨论 |
| 3.4.1 MCS途径在白念珠菌压力应答中的作用 |
| 3.4.2 MCS途径在白念珠菌线粒体功能中的作用 |
| 3.4.3 MCS途径在白念珠菌形态发生和致病性中的作用 |
| 3.4.4 MCS途径可能作用机理 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 Aft2转录因子在白念珠菌铁代谢调控中的功能 |
| 第一节 实验材料 |
| 4.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液 |
| 4.1.5 培养基 |
| 第二节 实验方法 |
| 4.2.1 实时定量PCR |
| 4.2.2 启动子-报告基因融合质粒的构建 |
| 4.2.3 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 4.2.4 原子吸收光谱法测定胞内铁含量水平 |
| 4.2.5 梯度稀释点板实验 |
| 4.2.6 活性氧ROS测定 |
| 4.2.7 超氧化物歧化酶SOD测定 |
| 第三节 结果与分析 |
| 4.3.1 Aft2转录因子影响白念珠菌铁稳态 |
| 4.3.2 Aft2转录因子影响白念珠菌铁代谢相关基因表达调控 |
| 4.3.3 Aft2转录因子调控白念珠菌FRP1和SIT1基因表达的机理研究 |
| 4.3.4 Aft2转录因子调控白念珠菌MRS4基因表达的机理研究 |
| 4.3.5 Aft2转录因子参与白念珠菌压力应答的机理研究 |
| 4.3.6 铁刺激信号影响白念珠菌Aft2转录因子的细胞学定位 |
| 第四节 讨论 |
| 4.4.1 Aft2转录因子在维持白念珠菌胞内铁稳态中的作用 |
| 4.4.2 Aft2转录因子通过CACCC元件调控白念珠菌铁应答基因的表达 |
| 4.4.3 Aft2转录因子在白念珠菌压力应答中的作用 |
| 4.4.4 低铁信号诱导白念珠菌Aft2转录因子细胞核定位 |
| 第五节 小结 |
| 第五章 Aft2转录因子在白念珠菌形态发生中的功能 |
| 第一节 实验材料 |
| 5.1.1 菌株、质粒与引物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要溶液 |
| 5.1.5 主要培养基 |
| 第二节 实验方法 |
| 5.2.1 实时定量PCR |
| 5.2.2 菌丝诱导实验 |
| 5.2.3 菌株粘附能力(Adhesion)测定 |
| 5.2.4 菌株生物被膜形成能力(Biofilm)测定 |
| 5.2.5 菌株絮凝能力(Flocculation)测定 |
| 5.2.6 菌株细胞表面疏水能力(Cell Surface Hydrophobicity)测定 |
| 5.2.7 MTL基因座杂合型菌株构建 |
| 5.2.8 White-opaque形态转换实验 |
| 5.2.9 双标签菌株构建 |
| 5.2.10 基因过表达菌株的构建 |
| 5.2.11 酵母细胞裂解物制备 |
| 5.2.12 免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 5.2.13 启动子-GFP报告基因系统荧光活性测定 |
| 第三节 结果和分析 |
| 5.3.1 Aft2转录因子影响白念珠菌细胞表面粘附特性 |
| 5.3.2 Aft2转录因子影响白念珠菌侵入式生长 |
| 5.3.3 Aft2转录因子影响白念珠菌液体菌丝发育 |
| 5.3.4 菌丝诱导信号能够引起Aft2转录因子细胞内定位的改变 |
| 5.3.5 Aft2转录因子参与白念珠菌低温嵌入应答 |
| 5.3.6 Aft2转录因子参与白念珠菌white-opaque形态转换 |
| 5.3.7 白念珠菌AFT2基因mRNA和蛋白表达分析 |
| 5.3.8 白念珠菌Aft2和Czf1具有物理性相互作用 |
| 第四节 讨论 |
| 5.4.1 Aft2转录因子在白念珠菌细胞表面粘附和侵入中的作用 |
| 5.4.2 Aft2转录因子在白念珠菌菌丝发育中的作用 |
| 5.4.3 Aft2转录因子在白念珠菌低温嵌入应答中的作用 |
| 5.4.4 Aft2转录因子在白念珠菌white-opaque形态转换过程中的作用 |
| 5.4.5 Aft2转录因子作用机理 |
| 第五节 小结 |
| 第六章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 相关工作的前景展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及科研成果 |
（6）白念珠菌CaRCH1基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 白念珠菌简介 |
| 1.2 溶质运载蛋白家族（SLC） |
| 1.2.1 溶质运载蛋白家族（SLC）概述 |
| 1.2.2 第10 个溶质运载蛋白家族（SLC10）及其成员 |
| 1.3 细胞内钙离子稳态及其信号通路 |
| 1.3.1 细胞内钙离子稳态 |
| 1.3.2 钙调磷酸酶信号途径 |
| 1.4 白念珠菌RCH1 基因 |
| 1.4.1 白念珠菌RCH1 基因简介 |
| 1.4.2 白念珠菌RCH1 基因已有研究 |
| 1.5 本文研究的内容与意义 |
| 1.5.1 研究的内容 |
| 1.5.2 研究的意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒和引物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要的生化试剂及其来源 |
| 2.1.5 常用试剂的配方 |
| 2.1.6 培养基配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌、酵母菌和白念珠菌的培养与菌种保存 |
| 2.2.2 质粒或连接体系转化到E. coli 感受态细胞 |
| 2.2.3 SDS 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 2.2.4 玻璃珠法提取酵母或白念珠菌的基因组DNA |
| 2.2.5 DNA 片段的切胶纯化 |
| 2.2.6 乙醇沉淀DNA 片段 |
| 2.2.7 PCR 扩增DNA 片段原理与方法 |
| 2.2.8 白念珠菌基因组提取方法 |
| 2.2.9 白念珠菌细胞的转化 |
| 2.2.10 倍比稀释实验 |
| 2.2.11 白念珠菌毒力实验 |
| 2.2.12 网络信息搜集方法 |
| 第三章 实验过程与结果讨论 |
| 3.1 RCH1 生物信息学分析 |
| 3.2 白念珠菌rch1Δ/rch1Δ缺失株与pmc1Δ/pmc1Δ缺失株表型的相似性 |
| 3.3 环孢霉素A 可以抑制rch1Δ/rch1Δ缺失株对钙离子敏感的表型 |
| 3.4 胞外Mg~(2+)能够抑制rch1Δ/rch1Δ缺失株对Ca~(2+)的敏感 |
| 3.5 白念珠菌pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株的构建 |
| 3.5.1 DWCA14 系列菌株及其检测 |
| 3.5.2 DWCA15 系列菌株及其检测 |
| 3.5.3 DWCA16 系列菌株及其检测 |
| 3.5.4 DWCA17 系列菌株及其检测 |
| 3.6 白念珠菌pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株的表型实验 |
| 3.7 白念珠菌pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株的形态学研究 |
| 3.8 白念珠菌pmc1Δ/pmc1Δrch1Δ/rch1Δ双基因缺失株小鼠毒力研究 |
| 3.9 白念珠菌RCH1 基因与PMC1 基因的功能互补实验 |
| 3.9.1 pCK1-RCH1 质粒的构建 |
| 3.9.2 白念珠菌RCH1 基因与PMC1 基因的功能互补实验 |
| 3.10 讨论 |
| 3.10.1 本论文总结 |
| 3.10.2 真菌耐药性与胞内钙离子稳态 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 一、临床真菌感染状况 |
| 二、抗真菌药物研究进展及面临问题 |
| 三、临床真菌耐药状况 |
| 四、联合用药抗真菌作用研究进展 |
| 五、小檗碱药理作用研究进展 |
| 六、小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌作用研究 |
| 七、蛋白质组学研究进展 |
| 八、基因芯片技术在白念珠菌研究中的应用 |
| 九、本研究课题的目的和意义 |
| 第一部分 小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的蛋白质组研究 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 应用基因芯片技术研究小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的分子机制 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的空泡机制研究 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 在读期间发表论文及获奖情况 |
| 致谢 |
（8）呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 抗真菌药物作用机制及真菌耐药机制研究现状 |
| 1.1 抗真菌药物作用机制 |
| 1.2 真菌的耐药机制 |
| 第2章 基因芯片技术在药物筛选中的应用 |
| 2.1 我国药物筛选的状况 |
| 2.2 新药筛选的发展趋势 |
| 2.3 基因芯片和药物筛选的概念 |
| 2.4 基因芯片技术在药物筛选中的作用 |
| 2.5 基因芯片技术在药物筛选中的应用 |
| 第3章 抗真菌天然产物研究进展 |
| 3.1 中药复方抗真菌的研究 |
| 3.2 单味中药及中药有效成分抗真菌的研究 |
| 3.3 中草药抗真菌的机理研究 |
| 3.4 问题与展望 |
| 3.5 机遇与挑战 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 白鲜碱抗临床分离真菌的体外药敏实验及白鲜碱细胞毒性实验 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 白鲜碱对酿酒酵母表达谱影响的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 利用荧光定量RT-PCR 技术和免疫印迹验证芯片结果 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 利用激光共聚焦等技术研究白鲜碱的抗真菌机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻博期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 作者简介 |
（9）白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 白念珠菌交替呼吸与其耐药性关系 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第二部分 线粒体醛脱氢酶ALD5 基因对抗真菌药物敏感性的影响 |
| 一 ALD5 基因敲除菌的构建及鉴定 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| 二 ALD5 基因高表达菌的构建及鉴定 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| 三 ALD5 基因对抗真菌药物敏感性的影响 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| （三） 讨论 |
| 第三部分 耐药相关基因的突变分析 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| （三） 讨论 |
| 第四部分 白念珠菌ORF19.1510 等新基因的耐药相关功能研究 |
| 一 ORF19.1510 等目的基因敲除菌的构建及鉴定 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| 二 ORF19.1510 等目的基因对抗真菌药物敏感性的影响 |
| （一） 材料与方法 |
| （二） 结果 |
| （三） 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（10）白念珠菌新基因MRF1的耐药相关功能研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 白念MRF1基因的缺失菌株构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 试剂及配制 |
| 1.1.4 仪器与装置 |
| 1.1.5 MRF1基因敲除载体的构建及鉴定 |
| 1.1.6 MRF1基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 MRF1基因敲除质粒的构建及鉴定 |
| 1.2.2 MRF1基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 白念MRF1基因的高表达菌株构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器与装置 |
| 2.1.5 MRF1基因高表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1.6 MRF1基因高表达菌株的构建及鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 MRF1基因高表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.2 MRF1基因高表达菌株的构建及鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 白念MRF1基因的耐药相关功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株及质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 试药和试剂 |
| 3.1.4 仪器与装置 |
| 3.1.5 生长动力学实验 |
| 3.1.6 药物敏感性实验 |
| 3.1.7 耐受H_2O_2 Spot assay实验 |
| 3.1.8 Real-time PCR检测MRF1基因高表达后对其他己知耐药相关基因表达量的影响 |
| 3.1.9 菌丝培养及观察 |
| 3.1.10 生物膜形成实验 |
| 3.1.11 激光共聚焦实验 |
| 3.1.12 甾醇成分分析 |
| 3.1.13 内源性活性氧检测 |
| 3.1.14 Rhodamine 6G荧光外排实验 |
| 3.1.15 ATP测定 |
| 3.1.16 线粒体膜电位检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MRF1基因不是白念珠菌生存必需基因 |
| 3.2.2 MRF1基因加快白念珠菌的生长倍增时间 |
| 3.2.3 MRF1基因无明显改变白念珠菌对唑类药物的敏感性 |
| 3.2.4 MRF1基因略影响白念珠菌对氧化刺激的敏感性 |
| 3.2.5 Real-Time PCR结果 |
| 3.2.6 MRF1基因略减弱白念珠菌菌丝形成能力 |
| 3.2.7 MRF1基因降低白念珠菌生物膜形成能力 |
| 3.2.8 白念珠菌生物被膜形态观察 |
| 3.2.9 MRF1基因缺失不影响白念珠菌甾醇的生物合成 |
| 3.2.10 抗真菌药物作用下MRF1基因略降低白念珠菌内源性活性氧水平 |
| 3.2.11 MRF1基因不影响白念珠菌的外排功能 |
| 3.2.12 MRF1基因略增加白念珠菌ATP的产生 |
| 3.2.13 MRF1基因略增加白念珠菌珠菌线粒体膜电位 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
四、膜转运蛋白与白念珠菌抗药（论文参考文献）
- [1]中国多中心侵袭性感染毛孢子菌流行病学、致病力和唑类耐药机制及乙酰转移酶调控因子Gcn5对光滑念珠菌耐药性和致病力的调控机制研究[D]. 于淑颖. 北京协和医学院, 2021(02)
- [2]基于转录组与真菌病毒侵染解析皮落青霉咪鲜胺抗机制[D]. 王胜强. 华中师范大学, 2020(01)
- [3]白念珠菌耐药基因的筛选[D]. 邓稀仁. 南昌大学, 2018(07)
- [4]1970–2015年白念珠菌耐药机制的文献计量分析[J]. 李德东,管少兴,胡静,单文治,刘屏,孙艳. 中国药物应用与监测, 2016(04)
- [5]白念珠菌铁稳态系统相关基因的功能研究[D]. 徐宁. 南开大学, 2014(04)
- [6]白念珠菌CaRCH1基因的功能研究[D]. 杜玮. 天津大学, 2010(07)
- [7]小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究[D]. 许懿. 第二军医大学, 2010(05)
- [8]呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究[D]. 郭娜. 吉林大学, 2009(08)
- [9]白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制[D]. 阎澜. 第二军医大学, 2009(10)
- [10]白念珠菌新基因MRF1的耐药相关功能研究[D]. 李妙海. 沈阳药科大学, 2009(S1)