一、核酸疫苗的研究现状和临床应用前景（论文文献综述）
周仪[1]（2020）在《MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究》文中研究指明癌症由于其逐年迅速攀升的高致病率及死亡率,严重威胁着人们的生存健康及生活质量。肿瘤免疫治疗作为随现代生物技术进步,应运而生的第四种肿瘤治疗方式,由于其良好的治疗效果,得到广泛关注。肿瘤基因疫苗具有制备简单,成本低、安全性高等特点,成为研究最为广泛的肿瘤免疫治疗方式。但肿瘤基因疫苗作为含有抗原、能够诱导机体免疫反应、产生特异性免疫、从而杀伤肿瘤的生物制剂,其长期稳定性及安全性是非临床研究的主要内容。对于肿瘤疫苗的非临床安全性研究,不仅要评价急性毒性试验、重复给药毒性试验、过敏试验等毒理学角度涉及的安全性内容,还必须通过组织分布,定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律,从药代动力学角度提供理论支撑。本课题组,前期已构建以双顺反子为载体、两种肿瘤相关抗原survivin和MUC1为免疫原、CpG基序和IL-2为免疫佐剂的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS,并且已完成BALB/c小鼠肌肉单次注射给药毒性试验、豚鼠全身主动过敏试验、家兔肌肉注射刺激性试验,为疫苗的临床应用提供了毒理学相关参考数据。基于以上前期研究基础,本论文将继续完成非临床安全性检测的组织分布及药代动力学研究,从定量分析的角度,为疫苗临床应用提供支撑。首先对质粒标准品CpDV-IL2-sPD1/MS进行序列分析,针对序列特点特异性设计引物,而后以质粒标准品及小鼠基因组DNA分别为模板,进行Q-PCR反应,分析CT值结果并考虑后续实验进行可行性,综合分析,确定选择引物IL-2（Y）继续进行后续实验。在确定引物后,进行方法学的建立,包括对引物浓度、引物退火温度、反应体系DNA载量等相关内容优化。在方法学建立过程中,主要采用单一变量法,始终以质粒标准品为模板,以灭菌水为阴性对照,进行梯度试验,确定了Q-PCR的反应体系,其中最适引物浓度为200 nM、引物最适退火温度为60℃、反应体系最大DNA载量为0.2 ug。而后对方法学从线性及线性范围、准确度、精密度、灵敏度等方面进行验证。确立质粒标准品在102-108拷贝/反应范围内建立的标准曲线,具有良好线性,线性系数（R2）大于0.99,PCR反应扩增效率在0.9-1.1之间,且检测方法对质粒标准品灵敏准确,相对回收率在50%-200%之间,RSD小于20%,灵敏度为62.5拷贝/ug genome。综上,完成整体方法学的建立与验证。提取给药后不同时间点的小鼠基因组DNA,运用建立并验证的方法学,进行Q-PCR反应,对组织样品中四个取样时间点的768例实验样品进行绝对定量分析。从组织分布结果可见,疫苗在给药后,首先在注射部位及血液中被检测到,而后在所选取的十六个组织部位均有分布,最后在脑组织中仍有少许残留。由此,可判断疫苗注射后,在体内的代谢呈快速吸收与分布,缓慢消除的特点。综上,本论文完成了课题组研制的DNA疫苗CpDV-IL2-sPD1/MS的非临床安全性检测中组织分布及药代动力学研究,首次采用Q-PCR法,对组织样品中疫苗含量进行绝对定量分析,进一步证实了疫苗的安全性,也提供了下一步探讨研究的主要方向,为疫苗进入临床试验阶段,提供了科学、可靠的理论依据。
童武[2]（2020）在《猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制》文中提出猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染所引起的以妊娠母猪流产、仔猪表现神经症状及高死亡率为特征的一种传染性疾病。目前对猪伪狂犬病的防控与净化主要还是靠接种基因缺失疫苗并配合相应的血清学检测来完成。我国于上世纪70年代从匈牙利引进PRV弱毒活疫苗Bartha K61株,并在猪场中推广应用后,猪伪狂犬病疫情得到了有效的控制。但2011年以来,很多伪狂犬病疫苗免疫过的猪场,大面积爆发了伪狂犬病,原来已经净化的猪场也在短时间内变成伪狂犬病野毒阳性,给养猪业造成了巨大的经济损失。经研究发现,引发免疫猪场伪狂犬病疫情的是一种变异的PRV毒株,该变异株的毒力较经典强毒株有明显增强,且现有的疫苗不能为免疫猪群提供完全保护。因此,研制新一代针对变异株的疫苗对于控制新发伪狂犬病十分必要,且具有重要意义。1、猪伪狂犬病病毒g E/g I双基因缺失疫苗候选株的研制（1）猪伪狂犬病病毒变异株（JS-2012株）g E/g I双基因缺失株的构建:以实验室前期分离的PRV变异株（JS-2012株）为基础,将其经过两次同源重组,将主要毒力基因g E/g I进行缺失,成功构建g E和g I基因双缺失的重组伪狂犬病基因缺失株,命名为JS-2012-△g E/g I。（2）JS-2012-△g E/g I病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I株在Vero细胞上连续传20代,未出现任何突变,表明其具有很好的稳定性。采用间接免疫荧光和Western blot进行g E蛋白表达检测,结果显示该疫苗候选株的g E蛋白成功失活。病毒生长曲线和蚀斑形态检查结果显示,JS-2012-△g E/g I与JS-2012在细胞上生长动力学相似,但JS-2012-△g E/g I形成的蚀斑要明显小于JS-2012。（3）JS-2012-△g E/g I病毒的安全性试验:结果表明,疫苗候选株对哺乳仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播;返祖试验证明该疫苗候选株不能在仔猪体内发生毒力返强。（4）JS-2012-△g E/g I病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,该疫苗候选株免疫仔猪后针对PRV变异株和经典PRV强毒株攻击均能提供完全的免疫保护。被动免疫试验结果表明,该疫苗候选株免疫母猪后所产仔猪通过哺乳也能获得完全的免疫保护。2、含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的研制（1）表达猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株的构建:以本研究所构建的伪狂犬病基因缺失弱毒活疫苗（JS-2012-△g E/g I株）为骨架,经过两次同源重组,成功获得一株含猪瘟病毒E2基因的重组PRV活载体疫苗株,命名为JS-2012-△g E/g I-E2。（2）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的生物学特性分析:JS-2012-△g E/g I-E2株在Vero细胞上连续传20代,E2基因均能在载体病毒JS-2012-△g E/g I中稳定存在,且未出现任何突变;采用间接免疫荧光和Western blot进行E2蛋白表达检测,结果证明该重组疫苗候选株中的E2蛋白在传代过程中均能稳定表达。病毒生长曲线和蚀斑形态结果显示,JS-2012-△g E/g I-E2与亲本病毒JS-2012-△g E/g I均具有高度的相似性。（3）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的安全性试验:结果表明,重组疫苗候选株对仔猪和妊娠母猪均具有很好的安全性;该重组疫苗不能在猪群中水平传播,也不能通过母猪垂直传播。（4）JS-2012-△g E/g I-E2病毒的免疫效力试验:免疫攻毒试验结果表明,重组疫苗候选株JS-2012-△g E/g I-E2免疫阴性仔猪,能有效的抵抗PRV强毒株和猪瘟病毒强毒株的攻击,临床保护效率达100%。重组疫苗候选株免疫PRV母源抗体阳性仔猪,然后再攻猪瘟强毒,临床保护效率仍能达到80%,这表明该载体疫苗能够较好地抵抗母源抗体干扰。综上所述,本试验构建的两株伪狂犬病病毒基因工程疫苗候选株（JS-2012-△g E/g I株和JS-2012-△g E/g I-E2株）,对仔猪和妊娠母猪均安全、有效,且不具备水平和垂直传播能力。同时,这两种疫苗都具有标记疫苗的特征,在临床应用过程中可利用其相应的分子标记来区分野毒感染动物与疫苗免疫动物,从而有利于净化猪群中的PRV和猪瘟病毒。如此,这两种疫苗将具有广阔的临床应用前景。
高映雪[3]（2020）在《2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建》文中提出猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classic Swine Fever virus,CSFV）引起的高度接触性热性传染病,是影响养猪业的主要传染病之一,疫苗接种是该病的主要的防控手段,对猪群猪瘟抗体水平的监测反映猪群的免疫保护水平。本研究对2018～2018年江西省部分地区猪群的猪瘟抗体水平进行了血清学检测,旨在了解不同阶段猪群的猪瘟免疫保护水平。猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒的一种结构蛋白,是猪瘟病毒的主要保护性抗原,目前已有商品化猪瘟E2蛋白亚单位疫苗应用于猪瘟的免疫防控。本研究构建了表达猪瘟E2蛋白的重组猪痘病毒,成功表达猪瘟E2蛋白,为猪瘟亚单位疫苗的研发打下基础。1.江西省猪瘟抗体水平的调查利用IDEXX公司猪瘟抗体检测试剂盒对2016～2018年来自江西省部分地区猪场共计16424份猪血清进行了猪瘟抗体水平检测（其中种猪10238份、哺乳仔1107份、保育猪2745份、育肥猪2289份）。结果显示,2016～2018年的猪瘟抗体阳性率分别为82.53%、83.21%、82.88%;春、夏、秋、冬猪瘟抗体阳性率分别为83.19%、81.41%、83.53%和83.27%,不同季节之间抗体阳性率差异不明显;不同阶段猪群的猪瘟抗体阳性率差异较大:种猪阳性率为90.16%、哺乳仔猪阳性率为73.23%、保育猪阳性率为59.20%、育肥猪阳性率为82.96%,其中保育猪的猪瘟抗体水平最低,究其原因可能为哺乳仔猪阶段的母源抗体衰减,免疫程序的不合理或机体还没有足够的时间产生良好的免疫应答;南昌、九江、赣州、宜春、上饶、吉安、抚州、景德镇、萍乡、新余、鹰潭共11个地区的猪瘟抗体阳性率分别为86.23%、82.94%、87.55%、82.35%、79.23%、82.87%、82.49%、87.70%、75.29%、86.21%、79.42%,不同地区的猪瘟抗体阳性率差异不大。2.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建以猪瘟病毒江西分离株CSFV-JXNC01-2015（NCBI登录号:KX064281.1）基因组为模板合成E2基因全长,设计引物扩增E2基因（3’端加标签蛋白6×his）,采用In-fusion Clone方法将E2基因连接到本实验室已构建的p SWE101转移载体上,构建重组质粒p SWE101-P28-E2-His。猪痘病毒江西分离株SWPV-JX20G为亲本病毒,TK基因为外源基因的插入位点,痘苗病毒启动子P28启动外源基因,经转染及5轮重组病毒纯化得到纯的重组猪痘病毒r SWPV-P28-E2-His,重组病毒大量增殖后进行SDS-PAGE电泳验证,结果表明重组病毒成功表达可溶性E2蛋白。
胡峰[4]（2020）在《锦鲤疱疹病毒碳纳米管载体核酸疫苗的构建及其免疫效果评价》文中认为锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）,又称为鲤疱疹病3型（Cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3）,能够导致鲤鱼、锦鲤及其变种患上高度传染性锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）。锦鲤疱疹病毒病是在20世纪末被发现及确认的,现已在全球范围内爆发,严重威胁鲤和锦鲤养殖产业安全。目前,锦鲤疱疹病毒病没有药物可以防控,疫苗是控制疾病最有效的方法。本论文通过研制安全高效低成本的碳纳米管载核酸疫苗,疫苗经肌肉注射、浸泡免疫的方式,在一定剂量范围内能够获得较好的免疫保护效果,有效降低KHVD对锦鲤的致死率,为后续疫苗研发应用奠定基础。全文内容主要分为以下三个部分:1、单壁碳纳米管载锦鲤疱疹病毒ORF149（SWCNTs-ORF149）核酸疫苗的构建:在实验室前期研究基础上,从锦鲤疱疹病毒的候选抗原蛋白中筛选囊膜蛋白ORF149作为本实验的目标蛋白。以单壁碳纳米管（SWCNT）作为运输载体,构建锦鲤疱疹病毒（KHV）ORF149核酸疫苗。首先构建pc DNA3.1（+）-ORF149重组质粒,通过瞬时转染和免疫印迹分析确定其表达情况,最后通过1,3-偶极环加成反应法将重组质粒与SWCNTs进行偶联。结果表明,构建的重组质粒转染细胞后在免疫印迹分析和间接免疫荧光试验中均能检测到特异性信号,而空白对照组均无反应;在核酸琼脂糖凝胶电泳中,构建的重组疫苗电泳痕迹消失;在场发射扫描电镜观察下,与重组质粒进行偶联的SWCNTs和空白SWCNTs形态差异明显。成功构建了单壁碳纳米管载KHV ORF149新型核酸疫苗,为后续进行免疫效果研究奠定基础。2、SWCNTs-ORF149核酸疫苗注射免疫及效果评价:将重组核酸疫苗（SWCNTs-ORF149）通过肌肉注射的方式,分别以1μg、5μg和10μg三个剂量对进行免疫。注射后体内重组质粒表达检测显示,ORF149成功进入鱼体并表达;免疫后1-8周血清效价检测发现,三个实验组血清抗体水平均明显高于空白对照组,其中10μg注射剂量组抗体水平最高,并在第4周时达到峰值;免疫相关基因检测表明,实验组免疫相关基因均出现上调,10μg组上调幅度最大,与血清检测结果一致;免疫相关生理指标检测,如酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等,结果显示实验组均出现明显升高免疫4周后进行攻毒实验,实验组死亡率低于空白对照组,10μg注射组死亡率最低,其相对免疫保护率达到81.9%,显着高于其他组。说明重组核酸疫苗（SWCNTsORF149）通过肌肉注射免疫的方式,能有效降低KHV的致死率,达到较好的免疫保护效果。3、SWCNTs-ORF149核酸疫苗浸泡免疫及效果评价:将重组核酸疫苗（SWCNTs-ORF149）通过浸泡的方式,分别以1mg/L、5mg/L和10mg/L三个剂量进行免疫。免疫后1-8周血清效价检测发现,10mg/L实验组血清抗体水平均明显高于空白对照组,其中10mg/L剂量组抗体水平最高,并在第4周时达到峰值;免疫相关基因检测表明,10mg/L组上调幅度最大,与血清检测结果一致;免疫相关生理指标检测,如酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等,结果显示10 mg/L实验组出现明显升高;免疫4周后进行攻毒实验,结果表明实验组死亡率低于空白对照组,10mg/L组死亡率最低,其相对免疫保护率达到56%,显着高于其他组。说明重组核酸疫苗（SWCNTsORF149）通过浸泡免疫的方式,也能有效降低KHV的致死率。本文通过构建单壁碳纳米管偶联的锦鲤疱疹病毒ORF149重组核酸疫苗,研究了在肌肉注射与浸泡两种免疫方式作用下核酸疫苗的免疫效果,为后续疫苗投入实际应用奠定基础。
陈江华[5]（2020）在《表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组伪狂犬疫苗的初步研究》文中研究指明非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的高致死率传染性疾病,家猪及野猪感染强毒后致死率接近100%。该疫情于1921年在肯尼亚首次报道,随后逐渐向欧洲、亚洲等国家蔓延且无商品化疫苗用于预防。在本研究中我们通过CRISPR/Cas9技术构建了表达ASFV CD2v蛋白的重组伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）（PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v））。PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）在Vero细胞中增殖能力与弱毒株（PRV-△gE/△gI/△TK）无明显差异,但PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）及PRV-△gE/△gI/△TK在小鼠外周血淋巴细胞（PBMC）中增殖能力明显弱于强毒株（PRV-Fa）,PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）在Vero细胞中连续20次传代CD2v依然维持高水平表达。经小鼠验证PRV-Fa侵染小鼠后会引起严重的瘙痒且可在脑、肺、心、肝、脾、肾检测到病毒核酸,而PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）与PRV-△gE/△gI/△TK不会引起瘙痒且未检测到病毒核酸。只有PRV-Fa可诱导组织IL6转录水平上调及血清IL6含量上升,但三者都未引起IL1β、TNFα、IFNβ转录水平的改变,而PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）与PRV-△gE/△gI/△TK都可激活T细胞免疫。重组毒株免疫小鼠后可产生高滴度抗ASFV CD2v蛋白的特异性抗体,用强毒株PRV-Fa攻毒对照组在第四天全部死亡,而重组毒株免疫组保护率为100%,在攻毒后免疫组排毒峰值出现的时间比对照组早,但排毒量远低于对照组。这些结果表明重组表达ASFV CD2v蛋白的PRV重组弱毒株PRV-△gE/△gI/△TK-（CD2v）是安全有效的,可能作为预防非洲猪瘟及伪狂犬病的候选疫苗株。
毛敏[6]（2020）在《纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用》文中指出核酸疫苗是指将含有编码蛋白基因序列的质粒载体导入宿主体内,通过宿主细胞表达相应的抗原蛋白,诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答。直接将核酸疫苗注射到宿主体内,易过早被体内的核酸酶降解,而不能有效发挥作用。因此,核酸疫苗免疫治疗成功的关键是发展出一种具有靶向特异性与基因高效转移和缓慢表达,并且不产生任何毒副作用的理想佐剂,但现行佐剂存在安全性低、稳定性不强以及局部毒副作用等问题。纳米金（Gold nanoparticles,GNPs）是粒径在10-150 nm间的胶体金颗粒,制备简单,价格低廉,具有高电子密度,能与DNA、蛋白质等多种生物大分子结合,降低大分子在体内的半衰期,且不影响其生物活性,生物相容性好。提示纳米金可能作为一种新型的核酸疫苗佐剂。哺乳动物中枢神经系统（Central nervous system,CNS）损伤后再生困难的一个重要原因是中枢微环境存在髓磷脂抑制因子（myelin-associated inhibitors,MAIs）,现发现四种MAIs:Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）、髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein,MAG）和硫酸软骨素蛋白多醣（chondroition sulfate proteoglycans,CSPGs）,它们主要通过Nogo受体（Nogo-66 receptor,NgR）和配对免疫球蛋白样受体 B（paired immunoglobulin-like receptor B,PirB）介导对神经再生的抑制作用。因此,以NgR、PirB为双靶点采取干预措施可能会逆转MAls介导的神经再生抑制作用。为探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,本研究以MAls信号为切入点,将GNPs与GMCSF-NgR-PirB双靶向核酸疫苗以不同体积比混合后免疫动物,通过疫苗接种后对血清抗体滴度检测探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,并比较得到质粒与GNPs结合的最佳体积比。体外观察抗血清对神经元突起生长的影响,结合行为学检测、凋亡分析、束路追踪及病理染色等技术在体内观察其对损伤脊髓轴突再生及功能恢复的影响,并利用免疫荧光和Western blot技术进行相关分子机制研究,为脊髓及其他中枢神经系统损伤修复提供新的方法,为核酸疫苗佐剂研究提供新的方向。主要研究内容:1、纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得粒径为15 nm纳米金的制备与鉴定,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB质粒的扩增、鉴定及体外表达检测,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB经GNPs不同体积比包被后免疫动物、抗体滴度检测获得最佳制剂,形成高效价的双靶向融合核酸疫苗。2、纳米金介导的GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用将纳米金和脂质体与质粒以最佳制剂比混合后免疫动物,连续免疫六周后进行脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）)半切造模。行为学采用BBB评分和Catwalk步态分析评估各组大鼠后肢功能恢复情况;组织水平通过神经示踪检测疫苗免疫对脊髓神经束信号传递功能恢复的促进作用,通过HE、Nissl及TUNEL组织病理学染色检测脊髓损伤处神经元的数量、形态、分布及神经元的凋亡情况,观察疫苗免疫对SCI大鼠脊髓神经元的保护作用;免疫荧光染色及Western blot检测损伤处脊髓NgR、PirB及下游分子RhoA和ROCK2,以及神经生长因子GAP-43和突触可塑性相关蛋白Synapsin I的表达情况,从分子水平探讨疫苗免疫对SCI大鼠行为学改善的作用机制。3、体外检测抗血清对神经元突起生长的影响体外以PC12细胞为神经元培养模型,以MAG模拟体内的神经生长抑制作用,探讨抗血清对神经元突起生长的影响,并通过免疫荧光和WB检测相关蛋白表达情况,探讨其作用机制。主要结果及结论:1.ELISA结果显示GNPs和脂质体分别与质粒以1:1体积比混合免疫动物效果最佳。2.以GNPs为佐剂能有效促进双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗进入动物体内,刺激机体免疫系统产生特异性抗体,中和损伤脊髓的NgR和PirB蛋白,逆转其介导的髓磷脂再生抑制信号的传递,促进受损脊髓神经纤维修复及运动功能改善。3.以GNPs为佐剂明显提高了核酸疫苗的免疫效果,且其作为佐剂,免疫效应与阳性对照佐剂脂质体效果相当。
马小静[7]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中研究说明牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
梅建国[8]（2019）在《猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究》文中研究指明猪瘟是由猪瘟病毒引起的发热、急性、高度接触性传染病。该病死亡率高,不同年龄、性别和品种的猪均可发病,一年四季均可发生。目前,该病尚无十分有效的药物和治疗方法。采用品质优良的猪瘟疫苗进行预防接种,仍是当今猪瘟防控过程中行之有效的重要手段之一。于是,猪瘟疫苗质量优劣及其预防免疫效果,已成为决定猪瘟防疫成败的关键因素。从多年的免疫接种和市场应用效果来看,我国的HCLV株在安全性和有效性方面表现十分优异,已成为世界公认的猪瘟活疫苗标准毒株。一直以来,传统猪瘟疫苗以兔源组织苗（包括脾淋苗、乳兔苗）和原代细胞苗为主。其生产成本高、污染难以控制、动物需求量大、工艺过程难以监测等缺点,已成为猪瘟疫苗大规模生产中一时无法逾越的瓶颈难题。随着猪瘟ST传代细胞源活疫苗的成功开发与应用,这些技术难题便迎刃而解。由于传统转瓶细胞培养技术的长期普遍应用,疫苗批间差异大、质量稳定性差、抗原滴度低、免疫效果差、不良反应大等新的影响猪瘟疫苗质量的难题也随之而来。本课题采用自主研发的细胞培养微载体及其应用技术,结合细胞生物反应器大规模高密度悬浮培养ST细胞,制备稳定均一的CSFV抗原,从根本上解决传统工艺面临的各种难题。同时,通过反应器细胞培养技术条件优化,有效提高病毒滴度,稳定病毒生产过程,建立一套完善的猪瘟病毒抗原大规模生产技术工艺,为制造稳定高效的猪瘟疫苗奠定良好的技术基础。为此,本课题的研究内容主要包括以下五个部分:第一部分:ST细胞单层静置培养特性及CSFV转瓶培养工艺研究。通过对ST细胞株培养特性的研究,可以看出,该细胞株生长速度快,细胞状态好。细胞倍增时间（DT）为16.1 h,72 h转瓶ST细胞密度达7.6×105 cells/mL,具有较强的生长扩增能力。在细胞培养至48 h,按4%（v/v）接种量接种CSFV种子细胞毒。CSFV并不引起ST细胞产生特征性CPE。从细胞日糖耗量看,CSFV感染细胞糖耗水平略高于正常细胞。病毒收获从接毒后第5 d开始,共5收。除第1收外,各收次病毒滴度为5×105 RID/mL。结果表明,CSFV能在经人工选育的ST细胞株上正常增殖,为病毒的大规模培养准备了很好的前提条件。第二部分:微载体细胞培养性能研究与微载体选择。本研究分别从细胞上球率、贴壁时间、最大细胞生长密度等多项指标上考察了Cephodex和CephodexD两款细胞微载体的生物相容性和对ST细胞的适应性。从细胞上球阶段培养效果来看,ST细胞在CephodexD微载体上的上球时间为2 h,上球率为92.7%,细胞在载体表面能在较短时间内表现出良好的铺展性。而ST细胞在Cephodex载体上的上球时间为6 h,上球率为62.3%,且细胞在载体表面的延展性较差。从最大细胞生长密度来看,ST细胞在CephodexD上72 h细胞密度为1.9×106cells/mL,而在Cephodex上为1.3×106cells/mL,两者相差约50%。在不更换培养液的条件下,ST细胞能在CephodexD微载体上维持存活7 d以上,而在Cephodex微载体上则存活不足5 d。一系列研究表明,CephodexD微载体在生物相容性、ST细胞适应能力等方面明显优于Cephodex载体,而且更能满足CSFV大规模培养的技术工艺要求。第三部分:CSFV微载体摇瓶培养及其放大工艺研究。本研究采用摇瓶培养法进行新型微载体细胞培养技术工艺研究,主要从载体用法用量、细胞接种与微载体悬浮培养步骤方法以及糖耗测定与病毒效价测定等各个方面做了详细的条件探索。初步确定了4 g/L的微载体用量、细胞培养48 h的CSFV接种时间以及1:5的工艺放大比率。通过中间过程补料技术,可以达到1.86×106 cells/mL的最大细胞培养密度。选择ST细胞培养48 h进行病毒接种,可以使CSFV滴度达到7.5×105RID/mL,较转瓶工艺略有提升。按1:5的比率进行放大培养,既降低了种子制备的工作压力,又兼顾了操作过程的可行性,同时也保证了放大培养的终端规模。第四部分:CSFV微载体反应器悬浮培养及其放大工艺建立。本部分研究了采用细胞生物反应器和新型细胞微载体CephodexD进行ST细胞的大规模悬浮培养,并以此为基础建立了一套完善的CSFV大规模生产技术工艺。参考摇瓶培养法的技术数据,完成了微载体悬浮培养从3 L到15 L反应器级联放大工艺过程。采用胰酶二步消化法,实现了细胞与微载体的完全分离以及细胞之间的相互分散。反应器内ST细胞生长72 h,最大细胞密度可达2.93×106 cells/mL。ST细胞培养48 h后,按4%（v/v）接种CSFV种子细胞毒。从接毒后第4 d开始收毒,之后每3 d收获一次,共5收。病毒滴度为1×106 RID/mL,是转瓶工艺的2倍。整个收毒过程维持16 d,较转瓶工艺缩短5 d。研究表明,猪瘟病毒的新型微载体反应器悬浮培养技术较传统转瓶培养工艺,不仅大大提高了生产效率,而且很好地提高了病毒抗原的质量水平。这也为今后高质量猪瘟ST传代细胞源活疫苗的工业化生产奠定了良好的技术基础。第五部分:免疫原性及免疫效果评价。本部分将新型微载体反应器工艺生产的CSFV接种试验猪,14 d后采血。ELISA试验测出试验猪血清中含有较高水平的CSFV抗体。采用IFA法,研究了反应器培养的CSFV的抗原特异性。在荧光显微镜下,可见感染CSFV的ST细胞胞浆内有明显的颗粒状或弥散性荧光,且荧光反应主要集中于细胞浆中,而未感染的ST细胞则无荧光。这些研究表明,反应器培养的CSFV具有良好的免疫原性和反应原性。同时,将新工艺制备的CSFV接种试验组猪和对照组猪各5只。14 d后,进行CSFV强毒攻毒试验。观察16 d,免疫猪无明显的临床症状,也无明显的发热反应,保护率达100%。对照组猪临床症状明显,有发热反应,全部死亡。结果表明,新型微载体悬浮培养技术制备的CSFV抗原具有良好的免疫保护效果。
何琦瑶[9]（2019）在《WSSV的分离鉴定及3种结构蛋白对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响》文中指出白斑综合征（White Spot Syndrome,WSS）给全世界范围内的虾蟹类养殖业带来了重大的危害。WSS主要症状表现为头胸甲出现白斑,在临床症状出现10天内感染虾会全部死亡。20世纪90年代在我国台湾地区首次被报道,至今WSS席卷全球,给全世界范围的虾类养殖业带来了无法预计的损失。白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）感染虾类发病后没有特效药物可以进行有效控制,防治方法主要以预防为主。本试验从湖北潜江自然发病的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）中分离到WSSV,并克隆相关结构蛋白VP28、VP24、VP466基因构建重组真核表达质粒,并研究其对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响。发病克氏原螯虾临床症状主要表现为摄食减少,活力下降,反应迟钝;肝胰腺、肠、肌肉、鳃组织均出现以细胞核肿大,细胞坏死为特征的病理学变化;PCR检测结果显示,患病克氏原螯虾WSSV阳性检出率为56%;检测产物测序并进行系统发育树分析,结果显示该基因序列与WSSV的EG3株（KR083866.1）核苷酸序列同源性为100%。人工感染螯虾的累积死亡率为100%,并出现与自然发病虾相同的症状。巢式PCR检测结果显示,人工感染病虾为WSSV阳性。本研究对湖北潜江地区自然发病的克氏原螯虾进行临床症状观察、PCR检测、系统发育树分析、人工感染和组织病理学观察,鉴定出导致克氏原螯虾大规模死亡的病原是WSSV。VP24,VP28,VP466蛋白含量在WSSV均较高,为主要的抗原蛋白,是作为WSSV免疫防治研究的重要候选蛋白。WSSV的DNA分子为双链环状,依照Genbank上公布的基因序列进行引物设计。将目的基因与T载连接,再连接pEGFP-N1真核表达质粒构建重组质粒。按照50μg/尾螯剂量,在螯虾腹部肌肉进行注射免疫,并设置pEGFP-N1组和PBS组。重组质粒pEGFP-N1-VP24、pEGFP-N1-VP28、pEGFP-N1-VP466免疫螯虾后12d,在螯虾肌肉、肝胰腺、鳃、肠、胃组织中均能检测到目的基因的存在,表明各组重组真核表达质粒广泛分布在螯虾各组织中。且转染结果显示,重组真核表达质粒能在FHM中进行表达。免疫后7d以10-3.1.mL-1种毒液按0.1ml/尾的剂量于螯虾腹节肌肉进行注射攻毒,pEGFP-N1-VP24组、pEGFP-N1-VP28组、pEGFP-N1-VP466组的的相对保护率分别为31.57%、42.11%、26.32%。于免疫后0h、48h、72h、168h、336h采集各组螯虾的肝胰腺和肌肉组织,检测螯虾非特异性免疫指标。pEGFP-N1-VP28组、pEGFP-N1-VP24组、pEGFP-N1-VP466组螯虾体内SOD活力在免疫48h后开始升高,72h体内SOD活性达到最高。各质粒组螯虾体内PO活力在72h和168h体内活性均较高,与对照组螯虾体内PO活性值有显着性差异。pEGFP-N1-VP28组螯虾在48h至336h,体内POD活性均较高与对照组螯虾体内POD活性值有显着性差异。结合攻毒实验的免疫保护率结果及SOD、PO、POD的变化情况显示WSSV相关结构蛋白VP24、VP28、VP466基因构建的质粒能提升螯虾非特异免疫水平,且能降低克氏原螯虾感染WSSV后的死亡率。
张涵[10]（2019）在《美洲型PRRSV二价核酸疫苗的制备及小鼠的免疫研究》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS 最早于1987年在美国报道,自爆发以来,给养猪业造成了严重的经济损失。在1995年左右传入中国,引起该病的的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）。我国流行的主要是美洲型PRRSV及其变异株,近些年来我国PRRSV谱系呈多样化趋势,增加了我国对PRRS的预防和治疗的难度。JXA1-like谱系毒株是PRRS爆发以来比较流行的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）,而NADC30-like谱系毒株是近些年流行的HP-PRRSV。通过这两个谱系构建的二价核酸疫苗将是一种非常理想的防控PRRSV的新型疫苗。从某发病猪场采集样本采集到一株PRRSV将其命名为YN-L株。对其进行全基因扩增,然后对其Nsp2、GP5基因和全基因组进行遗传进化分析及同源性比对,并对其Nsp2、GP5基因编码的氨基酸的序列进行比对,证实该YN-L株为JX41-like谱系毒株。对YN-L毒株的理化特性进行研究,结果表明,YN-LQ毒株不耐热、不耐酸和碱,对乙醚、氯仿和紫外线敏感,对胰蛋白酶和超声波不敏感。将YN-LQ株的ORF5基因与NADC30-Lie的ORF5基因通过自裂解Linker进行连接,再与pVAX1载体连接构建二价核酸疫苗,转染至BHK细胞,用蛋白免疫印迹（Western Blot）等方法进行验证。结果显示,二价核酸疫苗可表达GP5（JXA1-Like）-Linker-GP5（NADC30-Like）目的蛋白。将所构建的二价核酸疫苗进行小鼠免疫研究,实验结果显示,二价核酸疫苗加佐剂组可提高小鼠的体液免疫和细胞免疫,具有较好的免疫原性。IL-4和IFN-γ细胞因子检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。中和抗体检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组高于其它组,中和抗体滴度最高达1:17.77。CD3+CD4+和CD3+CD8+血清细胞因子检测结果显示35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。T淋巴细胞增殖实验结果显示:特异性刺激组的刺激指数（SI）高于非特异性刺激组,二价核酸疫苗加佐剂组和二价核酸疫苗组高于其它组。在特异性刺激中,二价核酸苗加佐剂组高于二价核酸疫苗组;在非特异性刺激中,二价核酸疫苗加佐剂组也高于二价核酸疫苗组。综上,联合佐剂可提高二价核酸疫苗的免疫效果,为美洲型PRRSV疫苗的进一步研发奠定基础。
二、核酸疫苗的研究现状和临床应用前景（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核酸疫苗的研究现状和临床应用前景（论文提纲范文）
（1）MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 名词缩写注释表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤治疗 |
| 1.1.1 肿瘤治疗方式 |
| 1.1.2 肿瘤免疫治疗 |
| 1.1.3 肿瘤基因疫苗 |
| 1.2 疫苗非临床研究 |
| 1.2.1 疫苗非临床研究内容 |
| 1.2.2 疫苗非临床安全性研究 |
| 1.2.3 药代动力学与组织分布 |
| 1.3 论文的立题依据及实验设计 |
| 1.3.1 前期基础 |
| 1.3.2 本论文的立论依据 |
| 1.3.3 实验方案及框架 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂、仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物回溶 |
| 2.2.2 质粒标准品准备 |
| 2.2.3 待测样品准备 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR检测(qRT-PCR) |
| 2.2.5 qRT-PCR反应条件优化 |
| 2.2.6 标准曲线建立 |
| 2.2.7 方法验证 |
| 2.2.8 统计学处理方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布方法学的建立 |
| 3.1.1 引物设计及选择 |
| 3.1.2 引物退火温度和浓度的优化选择 |
| 3.1.3 反应体系最大DNA载量 |
| 3.1.4 引物特异性 |
| 3.1.5 小结 |
| 3.2 标准曲线和定量范围 |
| 3.3 qRT-PCR法检测肿瘤基因疫苗组织分布的方法学的验证 |
| 3.3.1 准确度与精密度 |
| 3.3.2 灵敏度 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 BALB/c小鼠肌肉注射给予粘蛋白1-生存素治疗性癌症疫苗组织分布检测 |
| 3.4.1 动物个体各组织分布数据 |
| 3.4.2 试验样品再分析 |
| 3.4.3 组织分布浓度随时间变化情况 |
| 3.4.4 小结 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制（论文提纲范文）
| 英文缩略词或符号表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.2 伪狂犬病病毒研究概况 |
| 1.2.1 伪狂犬病病毒的形态结构 |
| 1.2.2 伪狂犬病病毒的基因组结构 |
| 1.2.3 伪狂犬病病毒的基因功能 |
| 1.2.4 伪狂犬病病毒的理化特性 |
| 1.2.5 伪狂犬病病毒的复制与传播 |
| 1.3 伪狂犬病疫苗的研究现状及应用 |
| 1.3.1 猪伪狂犬病灭活疫苗 |
| 1.3.2 猪伪狂犬病常规活疫苗 |
| 1.3.3 猪伪狂犬病基因缺失活疫苗 |
| 1.3.4 猪伪狂犬病核酸疫苗 |
| 1.3.5 猪伪狂犬病病毒活载体疫苗 |
| 1.4 猪伪狂犬病的防控与净化 |
| 1.5 猪瘟病毒的流行现状及其疫苗的研究进展 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要设备及仪器 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 伪狂犬病病毒变异株(JS-2012 株)gE/gI双基因缺失毒株的构建 |
| 2.2.2 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.3 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性试验 |
| 2.2.4 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力试验 |
| 2.2.5 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 2.2.6 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的生物学特性分析 |
| 2.2.7 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性试验 |
| 2.2.8 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的免疫效力试验 |
| 2.3 数据处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 同源重组转移载体的构建 |
| 3.1.1 p EGFP-C3 质粒改造后的鉴定 |
| 3.1.2 同源重组臂的获得 |
| 3.1.3 同源重组转移载体的鉴定 |
| 3.2 同源重组转移载体转染条件的优化 |
| 3.3 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的构建 |
| 3.3.1 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的筛选及纯化 |
| 3.3.2 JS-2012-△gE/gI-egfp病毒的PCR鉴定 |
| 3.4 JS-2012-△gE/gI病毒的构建 |
| 3.4.1 JS-2012-△gE/gI病毒的筛选及纯化 |
| 3.4.2 JS-2012-△gE/gI病毒的PCR鉴定 |
| 3.5 JS-2012-△gE/gI病毒的生物学特性分析 |
| 3.5.1 JS-2012-△gE/gI病毒滴度及生长动力学 |
| 3.5.2 JS-2012-△gE/gI病毒的蚀斑形态学 |
| 3.5.3 JS-2012-△gE/gI病毒gE蛋白的表达情况 |
| 3.5.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.6 JS-2012-△gE/gI病毒的安全性 |
| 3.6.1 JS-2012-△gE/gI病毒对哺乳仔猪的致病性 |
| 3.6.2 JS-2012-△gE/gI病毒对妊娠母猪的致病性 |
| 3.6.3 JS-2012-△gE/gI病毒的水平传播能力 |
| 3.6.4 JS-2012-△gE/gI病毒的垂直传播能力 |
| 3.6.5 JS-2012-△gE/gI病毒在仔猪体内毒力返强能力 |
| 3.7 JS-2012-△gE/gI病毒的免疫效力 |
| 3.7.1 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的主动免疫效力 |
| 3.7.2 JS-2012-△gE/gI病毒对仔猪的被动免疫效力 |
| 3.8 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 |
| 3.8.1 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的获得 |
| 3.8.2 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒的PCR鉴定 |
| 3.9 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的生物学特性 |
| 3.9.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒滴度及生长动力学 |
| 3.9.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的蚀斑形态学 |
| 3.9.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒E2 蛋白的表达情况 |
| 3.9.4 JS-2012-△gE/gI病毒的遗传稳定性 |
| 3.10 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的安全性 |
| 3.10.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对哺乳仔猪的致病性分析 |
| 3.10.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对妊娠母猪的致病性分析 |
| 3.10.3 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的水平传播能力 |
| 3.10.4 JS-2012-△gE/gI-E2病毒的垂直传播能力 |
| 3.11 JS-2012-△gE/gI-E2 病毒的免疫效力 |
| 3.11.1 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对母源抗体阴性仔猪的免疫效力 |
| 3.11.2 JS-2012-△gE/gI-E2病毒对PRV母源抗体阳性猪的免疫效力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪狂犬病病毒变异株的抗原差异性与Bartha K61 免疫不完全保护的关系 |
| 4.2 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与缺失基因的关系 |
| 4.3 伪狂犬病基因缺失活疫苗的安全性与免疫原性的关系 |
| 4.4 伪狂犬病基因缺失活疫苗的鉴别诊断 |
| 4.5 猪瘟病毒的防控与净化 |
| 4.6 外源基因的插入位置与重组病毒特性的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
（3）2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟的防控 |
| 1.1.1 猪瘟的流行 |
| 1.1.2 猪瘟的实验室诊断 |
| 1.1.2.1 兔体交互试验 |
| 1.1.2.2 动物回归试验 |
| 1.1.2.3 抗体检测 |
| 1.1.2.4 分子诊断 |
| 1.2 CSFV的研究进展 |
| 1.2.1 CSFV的基因组 |
| 1.2.2 CSFV的主要蛋白 |
| 1.2.2.1 Erns蛋白 |
| 1.2.2.2 E2蛋白 |
| 1.3 CSFV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.3.2.1 亚单位疫苗 |
| 1.3.2.2 合成肽疫苗 |
| 1.3.2.3 核酸疫苗 |
| 1.3.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3.2.5 基因标记疫苗 |
| 1.4 SWPV载体研究进展 |
| 第二章 江西省猪瘟抗体水平调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂盒及主要仪器 |
| 2.1.2 猪血清样品的采集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪瘟抗体检测方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪瘟抗体检测结果 |
| 2.3.2 不同年份猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.3 不同季节猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.4 不同阶段猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.5 不同地区猪瘟抗体结果分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 CSFVE2蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 P28启动子序列 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 P28-E2-His基因的PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物胶回收 |
| 3.2.5 转移载体p SWE101-P28-E2-His的构建 |
| 3.2.5.1 pSWE101质粒的提取 |
| 3.2.5.2 pSWE101质粒的单酶切 |
| 3.2.5.3 p SWE101与P28-E2-his的连接及转化 |
| 3.2.5.4 阳性克隆筛选及双酶切验证 |
| 3.2.5.5 质粒的构建流程及测序 |
| 3.2.5.6 重组质粒的提取及浓度测定 |
| 3.2.6 转染 |
| 3.2.6.1 细胞准备 |
| 3.2.6.2 细胞接毒 |
| 3.2.6.3 转染 |
| 3.2.7 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.2.7.1 重组病毒感染及蚀斑挑取 |
| 3.2.7.2 病毒增殖 |
| 3.2.8 重组病毒r SWPV-P28-E2-His的 PCR鉴定 |
| 3.2.9 重组病毒的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.9.1 样品处理 |
| 3.2.9.2 制胶及电泳 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 P28-E2-His基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组菌菌落PCR结果 |
| 3.3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.4 转染结果 |
| 3.3.5 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.3.6 重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.3.7 P28-E2-His蛋白的表达方式鉴定 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）锦鲤疱疹病毒碳纳米管载体核酸疫苗的构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 介绍 |
| 2 KHV主要免疫原性蛋白基因 |
| 2.1 KHV主要囊膜蛋白基因 |
| 2.2 KHV衣壳蛋白基因 |
| 2.3 KHV其他蛋白基因 |
| 3.KHVD的诊断与防控 |
| 3.1 KHVD的诊断 |
| 3.2 KHVD的防控 |
| 4.水生生物核酸疫苗应用现状及前景 |
| 5 本研究主要内容及意义 |
| 5.1 主要内容 |
| 5.2 意义 |
| 第一章 单壁碳纳米管载锦鲤疱疹病毒ORF149核酸疫苗的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 重组表达质粒构建和扩增 |
| 1.1.2.2 质粒DNA瞬时转染 |
| 1.1.2.3 SDS-PAGE与免疫印迹分析(Western blot) |
| 1.1.2.4 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.1.2.5 单壁碳纳米管载重组质粒表达系统构建 |
| 1.1.2.6 单壁碳纳米管载重组质粒合成效果检测 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 目的基因克隆 |
| 1.2.2 重组真核载体的鉴定 |
| 1.2.3 Western blot分析 |
| 1.2.4 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.2.5 单壁碳纳米管载重组质粒合成效果检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 SWCNTS-ORF149 核酸疫苗注射免疫及效果评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 肌肉注射免疫 |
| 2.1.2.2 重组质粒检测 |
| 2.1.2.3 重组质粒表达检测 |
| 2.1.2.4 抗体效价检测 |
| 2.1.2.5 免疫相关表达基因检测 |
| 2.1.2.6 免疫相关生理指标检测 |
| 2.1.2.7 攻毒试验 |
| 2.1.2.8 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组质粒检测 |
| 2.2.2 重组质粒表达检测 |
| 2.2.3 抗体效价检测 |
| 2.2.4 免疫相关表达基因检测 |
| 2.2.5 免疫相关生理指标检测 |
| 2.2.6 免疫保护率 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 SWCNTS-ORF149 核酸疫苗浸泡免疫及效果评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 浸泡免疫 |
| 3.1.2.2 抗体效价检测 |
| 3.1.2.3 免疫相关表达基因检测 |
| 3.1.2.4 免疫相关生理指标检测 |
| 3.1.2.5 攻毒试验 |
| 3.1.2.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 抗体效价检测 |
| 3.2.2 免疫相关表达基因检测 |
| 3.2.3 免疫相关生理指标检测 |
| 3.2.4 免疫保护率 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间主要成果 |
| 致谢 |
（5）表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组伪狂犬疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 非洲猪瘟疫苗的研究趋势 |
| 2 伪狂犬疫苗的研究进展 |
| 第一章 重组伪狂犬病毒株的构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 第四节 小结 |
| 第二章 重组伪狂犬病毒株的毒力测试 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 重组伪狂犬病毒株的有效性测试 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（6）纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写标注 |
| 绪论 |
| 1. 纳米金及其作为一种新型佐剂在疫苗研究中的应用 |
| 2. 治疗性疫苗接种策略及其在中枢神经损伤修复中的应用 |
| 3. MAIs通过NgR及PirB介导中枢神经轴突再生的抑制效应 |
| 第一章 纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要实验试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 纳米金的制备及鉴定 |
| 2.1.1 15 nm纳米金的制备 |
| 2.1.2 15 nm纳米金的鉴定 |
| 2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增、鉴定及体外表达检测 |
| 2.2.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增 |
| 2.2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的酶切鉴定 |
| 2.2.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的测序鉴定 |
| 2.2.4 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的体外表达检测 |
| 2.3 纳米金与pcDNA-GMCSF-NgR-PirB结合效应检测 |
| 2.3.1 波长扫描检测 |
| 2.3.2 核酸电泳检测 |
| 2.4 纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得 |
| 2.4.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB去内毒素质粒的大量提取 |
| 2.4.2 疫苗制备 |
| 2.4.3 动物免疫 |
| 2.4.4 血清抗体滴度检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 纳米金的制备及鉴定 |
| 3.1.1 15 nm纳米金的制备 |
| 3.1.2 15 nm纳米金的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增、鉴定及体外表达检测 |
| 3.2.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增 |
| 3.2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的酶切鉴定 |
| 3.2.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的测序鉴定 |
| 3.2.4 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的体外表达检测 |
| 3.3 纳米金与pcDNA-GMCSF-NgR-PirB结合效应检测 |
| 3.3.1 波长扫描检测 |
| 3.3.2 核酸电泳检测 |
| 3.4 免疫条件的确定 |
| 4. 小结 |
| 第二章 纳米金介导的GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用 |
| 1. 实验仪器和试剂 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 大鼠变态性脑脊髓炎发生率检测 |
| 2.3 SCI动物模型的制备 |
| 2.4 行为学观察运动功能恢复 |
| 2.4.1 BBB评分 |
| 2.4.2 Catwalk步态分析 |
| 2.5 神经示踪观察损伤脊髓的恢复情况 |
| 2.5.1 BDA神经顺行示踪 |
| 2.5.2 核黄逆行示踪 |
| 2.6 组织病理学检测损伤脊髓恢复情况 |
| 2.6.1 HE染色 |
| 2.6.2 Nissl染色 |
| 2.7 分子水平检测 |
| 2.7.1 TUNEL法检测损伤处脊髓细胞凋亡情况 |
| 2.7.2 免疫荧光染色检测相关蛋白表达情况 |
| 2.7.3 Western blot检测相关蛋白表达情况 |
| 2.8 体外观察抗血清对神经元突起生长影响 |
| 2.8.1 抗血清对神经元突起生长的影响 |
| 2.8.2 免疫荧光检测相关蛋白表达情况 |
| 2.9 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 动物EAE检测 |
| 3.2 行为学检测结果 |
| 3.2.1 BBB评分 |
| 3.2.2 Catwalk步态分析 |
| 3.3 神经示踪观察损伤脊髓的恢复情况 |
| 3.3.1 BDA神经顺行示踪 |
| 3.3.2 核黄逆行示踪 |
| 3.4 组织病理学检测损伤脊髓恢复情况 |
| 3.4.1 HE染色 |
| 3.4.2 Niss1染色 |
| 3.5 分子水平检测 |
| 3.5.1 TUNEL染色检测损伤处脊髓细胞凋亡情况 |
| 3.5.2 免疫荧光染色检测相关蛋白表达情况 |
| 3.5.3 Western blot检测相关蛋白表达情况 |
| 3.6 体外观察抗血清对神经元突起生长影响 |
| 3.6.1 抗血清对神经元突起生长的影响 |
| 3.6.2 免疫荧光检测相关蛋白表达情况 |
| 4. 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（7）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪瘟及其疫苗的研究进展 |
| 1.1 猪瘟概述 |
| 1.2 猪瘟疫苗研究与进展 |
| 第2章 细胞微载体与悬浮培养技术 |
| 2.1 细胞微载体的类型 |
| 2.2 细胞微载体培养技术的应用 |
| 2.3 目的与意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第3章 ST细胞单层静置培养特性及CSFV转瓶培养工艺研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 微载体细胞培养性能研究与微载体选择 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 CSFV微载体摇瓶培养及其放大工艺研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CSFV微载体反应器悬浮培养及其放大工艺建立 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CSFV的免疫原性及免疫效果评价 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）WSSV的分离鉴定及3种结构蛋白对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 WSSV的概况 |
| 1.1 WSSV的发现及命名 |
| 1.2 WSSV的形态学特性 |
| 1.3 WSSV的基因组及结构蛋白 |
| 1.4 WSSV感染症状及引起的组织病理学变化 |
| 1.5 WSSV的宿主 |
| 2 克氏原螯虾WSSV免疫防治研究 |
| 2.1 克氏原螯虾的概况 |
| 2.2 克氏原螯虾的免疫系统 |
| 2.2.1 早期甲壳动物免疫系统研究 |
| 2.2.2 甲壳动物的免疫致敏反应 |
| 2.3 甲壳类动物的免疫预防 |
| 2.4 甲壳类动物的免疫预防研究 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 克氏原螯虾白斑综合征病毒的分离鉴定及病毒增殖培养 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床症状及病理剖解 |
| 2.2 组织切片制备 |
| 2.3 毒株PCR检测 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 DNA提取 |
| 2.3.3 PCR扩增及产物的序列分析 |
| 2.4 回归实验 |
| 2.5 WSSV的增殖培养 |
| 2.5.1 螯虾注射对照实验死亡率 |
| 2.5.2 病毒在鱼类细胞的增殖培养 |
| 2.5.3病毒在鸡胚内的增殖培养及回归实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状剖解 |
| 3.2 患病克氏原螯虾的病理组织观察 |
| 3.3 PCR检测结果及系统发育树 |
| 3.4 回归实验结果 |
| 3.5 病毒的增殖培养结果 |
| 3.4.1 克氏原螯虾注射对照实验死亡率 |
| 3.4.2 病毒在FHM中的增殖培养 |
| 3.4.4 病毒在鸡胚内的增殖培养及人工感染实验 |
| 4 讨论 |
| 第三章 白斑病毒VP24,VP28,VP466 基因真核表达质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因获取 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 组织DNA的提取 |
| 2.1.3 VP24,VP28,VP466 目的基因的扩增 |
| 2.1.4 PCR产物回收纯化 |
| 2.2 pMD19-T-VP24,VP28,VP466 质粒的构建 |
| 2.2.1 目的基因连接到pMD19-T载体 |
| 2.2.2 连接产物的转化 |
| 2.2.3 pMD19-T-VP24,VP28,VP466 质粒的鉴定 |
| 2.3 真核表达质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 的构建 |
| 2.3.1 pMD19-T-VP24,VP28,VP466 双酶切和纯化 |
| 2.3.2 pEGFP-N1 质粒的制备和酶切 |
| 2.3.3 目的片段与pEGFP-N1 的连接转化 |
| 2.3.4 pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466质粒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 VP24,VP28,VP466 基因的DNA扩增与鉴定 |
| 3.2 重组质粒pMD19-T-VP24,VP28,VP466 的构建与鉴定 |
| 3.3 真核表达质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 的构建与鉴定 |
| 3.4 真核表达质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 的浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 重组真核表达质粒免疫实验及非特异指标检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 重组真核表达质粒与载体 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 数据处理 |
| 1.5 培养基 |
| 1.6 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 的大量提取 |
| 2.2 重组质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 免疫克氏原螯虾及攻毒实验 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 重组质粒免疫后克氏原螯虾体内检测 |
| 2.2.3 pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 重组质粒的转染 |
| 2.2.4 WSSV攻毒液最佳浓度的确定及制备 |
| 2.2.5 WSSV攻毒实验及免疫保护率 |
| 2.2.6 非特异性免疫因子检测结果 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组真核表达质粒免疫克氏原螯虾后体内检测结果 |
| 3.2 真核表达质粒pEGFP-N1-VP24,VP28,VP466 在鱼类细胞(FHM)中的表达 |
| 3.3 WSSV攻毒液最佳浓度的确定及制备 |
| 3.4 攻毒实验免疫保护率结果 |
| 3.5 非特异性免疫因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（10）美洲型PRRSV二价核酸疫苗的制备及小鼠的免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 PRRSV的流行现状 |
| 1.1 PRRSV在世界的历史和流行状况 |
| 1.2 PRRSV在中国的历史和流行状况 |
| 2 PRRSV的基因组结构 |
| 3 PRRSV的蛋白结构 |
| 4 PRRSV引发的先天性细胞免疫反应 |
| 4.1 树突状细胞(DC) |
| 4.2 巨噬细胞(MΦ) |
| 4.3 中性粒细胞(PMN) |
| 4.4 自然杀伤细胞(NK) |
| 4.5 γδT细胞 |
| 5 PRRSV与PCV2发生共感染 |
| 6 NADC30-Like谱系的PRRSV |
| 6.1 NADC30-Like谱系PRRSV的基因组特征 |
| 6.2 NADC30-Like谱系PRRSV重组率高 |
| 6.3 NADC30-Like谱系PRRSV的致病性 |
| 6.4 目前商用疫苗对NADC30-Like谱系PRRSV的疗效 |
| 7 PRRS疫苗设计的挑战 |
| 8 研究目的及展望 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒及小鼠 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析 |
| 2.2 YN-LQ毒株的理化特性检测 |
| 2.3 二价核酸疫苗的构建及小鼠的免疫研究 |
| 结果 |
| 1 PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析 |
| 1.1 PRRSV YN-LQ株全基因扩增结果 |
| 1.2 Nsp2和GP5基因进化树分析及同源性比对 |
| 1.3 全基因组遗传进化分析及同源性比对 |
| 1.4 GP5、Nsp2编码的氨基酸的序列比对 |
| 2 YN-LQ毒株理化特性的研究 |
| 2.1 YN-LQ毒株耐热试验 |
| 2.2 YN-LQ毒株耐酸、碱试验 |
| 2.3 YN-LQ毒株耐乙醚试验 |
| 2.4 YN-LQ毒株耐氯仿试验 |
| 2.5 YN-LQ毒株对胰蛋白酶的敏感性试验 |
| 2.6 YN-LQ毒株对超声波的敏感性试验 |
| 2.7 YN-LQ毒株对紫外线的敏感性试验 |
| 3 二价核酸疫苗的构建及小鼠的免疫研究 |
| 3.1 pGH-HP-ORF5 (JXA1-Lke)-Linker-ORF5(NADC30-Like)质粒的双酶切验证 |
| 3.2 pVAX1-HP-ORF5(JXA1-Like)-Linker-ORF5(NADC30-Like)质粒双酶切验证 |
| 3.3 Western Blot检测 |
| 3.4 细胞因子检测(IL-4、IFN-γ) |
| 3.5 中和抗体检测 |
| 3.6 T淋巴细胞亚群数量的检测(CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+) |
| 3.7 T淋巴细胞增殖实验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简历) |
| 附录B (攻读学位期间发表论文目录) |
四、核酸疫苗的研究现状和临床应用前景（论文参考文献）
- [1]MUC1-survivin治疗性癌症疫苗的药代动力学与组织分布研究[D]. 周仪. 吉林大学, 2020(08)
- [2]猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗及其载体疫苗的研制[D]. 童武. 东北农业大学, 2020(04)
- [3]2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建[D]. 高映雪. 江西农业大学, 2020(07)
- [4]锦鲤疱疹病毒碳纳米管载体核酸疫苗的构建及其免疫效果评价[D]. 胡峰. 上海海洋大学, 2020(03)
- [5]表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组伪狂犬疫苗的初步研究[D]. 陈江华. 福建师范大学, 2020(12)
- [6]纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用[D]. 毛敏. 重庆理工大学, 2020(01)
- [7]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [8]猪瘟病毒新型微载体悬浮培养技术研究[D]. 梅建国. 吉林大学, 2019(02)
- [9]WSSV的分离鉴定及3种结构蛋白对克氏原螯虾相关非特异性免疫因子的影响[D]. 何琦瑶. 四川农业大学, 2019(01)
- [10]美洲型PRRSV二价核酸疫苗的制备及小鼠的免疫研究[D]. 张涵. 延边大学, 2019(01)