一、一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用（论文文献综述）
母梦瑶[1]（2021）在《东北虎β、γ和β-γ干扰素蛋白的制备及生物学活性研究》文中研究指明干扰素（Interferon,IFN）拥有广谱抗病毒、调控免疫和抗肿瘤等多种生物学功能,在防治病毒性疾患时随处可见它的身影。不同干扰素具有不同的分子结构和抗原特性。为方便归纳与应用,国际干扰素命名委员对其进行了分类。其中β干扰素（IFN-β）是I型干扰素的重要成员,主要作用是参与机体对病毒进行抵抗。γ干扰素（IFN-γ）是唯一的Ⅱ型干扰素,其抵抗病毒的作用与I型相比较略弱,它可以促使受病毒感染的细胞表达对应抗原,免疫系统因此可成功识别并杀伤受到感染的细胞,从而对机体发挥保护作用。目前,关于东北虎干扰素的相关研究还很少,对IFN-β和IFN-γ的功能研究还未知。另外,将IFN-β、IFN-γ连接融合后的抗病毒效果还无从知晓。本研究针对单个干扰素,采用重叠延伸 PCR（gene splicing by overlap extension,SOE-PCR）技术,将东北虎IFN-β、IFN-γ（PtIFN-β、PtIFN-γ）基因融合。随后进行原核表达。最后利用细胞系进行体外生物学活性检测,并与单个PtIFN-β、PtIFN-γ重组蛋白比较强弱。为今后获得活性强且具有叠加抗病毒活性的干扰素制剂提供理论及物质依托。具体分为以下几个部分:1.从GenBank上查询到已经被发表的PtIFN-β、PtIFN-γ基因序列,参照并设计引物。模板为东北虎外周血DNA以及其淋巴细胞提取所得cDNA,成功扩增出无信号肽的PtIFN-β、PtIFN-γ成熟肽基因。通过SOE-PCR方法对PtIFN-β、PtIFN-γ两部分融合。三种基因分别连接到pET32a（+）载体上,构建得到PtIFN-β、PtIFN-γ和PtIFNβ-γ的原核表达载体。2.利用大肠杆菌原核表达系统,对各个重组质粒进行原核表达。纯化所得蛋白用到镍亲和层析法。另外以包涵体形式表达的蛋白需要用梯度透析法复性。最后使用SDS-PAGE以及Western blot蛋白印迹分析鉴定。一系列结果证明,本研究成功诱导表达得到了相应大小目的蛋白。3.使用纯化后的目的蛋白,以背部注射的方式免疫家兔。经过三次免疫后,心脏抽取血液并将血清分离,采用间接ELISA方法对三种抗体的效价进行检测。结果发现血清中 PtIFN-β、PtIFN-γ 及 PtIFNβ-γ 抗体效价均达到了 1:102400。4.采用微量细胞病变抑制法在VSV/F81、AIV/F81及CDV/F81系统上检测PtIFN-β、PtIFN-γ和PtIFNβ-γ的抗病毒活性。结果表明:PtIFN-β、PtIFN-γ和PtIFNβ-γ蛋白均有抗VSV、AIV和CDV活性,达到103～105 U/mg,由高到低的排序为:PtIFNβ-γ>PtIFN-βPtIFN-γ。通过RT-PCR及Western blot方法探究在各重组干扰素蛋白作用下,抗病毒相关通路JAK-STAT的激活情况,以及抗病毒基因的转录和蛋白表达水平。在JAK抑制剂的使用下,进一步证实了 PtIFN-β、PtIFN-γ和PtIFNβ-γ蛋白通过经典途径发挥抗病毒作用。本研究首次利用大肠杆菌成功表达重组蛋白PtIFN-β、PtIFN-γ和PtIFNβ-γ,并发现它们能够通过JAK-STAT通路抑制VSV、AIV和CDV的复制,且PtIFNβ-γ抑制病毒复制的效果最强。这为东北虎病毒性疾病的防治提供更佳的条件和方法,为东北虎干扰素工业化生产奠定基础。
孙红梅[2]（2020）在《桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中进行了进一步梳理桑树（Morus alba）根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因（chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32）,IAA-氨基酸水解酶编码基因（ILR1-5（IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,Ma APX2））进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系（OE-2和OE-7）与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系（OE-3和OE-9）与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系（mt-1和mt-2）相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
单嘉男[3]（2020）在《粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析》文中进行了进一步梳理线虫是后生动物中种类丰富的动物之一。由于线虫的结构简单,一些线虫已被用作神经和进化研究的模型生物,如秀丽隐杆线虫。然而,在线虫类中,有一类感染动物的线虫,又称寄生线虫,给农业生产和人类健康带来了极大的危害。据WHO报道,全球约八分之一的人感染有寄生性线虫,而粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）正是其中一种。由粪类圆线虫引起的疾病称为粪类圆线虫病,是一种广泛存在却易被忽视的热带疾病（Neglected Tropical Diseases,NTD）,主要在非洲等卫生条件落后的地区流行。到目前为止尚且没有简单快捷的诊断手段,也没有疫苗可用于预防粪类圆线虫病。虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动植物体内的金属蛋白酶,研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用,有望成为新的检测和制备疫苗的靶位点。本项目首先通过分析粪类圆线虫在各个时期的转录组数据并从中筛选出假定为虾青素金属蛋白酶的蛋白,再通过与已经报道过的金属蛋白酶进行氨基酸序列比对来选定所要研究的基因,最后选定粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶Ss-ast-1作为研究对象。本项目以原核表达的方式体外重组表达了该蛋白,并对该蛋白酶的活性进行了探究,此外又通过显微注射的方法对Ss-ast-1的表达特征进行了探究。（1）选定粪类圆线虫Ss-ast-1作为目标基因由粪类圆线虫的全转录组数据中可以得到49个标注为金属蛋白酶的基因,将这些金属蛋白酶与之前在线虫中已报道过的虾青素金属蛋白酶放在一起构建进化树的方式对49个金属蛋白酶进行筛选,最终选定Ss-ast-1作为研究目标。（2）粪类圆线虫Ss-ast-1金属蛋白酶基因序列和氨基酸序列的结构分析Ss-ast-1的c DNA序列是从Wormbase Parasite上得到,其中编码区为1905bp,编码634个氨基酸。通过分析可知,前32个氨基酸为信号肽,氨基酸序列比对发现虾青素金属蛋白酶Ss-AST-1具有保守的功能结构域,比如Zine-binding、Met-turn、EGF-like domain等,同时对Ss-AST-1进行三维同源建模分析。预测的Ss-ast-1启动子的全长为468 bp,具有多种真核生物保守的启动子调控元件。（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属的转录水平和定位分析通过转录组分析发现,该基因在粪类圆线虫的各个发育阶段均有表达,在i L3期的表达水平最高。通过显微注射,可以得到荧光虫卵,该蛋白虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达。（4）原核表达粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白体外原核表达并从包涵体中纯化Ss-AST-1,纯化的蛋白一部分用于酶活性实验,一部分用于制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1,表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究首次对粪类圆线虫Ss-ast-1的基因结构和功能进行了初步研究,证明Ss-ast-1在虫卵中表达,并具有良好的免疫原性,为之后开发疫苗和新的检测手段提供了一定的理论基础。
杜博亚[4]（2020）在《新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究》文中研究表明犬新孢子虫（Neospora caninum）属于顶复门原虫,主要引起犬的神经系统机能障碍,牛的流产、死胎和新生犊牛的运动神经系统疾病,给畜牧业造成巨大损失。近年来对新孢子虫基因功能研究发现,虫体棒状体蛋白、微线体蛋白和致密颗粒蛋白等参与新孢子虫入侵、增殖等致病过程,但仍有许多新孢子虫基因功能尤其是致病相关基因的功能尚不清楚。原癌基因调控蛋白（MYRs）可调控宿主细胞原癌基因（c-Myc）表达。近来研究报道疟原虫、弓形虫、锥虫可显着提高宿主细胞原癌基因表达量。弓形虫MYR与宿主细胞原癌基因、纳虫空泡及虫体致病相关,但新孢子虫MYR基因功能尚不清楚。因此,本研究通过免疫荧光观察NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,对△NcMYR1和△NcMYR2虫株在入侵、增殖、虫体毒力和致病性等方面的功能进行研究,并研究重组NcMYR1蛋白和△NcMYR1虫株对小鼠抗新孢子虫野生株感染的保护作用,以期明确NcMYR1和NcMYR2的功能,为研究新孢子虫对宿主的致病性和研究新孢子虫病的防治提供理论基础。1、NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位通过生物信息学分析获得NcMYR1和NcMYR2基因序列,原核表达技术制备和纯化重组NcMYR1和NcMYR2蛋白,制备抗NcMYR1和NcMYR2蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光对新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白进行亚细胞定位。首先,成功构建pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2基因表达载体,并成功诱导表达pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白,发现pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2重组蛋白均为上清表达,随后纯化蛋白并免疫小鼠。三次免疫后将小鼠眼球采血并离心收取血清作为多克隆抗体,通过细胞内和细胞外免疫荧光观察新孢子虫NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体中的亚细胞定位。结果显示,NcMYR1和NcMYR2蛋白定位于虫体速殖子细胞质。2、NcMYR1基因敲除虫株和NcMYR2基因敲除虫株的构建运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,通过PCR、Western blot和免疫荧光对敲除虫株鉴定。首先成功合成Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR1和Nc-pSAG1-Cas9:U6-SgUPRT-NcMYR2载体并扩增DHFR同源重组基因片段。随后通过电转,培养和筛选单克隆,并通过PCR、Western blot和免疫荧光鉴定是否构建成功。结果表明△NcMYR1和△NcMYR2虫株在gRNA位点成功插入DHFR同源重组基因片段,△NcMYR1和△NcMYR2虫株不再表达NcMYR1、NcMYR2蛋白,证明成功构建△NcMYR1和△NcMYR2虫株。3、NcMYR1和NcMYR2基因功能研究通过噬斑试验、入侵、增殖、逸出试验与虫体毒力试验,以探究NcMYR1和NcMYR2蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果表明,与野生虫株相比,△NcMYR1虫株的噬斑面积减小（P<0.001）;入侵率降低（P<0.001）;增殖率降低（P<0.001）;逸出率下降（P<0.05）。△NcMYR2虫株在噬斑面积、入侵、增殖和逸出方面与野生虫株相比差异不显着（P>0.05）。将△NcMYR1、△NcMYR2虫株和野生虫株分别感染BALB/c小鼠观察小鼠生存状况,检测细胞因子、虫体数量和观察病理变化。结果表明,与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcMYR1虫株的小鼠生存率达到100%,接种△NcMYR2虫株的小鼠生存率为0%,说明敲除NcMYR1的新孢子虫毒力降低,而敲除NcMYR2的新孢子虫毒力并没有受到影响。感染△NcMYR1虫株的小鼠血清中IL-6、IL-12、IFN-γ分泌下降且差异显着（P<0.01）,而感染△NcMYR2虫株小鼠的血清中IL-6分泌下降且差异显着（P<0.05）,IL-12和IFN-γ分泌均升高但差异不显着（P>0.05）。qPCR结果显示,感染△NcMYR1虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量降低（P<0.05）;感染△NcMYR2虫株小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑荷虫量与感染野生虫株小鼠相比均差异不显着（P>0.05）。感染△NcMYR1虫株小鼠与感染野生虫株小鼠相比心、肝、脾、肺、肾和脑病理变化减轻,而感染△NcMYR2虫株小鼠上述器官病理变化与感染野生虫株小鼠相比无明显差异。说明△NcMYR1虫株对小鼠致病性减弱。以上研究表明,NcMYR1是新孢子虫入侵和毒力基因,敲除NcMYR1蛋白后虫株生长、增殖、致病性等方面明显减弱,毒力显着降低,可作为疫苗候选分子。而敲除NcMYR2基因后虫株在生长、增殖、致病性和毒力等方面都没有显着变化。4、△NcMYR1虫株对小鼠抗野生株感染的保护作用将上述试验中毒力减弱的△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗免疫小鼠,分别在第1、10、20、30、40d后进行尾静脉采血进行细胞因子检测,以及感染新孢子虫Nc-1虫株观察小鼠生存状态。免疫△NcMYR1虫株40天时IFN-γ达到峰值,IL-12在免疫△NcMYR1虫株10d时达到峰值。5组小鼠免疫△NcMYR1虫株后第10、20、30、40d分别感染新孢子虫野生虫株,另外一组作为阴性对照组。10d组生存率达到30%,20d组生存率达到20%,30d组生存率达到10%,40d组生存率达到80%,表明利用△NcMYR1虫株免疫的小鼠对新孢子虫野生虫株感染产生免疫保护力。将上述的重组NcMYR1蛋白做为疫苗抗原免疫小鼠,随后接种新孢子虫,观察小鼠生存状态以对NcMYR1蛋白的免疫效果进行评价。结果显示,免疫NcMYR1蛋白的小鼠,IL-12与IFN-γ分泌量与对照组相比显着升高（P<0.001）,且免疫NcMYR1蛋白后感染新孢子虫,小鼠生存率达到20%。综上所述,NcMYR1和NcMYR2蛋白亚细胞定位于虫体细胞质;运用CRISPR-cas9基因敲除技术构建NcMYR1基因敲除虫株（△NcMYR1）和NcMYR2基因敲除虫株（△NcMYR2）,△NcMYR1虫株在虫体生长、增殖、虫体毒力和虫体致病力等方面显着减弱。以△NcMYR1虫株作为弱毒虫苗的免疫保护效力最高达到80%。为新孢子虫抗原疫苗的研究奠定基础。
李承娟[5]（2020）在《细胞穿膜肽融合ADκ的制备及活性分析》文中认为严格的细胞周期调控是机体进行正常生理活动的功能保障,在人类癌症中普遍表现出细胞周期调节失控。Cyclin D1是细胞周期重要的驱动因子,在多种肿瘤细胞中都存在过度表达和活化。近年来,越来越多的证据显示以Cyclin D1作为肿瘤诊断与治疗的靶点具有很高的可行性。单链抗体以其高特异性、分子量小、易于工程化修饰等优势在肿瘤治疗中展示出巨大潜力。本课题组前期已成功筛选并制备了能够特异性识别细胞内Cyclin D1,并使其失活的单链抗体ADκ,通过体内外实验证明其具有较好的抑瘤作用。但由于单链抗体ADκ不能有效穿透细胞膜,导致其难以作用于细胞内靶标分子,从而极大地限制其应用。近年来研究较多的可作为递送载体的细胞穿膜肽,其高效、低毒的穿膜能力,为治疗药物的跨膜递送提供了新途径,也为抗体蛋白跨膜治疗提供了新思路。为此,本研究在课题组前期制备的单链抗体ADκ的基础上,分别将细胞穿膜肽Penetratin（PTN）和TAT连接在其C末端,构建具有穿膜肽序列的新型重组人ADκ蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT的两个原核表达载体,对其进行诱导表达、纯化得到含有细胞穿膜肽的重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT,ELISA分析发现新型重组融合蛋白与Cyclin D1有较好的亲和活性,从而为单链抗体ADκ进行抗肿瘤治疗奠定基础,推动抗体肿瘤临床治疗的进一步发展。具体结果如下:1.以实验室前期成功制备的抗Cyclin D1单链抗体（ADκ）的质粒为模板,通过PCR反应将细胞穿膜肽PTN和TAT分别克隆到单链抗体ADκ的C末端,获得具有穿膜肽序列的新型重组人ADκ的基因片段ADκ-PTN和ADκ-TAT,构建重组的原核表达载体及并制备分泌型表达菌pDF-ADκ-PTN/HB2151和pDF-ADκ-TAT/HB2151,通过对IPTG诱导后的培养基上清进行ELISA分析,确定穿膜肽Penetratin和TAT的修饰均不影响ADκ的抗原结合活性。2.为了得到大量融合细胞穿膜肽PTN和TAT的重组蛋白,将目的片段ADκ-PTN和ADκ-TAT分别与pET28b载体进行连接,成功构建重组表达载体pET28b-ADκ-PTN和pET28b-ADκ-TAT,并制备穿膜肽融合ADκ表达菌pET28b-ADκ-PTN/BL21（DE3）和pET28b-ADκ-TAT/BL21（DE3）。3.在0.5 mM IPTG,30℃条件下诱导4 h目的蛋白ADκ-PTN表达量最高,而ADκ-TAT在1 mM IPTG,30℃诱导4 h表达量最高,重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT有可溶性和包涵体两种表达形式且大部分以包涵体形式存在。4.采用8M脲变性及His Trap HP亲和层析纯化ADκ-PTN和ADκ-TAT包涵体,目的蛋白的最佳咪唑洗脱浓度为100 mM,洗脱液通过稀释复性和除盐后获得ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白。5.纯化的重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT经ELISA和Western blot鉴定,表明成功获得了具有较高生物学活性的穿膜肽融合ADκ蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT。6.纯化制备的ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白的抗原结合活性的ELISA结果表明,纯化的重组蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT能高特异性结合Cyclin D1,并且和单链抗体ADκ相比,与Cyclin D1的结合活性没有显着差异。细胞穿膜肽PTN和TAT与抗Cyclin D1单链抗体ADκ融合产生的重组蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT为基于胞内诱导或组织特异性Cyclin D1敲除的研究和ADκ抗体蛋白抗肿瘤治疗奠定了基础,此外也为以Cyclin D1为靶点的癌症的抗体治疗提供理论依据和新思路。
牛军波[6]（2020）在《天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达》文中认为抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）是大多数生物体先天性免疫系统的重要组成部分,是生物体经过诱导产生的一类具有抗菌活性的小肽类物质,可在生物体中有效杀灭病原菌以及抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素AD为天蚕素抗菌肽的一种,天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显着的抗菌肽,因此实现其工业化生产可为其在农业、养殖业中的应用奠定基础。本研究分别使用AOX启动子和GAP启动子构建出诱导型基因工程菌株和组成型基因工程菌株,通过对其抑菌能力的检测以及菌株的遗传稳定性的观察,最终选用组成型表达菌株作为后续实验菌株。基于以上研究对天蚕素AD在毕赤酵母中的高效表达以及发酵条件进行了优化,并对其特性进行了检测。本研究为抗菌肽利用基因工程在毕赤酵母中成功表达并应用于养殖业、食品及医疗行业提供了科学数据及技术支持。主要实验结果如下:1.本文全基因合成天蚕素AD基因片段,利用引物扩增出带有Xho I和Not I位点的天蚕素AD基因,将其与同样双酶切的载体pPIC9K连接,将其转入大肠杆菌JM109感受态中,挑取转化子培养提取质粒,将得到的重组质粒pPIC9K-CAD转入毕赤酵母GS115中,挑取阳性克隆,得到两株抑菌效果较好的基因工程菌株GS115/pPIC9K-CAD-5和GS115/pPIC9K-CAD-9,甘油保存菌株。2.利用引物扩增出带有EcoR I和Not I位点的天蚕素AD基因,将其与同样双酶切的载体pGAPZαA连接,连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,得到质粒pGAPZαA-CAD经线性化后电击转入毕赤酵母X33电击感受态中,得到基因工程菌株X33/GCAD-3。将构建好的质粒pUCGAP-CAD电击转化至X33/GCAD-3的电击感受态中,最终得到多拷贝菌株X33/GUCAD-3,甘油保存菌株,以该菌株为后续实验菌株。3.利用Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶和LC-MS鉴定X33/GUCAD-3发酵产物,结果表明该抑菌物质为天蚕素AD。以YDFM、YPD和BMGY分别为发酵培养基,结果表明最适宜的发酵培养基为YDFM培养基。以甘油、葡萄糖和麦芽糖分别为唯一碳源,结果表明最适碳源为甘油。对氮源添加量及初始pH进行了条件优化,结果表明在其24 h和48 h分别补料5 g/L的有机氮源,且初始pH为7.0时,抑菌效果最好,其抗菌生物效价为8.84×108 U/L。4.确定了天蚕素AD的抗菌谱,表明其抗菌谱较广,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性,但对真菌无抑菌活性。天蚕素AD对部分常见致病菌均有抑菌活性。耐高温性较强,在100℃下放置3 h仍能具有较高抑菌活性。与未用蛋白酶处理的天蚕素AD相比,分别用30 U/mL的胃蛋白酶和蛋白酶K处理天蚕素AD 2.5 h时,其抑菌活性表现出一定程度的下降,且天蚕素AD在30 U/mL的胰蛋白酶下仍能具有一定的抑菌活性,但相对于未用胰蛋白酶处理的天蚕素AD,其抗菌活性出现较大程度的下降。通过溶血活性实验检测表明天蚕素AD不具有溶血活性。
李益民[7]（2020）在《重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽》文中研究指明丙谷二肽（L-Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln）具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,已经成为一种替代谷氨酰胺（L-Glutamine,Gln）的新型营养补充剂,被广泛应用于食品、保健品和医药等领域。α-氨基酸酯酰基转移酶（α-amino acid ester acyl transferase,Aet）能以丙氨酸甲酯盐酸盐（L-alanine methyl ester hydrochloride,AlaOMe）和Gln为底物直接合成Ala-Gln,基于表达Aet的微生物合成法因其原料廉价易得、反应步骤少、反应条件温和、环境污染小且副产物少,可以作为工业化生产Ala-Gln的新方法。然而,Aet催化合成Ala-Gln过程存在反应时间长和底物转化率低等问题,限制了其在Ala-Gln工业化生产中的应用。本论文的研究工作构建了异源表达Sphingobacterium siyangensis来源Aet（SsAet）的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母,通过菌体的重复利用及絮凝自固定化技术,解决了上述问题,为实现Ala-Gln安全、绿色且高效生产奠定了基础。取得的主要研究结果如下:首先,构建异源表达SsAet的重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln。以最常用的表达型宿主 BL21（DE3）,构建了重组大肠杆菌 BL21（DE3）-pET29a-SsAET（BPA）,发现 BPA表达了大量的包涵体,影响了其催化活性。通过更换有助于蛋白二硫键形成的宿主,提高蛋白的溶解性,其中Origami 2（DE3）-pET29a-SsAET（OPA）的SsAet可溶表达量最高,且催化活性是BPA的1.4倍。进一步优化了 OPA的诱导条件和全细胞催化合成Ala-Gln的反应条件,确定了最佳的诱导条件:温度16℃、诱导OD620=0.25、诱导时间12h及IPTG浓度0.6 mmol/L;最佳的反应条件:温度25℃、pH值8.5、反应溶液硼酸盐缓冲液及底物摩尔配比AlaOMe/Gln=1/2。在最优条件下,以OPA作为合成Ala-Gln的全细胞催化剂,反应过程最短可在5 min内完成,获得最高的底物转化率为94%,而比生产强度可高达1.78 g/L·min-1·OD620-1,是目前国内外文献中报道的最高水平。除此之外,OPA具有良好的重复利用性,经五个循环批次反应仍能维持80%以上的催化活性,实现了循环高效合成Ala-Gln。但是,在相同的细胞浓度和反应时间内,OPA全细胞的催化效率比裂解液降低了 21%,发现了物质扩散阻力的存在。其次,构建表面展示SsAet的重组酿酒酵母。为了克服物质扩散阻力和大肠杆菌表达系统潜在的生物安全问题,以生物安全性的酿酒酵母作为表达宿主,将SsAet以N端和C端锚定两种方式展示在酵母细胞表面,通过免疫荧光实验,证明了 SsAet已成功固定在酵母细胞壁上;综合比较菌株生长情况和催化活性,选择N端锚定作为SsAet在酵母表面展示的方法。在此基础上,通过密码子优化提高了 SsAet表达量,发现经密码子优化的EBY100-pYD1-SsAETs（EPagaAs）在20 min时Ala-Gln合成量是未经密码子优化菌株的1.7倍;反应终点从40 min缩短至30 min,生产效率提高了 33%。但是,EPagaAs合成Ala-Gln的反应时间长,且底物转化率仅为OPA的58%,推测酵母表达系统中蛋白翻译后修饰可能影响了 SsAet的催化活性。然后,针对上述问题,研究了蛋白翻译后修饰对SsAet的影响。以糖基化程度低的毕赤酵母为表达宿主,通过密码子优化,提高蛋白表达量和催化效率,构建了分泌表达SsAet的重组毕赤酵母GS115-pPIC9-SsAETP（GPAP）。以GPAP为研究对象,对重组毕赤酵母的诱导条件和合成Ala-Gln的反应条件进行了优化,确定了最佳的诱导温度为26℃、诱导时间为3d及甲醇补加量（v/v）为1.5%;最佳的反应温度为28℃、反应pH值为8.5、反应底物为AlaOMe及底物摩尔配比AlaOMe/Gln为2/1。在最优条件下,GPAP的底物转化率仅为OPA的71%左右,再次验证了蛋白后修饰作用对SsAet催化活性的影响。在此基础上,构建了胞内和分泌表达SsAet的重组毕赤酵母,发现胞内表达SsAet重组菌株的催化活性明显高于分泌表达的,其中胞内表达且去掉内源信号肽的菌株KM71-pPIC3.5K-SAETP1800（KP3.5KAP1800）合成Ala-Gln的底物转化率最高为80%,能达到OPA的90%左右,比分泌表达的对比菌株提高了 41%,阐述了胞内表达SsAet和去掉内源信号肽是提高酵母表达系统中SsAet催化活性的有效方法。通过SDS-PAGE和Western blotting发现了分泌型SsAet分子量的增加;通过去糖基化酶的切除,证明了分泌型SsAet中糖基化修饰的存在;通过LC-MS证明了糖基化修饰发生在第442位Asn残基上;通过圆二色光谱仪鉴定了胞内和分泌型SsAet的二级结构,发现了两者的显着性差异,证明了糖基化修饰是影响SsAet结构和催化活性的重要因素。最后,基于上述研究结果,构建了自固定化重组酿酒酵母高效合成Ala-Gln。使用高拷贝数质粒构建了胞内表达SsAet且去掉内源信号肽的EBY100-pRS424-SsAETs1800（EP424AS1800）。通过培养和反应条件的优化,EP424AS1800能在5 min内获得高达74%的底物转化率,是表面展示重组菌EPagaAs的1.44倍,能达到OPA的83%以上;反应时间比EPagaAs缩短了 80%以上,生产效率提高了 5倍;比生产强度高达1.28 g/L·min·1·OD600-1。通过导入絮凝基因FLOI,得到了毫米级絮凝颗粒且催化活性不受影响的EP424As1800-FLOI,实现了其在反应器内的自固定化。EP424AS1800-FLO1经过十次循环催化反应后仍能保持稳定的催化活性,实现了连续高效合成Ala-Gln。本论文的研究为Ala-Gln安全、绿色且高效的工业化生产奠定了基础。
唐子清[8]（2019）在《OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析》文中研究说明水稻内寄生线虫是水稻重要的病害之一,受线虫侵染的水稻在地上部分通常无明显症状,但是,水稻线虫会导致植物生长速度减慢,特别是在水稻生长早期,导致水稻的有效分蘖数明显减少,植株黄化、矮化,根部变成黄褐色甚至腐烂。据统计,全球58%的水稻都受到了潜根线虫的侵染,导致水稻减产25%左右。水稻尖细潜根线虫（Hirschmanniella mucronata）是内寄生线虫的一种,它侵染并寄生在水稻的根部,通过分泌多种效应蛋白来降解或修饰水稻根部细胞壁和改变根部细胞蛋白功能来达到侵染和繁殖的目的。同时,水稻为了抵御线虫的侵染也会主动调节体内代谢水平,激活细胞壁修饰酶基因和防卫基因的表达,诱导产生植物激素等途径来抵抗内寄生线虫的侵染。实验室前期通过转录组测序,比较分析了接种与不接种尖细潜根线虫的水稻根部组织差异表达基因。本实验从差异表达基因中选取了OsGWD1基因,通过克隆该基因并表达出编码的蛋白质来寻找与其相互作用的蛋白,为进一步探究该基因在水稻与尖细潜根线虫互作中的作用,以及探索新的潜根线虫防治策略奠定理论基础。主要研究结果如下:1.扩增目的基因OsGWD1,利用TA克隆技术将该基因克隆转化pEASY-T3载体,获得了重组载体T3:OsGWD1。预测分析OsGWD1基因的开放阅读框为462 bp,共编码153个氨基酸,蛋白分子量大小约为18 KD,等电点（pI）为4.83;属于亲水性不稳定蛋白;该蛋白无信号肽且不含跨膜结构,表明其可能不属于膜蛋白或分泌蛋白;肽链中无规则卷曲所占比例较高,具有7个β片层结构;具有高度保守的WD40-repeat结构域,属于WD40-repeat家族;预测与OsGWD1蛋白可能互作的有10个蛋白并模拟形成了相互作用的关系网络图。2.通过克隆转化得到过表达载体pCAMBIA1302:OsGWD1:GFP,亚细胞定位发现目的蛋白定位于细胞核内。利用Gateway技术将RNAi片段重组至植物干扰载体pB7G,获得了重组RNAi质粒。利用农杆菌转化法将过表达重组质粒以及RNAi质粒转染进入水稻日本晴获得转基因水稻植株,为后续进行水稻潜根线虫接种实验提供了原材料。3.将OsGWD1的orf序列克隆重组进入原核表达载体中pCzn1中。提取阳性重组质粒进入含有分子伴侣pTf16的BL21（DE3）感受态细胞中,与分子伴侣蛋白共表达。经过SDS-PAGE分析和Western Blot验证表明成功表达出了18KD的目的蛋白。0.05 mM的IPTG诱导浓度,16℃诱导表达20 h为最优诱导表达条件。4.通过His-tag pull down获得25个可能与OsGWD1互作的水稻蛋白。GO分析发现,这些基因共富集在20个GO条目中,KEGG富集分析表明这些蛋白富集在12条通路中,主要集中在核糖体、氧化磷酸化和吞噬过程等代谢通路。其中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、S-腺苷甲硫氨酸转移酶、热休克家族蛋白Hsp70、Hsp73和延伸因子蛋白eEF1A在代谢通路中起着关键作用,对水稻胁迫反应及防卫反应具有重要意义。
王玉建[9]（2019）在《枯草芽孢杆菌表达产气荚膜梭菌α，β和ε毒素融合蛋白对小鼠的免疫保护作用》文中提出产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）一直被认为是一种危害性较强的人畜共患病病原体,能够引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人畜创伤性气性坏疽,由于其引起的部分疾病兼具发病快、死亡率高的特点,对畜牧养殖业具有极大的潜在威胁性。产气荚膜梭菌发病的主要因素是其分泌的外毒素,而根据细菌产生的主要毒素α（Cpa）,β（Cpb）,ε（Etx）,iota（Cpi）,可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5种毒素型,其中α、β和ε是最主要的致病毒素。在当前畜牧养殖业中,接种是最常用的预防措施,而此类疫苗主要由从产气荚膜梭菌培养物中获得的类毒素组成。与常规类毒素相比,重组疫苗具有针对性强、稳定性和安全性高以及商业空间大的特点,已经作为为一种更加具有前景的免疫接种方案而被广泛研究。此外,枯草芽孢杆菌作为一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌,有着人和动物作为益生菌和食品添加剂使用的安全记录,显着的耐热性,其不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体,都展现出其他细菌无可比拟的优势,是研究较多、应用广泛的生物安全菌。先前的研究已经证明了Cpa247-370能够赋予针对产气荚膜梭菌α毒素的攻毒免疫力,而具有H106P突变的EtxH106P被认为是用于预防由产气荚膜梭菌引起的动物疾病的最佳特异性疫苗候选物,而β毒素目前尚未有比较明确的研究证明其有效表位,本研究针对这一现状,对β毒素的有效表位进行了预测。对β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、氨基酸信号肽序列及切割位点进行预测,建立β毒素蛋白的三维空间结构模型。在线服务器以5个连续残基为最低标准预测线性和不连续的抗原表位,标记β毒素蛋白优势抗原表位,筛选、截取并建立新蛋白三维空间结构模型。构建重组质粒pET28a-Cpb108-305,经电转化转入大肠杆菌感受态BL21,通过Western免疫印迹分析对表达产物做出鉴定,结果显示在约24kda有明显条带。分3组进行小鼠免疫实验,每组分别口服BL21-pET28a-Cpb108-305菌液(0.2 ml,10 10 CFU/ml)、BL21-Cpb菌液(0.2ml,10 10 CFU/ml)和PBS液（0.2 ml）,各组分别在免疫后的第0、7、14、21、28和35 d取3只小鼠从尾静脉采集血液并分离血清,同时收集小鼠肠道灌洗液。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,比较新蛋白Cpb108-305与β毒素蛋白之间的免疫效果。结果表明预测筛选的新蛋白Cpb108-305与β毒素蛋白的免疫效果基本相同。基于已知可行的Cpa247-370和EtxH106P表位及预测的β毒素蛋白的有效抗原表位Cpb108-305,本研究近一步构建包含α、β和ε三种毒素蛋白保护性表位的融合蛋白,并选用枯草芽孢杆菌构建原核表达系统。分别设计合成三对特异性引物,利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌中分别扩增出Cpa247-370、Cpb108-305和Etx基因序列,通过SOE-PCR将第74位氨基酸（组氨酸）突变为甘氨酸,将ε毒素第118位氨基酸（组氨酸）突变为脯氨酸,利用SOE-PCR将已扩增并突变完成的Cpa247-370、Cpb108-305和EtxH106P三段序列重组连接成一段新的融合序列Cpa247-370-Cpb108-305-EtxH106P（Cpa-b-x）。将PCR扩增出来的Cpa-b-x基因片段连接到pHT43表达质粒构建重组表达质粒pHT43-Cpa-b-x,基因测序鉴定准确性。通过电转化方式将重组表达质粒转化到提前制备好的枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中,从LB平板（添加氯霉素抗性）上筛选出阳性转化子。诱导表达Cpa-b-x融合蛋白,通过SDS-PAGE和Western Blot对表达产物做出鉴定,结果显示在约71.15 kda附近有明显条带,成功表达了Cpa-b-x融合蛋白。为了评价融合蛋白的免疫效果,我们进一步对融合蛋白进行多项免疫检测。随机将175只6周龄SPF小鼠分为5组,分别口服免疫同等剂量枯草芽孢杆菌pHT43-Cpa-b-x（Bs-pHT43-Cpa-b-x）、枯草芽孢杆菌pHT43（Bs-pHT43）、枯草芽孢杆菌（Bs）、Cpa-b-x纯化蛋白和PBS,并于初次免疫后第10-14 d和24-28 d加强免疫。分别于接种以后的第0、7、14、21、28、35、42、49 d采集外周血和肠道灌洗液（每组3只）,然后通过ELISA方法分别检测血清抗体及肠道黏膜抗体效价、血清细胞因子（白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和γ-干扰素（IFN-γ））水平,采用MTT比色法测T淋巴细胞转化率,采用流式细胞技术检测外周血CD4+与CD8+水平。第3次加强免疫后1一周,随机从每组选出10只小鼠腹腔注射10×LD50的B型产气荚膜梭菌,连续7d观察已攻毒小鼠的发病及死亡情况并及时记录,一周后进行肠道组织病理检测。结果表明,小鼠口服免疫Bs-pHT43-Cpa-b-x后能够刺激机体产生特异性抗体,免疫保护效果显着优于其他组,此外,枯草芽孢杆菌一定程度增强了机体的免疫应答。本研究通过对β毒素进行预测,成功筛选出与β毒素具有相似免疫效果的保护性表位,基于此构建出能够预防α、β和ε三种毒素的重组融合蛋白Cpa-b-x。研究证明Cpa-b-x蛋白能够有效提升机体的免疫防御,对小鼠具有显着的保护作用,而枯草芽孢杆菌作为益生菌对机体也具有一定程度的免疫调理作用,本研究为产气荚膜梭菌重组体研究更新了理论数据,为产气荚膜梭菌病口服重组疫苗的研究提供了技术依托。
王栋[10]（2019）在《犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析》文中进行了进一步梳理目前抗生素在动物临床上的滥用已经普遍存在,而滥用的后果造成了极大的资源浪费和环境污染,动物疾病的有效诊断能够显着降低抗生素的滥用。作为一种机体的蛋白,降钙素原（Procalcitonin PCT）具有较高的灵敏度和特异性,在临床上是一种用于机体严重细菌感染性疾病和病毒感染性疾病的鉴别诊断指标。因此,本研究以犬的PCT蛋白为研究对象,通过原核表达,蛋白纯化,间接ELISA检测方法的建立以及重组蛋白的应用性分析来探讨犬PCT蛋白的临床应用性。首先,构建并验证了犬pET-30a-PCT表达载体。重组质粒双酶切以及测序结果显示,犬PCT蛋白基因成功克隆至pET-30a中,SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导的重组菌成功表达出分子质量为14.9 ku的蛋白,与预期结果相符。其次,进行重组蛋白纯化和验证。通过对影响蛋白表达的因素进行优化,SDS-PAGE结果显示,诱导温度28℃,IPTG终浓度1 mmol/L,诱导9 h,重组蛋白可溶性表达量较多。将His标签的单克隆抗体作一抗对重组蛋白进行验证,Western blot结果显示,重组蛋白与His标签的抗体发生特异性反应。随后,纯化重组蛋白,免疫小鼠,制备多克隆抗体。SDS-PAGE,Western blot和间接ELISA结果显示,纯化蛋白无杂带且具有良好的反应原性,多抗血清效价达到1:51200。间接ELISA检测方法的建立。通过对包被条件进行优化,结果表明,抗原最佳包被浓度为5 mg/L,最佳血清稀释浓度为1:200,最佳孵育时间为60 min;最佳二抗稀释倍数为1:5000,最佳孵育时间为30 min。敏感性试验结果表明本试验建立的间接ELISA敏感性较高。最后,进行重组蛋白应用性分析。通过间接ELISA检测方法对健康犬和炎症犬的血清进行检测,ELISA结果显示,发生炎症犬的血清内成功检测到PCT且与炎症反应程度呈正相关。综上所述,本研究通过对犬pET-30a-PCT原核表达载体的构建,重组蛋白的表达,间接ELISA检测方法的建立以及对该蛋白应用性的分析,为犬PCT蛋白生物学功能的进一步研究以及为其单克隆抗体的制备和免疫胶体金检测试纸的开发提供了理论基础。
二、一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用（论文提纲范文）
（1）东北虎β、γ和β-γ干扰素蛋白的制备及生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 干扰素的发现及分类 |
| 1.2.1 干扰素的发现 |
| 1.2.2 干扰素的分类 |
| 1.3 干扰素的分子结构 |
| 1.4 干扰素的信号传导 |
| 1.5 干扰素的生物学活性 |
| 1.5.1 抗病毒活性 |
| 1.5.2 抗肿瘤和抗增殖活性 |
| 1.5.3 免疫调节活性 |
| 1.6 基因工程干扰素的临床应用 |
| 1.7 重组融合蛋白的研究进展 |
| 1.7.1 干扰素融合蛋白研究现状 |
| 1.7.2 重叠延伸PCR技术 |
| 1.8 东北虎概况及研究进展 |
| 1.8.1 东北虎概况 |
| 1.8.2 东北虎研究进展 |
| 1.9 本研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及实验动物 |
| 2.1.2 质粒、载体及菌株 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液配制 |
| 2.1.4 主要试验仪器 |
| 2.2 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因的克隆 |
| 2.2.1 东北虎及家猫基因组的提取 |
| 2.2.2 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因引物设计与合成 |
| 2.2.3 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因的扩增 |
| 2.3 东北虎IFN-β、IFN-γ基因的序列分析 |
| 2.3.1 进化分析 |
| 2.3.2 氨基酸同源性分析 |
| 2.3.3 信号肽预测分析 |
| 2.3.4 跨膜区分析 |
| 2.3.5 疏水性分析 |
| 2.3.6 二级结构预测 |
| 2.3.7 3D结构预测 |
| 2.4 东北虎及家猫干扰素基因的原核表达 |
| 2.4.1 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ成熟肽基因的克隆 |
| 2.4.2 东北虎IFNβ-γ融合基因的克隆 |
| 2.4.3 原核表达载体的构建 |
| 2.4.4 原核表达、纯化及复性 |
| 2.5 兔抗东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.5.1 兔抗东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ多克隆抗体的制备 |
| 2.5.2 兔抗东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ多克隆抗体效价的检测 |
| 2.5.3 蛋白免疫印迹(Western blot)分析 |
| 2.6 东北虎及家猫干扰素基因的抗病毒活性分析 |
| 2.6.1 猫肾细胞的复苏及培养 |
| 2.6.2 病毒的培养 |
| 2.6.3 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.6.4 东北虎及家猫干扰素基因的抗病毒活性测定及比较 |
| 2.6.5 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ的抗病毒活性的中和试验 |
| 2.6.6 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ对抗病毒蛋白转录及表达的影响 |
| 2.7 东北虎重组干扰素的理化性质分析 |
| 2.7.1 胰酶敏感性分析 |
| 2.7.2 酸碱敏感性分析 |
| 2.7.3 温度敏感性分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因的克隆 |
| 3.1.1 东北虎及家猫外周血淋巴细胞的体外培养 |
| 3.1.2 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因的扩增 |
| 3.2 东北虎IFN-β、IFN-γ基因的序列分析 |
| 3.2.1 进化关系 |
| 3.2.2 氨基酸同源性对比 |
| 3.2.3 信号肽预测 |
| 3.2.4 跨膜区预测 |
| 3.2.5 疏水性预测 |
| 3.2.6 二级结构预测 |
| 3.2.7 3D结构预测 |
| 3.3 东北虎及家猫干扰素基因的原核表达 |
| 3.3.1 东北虎及家猫干扰素成熟肽基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 3.3.2 东北虎及家猫干扰素基因的原核表达及纯化 |
| 3.4 抗东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.4.1 多克隆抗体的效价检测 |
| 3.4.2 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.5 东北虎及家猫干扰素之间抗病毒活性比较 |
| 3.5.1 VSV、AIV、CDV病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.5.2 东北虎及家猫干扰素抗VSV、AIV、CDV活性的比较 |
| 3.5.3 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ的抗病毒活性的中和试验 |
| 3.5.4 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ对抗病毒蛋白转录及表达的影响 |
| 3.6 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ理化性质分析 |
| 3.6.1 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-IFNγ胰酶敏感性分析 |
| 3.6.2 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ酸碱敏感性分析 |
| 3.6.3 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ温度敏感性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 东北虎及家猫IFN-β、IFN-γ基因的克隆 |
| 4.2 东北虎IFN-β、IFN-γ基因序列的生物信息学分析 |
| 4.3 东北虎IFN-β、IFN-γ、IFNβ-γ及家猫干扰素基因的原核表达 |
| 4.4 东北虎IFN-β、IFN-γ、IFNβ-γ及家猫干扰素基因的抗病毒活性分析及比较 |
| 4.5 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ对JAK-STAT通路的激活 |
| 4.6 东北虎IFN-β、IFN-γ及IFNβ-γ的理化性质 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学 硕士学位论文修改情况确认表 |
（2）桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物生长的影响 |
| 1.2 植物抗旱性的研究进展 |
| 1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
| 1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
| 1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
| 1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
| 1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
| 1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
| 1.4.1 Trxs功能概况 |
| 1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
| 1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
| 1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
| 1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
| 1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
| 1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
| 1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
| 1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
| 1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
| 1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
| 1.9.1 前期工作基础 |
| 1.9.2 技术流程 |
| 第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂及菌株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
| 2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
| 2.3.3 基因克隆 |
| 2.3.4 序列的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
| 2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
| 2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
| 3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
| 3.3.2 基因定量引物设计 |
| 3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
| 3.3.4 叶片含水量测定 |
| 3.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 3.3.6 原核表达载体的构建 |
| 3.3.7 多克隆抗体制备 |
| 3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
| 3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
| 3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
| 3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
| 3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
| 3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
| 3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
| 3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
| 3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 植物表达载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
| 4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
| 4.3.7 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
| 4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
| 4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
| 4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
| 4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 主要试剂和耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
| 5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
| 5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
| 5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
| 5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
| 5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
| 5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
| 5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
| 5.3.9 叶绿色素含量测定 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
| 5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
| 5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
| 5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 主要试剂和耗材 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
| 6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
| 6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
| 6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
| 6.3.5 生理生化指标测定 |
| 6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
| 6.3.7 数据统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
| 6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
| 6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
| 6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
| 6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
| 6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
| 6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 试验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 样品转录组文库构建 |
| 7.3.2 上机测序 |
| 7.3.3 信息分析流程 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
| 7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
| 7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
| 7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
| 7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
| 7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
| 7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 本研究总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 粪类圆线虫简介 |
| 1.1.1 粪类圆线虫概述 |
| 1.1.2 粪类圆线虫的生活史 |
| 1.1.3 粪类圆线虫的流行病学 |
| 1.1.4 粪类圆线虫病的临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 粪类圆线虫病的诊断方法和治疗措施 |
| 1.2 .虾青素金属蛋白酶 |
| 1.2.1 金属蛋白酶概述 |
| 1.2.2 虾青素金属蛋白酶概述 |
| 1.2.3 虾青素金属蛋白酶研究进展 |
| 1.3 显微注射在寄生虫基因功能研究中的应用 |
| 2.研究目的与意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物以及实验用菌株、载体 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验溶液的配制 |
| 3.2.1 抗生素和培养基的制备 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)主要溶液 |
| 3.2.4 Western blot缓冲液 |
| 3.2.5 线虫收集用缓冲液 |
| 3.2.6 ELISA试验相关溶液 |
| 3.2.7 镍柱亲和纯化缓冲液 |
| 3.2.8 酶活实验缓冲液 |
| 3.2.9 其它缓冲液 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 粪类圆线虫的保存和各阶段虫体的收集及感染方法 |
| 3.3.2 引物的设计与合成 |
| 3.3.3 粪类圆线虫DNA的提取 |
| 3.3.4 粪类圆线虫RNA的提取 |
| 3.3.5 反转录获得粪类圆线虫cDNA的提取 |
| 3.3.6 粪类圆线虫Ss-ast-1的生物信息学分析 |
| 3.3.7 粪类圆线虫Ss-ast-1全长和截短型原核表达质粒的构建 |
| 3.3.7.1 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p ET-42b-no GST载体) |
| 3.3.7.2 Ss-ast-1 全长基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.3 Ss-ast-1 截短基因的PCR扩增(p E-SUMO载体) |
| 3.3.7.4 PCR产物的凝胶检测 |
| 3.3.7.5 PCR产物的凝胶纯化回收 |
| 3.3.7.6 目的DNA连接p ET-42b-no GST与 p E-SUMO载体 |
| 3.3.7.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.3.7.8 连接产物的转化 |
| 3.3.7.9 菌液PCR鉴定 |
| 3.3.8 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的小量表达 |
| 3.3.9 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 3.3.10 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的大量表达 |
| 3.3.11 包涵体的溶解 |
| 3.3.12 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的纯化 |
| 3.3.13 粪类圆线虫Ss-AST-1重组蛋白的复性 |
| 3.3.14 粪类圆线虫Ss-AST-1 重组蛋白的Western-Blot分析 |
| 3.3.15 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.16 ELISA测定多抗血清效价 |
| 3.3.17 粪类圆线虫全虫蛋白的提取 |
| 3.3.18 Western blot多克隆抗体的特异性 |
| 3.3.19 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的酶活性实验 |
| 3.3.20 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 3.3.21 粪类圆线虫的转基因实验 |
| 3.3.22 粪类圆线虫转基因后代的观察 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 选定研究基因 |
| 4.1.1 从转录组数据中筛选锌依赖性金属蛋白酶的基因 |
| 4.1.2 构建进化树选定粪类圆线虫靶基因 |
| 4.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的生物信息学分析 |
| 4.2.1 粪类圆线虫Ss-ast-1蛋白的氨基酸进化树 |
| 4.2.2 粪类圆线虫Ss-ast-1基因的氨基酸比对分析 |
| 4.2.3 粪类圆线虫Ss-AST-1抗原性和亲水性分析 |
| 4.2.4 粪类圆线虫Ss-ast-1 基因的DNA结构分析 |
| 4.2.5 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白的三维结构分析 |
| 4.3 粪类圆线虫Ss-ast-1基因在各个时期的转录水平分析 |
| 4.4 粪类圆线虫Ss-AST-1蛋白信号肽位置分析 |
| 4.5 原核表达质粒的构建和鉴定 |
| 4.5.1 全长蛋白原核表达质粒Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc的构建 |
| 4.5.2 全长原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-qc的构建 |
| 4.5.3 Ss-AST-1 截短型原核表达质粒Ss-AST-1-p E-SUMO-jd的构建 |
| 4.6 粪类圆线虫全长和截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.1 以Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.1.1 Ss-AST-1 的诱导表达(Ss-AST-1-p ET-42b-no GST-qc) |
| 4.6.1.2 不同浓度IPTG对全长Ss-AST-1 蛋白表达的影响 |
| 4.6.1.3 全长Ss-AST-1蛋白在包涵体和上清中的表达情况 |
| 4.6.2 .以Ss-AST-1-p E-SUMO-qc质粒表达全长Ss-AST-1 |
| 4.6.3 截短型Ss-AST-1的原核表达 |
| 4.6.4 蛋白的纯化 |
| 4.6.5 蛋白的复性 |
| 4.6.6 复性蛋白的Western blot分析 |
| 4.7 酶谱法检测酶活性 |
| 4.8 多克隆抗体的制备 |
| 4.8.1 ELISA测定抗血清效价 |
| 4.8.2 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.9 粪类圆线虫Ss-ast-1的基因定位 |
| 4.9.1 粪类圆线虫Ss-ast-1基因启动子序列分析 |
| 4.9.2 粪类圆线虫Ss-ast-1定位质粒的构建 |
| 4.9.3 粪类圆线虫Ss-ast-1在虫卵中的表达模式 |
| 5.讨论 |
| 5.1 粪类圆线虫Ss-AST-1的一级结构和三维结构分析 |
| 5.2 粪类圆线虫Ss-AST-1的原核蛋白的表达和纯化 |
| 5.3 粪类圆线虫Ss-AST-1的酶活性的分析 |
| 5.4 粪类圆线虫Ss-ast-1的转录水平的分析 |
| 5.5 粪类圆线虫Ss-AST-1的定位分析 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（4）新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩词对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新孢子虫病概述 |
| 1.1 病原及生活史 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 生活史 |
| 1.2 新孢子虫流行病学 |
| 1.2.1 流行病学调查 |
| 1.2.2 新孢子虫传播方式 |
| 1.3 致病机制与临床症状 |
| 1.3.1 致病机制 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.4 免疫反应 |
| 1.4.1 天然免疫 |
| 1.4.2 体液免疫 |
| 1.4.3 细胞免疫 |
| 1.5 诊断及防治 |
| 1.5.1 新孢子虫病诊断 |
| 1.5.2 新孢子虫病防治 |
| 1.6 新孢子虫防治过程存在的问题与展望 |
| 第二章 新孢子虫基因功能研究进展 |
| 2.1 新孢子虫基因功能研究技术 |
| 2.1.1 基因组测序 |
| 2.1.2 转染技术 |
| 2.1.3 CRISPR-Cas9 |
| 2.2 新孢子虫基因功能研究进展 |
| 2.3 新孢子虫基因功能研究中的问题与展望 |
| 第三章 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.1 原癌基因概述 |
| 3.1.1 原癌基因简介 |
| 3.1.2 原癌基因功能概述 |
| 3.2 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.1 原癌基因相关通路研究进展 |
| 3.2.2 原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.3 寄生虫调控宿主原癌基因表达研究进展 |
| 3.2.4 寄生虫原癌基因调控蛋白研究进展 |
| 3.2.5 原癌基因调控蛋白研究中的问题与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 NcMYR1和NcMYR2 蛋白在虫体中的亚细胞定位 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 虫体与细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 新孢子虫MYR基因序列分析 |
| 1.2.2 新孢子虫速殖子及细胞的培养 |
| 1.2.3 新孢子虫c DNA提取 |
| 1.2.4 PCR扩增Nc MYR1和NcMYR2 基因 |
| 1.2.5 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 基因表达载体的构建 |
| 1.2.6 重组NcMYR1和Nc MYR2 蛋白的表达 |
| 1.2.7 重组NcMYR1和Nc MYR2 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 制备抗NcMYR1和NcMYR2 蛋白多克隆抗体 |
| 1.2.9 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白细胞内虫体免疫荧光定位 |
| 1.2.10 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白细胞外虫体免疫荧光定位 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Nc MYR1和NcMYR2 基因序列分析 |
| 1.3.2 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 基因表达载体的构建 |
| 1.3.3 pET-32a-NcMYR1和pET-32a-NcMYR2 重组蛋白诱导表达及纯化 |
| 1.3.4 Nc MYR1和NcMYR2 蛋白在虫体中的亚细胞定位 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 Nc MYR1 基因敲除虫株和Nc MYR2 基因敲除虫株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫体与细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与材料 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞及新孢子虫速殖子的培养 |
| 2.2.2 基因敲除质粒的构建和DHFR同源重组基因片段制备 |
| 2.2.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 的构建及鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因敲除质粒的构建和DHFR同源重组基因片段制备 |
| 2.3.2 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株PCR鉴定 |
| 2.3.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株Western blot鉴定 |
| 2.3.4 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株免疫荧光鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Nc MYR1和NcMYR2 基因功能研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 虫体与细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 试剂与材料 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬斑试验、入侵及增殖试验、逸出试验 |
| 3.2.2 毒力试验 |
| 3.2.3 ELISA检测细胞因子 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株生长、入侵、增殖和逸出 |
| 3.3.2 △Nc MYR1 和△NcMYR2 虫株毒力检测 |
| 3.3.3 △Nc MYR1 和△NcMYR2 诱导小鼠细胞因子检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 △Nc MYR1 虫株和Nc MYR1 重组蛋白对小鼠抗野生株的保护作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 虫体与细胞 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组NcMYR1 蛋白免疫小鼠和攻虫试验 |
| 4.2.2 △Nc MYR1 虫株感染小鼠和攻虫试验 |
| 4.2.3 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组NcMYR1 蛋白免疫小鼠细胞因子的检测 |
| 4.3.2 重组NcMYR1 蛋白对小鼠抗野生株感染的保护作用 |
| 4.3.3 △Nc MYR1 虫株免疫小鼠细胞因子检测 |
| 4.3.4 △Nc MYR1 虫株对小鼠抗野生株感染的保护作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（5）细胞穿膜肽融合ADκ的制备及活性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 癌症治疗的现状 |
| 1.2 Cyclin D1 与癌症 |
| 1.2.1 Cyclin D1 的分子结构特点及调节 |
| 1.2.2 Cyclin D1 的生物学功能 |
| 1.2.3 Cyclin D1 相关的癌症靶向治疗 |
| 1.3 胞内抗体 |
| 1.3.1 单链抗体的定义及类型 |
| 1.3.2 胞内抗体的发展前景 |
| 1.4 细胞穿膜肽概述 |
| 1.4.1 细胞穿膜肽的定义 |
| 1.4.2 细胞穿膜肽分类 |
| 1.4.3 细胞穿膜肽的穿膜机制 |
| 1.5 本论文立题目的及意义 |
| 第二章 融合蛋白ADΚ-PTN的制备及活性分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 主要药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组人Cyclin D1 蛋白的表达纯化及活性分析 |
| 2.2.2 抗Cyclin D1 单链抗体ADκ的表达纯化及活性分析 |
| 2.2.2.1 抗Cyclin D1 单链抗体ADκ的可溶性表达与纯化 |
| 2.2.2.2 ELISA鉴定纯化的单链抗体蛋白 |
| 2.2.3 穿膜肽融合的新型抗Cyclin D1单链抗体ADκ-PTN蛋白的制备 |
| 2.2.4 ADκ-PTN抗原结合活性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Cyclin D1 蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.3.2 抗Cyclin D1 单链抗体ADκ的纯化及鉴定 |
| 2.3.3 成功制备穿膜肽融合的新型抗Cyclin D1 单链抗体ADκ-PTN |
| 2.3.4 融合蛋白ADκ-PTN的活性分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 融合蛋白ADΚ-TAT的制备及活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌株 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 主要药品及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 穿膜肽融合的新型抗Cyclin D1 单链抗体ADκ-TAT蛋白的制备 |
| 3.2.2 ADκ-PTN抗原结合活性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 成功制备穿膜肽融合抗Cyclin D1 单链抗体ADκ-TAT |
| 3.3.2 纯化的ADκ-TAT蛋白具有较好的抗原结合活性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 抗菌肽概述 |
| 1.1.1 抗菌物质的发展史 |
| 1.1.2 抗菌肽的种类 |
| 1.1.3 抗菌肽的作用原理 |
| 1.1.4 抗菌肽的应用 |
| 1.1.5 获得抗菌肽的途径 |
| 1.1.6 天蚕素抗菌肽的研究进展 |
| 1.2 抗菌肽基因的表达系统 |
| 1.2.1 原核表达系统 |
| 1.2.2 真核表达系统 |
| 1.3 本论文研究的内容、目的及意义 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目的及意义 |
| 2 天蚕素AD在毕赤酵母中的诱导型表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与载体 |
| 2.2.2 试剂与酶 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基及常用溶液的配制 |
| 2.2.5 天蚕素AD基因的克隆 |
| 2.2.6 重组质粒p PIC9K-CAD的构建 |
| 2.2.7 重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-CAD的构建 |
| 2.2.8 重组菌株GS115/p PIC9K-CAD抗菌肽生物活性的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 天蚕素AD的基因克隆 |
| 2.3.2 重组质粒p PIC9K-CAD的构建 |
| 2.3.3 重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-CAD的构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 天蚕素AD在毕赤酵母中的组成型表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株与载体 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 天蚕素AD基因的克隆 |
| 3.2.4 重组质粒p GAPZαA-CAD的构建 |
| 3.2.5 重组毕赤酵母菌株X33/GCAD的构建 |
| 3.2.6 p GAPKa A-CAD载体的构建 |
| 3.2.7 p UCGAP-CAD载体的构建 |
| 3.2.8 多拷贝菌株的构建 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR法确定重组菌株中的基因拷贝数 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 天蚕素AD基因的克隆 |
| 3.3.2 重组质粒p GAPZαA-CAD的构建 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母菌株X33/GCAD的构建 |
| 3.3.4 多拷贝菌株的构建及拷贝数的鉴定 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 重组菌株发酵产物的鉴定及其发酵条件的优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 天蚕素AD的Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶 |
| 4.2.2 天蚕素AD的质谱鉴定 |
| 4.2.3 不同发酵培养基的选择 |
| 4.2.4 发酵培养基中不同碳源的选择 |
| 4.2.5 发酵培养中氮源添加量优化 |
| 4.2.6 发酵培养中初始pH的优化 |
| 4.2.7 抗菌肽生物效价的计算方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 天蚕素AD的 Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶 |
| 4.3.2 天蚕素AD的质谱鉴定 |
| 4.3.3 不同发酵培养基的选择 |
| 4.3.4 发酵培养基中不同碳源的选择 |
| 4.3.5 发酵培养基中氮源添加量优化 |
| 4.3.6 发酵培养中初始pH的优化 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 天蚕素AD的活性检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 天蚕素AD的抗菌谱测定 |
| 5.2.2 天蚕素AD对某些致病菌的抗菌活性测定 |
| 5.2.3 抗菌肽耐高温性检测 |
| 5.2.4 抗菌肽耐蛋白酶检测 |
| 5.2.5 溶血活性的测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 天蚕素AD的抗菌谱测定 |
| 5.3.2 天蚕素AD对某些致病菌的抗菌活性测定 |
| 5.3.3 抗菌肽耐高温性检测 |
| 5.3.4 抗菌肽耐蛋白酶检测 |
| 5.3.5 溶血活性的测定 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（7）重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 L-谷氨酰胺 |
| 1.1.1 理化性质 |
| 1.1.2 代谢及生理功能 |
| 1.1.3 局限性及替代物 |
| 1.2 丙谷二肽 |
| 1.2.1 理化性质及应用优势 |
| 1.2.2 合成方法及研究进展 |
| 1.2.3 检测方法 |
| 1.3 异源表达系统介绍 |
| 1.3.1 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.3.2 酿酒酵母真核表达系统 |
| 1.3.3 毕赤酵母真核表达系统 |
| 1.4 糖基化修饰 |
| 1.4.1 N-糖基化修饰 |
| 1.4.2 O-糖基化修饰 |
| 1.5 本文主要研究思路 |
| 1.5.1 选题背景及存在问题 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线 |
| 2 异源表达SsAet重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和溶液 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 分子操作技术 |
| 2.2.6 分析验证方法 |
| 2.2.7 异源表达SsAet重组大肠杆菌的构建 |
| 2.2.8 异源表达SsAet重组大肠杆菌诱导条件的优化 |
| 2.2.9 全细胞催化合成Ala-Gln反应条件的优化 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Ala-Gln定性定量方法的确立 |
| 2.3.2 异源表达SsAet重组大肠杆菌的表征 |
| 2.3.3 可溶性表达SsAet重组大肠杆菌的构建及筛选 |
| 2.3.4 OPA催化方式及催化活性差异性的分析 |
| 2.3.5 OPA诱导条件和全细胞催化反应条件的优化 |
| 2.3.6 循环利用OPA全细胞合成Ala-Gln |
| 2.4 本章小结 |
| 3 表面展示SsAet重组酿酒酵母合成Ala-Gln |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和溶液 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 分子操作技术 |
| 3.2.6 分析验证方法 |
| 3.2.7 表面展示SsAet重组酿酒酵母的构建 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 表面展示方式对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.2 密码子优化对SsAet催化活性的影响 |
| 3.3.3 表面展示SsAet重组酿酒酵母的絮凝化 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 糖基化修饰对SsAet结构和催化活性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和溶液 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 分子操作技术 |
| 4.2.6 分析验证方法 |
| 4.2.7 异源表达SsAet重组毕赤酵母的构建 |
| 4.2.8 产酶条件和催化反应条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 异源表达SsAet重组毕赤酵母的表征 |
| 4.3.2 糖基化修饰对SsAet催化活性的影响 |
| 4.3.3 糖基化修饰的鉴定及对SsAet结构的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 胞内表达SsAet重组酿酒酵母的自固定化及高效合成Ala-Gln |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 试剂和仪器 |
| 5.2.3 培养基和溶液 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.2.5 分子操作技术 |
| 5.2.6 分析验证方法 |
| 5.2.7 胞内表达SsAet重组酵母的构建 |
| 5.2.8 胞内表达SsAet重组酵母培养条件的优化 |
| 5.2.9 胞内表达SsAet重组酵母全细胞催化反应条件的优化 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 胞内表达SsAet重组酵母的催化活性 |
| 5.3.2 胞内表达SsAet重组酵母的条件优化 |
| 5.3.3 胞内表达SsAet重组酵母的自固定化及重复利用 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（8）OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 富含谷氨酸植物蛋白研究进展 |
| 1.2 WD40-repeat蛋白 |
| 1.3 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.3.1 表达载体的选择 |
| 1.3.2 表达条件的优化 |
| 1.3.3 分子伴侣助表达作用 |
| 1.4 蛋白质间相互作用研究进展 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 pull down技术 |
| 1.4.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.5 本研究的内容及目的 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 试验内容 |
| 1.5.3 试验的目的 |
| 1.5.4 试验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 PCR引物 |
| 2.1.4 酶与各种生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 OsGWD1 基因的克隆 |
| 2.2.1.1 水稻根总RNA的提取 |
| 2.2.1.2 c DNA第一条链合成 |
| 2.2.1.3 基因的PCR扩增 |
| 2.2.1.4 目的片段与载体连接转化trans5α |
| 2.2.1.5 菌落PCR鉴定阳性克隆 |
| 2.2.1.6 测序与保种 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 植物RNAi载体的构建 |
| 2.2.3.1 入门载体构建 |
| 2.2.3.2 LR重组反应 |
| 2.2.3.3 转化与鉴定 |
| 2.2.4 植物过表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 质粒提取 |
| 2.2.4.2 添加酶切位点 |
| 2.2.4.3 PCR产物和载体双酶切 |
| 2.2.4.4 连接反应 |
| 2.2.4.5 转化与鉴定 |
| 2.2.4.6 双酶切鉴定 |
| 2.2.5 OsGWD1 基因亚细胞定位 |
| 2.2.5.1 感受态土壤农杆菌GV3101 制备 |
| 2.2.5.2 冻融法转化农杆菌感受态GV3101 |
| 2.2.5.3 亚细胞定位 |
| 2.2.6 水稻遗传转化 |
| 2.2.7 转基因水稻植株的鉴定 |
| 2.2.7.1 PCR鉴定 |
| 2.2.7.2 快速试纸条鉴定 |
| 2.2.8 原核表达载体的构建 |
| 2.2.8.1 质粒的提取 |
| 2.2.8.2 OsGWD1 基因的PCR扩增 |
| 2.2.8.3 双酶切 |
| 2.2.8.4 连接转化与鉴定 |
| 2.2.8.5 双酶切鉴定 |
| 2.2.9 目的蛋白的表达 |
| 2.2.9.1 原核表达载体在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳检测蛋白表达 |
| 2.2.9.3 目的蛋白的可溶性检测 |
| 2.2.10 目的蛋白可溶性探索 |
| 2.2.10.1 含有分子伴侣pTf16 的制备及转化 |
| 2.2.10.2 目的蛋白的小量表达 |
| 2.2.10.3 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.2.11 重组蛋白质表达条件的优化 |
| 2.2.12 目的蛋白的大量表达及纯化 |
| 2.2.12.1 目的蛋白的大量表达 |
| 2.2.12.2 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.13 目的蛋白的浓缩及透析 |
| 2.2.14 His-tag pull down初步筛选互作蛋白 |
| 2.2.14.1 水稻根部总蛋白的提取 |
| 2.2.14.2 目的蛋白与水稻根部总蛋白浓度的测定 |
| 2.2.14.3 His-tag pull down法捕获的OsGWD1的互作蛋白 |
| 2.2.14.4 互作蛋白功能注释及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 OsGWD1 基因克隆 |
| 3.1.1 水稻根部总RNA提取结果 |
| 3.1.2 OsGWD1 基因的扩增 |
| 3.1.3 OsGWD1 基因克隆载体的阳性鉴定 |
| 3.2 生物信息学分析 |
| 3.2.1 氨基酸序列理化性质分析 |
| 3.2.2 亲水性与疏水性预测 |
| 3.2.3 OsGWD1 蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.4 OsGWD1 信号肽预测 |
| 3.2.5 OsGWD1 蛋白跨膜结构及保守结构域分析 |
| 3.2.6 OsGWD1 蛋白二级结构预测 |
| 3.2.7 OsGWD1 蛋白三级结构预测 |
| 3.2.8 相互作用的蛋白的预测 |
| 3.3 植物RNAi载体构建结果 |
| 3.3.1 入门载体构建结果 |
| 3.3.2 LR重组结果分析 |
| 3.4 植物过表达载体构建结果 |
| 3.5 OsGWD1 基因亚细胞定位 |
| 3.5.1 重组过表达载体转化GV3101 |
| 3.5.2 OsGWD1 基因亚细胞定位检测 |
| 3.6 水稻的遗传转化与鉴定 |
| 3.6.1 水稻的遗传转化 |
| 3.6.2 PCR法检测转基因水稻 |
| 3.6.3 快速试纸条检测转基因水稻 |
| 3.7 原核表达载体的构建 |
| 3.8 目的蛋白的表达 |
| 3.8.1 原核表达载体在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 3.8.2 目的蛋白的可溶性检测 |
| 3.8.3 共表达体系的构建结果 |
| 3.8.4 重组蛋白的小量表达 |
| 3.8.5 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.8.6 目的蛋白质诱导表达条件的优化 |
| 3.8.7 目的蛋白的大量表达及纯化 |
| 3.8.8 BSA蛋白标准曲线的制定 |
| 3.8.9 His-tag pull down捕获OsGWD1 互作蛋白 |
| 3.9 互作蛋白的功能分析 |
| 3.9.1 总蛋白的GO功能分析 |
| 3.9.2 总蛋白的KEGG富集分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 目的基因的克隆 |
| 4.2 植物表达载体的构建及转基因植株的获得 |
| 4.3 OsGWD1 基因的原核表达与纯化 |
| 4.4 His-tag pull down初步筛选互作蛋白 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）枯草芽孢杆菌表达产气荚膜梭菌α，β和ε毒素融合蛋白对小鼠的免疫保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 产气荚膜梭菌简介 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌生物学特征 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌致病机理 |
| 1.1.3 产气荚膜梭菌毒素研究进展 |
| 1.1.4 产气荚膜梭菌分型及相关疾病 |
| 1.2 产气荚膜梭菌重组疫苗 |
| 1.2.1 重组融合毒素蛋白 |
| 1.2.2 重组疫苗载体 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统概述 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌概述 |
| 1.3.2 表达质粒 |
| 1.3.3 宿主菌株 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌转化 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 主要溶液及培养基 |
| 2.2 β毒素蛋白抗原表位预测及免疫原性分析 |
| 2.2.1 β 毒素蛋白抗原表位预测 |
| 2.2.2 Cpb~(108-305)毒素重组表达载体构建 |
| 2.2.3 Cpb~(108-305)毒素蛋白及Cpb蛋白诱导表达 |
| 2.2.4 Cpb~(108-305)毒素蛋白与Cpb蛋白免疫效果比较 |
| 2.3 产气荚膜梭菌Cpa-b-x融合蛋白原核表达质粒的构建及表达 |
| 2.3.1 pHT43-Cpa-b-x质粒构建 |
| 2.3.2 重组产气荚膜梭菌Cpa-b-x基因PCR扩增 |
| 2.3.3 重组产气荚膜梭菌Cpa-b-x基因克隆及测序 |
| 2.3.4 pHT43-Cpa-b-x重组表达载体的构建 |
| 2.3.5 枯草芽孢杆菌阳性转化子的筛选 |
| 2.3.6 Cpa-b-x融合蛋白的表达、鉴定及纯化 |
| 2.4 口服表达融合蛋白的枯草芽孢杆菌对小鼠的免疫保护 |
| 2.4.1 口服免疫 |
| 2.4.2 血清抗体lgG及肠道黏膜抗体slgA检测 |
| 2.4.3 细胞因子分泌水平检测 |
| 2.4.4 外周血淋巴细胞转化率检测 |
| 2.4.5 外周血CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞含量检测 |
| 2.4.6 攻毒保护及病理组织观察 |
| 2.4.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 β毒素蛋白抗原表位预测结果及免疫原性分析 |
| 3.1.1 β 毒素蛋白抗原表位预测结果 |
| 3.1.2 β 毒素蛋白表达鉴定结果 |
| 3.1.3 免疫效果比较 |
| 3.2 Cpa-b-x融合蛋白原核表达质粒的构建及表达结果 |
| 3.2.1 枯草芽孢杆菌pHT43-Cpa-b-x阳性转化子的构建 |
| 3.2.2 Cpa-b-x融合蛋白的表达及鉴定 |
| 3.3 口服表达融合蛋白的枯草芽孢杆菌对小鼠的免疫保护结果 |
| 3.3.1 血清抗体lgG及肠道黏膜抗体slgA结果分析 |
| 3.3.2 细胞因子分泌水平结果分析 |
| 3.3.3 外周血淋巴细胞转化率分析结果 |
| 3.3.4 外周血CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞含量结果分析 |
| 3.3.5 攻毒后免疫保护率 |
| 3.3.6 小鼠肠道病理组织切片结果分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 个人简介 |
（10）犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 降钙素原的来源 |
| 1.2 降钙素原的生物学功能 |
| 1.3 降钙素原作为诊断工具 |
| 1.4 降钙素原检测的临床意义 |
| 1.5 指导抗生素的临床应用 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 工具酶、抗体以及分子生物学试剂盒 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要实验仪器设备 |
| 2.1.6 主要试验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 犬PCT蛋白的原核表达及多抗制备 |
| 2.2.2 犬降钙素原蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.3 犬降钙素原蛋白的应用分析 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 重组表达载体的构建与多抗制备 |
| 3.1.1 重组载体pET-30a-PCT的构建与鉴定 |
| 3.1.2 犬PCT蛋白的原核表达 |
| 3.1.3 重组蛋白诱导条件的优化及蛋白表达形式分析 |
| 3.1.4 重组蛋白表达鉴定 |
| 3.1.5 蛋白纯化与验证 |
| 3.1.6 小鼠免疫与多抗血清效价测定 |
| 3.1.7 Western blot检测多抗的特异性 |
| 3.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.1 抗原包被浓度 |
| 3.2.2 免疫血清稀释浓度 |
| 3.2.3 血清孵育时间 |
| 3.2.4 酶标二抗稀释浓度 |
| 3.2.5 酶标二抗孵育时间 |
| 3.2.6 敏感性试验 |
| 3.3 犬PCT蛋白的应用分析 |
| 3.3.1 犬体温的变化 |
| 3.3.2 犬血液白细胞和中性粒细胞的变化 |
| 3.3.3 犬血清IL-6和TNF-的变化 |
| 3.3.4 犬血清PCT的变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 连接转化条件的优化 |
| 4.2 原核表达载体的选择 |
| 4.3 诱导表达条件的优化 |
| 4.4 蛋白纯化 |
| 4.5 ELISA检测方法条件的优化 |
| 4.6 犬降钙素原蛋白应用分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用（论文参考文献）
- [1]东北虎β、γ和β-γ干扰素蛋白的制备及生物学活性研究[D]. 母梦瑶. 东北林业大学, 2021(08)
- [2]桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [3]粪类圆线虫Ss-ast-1虾青素金属蛋白酶编码基因的鉴定与表达分析[D]. 单嘉男. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]新孢子虫原癌基因调控蛋白MYR基因敲除株的构建及其功能研究[D]. 杜博亚. 吉林大学, 2020(08)
- [5]细胞穿膜肽融合ADκ的制备及活性分析[D]. 李承娟. 吉林大学, 2020(08)
- [6]天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达[D]. 牛军波. 兰州交通大学, 2020(01)
- [7]重组微生物全细胞催化高效合成丙谷二肽[D]. 李益民. 大连理工大学, 2020(07)
- [8]OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析[D]. 唐子清. 江西农业大学, 2019
- [9]枯草芽孢杆菌表达产气荚膜梭菌α，β和ε毒素融合蛋白对小鼠的免疫保护作用[D]. 王玉建. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析[D]. 王栋. 山东农业大学, 2019(01)