一、昆虫微孢子虫及其应用的研究进展（论文文献综述）
李贝贝[1]（2021）在《Serpin1对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响及作用机制》文中研究说明丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins是分布最为广泛,数量最大的一类抑制剂超家族,主要通过调控蛋白酶的活性,在昆虫对病原菌的免疫应答过程中扮演着重要的角色。早有研究表明serpins家族在体液免疫中起主要作用。东亚飞蝗是世界性重要害虫之一,对农业及畜牧业造成严重的危害。实验室前期研究发现金龟子绿僵菌对东亚飞蝗有较好的控制作用,但对东亚飞蝗的免疫机制较少研究。本文为了研究丝氨酸蛋白酶抑制剂在东亚飞蝗抵抗绿僵菌的免疫机制,本文克隆并获得Serpin1蛋白,分别通过饲喂蛋白和RNAi的方法检测了绿僵菌处理后东亚飞蝗的死亡率及体内部分保护酶、解毒酶及水解酶的活性,并测定了脂肪体内免疫相关基因的表达性状,为进一步揭示东亚飞蝗的免疫机制奠定了基础。结果如下:1.通过qRT-PCR检测了serpin1基因在绿僵菌侵染东亚飞蝗时的表达量升高,表明serpin1参与东亚飞蝗的免疫;serpin1在东亚飞蝗的各个龄期和各个组织中均有表达,且在三龄和表皮中表达量最高。通过克隆和原核表达获得Serpin1蛋白,对serpin1基因序列分析发现:serpin1基因序列为1228bp,开放阅读框为1040bp,共编码346个氨基酸,其蛋白分子量为35.6k Da。2.通过平板培养及酶活实验验证Serpin1蛋白对绿僵菌体内酶系及蛋白酶的抑制功能。结果表明不同浓度的Serpin1蛋白均不能抑制绿僵菌的生长,但可显着抑制绿僵菌胞外蛋白酶的活性。且不同含量的Serpin1蛋白均可显着抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性,10μg的Serpin1蛋白的抑制效果最高。3.通过Serpin1蛋白及绿僵菌混合处理东亚飞蝗,验证绿僵菌杀虫效果,并通过酶标法验证不同处理组间保护酶（SOD、POD）、解毒酶（GSTs、MFO）、水解酶（ESTs、ACh E）以及PO的活性,qRT-PCR验证Toll通路相关基因（toll、myd88、tube、sp?tzle、persephone、defensin）和黑化反应相关基因（PPAE、PPO）的表达机制研究。结果表明将Serpin1与绿僵菌混合后处理东亚飞蝗,显着降低绿僵菌对蝗虫的杀虫效果;Serpin1蛋白与绿僵菌共同处理东亚飞蝗,显着提高了东亚飞蝗体内的保护酶、解毒酶、水解酶以及PO的活性,并可显着提高东亚飞蝗体内Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达。4.通过干扰虫体的serpin1后,再次施用绿僵菌,并通过酶标法验证不同处理组间保护酶、解毒酶、水解酶以及PO的活性,qRT-PCR验证Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达机制研究。研究表明干扰serpin1,可增加东亚飞蝗的死亡率;致使东亚飞蝗体内的检测7种酶的活性紊乱,并降低东亚飞蝗体内Toll通路相关基因和黑化反应相关基因的表达。即serpin1能够增强东亚飞蝗的酶学免疫,提高免疫相关基因的表达。
郑宁[2]（2021）在《家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能研究》文中指出miRNA是一类长度约为21-23 nt的调控性小分子RNA,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,在生物生长发育、分化和疾病等方面都发挥重要作用。目前,在真菌内发现了类似miRNA的真菌小RNA（MicroRNA-likeRNA,milRNAs）。milRNAs可通过调控病原菌与寄主内相关基因的表达,从而在真菌的发育、致病和宿主的免疫等过程中发挥重要作用。微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的真菌类病原微生物,能够广泛的感染无脊椎动物和脊椎动物。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis,N.b）是第一个被发现的微孢子虫,可作为微孢子虫的代表种,其引发的家蚕微粒子病严重威胁着蚕业生产的可持续发展,由于其独特的致病机理,也可作为研究寄生类真菌的模式生物。通过对家蚕微孢子虫milRNA及其功能的研究,可为家蚕微孢子虫milRNA的研究奠定基础,也为解析家蚕微孢子虫的侵染机制和病害防控提供参考。鉴于此,我们通过深度测序预测了家蚕微孢子虫milRNAs,对milRNA-8的表达特征和功能进行了研究,并通过预测milRNA的靶基因,初步解析了milRNA-8调控家蚕微孢子虫的增殖机制。论文取得的研究结果如下:1.家蚕微孢子虫milRNAs的预测和分析为了预测家蚕微孢子虫的milRNAs,本研究通过荧光显微镜观察和q PCR检测对家蚕微孢子虫的生活史进行分析,结果显示家蚕微孢子虫在48 h的裂殖增殖期时,尚未形成完整的孢壳,是微孢子虫milRNAs最丰富的时期,故选择48 h的家蚕微孢子虫进行milRNA测序。通过milRNA测序对得到的家蚕微孢子虫sRNAs进行长度筛选、基因组比对和milRNAs二级结构分析,共预测到的11个家蚕微孢子milRNAs。采用stem-loop q RT-PCR对其表达量进行验证,结果显示有10个milRNAs的表达水平与测序预测趋势一致,均在微孢子虫感染后特异高表达。以上研究结果表明,在家蚕微孢子虫48 h裂殖增殖期预测的10个milRNAs较为可靠,可进行后续研究。2.家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能分析为了分析家蚕微孢子虫milRNAs的功能,本研究成功构建7个milRNAs过表达载体,在细胞水平转染后,利用q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示milRNA-4、milRNA-8、milRNA-10和milRNA-12对N.b的增殖有促进作用,milRNA-1、milRNA-3和milRNA-11对N.b的增殖有抑制作用,其中milRNA-8对N.b的促进作用最显着,故以milRNA-8为研究对象进行后续研究。为分析milRNA-8的表达特征进行,我们通过stem-loop q RT-PCR对milRNA-8的表达水平进行分析,结果表明家蚕细胞感染N.b后,milRNA-8的表达量呈上升趋势;进一步对milRNA-8设计特异的荧光探针,采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）发现,milRNA-8在微孢子虫的孢原质和宿主的细胞质内表达。为进一步探究milRNA-8的功能,在细胞水平添加milRNA-8 inhibitor后,通过q PCR检测家蚕微孢子虫的拷贝数,结果显示N.b的增殖受到了抑制。以上研究表明,milRNA-8对N.b的增殖有重要的调控作用。3.家蚕微孢子虫milRNA-8靶基因的筛选与鉴定为进一步探究milRNA-8对N.b增殖的调控机制,我们对milRNA-8在宿主内的靶基因进行预测,共预测到569个候选基因,选取其中表达水平的差异倍数≥2的64个候选基因进行研究。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and genomes,KEGG）分析发现这些基因主要富集于新陈代谢类、神经活性受体--配体类和过氧化物酶体通路。此外,利用q RT-PCR对候选基因的表达水平进行检测,发现过表达milRNA-8后,家蚕过氧化物酶膜蛋白基因16（Bombyx mori peroxisomal membrane protein 16,BmPEX16）的表达水平受到显着抑制。基于以上对候选基因的功能和表达水平的分析,我们选择了其中涉及过氧化物酶体生物形成的BmPEX16进行深入研究。为了验证milRNA-8与BmPEX16的结合作用,除对结合位点进行分析外,利用双荧光素酶报告实验检测发现,将BmPEX16 3’UTR部分序列与milRNA-8过表达载体共转后,实验组荧光素酶活性降低。为了分析BmPEX16的基因特征,通过序列比对分析,发现BmPEX16与鳞翅目类、双翅目类具有较高的序列保守性;q RT-PCR检测发现,其在大造5龄3天（5L3D）的血液和中肠高表达,同时,在细胞水平上感染N.b后,发现其表达水平呈下降趋势。为进一步研究milRNA-8对BmPEX16的调控作用,添加milRNA-8 inhibitor后,通过q RT-PCR检测,BmPEX16的表达水平上调。以上研究结果表明,BmPEX16为milRNA-8的靶基因,其表达水平受到milRNA-8的调控。4.BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响为了探究BmPEX16对家蚕微孢子虫增殖的影响,我们构建了BmPEX16的过表达载体,q RT-PCR和Western Blotting检测发现,当BmPEX16表达量上调,对微孢子虫的增殖有抑制作用。此外,根据规律成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）编辑系统的原理,设计并成功构建CRISPR/Cas13a编辑载体和ssg BmPEX16敲除载体,q RT-PCR和Western Blotting检测发现,当BmPEX16表达量下降时,对微孢子虫的增殖有显着的促进作用。以上研究表明,家蚕微孢子虫milRNA-8可通过下调宿主BmPEX16的表达水平,影响宿主的过氧化物酶体的形成,抑制宿主的先天免疫反应,有助于微孢子虫的入侵,从而促进自身增殖。
周妮[3]（2021）在《家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化》文中研究指明微孢子虫（microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞病原真菌。其宿主范围广泛,几乎能感染所有动物包括人类。第一种被报道的微孢子虫是家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）,距今已经150多年的历史。其感染家蚕后能够水平传播和经卵垂直传播,导致后代大面积死亡,严重影响了蚕业的发展。近年来,随着分子生物学的发展,微孢子虫的基因组研究发展迅速。目前已经完成了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）、蝗虫微孢子虫（Nosema locustae）、家蚕微粒子虫等多种微孢子虫的全基因组测序。微孢子虫的研究已经进入后基因组时代了,深入研究微孢子虫的基因功能尤为重要。目前,微孢子虫基因功能的研究只能通过同源性分析预测基因功能以及体外实验研究,缺乏体内研究证据。并且微粒子虫的大部分基因与其它生物几乎没有同源性,我们无法对其研究。正是因为缺乏有效的遗传操作体系,极大的限制了对家蚕微粒子虫的研究,导致了微粒子虫研究瓶颈。因此亟需建立有效的家蚕微粒子虫遗传操作体系。而此系统的瓶颈之一在于缺少可用的转化子筛选药物与特异的筛选标记,这极大的限制了其遗传操作系统的效率。因此,本研究在实验室前期工作的基础上,通过探索外源基因的转染方法、优化转基因载体元件和建立高效的药物筛选富集系统,从这三个方面进行探究对遗传操作体系进行优化,为建立高效的遗传操作体系奠定基础,提供新的方法。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子虫外源基因转染方法及时期的研究本研究首先选用家蚕肌动蛋白A3基因启动子,结合带有piggyBac转座子的载体,构建了pBac-[IE2-HK]-[A3-EGFP]载体。并制备了不同N/P值的HTCC/pDNA复合物,确定制备复合体的配方,并探索了季铵化壳聚糖（HTCC）介导转染家蚕微粒子虫的方法。随后利用脂质体法和HTCC法分别进行转染,将质粒导入家蚕微粒子虫成熟孢子中,添至宿主细胞中进行培养,在转染9天后两种方法都观察到了发出绿色荧光的孢子。分别采用脂质法和HTCC法,在不同的时期对感染家蚕微粒子虫的宿主细胞进行转染,发现脂质体转染组,在感染0 h和12 h观察到了绿色荧光孢子,HTCC转染组均未观察到绿色荧光孢子。以上研究结果表明,通过脂质体法转染家蚕微粒子虫成熟孢子,导入外源基因是可行的,转染最佳时期为微粒子虫侵染细胞后0 h-12 h内;HTCC法转染感染家蚕微粒子虫的宿主细胞的最佳时期仍不确定,且现阶段转染家蚕微粒子虫成熟孢子的效果不稳定。2.家蚕微粒子虫转化子药物筛选体系的建立为了便于从数量庞大的家蚕微粒子虫中快速筛选富集到转化子,本研究建立了药物筛选富集系统。实验室前期对巴龙霉素、多菌灵等药物进行了筛选,但没有获得能有效抑制家蚕微粒子虫增殖并能筛选出转化子的药物。在此基础上,本研究根据微孢子虫胞内寄生的特点,初步选择了红霉素（Erythromycin）、土霉素（Oxytetracycline）、壮观霉素（Spectinomycin）、G418（G418 sulfate）、硫链丝菌素（Thiostrepton）、潮霉素（Hygromycin B）、烟曲霉素（Fumagillin）等不同作用机制的药物,设计了不同浓度梯度进行了宿主细胞毒性评估,确定了最大安全浓度,并且评估了它们抑制微孢子虫增殖的能力。最终结果表明G418、壮观霉素和烟曲霉素在可用浓度范围内,能够有效抑制家蚕微粒子虫增殖。随后分别构建了含有对应抗性基因的三种转基因载体,对家蚕微粒子虫转染并在宿主细胞中进行药物筛选培养。通过qPCR检测抗性基因的表达量以及家蚕微粒子虫β-tubulin基因的表达量来评估突变体的筛选效果,发现烟曲霉素可用于筛选转化子。以上研究结果首次表明,来自酵母菌的甲硫氨酸氨肽酶I（MAPI）基因可以作为家蚕微粒子虫遗传操作体系的抗性基因,并可以利用烟曲霉素作为筛选药物来筛选转化子。3.家蚕微粒子虫转基因载体元件优化为了优化外源基因的表达水平,便于后续显微观察和药物筛选,对转基因载体元件进行优化。我们选择可以编码荧光强度更高的荧光蛋白基因（mNeonGreen）作为报告基因,以此来增强转化子的荧光强度。并结合实验室前期所得的家蚕微粒子虫侵染家蚕中肠早期的转录组数据,选定了10个家蚕微粒子虫中表达量较高的基因,通过qPCR确证出了其中4个表达量相对较高的基因。根据家蚕微粒子虫基因组数据库信息,对4个基因以及后期表达量极高的极管蛋白2,3的上游调控序列进行分析预测启动子序列,并分别克隆其启动子序列用于调控报告基因的表达。随后,构建了六个含有不同启动子的mNG荧光蛋白表达载体,通过脂质体转染将载体导入受体中。结果显示,目的基因有转录,但未能观察到绿色荧光的家蚕微粒子,后续研究将进一步筛选其他适用的强启动子。
龙江琼[4]（2020）在《纳米银对家蚕微粒子的抑制作用研究》文中进行了进一步梳理微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核微生物,分布极其广泛,几乎可以寄生在包括人在内的所有脊椎动物与无脊椎动物中。家蚕微粒子（Nosema bombycis,N.b）是第一个被鉴定的微孢子虫,能够感染家蚕（Bombyx mori）引起家蚕微粒子病（Pébrine）,给蚕业造成重大的经济损失。当前防控家蚕微粒子的手段主要有:母蛾镜检淘汰有毒蚕种、饲养过程中严格消毒处理、感染后通过防微灵及阿苯达唑等化学药物治疗。由于家蚕微粒子的结构特殊,现有治疗药物效果尚不稳定,一直以来家蚕微粒子的防治工作以预防为主。但是现有的预防措施也很难达到一个理想的效果,迫切需要研发一种新型高效的防控方法。纳米银（Ag nanoparticles,AgNPs）是粒径为纳米级的金属银单质,由于其独特的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等,已广泛应用于化工、纺织、电子、生命科学和医学等研究领域,并呈现出极其重要的应用价值。纳米银具有广谱的抗菌特性,抗菌效果持久,且不易产生耐药性,能够有效的杀灭细菌、真菌和支原体等致病微生物。本研究为了探究纳米银对家蚕病原微生物尤其家蚕微粒子是否具有抑制作用以及对家蚕微粒子的作用机制,进行了相关研究,并获得以下研究结果:1.纳米银对家蚕生长发育的影响通过透射电子显微镜观察到纳米银呈球形,大小在324 nm,主要集中分布在318 nm,晶格条纹间距为0.23 nm。家蚕BmN-SWU1细胞增殖活力实验表明,12μg/m L浓度以下的纳米银不影响家蚕细胞的增殖活力。进一步选取1μg/m L、10μg/mL、25μg/m L、50μg/m L和100μg/m L五个浓度纳米银,对家蚕幼虫的毒性进行测试,结果显示各组之间家蚕幼虫体重、全茧量、茧层量、茧层率以及产卵数均没有显着差异,表明100μg/mL以下浓度的纳米银对家蚕幼虫安全。2.纳米银对家蚕主要病原的抑制作用家蚕病原微生物包括病毒、细菌以及真菌,其中家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）以及家蚕微粒子危害最为严重,本研究选择二者以及几种代表性细菌作为纳米银抑制家蚕病原微生物的研究对象。首先鉴定纳米银对BmNPV的抑制作用,个体水平上通过qRT-PCR分析发现,纳米银作用后病毒基因的表达量维持在一个较低水平;存活率统计结果显示,纳米银处理后显着提高了家蚕的存活率。纳米银对家蚕病原细菌的抑制作用检测结果表明,25μg/m L以上浓度的纳米银能够完全抑制灵菌、苏芸金杆菌和黑胸败血病菌的生长繁殖。进而对纳米银抑制家蚕微粒子的作用进行检测,统计感染家蚕微粒子后的家蚕存活率发现,纳米银作用后能提高家蚕存活率,100μg/m L的纳米银作用后在第十天时家蚕存活率高达90%,此时正常感染家蚕微粒子的家蚕存活率仅20%。qRT-PCR结果分析发现,家蚕微粒子的拷贝数低于对照组,且随纳米银作用浓度的升高而显着降低,证明了纳米银能够抑制家蚕微粒子的增殖。以上结果表明纳米银对BmNPV、家蚕细菌以及家蚕微粒子均有抑制作用,对家蚕病原微生物具有广谱抗性。3.纳米银对家蚕微粒子的作用机制探究综合家蚕病原微生物的防控现状,选取家蚕微粒子作为主要研究对象,探究纳米银对家蚕微粒子的作用机制。纳米银作用家蚕微粒子后经人工发芽处理发现,纳米银浓度越高,家蚕微粒子的发芽率越低,从而影响了家蚕微粒子的侵染能力。通过透射电子显微镜观察家蚕微粒子的结构发现,纳米银处理后,家蚕微粒子的刺突状孢子外壁变得光滑,具有透明电子层的孢子内壁变厚,孢子内部结构如细胞核、细胞器、发芽装置等变得极其紊乱。进而通过扫描电子显微镜观察发现,纳米银在接触到家蚕微粒子后便迅速作用于孢壁,随着时间的延长,部分家蚕微粒子出现破裂干瘪的现象。对纳米银处理后的家蚕微粒子的细胞核进行染色以及qRT-PCR检测,发现其核物质被释放出来;对家蚕微粒子的总蛋白检测结果表明,纳米银处理使家蚕微粒子释放出大量蛋白质,导致家蚕微粒子蛋白质严重变性降解。综合以上结果表明,纳米银会严重破坏家蚕微粒子的结构,与孢壁作用增加其通透性,从而被破坏的一些DNA以及蛋白质等其他物质被释放出来,使其侵染能力大大削弱,降低了家蚕微粒子的致病能力。
周敬林[5]（2019）在《柞蚕凝集素基因克隆及表达分析》文中研究表明凝集素作为一种模式识别受体,在昆虫免疫系统中发挥着重要的作用,主要通过识别病原微生物表面的特定模式分子来激活昆虫免疫防御系统。不同的凝集素含有的特异性碳水化合物识别结构域CRD不同,能够识别的病原微生物表面特定模式分子也不同。其中C型凝集素是鳞翅目昆虫中凝集素的主要类型,是一种Ca2+依赖的糖结合蛋白,对病原物表面的糖蛋白、糖脂都有较好的结合能力。本文以柞蚕凝集素为对象,对其序列特征、基因表达水平、重组蛋白的凝集活性进行研究,以期进一步明晰柞蚕免疫中模式识别受体—凝集素的功能及作用机理。1.本研究从柞蚕中肠转录组数据库中筛选出柞蚕凝集素相关序列,设计引物,克隆获得4个柞蚕凝集素基因Lectin、Lectin16、Lectin21、CTL,并对其氨基酸序列进行比对和生物信息学分析:Lectin开放阅读框（ORF）长度为678 bp,编码225个氨基酸,预测其等电点（PI）为6.30,蛋白分子质量（Mw）为26.11 kDa,1-19个氨基酸为信号肽;Lectin16开放阅读框（ORF）长度为708 bp,编码235个氨基酸,预测其等电点（PI）为6.63,蛋白分子质量（Mw）为26.99 kDa,1-34个氨基酸为信号肽;Lectin21开放阅读框（ORF）长度为801 bp,编码266个氨基酸,预测其等电点（PI）为6.70,蛋白分子质量（Mw）为30.13 kDa,无信号肽;CTL开放阅读框（ORF）长度为924 bp,编码307个氨基酸,预测其等电点（PI）为5.11,蛋白分子质量（Mw）为34.97 kDa,1-15个氨基酸为信号肽。2.利用半定量RT-PCR技术分析柞蚕凝集素基因在卵、幼虫、蛹、成虫4个发育时期的时间表达谱和幼虫不同组织的空间表达谱。半定量RT-PCR检测基因表达谱表明,4个凝集素基因在柞蚕各组织中表达存在差异。其中CTL分布广泛,在除血浆和马氏管以外的各组织中均有表达。其他3个基因主要在血细胞、中肠、脂肪体和生殖器官中表达。3.利用实时定量PCR技术检测柞蚕幼虫中凝集素基因经柞蚕微孢子虫（Nosema pernyi）、柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus）、柞蚕链球菌（Streptococcus pernyi）、白僵菌（Beauveria bassiana）4种病原微生物及大肠杆菌（Escherichia coli）诱导后不同时间点的表达水平变化。实时定量PCR结果显示经不同病原物及大肠杆菌诱导后柞蚕凝集素基因在血细胞和中肠中的表达量均有明显升高。经5种不同微生物诱导以后,凝集素基因在感染细菌后基因表达量变化最显着,其中感染大肠杆菌、核型多角体病毒后凝集素基因表达量变化最迅速,6-9 h高表达;感染微孢子虫以后凝集素基因表达量随诱导时长逐渐升高,在24 h后最高达;在链球菌的诱导下凝集素基因表达量在9 h升至最高,然后逐渐降低;感染白僵菌后24 h凝集素开始高表达。4.将克隆所得基因与原核表达载体pEASY?-E1 Expression vector相连后转化到感受态细胞BL21（DE3）,通过SDS-PAGE检测表明经IPTG诱导后重组质粒能够表达与预测蛋白质量相一致的融合蛋白。Western blot结果显示,纯化后的菌液能够杂交产生目的条带。凝集试验验证了重组蛋白对大肠杆菌、鼠血红细胞的凝集活性。
高娜[6]（2019）在《示踪家蚕微粒子的创制研究》文中研究说明微孢子虫（Microsporidia）是一类专性寄生于细胞内的单细胞真核微生物,在自然界中广泛存在。微孢子虫寄主广泛,影响宿主的生长发育,严重时可导致宿主死亡。家蚕微粒子（Nosema bombycis,N.b）是最早被认识的微孢子虫,也是Nosema属的重要成员之一,它能够感染重要泌丝经济昆虫家蚕（Bombyx mori）引发家蚕微粒子病（Pébrine）,给养蚕业造成巨大的经济损失。因此,对家蚕微粒子生活史的研究以及对其侵染路径和增殖过程进行标记示踪,将为家蚕微粒子的基础研究和有效防控奠定基础。家蚕微粒子具有严格的寄生生活方式,只有在宿主细胞内才能进行增殖,完成生活周期。目前微孢子虫示踪大多采用标记成熟微孢子虫的方法,而胞内阶段的未成熟微孢子虫很难被发现,且不能对微孢子虫进行活体标记和实时观察,限制了对其生活周期和侵染增殖机制的研究。可视化的示踪技术是研究病原入侵、增殖以及和宿主互作的有效手段,通过基因操作实现外源荧光蛋白活体示踪已在其他病原中广泛应用,但由于缺乏微孢子虫遗传操作体系,现阶段尚未获得活体示踪微孢子虫。鉴于此,本文首先对家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞的特征进行了分析,然后尝试不同的转基因方法,并结合家蚕微粒子生活史中不同发育阶段的结构特征,对示踪家蚕微粒子的创制进行探索。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞的特征透射电子显微镜观察发现,在家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞后3 h,可在细胞内观察到芽体（孢原质）时期的家蚕微粒子,并在感染后9 h发现芽体体积增大;在感染后48 h、72 h和84 h依次观察到正在分裂的裂殖体、质膜增厚的孢子母细胞以及具有完整结构的新生孢子。通过RT-PCR分析家蚕微粒子侵染后各时间点微管蛋白基因Nbβ-Tublin、孢壁蛋白基因NbSWP5、几丁质合成酶1基因NbCs-1（Chitin synthase 1）、极管蛋白基因NbPTP2和DNA复制许可因子6基因NbMCM6（DNA replication licensing factor MCM6）基因的表达情况,发现相关基因的表达水平与家蚕微粒子发育过程特点相符。利用NbPTP2抗体、DAPI和荧光增白剂28对BmE-SWU1细胞中的家蚕微粒子进行标记观察,可对胞外感染期、裂殖体时期、孢子母细胞时期和成熟孢子时期的家蚕微粒子进行区分。以上研究结果表明,家蚕微粒子感染宿主BmE-SWU1细胞后,84 h完成一个生活周期,在03 h为感染期,348 h为裂殖增殖期,72 h后已进入孢子增殖期。2.示踪家蚕微粒子创制构建含有不同启动子的pIZ-OpIE2-DsRed、pig-A3-EGFP、pSL1180-NbCDCP23-DsRed和pSL1180-NbPTP2-DsRed四个荧光蛋白表达载体,通过多次脂质体转染的方式,将质粒导入感染家蚕微粒子后的细胞,仅在转染了pIZ-OpIE2-DsRed和pig-A3-EGFP的实验组中观察到呈现荧光的示踪家蚕微粒子。采用电转化成熟家蚕微粒子的导入方法,未能获得示踪家蚕微粒子。采用电转化感染家蚕微粒子后的细胞的方法,在感染后9 h和48 h进行电转化,均发现呈现荧光的示踪家蚕微粒子,而在感染后60 h的电转化实验组中则没有观察到。体腔注射转染已感染家蚕微粒子的蚕体,导入pig-A3-EGFP表达载体,结果在蚕体组织中观察到部分家蚕微粒子呈现绿色荧光。以上研究结果表明,OpIE2prm和A3prm启动子在家蚕微粒子中能够启动荧光蛋白表达;家蚕微粒子的裂殖增殖期有利于荧光蛋白基因的转化;通过转染感染家蚕微粒子后的细胞和蚕体以及电转化感染家蚕微粒子后的细胞的方法导入荧光蛋白基因是可行的。3.示踪家蚕微粒子的收集和鉴定收集蚕体转染实验获得的示踪家蚕微粒子,提取基因组,进行PCR检测,结果扩增出EGFP的特异条带。进一步将收集的示踪家蚕微粒子再接种于细胞,发现示踪家蚕微粒子能够正常侵染宿主细胞,并在宿主细胞内进行增殖,产生新生的孢子,在感染后8 d内均可观察到呈现荧光的示踪家蚕微粒子。以上研究结果表明,A3prm-EGFP表达元件能进入家蚕微粒子的基因组,并能启动荧光蛋白的表达,但荧光信号强度较弱,可能与导入效率较低或者启动子启动活性较低等原因相关。综上所述,本研究明确了家蚕微粒子侵染家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1后的生活史特征,探索了多种创制示踪家蚕微粒子的方法,获得了呈现荧光信号的示踪家蚕微粒子,同时筛选到可用的荧光蛋白表达载体,并确定了载体导入和结果检测的最佳时间,初步建立了一种创制示踪家蚕微粒子的方法。
黄旭华,罗梅兰,汤庆坤,王桂文,黄深惠,潘国庆,蒋师东,夏青,王霞,毛洪斌,潘志新[7]（2018）在《家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析》文中指出【目的】从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据。【方法】跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度（IC50）和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU r RNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征。【结果】不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率（毒率）呈波动起伏态势。GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫（GXM6和GXM13）对家蚕无胚种传染力。GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异。【结论】广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性。
杨思佳[8]（2016）在《家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测》文中研究指明微孢子虫可以感染几乎所有动物,包括大多数的昆虫,微孢子虫和微孢子虫病的研究一直是病理学领域的研究热点。家蚕微孢子虫病既可以通过水平传播,也可以经胚胎传播,威胁着各养蚕国家的蚕桑产业的健康可持续发展,因此家蚕微孢子虫病是蚕业生产上最重要的检疫防控对象。自从在人肠道微孢子虫病治疗研究中发现烟曲霉素及其衍生物、类似物均具有明显的治疗效果,且作用的靶位点是Met-AP2基因,这为家蚕微孢子虫病的治疗机理研究提供了方向。故本课题拟在家蚕微孢子虫基因组和转录组数据库中筛选寻找家蚕微孢子虫Met-AP2基因的存在基础上,尝试应用对人微孢子虫病治疗有效的药物烟曲霉素对家蚕微孢子虫病进行模拟治疗研究,探讨药物处理前后在人工感染家蚕微孢子虫的家蚕组织中微孢子虫Met-AP2基因的变化规律,以期为家蚕微孢子虫病的治疗提供实验参考和理论依据。本论文在课题组前期开展家蚕微孢子虫基因组和转录组（广东株）研究基础上,通过生物信息学方法筛选出与烟曲霉素药物治疗相关靶基因Met-AP2进行了PCR测序验证及检测应用研究,并对其基因功能及其在家蚕组织中的不同侵染阶段的表达功能等进行了分析研究,旨在为家蚕微孢子虫病有效治疗提供分子依据。结果如下:（1）家蚕微孢子虫Met-AP2基因的验证及生物信息学分析在对家蚕微孢子虫的转录组数据中推断的Met-AP2基因进行PCR克隆测序验证,经不同引物测序验证发现相似性都在93%以上,其中MC-F/R引物测序结果与转录组数据相似性高达99.9%;以引物MC-F/R,2047F/R对其他家蚕常见病原微生物及4种昆虫微孢子虫中Met-AP2基因的特异性,敏感性进行PCR鉴别,并以引物MC-F/R对相应片段进行克隆测序分析。发现家蚕微孢子虫（广东株）只存在一个Met-AP2基因,开放阅读框1077 bp,共编码358个氨基酸,其编码蛋白的分子量约为45kDa,为疏水的稳定蛋白。Met-AP2基因序列上没有预测的信号肽糖基化位点及跨膜结构域,其蛋白结构中存在典型的α–helix元件。（2）建立了原核重组质粒pET-28a–met使用pET-28a载体,Rosetta感受态细胞,对Met-AP2进行原核表达,并通过SDS-PAGE和Western blot验证其分子量为45KDa,与预测结果相符。对融合蛋白进行镍琼脂糖亲和层析纯化后得到纯度较高的蛋白。（3）家蚕微孢子虫烟曲霉素治疗效果验证及Met-AP2靶基因应用对正常家蚕、感病家蚕、只添食药物烟曲霉素家蚕和感病后烟曲霉素治疗的家蚕进行了比较观察,发现添食药物之后的家蚕表面无明显的病斑。同时筛选了5对以Met-AP2基因为靶基因的LAMP引物,选了其中一个效果较好的引物LM1,优化了合适的内外引物配比和扩增温度,创新地建立一套基于Met-AP2基因的家蚕微孢子虫LAMP检测方法。同时通过对添食药物前后不同时期中肠组织的进行了LAMP检测,从分子水平上验证了烟曲霉素治疗家蚕微孢子虫病的效果,为生产上推进应用烟曲霉素药物治疗家蚕微孢子虫病提供实验参考。
王玉强[9]（2015）在《微孢子虫在害虫生物防治中的应用研究进展》文中进行了进一步梳理昆虫微孢子虫能引起昆虫的流行病,是一种很有应用潜力的微生物杀虫剂。综述昆虫微孢子虫在防治蝗虫、红火蚁、棉铃虫、玉米螟、云南松毛虫等农业害虫上的研究进展,并对目前存在的问题及其应用前景进行了展望。
宋小景,刘吉平[10]（2014）在《玉米微孢子虫超微结构的观察与系统发育分析》文中研究表明玉米螟微孢子虫作为玉米螟田间种群自然控制因子之一,能否交叉感染家蚕,其与家蚕微孢子虫的血缘关系值得探究。通过对实验室搜集的家蚕微孢子虫和玉米微孢子虫进行了电镜水平的超微结构观察和分析,进而对它们的16S r DNA基因进行了PCR扩增、测序和系统发育分析,结果显示玉米微孢子虫与家蚕微孢子虫均属Nosema属,分别落在不同进化枝上的种,这可能暗示了玉米螟微孢子虫不能直接感染家蚕的部分缘由。
二、昆虫微孢子虫及其应用的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、昆虫微孢子虫及其应用的研究进展（论文提纲范文）
（1）Serpin1对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响及作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 昆虫病原菌与寄主的协同进化 |
| 1.1.1 病原菌防效 |
| 1.1.2 昆虫病原真菌的侵染机理 |
| 1.2 昆虫免疫系统 |
| 1.2.1 细胞免疫 |
| 1.2.2 体液免疫 |
| 1.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 |
| 1.3.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类 |
| 1.3.2 serpins基因的结构及抑制途径 |
| 1.3.3 serpins在昆虫先天免疫系统中的机制 |
| 1.4 研究的内容与目的 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 技术路线图 |
| 第二章 东亚飞蝗serpin1 基因的克隆及其蛋白功能分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.2 培养基及试剂的配制 |
| 2.1.3 供试虫源 |
| 2.1.4 供试菌株 |
| 2.1.5 总RNA和 c DNA的获取 |
| 2.1.6 serpin1 基因表达量的测定 |
| 2.1.7 serpin1 时空表达分析 |
| 2.1.8 serpin1 基因克隆 |
| 2.1.9 serpin1 表达载体构建 |
| 2.1.10 Serpin1 蛋白的提取 |
| 2.1.11 Serpin1 蛋白的生物学功能分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 绿僵菌侵染后serpin1 基因表达量 |
| 2.2.2 serpin1 基因的组织和龄期定位 |
| 2.2.3 serpin1 基因的克隆及表达 |
| 2.2.4 Serpin1 对胰蛋白酶的抑制 |
| 2.2.5 Serpin1 对胰凝乳蛋白酶的抑制 |
| 2.2.6 Serpin1 对绿僵菌生长的抑制 |
| 2.2.7 Serpin1 对绿僵菌胞外蛋白酶的抑制 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Serpin1 蛋白对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 供试真菌 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.1.4 对绿僵菌杀虫活性的测定 |
| 3.1.5 东亚飞蝗免疫相关酶活的测定 |
| 3.1.6 东亚飞蝗免疫相关基因表达量的测定 |
| 3.1.7 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Serpin1 蛋白对绿僵菌杀虫活性的影响 |
| 3.2.2 Serpin1 蛋白对东亚飞蝗免疫相关酶活性的影响 |
| 3.2.3 Serpin1 蛋白对东亚飞蝗免疫相关基因的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 通过RNAi对 serpin1 基因的功能进行验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试样品 |
| 4.1.2 供试真菌 |
| 4.1.3 主要试剂与仪器 |
| 4.1.4 serpin1 双链RNA的合成 |
| 4.1.5 serpin1 干扰效率的测定 |
| 4.1.6 对绿僵菌杀虫活性的测定 |
| 4.1.7 对东亚飞蝗免疫相关酶的影响的测定 |
| 4.1.8 对东亚飞蝗免疫相关基因的测定 |
| 4.1.9 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 serpin1 基因的干扰效率 |
| 4.2.2 干扰serpin1 基因对绿僵菌侵染与东亚飞蝗致病力的影响 |
| 4.2.3 干扰serpin1 基因对东亚飞蝗免疫相关酶活性的影响 |
| 4.2.4 干扰serpin1 基因对东亚飞蝗免疫相关基因表达量的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 非编码RNA |
| 1.1.1 非编码RNA的分类 |
| 1.1.2 非编码RNA的功能 |
| 1.1.3 miRNA |
| 1.2 真菌RNA(microRNA-likeRNA,milRNA) |
| 1.2.1 milRNA生物形成 |
| 1.2.2 milRNA生物功能 |
| 1.2.3 milRNA研究方法 |
| 1.3 微孢子虫 |
| 1.3.1 微孢子虫概述 |
| 1.3.2 微孢子虫的调控机制 |
| 1.3.3 微孢子虫非编码RNA研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 家蚕微孢子虫milRNAs的预测和分析 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫milRNA-8 的鉴定和功能分析 |
| 2.2.3 家蚕微孢子虫milRNA-8 靶基因的筛选与鉴定 |
| 2.2.4 BmPEX16 对家蚕微孢子虫增殖的影响 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕微孢子虫milRNAs的预测和分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 主要试剂制备 |
| 3.1.4 实验方法和步骤 |
| 3.1.5 家蚕微孢子虫测序样品的准备与分析 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫侵染BmE-SWUI细胞的增殖特征 |
| 3.2.2 家蚕微孢子虫milRNAs的预测 |
| 3.2.3 家蚕微孢子虫milRNAs的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 家蚕微孢子虫milRNA-8 的鉴定和功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.1.4 实验方法和步骤 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 milRNAs对家蚕微孢子虫增殖的影响 |
| 4.2.2 milRNA-8 表达特征分析 |
| 4.2.3 milRNA-8 inhibitor对家蚕微孢子虫增殖的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 家蚕微孢子虫milRNA-8 靶基因的筛选与鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验方法和步骤 |
| 5.2 结果和分析 |
| 5.2.1 milRNA-8 靶基因预测及分析 |
| 5.2.2 milRNA-8与BmPEX16 结合作用分析 |
| 5.2.3 BmPEX16 表达特征分析 |
| 5.2.4 milRNA-8与BmPEX16 相互作用分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 BmPEX16 对家蚕微孢子虫增殖的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器与试剂 |
| 6.1.3 主要试剂制备 |
| 6.1.4 实验方法和步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过表达BmPEX16 对微孢子虫增殖的影响 |
| 6.2.2 CRISPR/Cas13a编辑系统的建立 |
| 6.2.3 CRISPR/Cas13a敲除BmPEX16 后对微孢子虫增殖的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
（3）家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微孢子虫概述 |
| 1.1.1 微孢子虫的结构 |
| 1.1.2 微孢子虫的生活史 |
| 1.2 外源DNA导入方法的研究现状 |
| 1.2.1 外源DNA导入方法的类型 |
| 1.2.2 外源DNA导入方法在胞内寄生物中的应用 |
| 1.3 筛选标记 |
| 1.3.1 荧光基因类筛选标记 |
| 1.3.2 抗药基因类筛选标记 |
| 1.3.3 营养缺陷型与功能附加型类筛选标记 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 家蚕微粒子虫外源基因导入方法及时期的研究 |
| 2.2.2 家蚕微粒子虫转化子筛选体系的建立 |
| 2.2.3 家蚕微粒子虫转基因载体元件的优化 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕微粒子虫外源基因导入方法及时期的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕微粒子虫转基因载体的构建 |
| 3.2.2 HTCC介导转染体系的研究 |
| 3.2.3 外源基因的导入及荧光观察 |
| 3.2.4 转染感染家蚕微粒子虫的细胞及荧光观察 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 家蚕微粒子虫转化子药物筛选体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 抗性筛选药物的选择 |
| 4.2.2 细胞毒性评估 |
| 4.2.3 药物抑制家蚕微粒子虫增殖能力评估 |
| 4.2.4 抗性基因载体构建 |
| 4.2.5 药物筛选及抗性基因的可行性评估 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 家蚕微粒子虫转基因载体元件的优化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 工具软件 |
| 5.1.3 主要仪器及试剂 |
| 5.1.4 主要方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荧光报告基因选择与克隆 |
| 5.2.2 家蚕微粒子虫高表达启动子的筛选 |
| 5.2.3 高表达启动子分析及克隆 |
| 5.2.4 启动子调控报告基因的表达载体构建 |
| 5.2.5 外源基因的导入及荧光观察 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语表（Abbreviation） |
| 致谢 |
（4）纳米银对家蚕微粒子的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 家蚕微粒子生物学特征 |
| 1.1.1 家蚕微粒子概述 |
| 1.1.2 家蚕微粒子的结构 |
| 1.1.3 家蚕微粒子的生活史 |
| 1.1.4 家蚕微粒子的稳定性 |
| 1.2 蚕用消毒剂的研究进展 |
| 1.2.1 家蚕病原微生物的种类 |
| 1.2.2 蚕用消毒剂的种类与消毒效果 |
| 1.3 纳米银的研究进展 |
| 1.3.1 纳米银概述 |
| 1.3.2 纳米银在生物医学上的研究进展 |
| 1.3.3 纳米银在家蚕病原消毒中的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景与目的意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 纳米银对家蚕生长发育的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂及溶剂配制 |
| 3.1.4 实验方法及步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 纳米银的表征 |
| 3.2.2 纳米银对家蚕Bm N-SWU1 细胞增殖活力的影响 |
| 3.2.3 纳米银对家蚕体重的影响 |
| 3.2.4 纳米银对家蚕经济性状及产卵能力的影响 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 纳米银对家蚕主要病原的抑制作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂及溶剂配制 |
| 4.1.4 实验方法及步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 纳米银对BmNPV的抑制作用 |
| 4.2.2 纳米银对家蚕细菌的抑制作用 |
| 4.2.3 纳米银对家蚕微粒子的抑制作用 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 纳米银对家蚕微粒子的作用机制探究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂及溶剂配制 |
| 5.1.4 实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 纳米银对家蚕微粒子发芽率的影响 |
| 5.2.2 纳米银处理后家蚕微粒子的结构与形态观察 |
| 5.2.3 纳米银对家蚕微粒子核酸及蛋白质的影响 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文和参研课题情况 |
| 致谢 |
（5）柞蚕凝集素基因克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫免疫 |
| 1.1.1 昆虫的物理防御 |
| 1.1.2 细胞免疫 |
| 1.1.3 体液免疫 |
| 1.1.4 肠道免疫 |
| 1.2 模式识别受体 |
| 1.2.1 β-1,3-葡聚糖识别蛋白、革兰氏阴性细菌结合蛋白 |
| 1.2.2 肽聚糖识别蛋白 |
| 1.2.3 Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs) |
| 1.2.4 昆虫凝集素 |
| 1.2.4.1 昆虫凝集素的结构 |
| 1.2.4.2 昆虫凝集素的功能 |
| 1.3 研究的目的及意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第二章 柞蚕凝集素基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 柞蚕幼虫组织RNA的提取和cDNA的合成 |
| 2.1.6 柞蚕凝集素基因的克隆 |
| 2.1.7 柞蚕凝集素基因的生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 柞蚕凝集素基因的克隆 |
| 2.2.2 柞蚕凝集素基因的序列分析及蛋白质序列同源比对 |
| 2.2.3 柞蚕凝集素与其他昆虫凝集素的进化关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 柞蚕凝集素基因的表达谱分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 试验试剂配制 |
| 3.1.5 设计半定量PCR和实时荧光定量PCR引物 |
| 3.1.6 半定量RT-PCR方法检测柞蚕凝集素基因的表达谱分析 |
| 3.1.7 病原微生物对柞蚕凝集素基因的诱导 |
| 3.1.8 柞蚕幼虫组织RNA的提取和cDNA的合成 |
| 3.1.9 柞蚕凝集素基因诱导表达的实时荧光定量PCR检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA的提取 |
| 3.2.2 柞蚕凝集素基因的组织表达谱分析 |
| 3.2.3 柞蚕凝集素基因在不同病原微生物侵染下的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 柞蚕凝集素基因的原核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.1.4 试剂配置 |
| 4.1.5 引物设计与PCR扩增 |
| 4.1.6 目的片段的PCR扩增和纯化 |
| 4.1.7 目的片段的连接和转化 |
| 4.1.8 重组质粒抽提和转化 |
| 4.1.9 重组蛋白的IPTG诱导表达 |
| 4.1.10 重组蛋白纯化 |
| 4.1.11 重组蛋白的Western Blot检测 |
| 4.1.12 重组蛋白的凝集试验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 原核表达载体的构建 |
| 4.2.2 IPTG诱导产物的检测 |
| 4.2.3 重组蛋白的纯化与SDS-PAGE检测 |
| 4.2.4 Western blot检测 |
| 4.2.5 重组蛋白的凝菌活性检测 |
| 4.2.6 重组蛋白的凝血活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（6）示踪家蚕微粒子的创制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微孢子虫的生物学特征 |
| 1.1.1 微孢子虫概述 |
| 1.1.2 微孢子虫的结构特征和侵染机制 |
| 1.1.3 微孢子虫的生活史 |
| 1.2 家蚕微粒子分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 家蚕微粒子的基因组特征 |
| 1.2.2 家蚕微粒子相关蛋白研究 |
| 1.2.3 家蚕微粒子的基因表达特征 |
| 1.3 微孢子虫的标记与示踪研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 主要研究内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第三章 家蚕微粒子侵染BME-SWU1 细胞的特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 实验方法和步骤 |
| 3.2 结果和分析 |
| 3.2.1 家蚕微粒子侵染BmE-SWU1 细胞后的生活史观察 |
| 3.2.2 家蚕微粒子侵染BmE-SWU1 细胞后相关基因的转录情况 |
| 3.2.3 胞内家蚕微粒子的标记与观察 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 示踪家蚕微粒子创制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器和试剂 |
| 4.1.3 实验方法和步骤 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 荧光蛋白表达载体构建 |
| 4.2.2 脂质体转染感染家蚕微粒子后的BmE-SWU1 细胞的效果检测 |
| 4.2.3 电转化成熟家蚕微粒子的效果检测 |
| 4.2.4 电转化感染家蚕微粒子后的BmE-SWU1 细胞的效果检测 |
| 4.2.5 体腔注射转染感染家蚕微粒子后的蚕体的效果检测 |
| 4.2.6 荧光蛋白基因导入方法评估 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 示踪家蚕微粒子的收集和鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验方法和步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 示踪家蚕微粒子的收集、PCR鉴定和流式检测 |
| 5.2.2 示踪家蚕微粒子再感染观察 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文和参研课题情况 |
| 致谢 |
（7）家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 广西家蚕病原性微孢子虫发生情况调查 |
| 1.3 异型微孢子虫对家蚕的感染力调查 |
| 1.3.1 异型微孢子虫对家蚕的食下感染力测定 |
| 1.3.2 异型微孢子虫对家蚕的胚种传染力调查 |
| 1.3.3 蚕种生产中带毒蚕种胚种传染率调查 |
| 1.4 异型微孢子虫的系统发育进化分析 |
| 1.4.1 基因组DNA提取 |
| 1.4.2 SSU r RNA序列PCR扩增与测序 |
| 1.4.3 构建系统发育进化树 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广西家蚕病原性微孢子虫分布情况 |
| 2.1.1 广西蚕区蚕种繁育微孢子虫分布情况 |
| 2.1.2 广西蚕区饲养家蚕微粒子病发生情况 |
| 2.2 异型微孢子虫对家蚕的感染性 |
| 2.2.1 异型微孢子虫对家蚕的食下感染力 |
| 2.2.2 异型微孢子虫对家蚕的胚种传染率 |
| 2.2.3 蚕种生产中带毒蚕种的微孢子虫胚种传染率调查结果 |
| 2.3 异型微孢子虫的分子系统发育规律 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（8）家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文缩写词中英文对照 |
| 1.前言 |
| 1.1 微孢子虫概述 |
| 1.1.1 微孢子虫结构 |
| 1.1.2 微孢子虫基因组学研究进展 |
| 1.2 家蚕微孢子虫病的发病及流行 |
| 1.2.1 家蚕微孢子虫发病及症状 |
| 1.2.2 家蚕微孢子虫病的流行 |
| 1.3 微孢子虫病的诊断 |
| 1.3.1 微孢子虫病病原染色鉴别 |
| 1.3.2 微孢子虫病的免疫学方法诊断 |
| 1.3.3 微孢子虫病的分子生物学方法诊断 |
| 1.3.4 微孢子虫病的LAMP方法诊断 |
| 1.4 微孢子虫的治疗 |
| 1.4.1 微孢子虫的物理治疗 |
| 1.4.2 微孢子虫的化学治疗 |
| 1.5 烟曲霉素 |
| 1.5.1 烟曲霉素的发现及结构 |
| 1.5.2 烟曲霉素的用途及治疗作用进展 |
| 1.6 Met-AP2基因的研究概述 |
| 1.6.1 Met-AP的发现 |
| 1.6.2 Met-AP的简介 |
| 1.6.3 Met-AP2的结构特点 |
| 1.6.4 Met-AP2的功能及进展 |
| 1.7 烟曲霉素抑制Met-AP2的作用机理 |
| 1.8 本论文研究意义及内容 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂及药品 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 软件及相关在线预测网站 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 生物材料的分离、纯化、核酸提取 |
| 2.2.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因注释和功能预测 |
| 2.2.3 家蚕微孢子虫Met-AP2基因引物的设计 |
| 2.2.4 不同昆虫微孢子虫Met-AP2基因的PCR扩增 |
| 2.2.5 微孢子虫Met-AP2基因克隆重组质粒的构建及测序分析 |
| 2.2.6 家蚕微孢子虫Met-AP2基因系统发育分析 |
| 2.2.7 家蚕微孢子虫Met-AP2基因原核表达 |
| 2.2.8 家蚕微孢子虫Met-AP2基因LAMP方法建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗结果 |
| 3.1.1 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗表征观察结果 |
| 3.1.2 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗治愈率及对家蚕影响的结果 |
| 3.2 家蚕微孢子虫（广东株）转录组的Met-AP2基因测序结果的PCR验证 |
| 3.2.1 家蚕微孢子虫Met-AP2基因引物筛选验证 |
| 3.2.2 家蚕微孢子虫（广东株）转录组的Met-AP2基因测序结果验证 |
| 3.2.3 烟曲霉素对家蚕微孢子虫病治疗前后PCR扩增结果 |
| 3.3 家蚕微孢子虫Met-AP2基因的生物信息学及分析 |
| 3.3.1 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白的结构分析 |
| 3.3.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因与其他物种Met-AP2基因相似性及进化树分析 |
| 3.4 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白的原核表达 |
| 3.4.1 大肠杆菌克隆载体的构建和鉴定 |
| 3.4.2 大肠杆菌重组表达载体pET-28A–met的构建和鉴定 |
| 3.4.3 融合蛋白诱导结果 |
| 3.4.4 融合蛋白的镍琼脂糖亲和层析纯化 |
| 3.4.5 融合蛋白的鉴定及浓度测定 |
| 3.5 基于Met-AP2靶基因的LAMP方法在烟曲霉素治疗效果检测上的应用 |
| 3.5.1 基于Met-AP2靶基因的LAMP引物的筛选结果 |
| 3.5.2 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组反应条件的优化 |
| 3.5.3 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组的特异性及灵敏度检测 |
| 3.5.4 基于Met-AP2靶基因的LM1引物组的烟曲霉素治疗效果的检测 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 家蚕微孢子虫病的症状及烟曲霉素治疗情况研究 |
| 4.1.2 家蚕微孢子虫Met-AP2基因研究 |
| 4.1.3 家蚕微孢子虫Met-AP2蛋白研究 |
| 4.1.4 家蚕微孢子虫病治疗效果LAMP检测研究 |
| 4.1.5 后续工作 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 攻读学位期间的学术成果 |
（9）微孢子虫在害虫生物防治中的应用研究进展（论文提纲范文）
| 1利用蝗虫微孢子虫防治蝗虫 |
| 2利用微孢子虫防治红火蚁 |
| 3利用微孢子虫防治棉铃虫 |
| 4利用玉米螟微孢子虫防治玉米螟、云南松毛虫 |
| 5其他微孢子虫应用研究 |
| 6展望 |
（10）玉米微孢子虫超微结构的观察与系统发育分析（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 家蚕微孢子虫和玉米螟微孢子虫 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 微孢子虫孢子悬浮液的计数 |
| 2.2 微孢子虫 SEM 样品制备与观察 |
| 2.3 微孢子虫 TEM 样品制备与观察 |
| 2.4 玉米螟微孢子虫的分子系统发育分析 |
| 2.4.1 微孢子虫基因组 DNA 的提取 |
| 2.4.2 PCR 扩增和测序 |
| 2.5 系统发育分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫的 SEM 结果 |
| 3.2 玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫超微结构的比较观察 |
| 3.4 基于 16Sr DNA 基因序列的微孢子虫系统发育分析 |
| 4 讨论 |
四、昆虫微孢子虫及其应用的研究进展（论文参考文献）
- [1]Serpin1对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响及作用机制[D]. 李贝贝. 中国农业科学院, 2021
- [2]家蚕微孢子虫milRNA-8的鉴定和功能研究[D]. 郑宁. 西南大学, 2021(01)
- [3]家蚕微粒子虫遗传操作体系的优化[D]. 周妮. 西南大学, 2021(01)
- [4]纳米银对家蚕微粒子的抑制作用研究[D]. 龙江琼. 西南大学, 2020(01)
- [5]柞蚕凝集素基因克隆及表达分析[D]. 周敬林. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [6]示踪家蚕微粒子的创制研究[D]. 高娜. 西南大学, 2019(01)
- [7]家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析[J]. 黄旭华,罗梅兰,汤庆坤,王桂文,黄深惠,潘国庆,蒋师东,夏青,王霞,毛洪斌,潘志新. 南方农业学报, 2018(06)
- [8]家蚕微孢子虫Met-AP2基因验证与烟曲霉素治疗效果检测[D]. 杨思佳. 华南农业大学, 2016(03)
- [9]微孢子虫在害虫生物防治中的应用研究进展[J]. 王玉强. 农业灾害研究, 2015(07)
- [10]玉米微孢子虫超微结构的观察与系统发育分析[J]. 宋小景,刘吉平. 广东蚕业, 2014(04)