一、Spatial and temporal expression of germ cell nuclear factorin murine epididymis（论文文献综述）
陈廷荣[1]（2021）在《腺苷酸环化酶3敲除小鼠雄性不育机制研究》文中研究表明人类不孕不育已经成为一个世界性的健康问题,其发病率在逐年上升。由男性因素导致的不育约占不孕不育患者的40%,因此男性生殖健康的研究具有十分重要的生理意义和社会意义。腺苷酸环化酶3（type 3 adenylyl cyclase,AC3）可以催化三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）生成环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,c AMP）。c AMP可以改变细胞胞内的p H及钙离子浓度,在调节精子成熟、运动能力、顶体反应及受精过程等基本功能中发挥着重要的作用。研究认为,AC3-/-小鼠雄性不育是由于精子穿过透明带能力减弱导致的。但这只是表象解释,AC3基因缺失后对睾丸和附睾功能结构的影响以及AC3基因调控雄性不育的分子机制仍不清楚。本研究围绕AC3基因在小鼠睾丸血睾屏障（blood-testis barrier,BTB）以及附睾的生物学功能及分子机制进行分析,主要从以下三个方面展开研究:1.AC3基因缺失后对小鼠睾丸形态及精子发生过程的影响为了探究AC3基因缺失后是否影响精子形成及顶体形成过程,首先对野生型（wild type,WT）和AC3基因敲除型(AC3 knockout,AC3-/-)小鼠的性腺指数（睾丸或附睾/体重）进行比较。采用组织学苏木素-伊红（Hematoxylin and Eosin,H&E）染色技术,比较WT和AC3-/-小鼠睾丸组织形态学的差异。利用顶体特异性标记物花生凝集素荧光标记（Fluorescein isothiocyanate conjugate peanut agglutinin,FITC-PNA）,检测AC3基因缺失后对小鼠精子顶体发生的影响。研究结果表明,AC3基因缺失后小鼠性腺指数显着降低。FITC-PNA免疫荧光染色结果表明,AC3-/-小鼠精子顶体形成过程正常。H&E染色结果显示,AC3-/-小鼠曲细精管结构表现为轻微损伤,如睾丸曲细精管管腔面积变小、生精细胞退化、支持细胞空泡化、部分生殖细胞聚集形成多核巨细胞、部分生精细胞过早地脱落到曲细精管管腔内,导致腔内生精细胞的退化和/或凋亡等。这些结果表明,AC3基因缺失后会导致小鼠睾丸精子发生过程异常。2.AC3基因缺失后对小鼠附睾形态及精子的影响为了探究AC3基因缺失后对附睾的影响,利用组织学H&E染色技术,比较WT和AC3-/-小鼠附睾组织形态学的差异。比较WT和AC3-/-小鼠附睾成熟精子形态以及数目的变化。采用蛋白质谱方法筛选WT和AC3-/-小鼠附睾不同区段（附睾头、附睾体和附睾尾）差异表达蛋白（different expression proteins,DEPs）。最后利用分子和细胞生物学技术,如RT-PCR,q RT-PCR,western blot以及免疫荧光技术等,分别在分子水平和细胞水平对AC3蛋白在附睾中的表达和定位进行研究。H&E染色结果表明,AC3基因敲除后附睾初始区段、附睾头、附睾体与附睾尾的管腔上皮组织结构均正常。AC3-/-小鼠附睾成熟精子数目减少,精子头部畸形。非标定量（label-free quantification,LFQ）蛋白质组学结果表明,多个AC3-/-小鼠附睾小体蛋白具有显着差异。免疫荧光结果表明,AC3蛋白在小鼠附睾不同区段（附睾初始区段、附睾头、附睾体和附睾尾）的表达量逐渐减弱。AC3蛋白不仅定位于附睾的狭窄细胞、透明细胞、基底细胞、管肌样细胞和间质细胞中,也表达在附睾初始区段的静纤毛层以及附睾上皮细胞的初级纤毛上。3.AC3基因缺失后对小鼠睾丸BTB结构和功能的影响为了探究AC3蛋白参与调控睾丸功能及精子发生过程的关键信号通路,采用蛋白质谱方法筛选WT和AC3-/-小鼠睾丸组织差异表达蛋白。利用细胞生物学技术-FITC荧光示踪法,评估AC3基因缺失后小鼠睾丸组织BTB的完整性,随后采用q RT-PCR,western blot以及免疫荧光等分子和细胞生物学技术对BTB功能相关的一些差异蛋白进行验证。为了进一步探究AC3蛋白在睾丸中如何调控BTB功能,利用免疫共沉淀质谱（Co-Immunoprecipitation mass spectrometry,CO-IP-MS）技术筛选和AC3蛋白相互作用的蛋白,并进行验证。采用western blot及免疫荧光技术,探究AC3基因缺失后对睾丸生殖细胞增殖和凋亡的影响。由于BTB可以调控睾丸中包括脂质在内多种物质的运输,采用油红O染色,检测AC3敲除后小鼠睾丸组织脂质代谢的变化情况。采用western blot以及免疫荧光染色技术,对LFQ蛋白质组学结果筛选的多个差异蛋白进行验证和功能分析。非标定量蛋白质组学结果表明,AC3-/-小鼠睾丸中和黏附连接相关的信号通路发生显着改变。AC3基因缺失后通过降低紧密连接蛋白（Occludin和Claudin-1）和基底细胞外质特化蛋白（β-catenin）的表达,破坏血睾屏障结构,导致BTB功能紊乱。CO-IP-MS和CO-IP结果表明,Basigin和AC3蛋白在睾丸中具有相互作用。而且western blot结果表明,Basigin在AC3-/-小鼠睾丸组织中的表达量显着低于WT小鼠。此外Brdu、Edu、Ki67、caspase 3和Tunel免疫荧光染色结果表明,AC3-/-小鼠睾丸生殖细胞增殖能力减弱,生殖细胞凋亡水平增加。油红O染色结果表明,AC3基因缺失后睾丸组织中脂质代谢紊乱。对LFQ蛋白质组学结果筛选的多个差异蛋白（H3.3,H2AX,PRM2）进行验证,western blot和免疫荧光结果表明,精子形成过程中组蛋白替换异常。这些结果表明,AC3基因缺失后通过降低紧密连接（tight junction,TJ）和细胞外质特化（ectoplasmic specialization,ES）相关蛋白的表达,破坏血睾屏障结构和功能。同时也会导致精子发生过程多种缺陷,如生殖细胞增殖能力减弱、生殖细胞凋亡水平增加、睾丸脂质代谢紊乱、精子形成过程中组蛋白替换异常。总之,本研究的研究结果表明AC3对于BTB结构和功能的维持至关重要。研究结果推进了前人对于AC3基因缺失后导致的雄性不育的认识,从精子功能问题导致不育推进到BTB功能影响导致不育。本研究在解决由睾丸血睾屏障功能异常导致的雄性不育问题方面,具有广泛的参考价值和重要的社会意义。
张飞[2]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中认为睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
李小英[3]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中进行了进一步梳理不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
王霞[4]（2021）在《藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能》文中研究表明哺乳动物的睾酮合成受很多基因的共同调控,其中某些基因的表达量减少或者缺失都将影响睾酮合成的水平,睾酮缺乏会对生精过程会产生不利影响。研究发现STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4在雄性动物睾丸中表达,与雄性动物睾酮合成过程以及睾丸功能维持密切相关,但是其在不同物种中的表达特征及发挥的生物学作用存在差异。因此,本研究利用q RT-PCR和Western Blot方法检测STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4在3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟）、3岁龄（成年）3个关键发育阶段藏绵羊睾丸和附睾组织中的表达特征,并运用免疫荧光技术对其蛋白的阳性信号分布特征进行检测。此外,采用q RT-PCR和双荧光素酶报告系统对oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p的表达特征与HSD17B3的靶向关系进行验证。主要研究结果如下:1.与3月龄相比,1岁龄和3岁龄藏绵羊睾丸中STAR、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3 mRNA的表达量显着下调（P<0.01）,而其蛋白的表达量显着上调（P<0.01）,1岁龄和3岁龄睾丸中CYP11A1和GLOD4 mRNA和蛋白的表达量均显着上调（P<0.01）。免疫荧光染色结果发现,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3和GLOD4蛋白主要分布在性成熟后（1岁龄和3岁龄）藏绵羊的睾丸间质细胞中,在整个发育阶段的生殖细胞中也有少量分布。研究结果表明,睾酮合成相关基因可能通过维持睾丸间质细胞的功能及调控藏绵羊间质细胞睾酮的分泌及来参与精子发生。2.STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3 mRNA和蛋白在不同发育阶段藏绵羊附睾头、体和尾中均有表达。STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3mRNA在不同发育阶段附睾（头、体和尾）中差异表达,而其蛋白的表达均显着上调（P<0.01）。免疫荧光结果显示,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3蛋白主要存在于不同发育阶段藏绵羊附睾上皮细胞中,并且随着年龄的增加信号强度逐渐增强。此外,在性成熟后（1岁龄和3岁龄）藏绵羊附睾（头、体和尾）管腔的精子中也存在中等强度的阳性信号分布。研究结果表明,STAR、CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1和HSD17B3在不同发育阶段藏绵羊附睾中主要通过调控附睾上皮细胞的分泌和吸收功能进而参与附睾发育以及精子成熟。3.随着年龄的增加,oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p在睾丸中表达显着上调（P<0.01）,在不同发育阶段附睾中呈区段性差异表达。双荧光素酶报告系统检测结果发现oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p模拟物均明显降低了HSD17B3 3′UTR野生型的荧光素酶活性（P<0.05）。这些结果表明,oar-miR-190-3p和oar-miR-363-3p可以靶向调控绵羊HSD17B3基因的表达。
韩秋[5]（2021）在《hnRNPK在小鼠精子发生中的功能研究》文中研究表明精子发生是一个连续而又复杂的高度协调的细胞增殖、分化的动态过程,主要包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形等三个阶段。每个阶段都受到基因表达的精确调控,才能确保精原细胞分化为精母细胞,最终形成单倍体长形精子。目前,精子发生的生物学机制仍未完全揭示,探讨与精子发生相关的基因、分子及其作用机制,依然是未来生殖生物学研究的热点和重点。不均一性核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK）是一个多功能蛋白,也是重要的转录调控因子,对动物胚胎发育及细胞的增殖分化起着关键的调控作用。已有研究表明hnRNPK高表达于动物睾丸组织中,在精子发生过程中可能起着重要作用,但缺乏系统的研究。本研究通过构建雄性生殖细胞特异性敲除小鼠模型,研究hnRNPK在小鼠精子发生过程中的作用及分子机制。主要取得了以下研究结果:（1）qRT-PCR和Western blot方法证实hnRNPK在小鼠睾丸组织中高表达;免疫组织荧光结果表明hnRNPK在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞中具有较高的表达水平。（2）利用Cre-Loxp系统,选取Stra8-Cre+/-小鼠与hnRNPKflox/flox小鼠杂交,得到hnRNPKflox/-/Stra8-Cre+/-的杂合子小鼠,再用杂合子雌性小鼠与雄性hnRNPKflox/flox小鼠交配得到hnRNPK基因敲除小鼠(hnRNPKflox/flox/Stra8-Cre+/-,简称KO);Western blot和免疫荧光表明hnRNPK在小鼠睾丸组织生殖细胞中特异性敲除,该模型可用于后续进一步研究。（3）KO小鼠出生率符合孟德尔遗传定律,生长发育正常,外观与野生型相比无显着差异,但睾丸体积变小,从14日龄起睾丸重与体重比值显着小于野生型小鼠（p<0.05）;睾丸组织HE染色结果发现从14日龄起KO小鼠睾丸曲细精管管腔直径显着小于野生型（p<0.05）,并且大部分区域出现空泡状、生殖细胞层缺失,管腔细胞数目减少;附睾组织HE染色结果显示KO小鼠附睾管腔中大多呈现空腔,无成簇精子发生;生育力测试试验表明KO小鼠雄性不育。以上结果表明减数分裂前生殖细胞中特异性敲除hnRNPK影响了精子发生的正常进行,进而影响小鼠睾丸发育。（4）利用免疫荧光技术结合计数统计分析以确定缺失的细胞类型,结果显示:与野生型相比,KO小鼠中γH2AX阳性细胞数目显着减少,特别是γH2AX点状着色的粗线期或双线期精母细胞（p<0.05）,而PLZF和SOX9阳性着色的细胞数目无显着差异（p>0.05）;Ki67阳性着色细胞数目也显着减少（p<0.05）,且减少的多为减数分裂期细胞;进一步通过TUNEL检测细胞凋亡,发现敲除小鼠中凋亡细胞数目多于野生型（p<0.05）。以上结果表明hnRNPK敲除抑制生殖细胞增殖促进凋亡,进而导致管腔中减数分裂期细胞显着减少,提示hn RNPK敲除可能通过影响精母细胞减数分裂过程进而阻滞精子发生。（5）通过免疫组织荧光检测DNA损伤相关蛋白γH2AX和hnRNPK,顶体标志蛋白PNA和hnRNPK的表达,发现在KO小鼠中能观察到hnRNPK阴性的粗线期精母细胞,但不能观察到hnRNPK阴性的双线期精母细胞和hnRNPK阴性的圆形精子;进一步通过染色体铺展结合免疫组织荧光检测联会复合体蛋白SYCP3和hnRNPK的表达,发现KO小鼠中可以观察到粗线期精母细胞,而双线期精母细胞数量很少。以上结果表明hnRNPK敲除后可能通过影响粗线期精母细胞向双线期精母细胞的转变过程进而导致精子发生减数分裂进程阻滞,无法形成圆形精子。（6）对4周龄KO和WT小鼠睾丸组织进行RNA-Seq分析,通过q RT-PCR进一步验证差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果相符。结果发现,与野生型相比,4W上调基因6227个,下调基因3841个（q<0.05,fold change≥1.5）。进一步对差异表达基因分别进行GO功能聚类分析发现:上调表达基因主要集中在凋亡过程和负调控细胞增殖过程,下调表达基因主要集中在精子发生和精子活力过程,揭示hnRNPK与精子发生密切相关。在KO小鼠睾丸的下调基因中,基因表达量较高且下调倍数较大的基因类群主要与精子发育、睾丸特异组蛋白变体以及圆形精子形成相关基因。KEGG富集分析显示上调表达基因富集的通路有PI3K-Akt信号通路和ECM相互作用通路,下调表达基因富集的通路有c AMP信号通路,这暗示hnRNPK可能通过参与这些信号通路从而调控精子发生过程。综上所述,本研究通过Cre-LoxP系统首次成功构建了减数分裂前生殖细胞特异性敲除hnRNPK小鼠,并从细胞、组织和个体水平系统研究了hnRNPK敲除对小鼠精子发生过程的影响。发现hnRNPK敲除会导致减数分裂期细胞增殖减少、凋亡增多,精子发生在稍早于圆形精子阶段发生阻滞,不能形成圆形精子,导致雄鼠不育;KO小鼠曲细精管管腔中可以观察到hnRNPK阴性的粗线期精母细胞,但无hnRNPK阴性的双线期精母细胞,表明减数分裂前期阶段出现一定缺陷;转录组测序发现hnRNPK在精子发生中主要通过参与PI3K-Akt信号通路影响精子发育、睾丸特异组蛋白变体以及圆形精子形成相关基因的表达。这些研究结果表明hnRNPK作为一个关键的转录因子,可能参与调控减数分裂粗线期到减数分裂后基因表达,从而影响精子发育。
张仙玉[6]（2020）在《内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究》文中提出猪肉是我国居民肉类消费的主要来源。在现代养猪生产中,顶级种公猪通过人工授精技术可繁殖大量后代,对于提高养殖效益和经济效益发挥着重大作用。如何能大量复制顶级种公猪或其遗传物质?体细胞克隆是当前的主要技术手段,但由于克隆动物的效率低,限制了这一技术的规模化应用。将外源精原干细胞（SSCs）移植到自身无SSCs生精能力的受体睾丸中产生精子,这是一个类似于动物克隆技术,实现外源遗传物质完全复制的新途径。本文的目的是,研究制备自身SSCs消融但能利用外源SSCs生产精子的受体模型动物,为下一步建立替代克隆技术复制供体动物遗传物质的新体系打下坚实基础。全文主要研究内容包括:采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的ETV5基因,制备小鼠模型,将体外培养的正常SSCs移植到小鼠模型睾丸中,观察精子的发生,评估该技术的可行性,进一步制备ETV5基因敲除猪动物模型。全文主要结果如下:1、ETV5基因敲除小鼠的制备:（1）通过CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠ETV5基因后,纯合敲除的公鼠(ETV5-/-),从3周龄开始,其睾丸明显比野生型（WT）要小,睾丸重也显着低于WT（P<0.01）。（2）ETV5-/-小鼠睾丸生殖细胞渐行性丢失,到12周龄生殖细胞丢失殆尽,出现唯支持细胞综合症。（3）性成熟后ETV5-/-小鼠睾酮含量显着低于WT（P<0.01）,附睾中精子在12周龄丢失殆尽,且丧失了繁殖后代的能力。（4）ETV5基因杂合敲除的小鼠,其睾丸形态和发育均与WT小鼠无差别,生育能力正常。2、小鼠SSCs体外培养体系的建立:（1）通过两步酶消化法能得到活力99%以上的睾丸单细胞悬液,通过差速贴壁法获得纯度79%以上的SSCs。（2）丝裂霉素C处理之后的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,Stem Pro-34（含SFM）作为基础培养基,添加GDNF、LIF、b FGF、IGF1生长因子的复合培养体系,能支持SSCs的体外增殖与长期培养。（3）小鼠SSCs能正常冻存与复苏,在体外培养与富集后用AKP免疫染色和PLZF免疫荧光均可观察到大量阳性克隆集落。用RT-PCR和Q-PCR检测SSCs中标志基因的表达水平,均显示SSCs可在体外稳定培养增殖并维持干性。3、小鼠SSCs移植:（1）幼鼠(3周龄的ETV5-/-小鼠)作为移植受体比成鼠(7周龄的ETV5-/-小鼠)易于重启外源精子的发生。移植后2个月,幼鼠睾丸中全部恢复了精子的发生,精子统计数约为9.58±5.05×104,而成鼠受体睾丸中无精子发生的恢复。（2）荧光显微镜下,幼鼠受体附睾中产生的精子头部发出绿光,说明精子来源于外源供体的SSCs（移植前用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因）。精液中外源基因EGFP和ETV5的表达,进一步说明恢复的精子来源于外源供体的SSCs,而非内源产生。4、ETV5基因敲除猪动物模型探讨:（1）用构建成功的p X330-g RNA质粒转染莱芜猪胎儿成纤维细胞,敲除效率约为41.92%。（2）通过体细胞核移植得到8头新生克隆猪,基因型检测显示ETV5基因在靶位点被敲除,Western blot结果证实了ETV5蛋白的丢失。（3）睾丸组织切片的H.E.染色和UCHL-1蛋白的表达显示,1月龄的ETV5-/-公猪曲细精管的形态和生殖细胞与WT公猪几乎无差异。但2.5月龄的ETV5-/-公猪曲细精管管腔中央的生殖细胞有消融的趋势。另外,UCHL-1蛋白标记的阳性SSCs细胞比WT睾丸中要少。这些结果说明ETV5基因的敲除影响猪生殖细胞的发育。综上所述,本研究制备了ETV5基因纯合敲除后生殖细胞消融且无生育能力的受体小鼠;随后进行外源正常的精原干细胞移植,受体小鼠的生精能力得以恢复;最后将小鼠上构建的方法体系借鉴应用于猪受体模型的制备。目的为家畜优质个体遗传物质大量复制,物种的保种和精原干细胞研究等提供科学依据。
吴迪[7]（2020）在《双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究》文中研究说明环境污染是伴随社会化进程不可避免的社会生态学问题,其对生物个体及生态链的影响亦日益备受关注。生殖系统作为传递动物遗传物质的器官,同时也是对环境污染物最敏感的系统之一。人类生殖障碍导致人口缓慢或负增长以及新生儿出生缺陷等严重社会和经济学问题,就畜牧业而言,动物生殖障碍则会影响市场经济效益。因此,从分子水平阐明环境污染物的作用机制对于改善和提高人类和动物生殖能力具有重要意义。双酚AF（Bisohenol AF,BPAF）作为双酚A（Bisohenol A,BPA）的氟化同系物广泛应用于食品包装聚合物和医药中间体等产品中,在生产和使用过程中被释放至环境中,对生态环境和动物具有潜在的危害。环境介质、消费产品、食品乃至人体体液中均能检测到BPAF的存在,而且BPAF在雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性方面具有比BPA更高的内分泌干扰效应,同时具有神经毒性、发育毒性和生殖毒性。但目前仍缺乏饮食和非饮食性接触BPAF是否对动物生殖健康具有潜在危害的系统性研究。本研究以雄性小鼠为研究对象,经口分别连续28天给予0,5,20和50 mg/kg/d BPAF,建立对照及低,中,高剂量BPAF亚急性接触模型,通过检测小鼠生长,睾丸脏器系数,精子数量,精子活力,精子内ATP,ROS和钙离子水平,血清中雄激素水平及血睾屏障完整性等全面评估BPAF的生殖毒性,并探究BPAF诱导雄性生殖损伤的作用机制。主要研究结果如下:（1）与对照组相比,BPAF接触对动物体重增长和睾丸附睾发育无显着影响,曲细精管结构和附睾尾上皮结构完整无显着变化。然而,BPAF接触会导致血清中睾酮水平显着下降。此外,中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子数量分别下降30.9%和44.6%。（2）与对照组相比,高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子内ROS和钙离子水平显着增加。中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）精子内抗氧化酶PRDX5和SDHB蛋白表达水平显着下降,抗氧化酶GPX4和DNA损伤蛋白γH2AX表达水平显着上升,表明BPAF能破坏精子内抗氧化体系。此外,20 mg/kg/d和50 mg/kg/d剂量组精子顶体完整率显着下降表明畸形精子产生增加。（3）中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）附睾尾精子内蛋白质翻译后修饰方式发生改变,表现为泛素化和SUMO2/3螯合物水平下调而SUMO1螯合物水平上调。此外,作为转录抑制表观遗传学标记的H3K27me3修饰水平也显着性上调。（4）在对照组中睾丸中,生物素示踪剂被限制在靠近基底膜的基膜处,而中剂量（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量（50 mg/kg/d BPAF）处理组睾丸内生物素示踪剂可穿过血睾屏障弥散至近腔小室,同时高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）睾丸内紧密连接蛋白ZO-1、缝隙连接蛋白p-Connexin 43和细胞骨架调节蛋白Palladin的表达水平出现显着下调,表明BPAF能破坏血睾屏障的完整性和功能。（5）为进一步证实BPAF对血睾屏障的影响,本研究采用0,5,25,50μM BPAF（对支持细胞活力无显着影响）处理原代支持细胞以探究其作用机制。结果表明,50μM BPAF处理能显着下调支持细胞TER,同时紧密连接蛋白ZO-1、紧密连接调节蛋白FAK、缝隙蛋白p-Connexin 43和细胞骨架调节蛋白Palladin的表达水平也出现明显下调,进一步证实了BPAF能破坏支持细胞屏障功能。。（6）中剂量组（20 mg/kg/d BPAF）和高剂量组（50 mg/kg/d BPAF）睾丸内丝裂原蛋白激酶,磷酸化ERK/MAPK水平显着增加。为进一步探究BPAF是否通过激活ERK信号通路从而破坏BTB功能,在50μMBPAF处理前,使用10μM ERK特异性抑制剂U0126预处理支持细胞1h。结果表明,U0126处理能显着缓解BPAF诱导支持细胞屏障功能下降,并抑制BPAF诱导的紧密连接调节蛋白FAK和细胞骨架调节蛋白Palladin表达水平的下调以及支持细胞骨架的紊乱。综上所述,本研究发现BPAF损伤雄性小鼠睾丸功能,通过靶向支持细胞激活ERK/MAPK信号通路从而扰乱细胞骨架,破坏BTB结构和功能,进而影响精子发生过程。本研究初步探讨BPAF影响精子发生的作用机制,为双酚类化合物的生殖危害评价以及缓解和预防BPA替代物带来的潜在危害提供重要参考依据。
伊茹汗[8]（2020）在《GPx5在骆驼附睾上的时空表达研究》文中进行了进一步梳理哺乳动物精子通过附睾的运输、保护和储存过程中,获得受精能力,是精子成熟和储存的主要场所。精子也和其他任何一种细胞一样面对氧化损伤。精子对脂质过氧化、DNA损伤的进攻极为敏感,从而影响活力及受精能力。附睾为精子提供免受外界压力的环境并促进其成熟。附睾含有一系列抗氧化剂,包括谷胱甘肽过氧化物酶5（GPx5）,GPx5可以保护精子免受氧化应激,维持公畜生殖道内自由基正常水平,促进精子发育成熟,其在提高雄性动物繁殖力上发挥着重要作用。国内现没有关于GPx5基因在骆驼附睾中的研究,因此,本研究以骆驼为研究对象,检测了不同年龄段（三岁、五岁、六岁）骆驼附睾不同部位GPx5的表达规律。研究结果如下:1.采用荧光定量PCR技术检测GPx5基因在不同年龄骆驼附睾不同部位上的mRNA水平表达情况。结果表明:各年龄阶段（三岁、五岁、六岁）骆驼附睾表达量存在差异。在三岁骆驼、五岁骆驼及六岁骆驼附睾头部为GPx5 mRNA的主要表达部位,表达量极显着高于附睾体部和附睾尾部（P<0.01）。五岁骆驼附睾头部表达量极显着高于三岁骆驼和六岁骆驼（P<0.01）,三岁骆附睾头部表达量与六岁头部表达量无显着差异（P>0.05）。三岁骆驼,五岁骆驼,六岁骆驼附睾体跟附睾尾仅检测到微量GPx5基因表达。2.利用Western blot技术检测不同年龄骆驼附睾不同部位上的蛋白水平表达情况。免疫印迹结果表明:GPx5蛋白在各年龄阶段（三岁、五岁、六岁）骆驼附睾不同部位均有表达。骆驼不同年龄,附睾相同部位的表达量也有明显差异。通过进一步灰度分析结果显示,三岁骆驼,五岁骆驼,六岁骆驼附睾头是GPx5蛋白主要表达区域,五岁骆驼GPx5蛋白在附睾头的表达量均极显着高于三岁骆驼和六岁骆驼（P<0.01）,而三岁骆驼附睾头GPx5蛋白表达量与六岁骆驼附睾头GPx5蛋白表达量差异不显着（P>0.05）。各年龄段相同部位的比较中,可以看到,五岁骆驼附睾各部位相对表达量都显着高于其他两个年龄段（P<0.05）。3.采用免疫组化技术检测GPx5蛋白在不同年龄骆驼附睾不同部位上的蛋白分布情况。免疫组化结果表明:三岁骆驼,五岁骆驼,六岁骆驼GPx5蛋白主要在附睾头上皮细胞质及静纤毛上,附睾体和附睾尾在上皮细胞的静纤毛中均少量表达。而且在三岁,五岁和六岁年龄阶段骆驼附睾腔中精子上都存在GPx5阳性信号。结果显示,GPx5蛋白主要在骆驼附睾头部上皮细胞质及静纤毛表达,附睾体跟附睾尾少量表达。
宋惠彬[9]（2019）在《BAG6基因外显子24跳跃影响哺乳动物睾丸细胞生长和血睾屏障组装及相关分子机制研究》文中认为精子发生是一个复杂的生理过程,这种独特的过程要求特定基因行使特定的调控作用。选择性剪接是指从一个m RNA前体中通过不同的剪接方式产生不同的m RNA剪接异构体的过程,而最终的蛋白产物会表现出不同结构和功能,从而在动物精子发生等生理过程中起到重要的调控作用。本研究通过对性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序,鉴定了差异表达基因,利用SOAPsplice和MISO软件分别对测序数据进行选择性剪接事件分析,筛选出差异表达的与精子发生相关的BCL2相关抗凋亡基因6（BCL2 associated athanogene 6,BAG6）的两个剪接体:全长剪接体（BAG6-FL）和24号外显子跳跃剪接体（BAG6-Δ24）,并对其在睾丸支持细胞中发挥的功能进行了研究。主要研究结果如下:1、性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序及数据分析（1）本研究选取60日龄和180日龄大白猪睾丸组织为试验材料进行转录组测序（华大基因公司完成）。以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1为基准,共检测到10095个差异表达的基因,其中5199个基因在180日龄中上调表达,4896个基因在60日龄中上调表达。利用q RT-PCR验证9个基因（PIWIL4、BAG6、DCTN、INHA、INHBA、SP1、TESK2、PRKAR1A和PRKACA）的差异表达,结果显示:除了DCTN,其他8个基因的表达模式与RNA-seq数据保持一致(皮尔森相关系数r为0.96,P值为3.31×10-5)。（2）对差异表达基因的GO功能富集分析发现有5995个差异表达基因被显着富集到34个GO功能类别（P<0.05）,其中有242个差异表达基因被显着富集到精子发生过程（GO:0007283）,包括PIWIL家族（Piwi-like,PIWIL）、精子发生相关家族（spermatogenesis associated,SPATA）和BAG6等基因。对差异表达基因的KEGG pathway显着性富集分析发现有8657个差异表达基因注释到57个经典的KEGG信号通路中（P<0.05）,包括黏着斑通路（ko04510）、细胞外基质受体信号通路（ko04512）等。其中BAG6基因在肌动蛋白细胞骨架的调控（ko04810）和内质网中的蛋白加工（ko04141）等信号通路中显着富集。（3）以参考基因组作为参照,分别在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中检测到了19996和15964个SNP。在242个精子发生相关的差异表达基因中,分别有106个基因的1224个SNP和174个基因的1622个SNP在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。选取差异表达的PIWIL4基因的2个SNP位点进行PCR-RFLPs验证,发现PIWIL4基因g.572 C>T位点和g.561 G>A位点都与公猪精液品质性状间存在显着关联。（4）利用SOAPsplice软件对60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中的选择性剪接事件进行分析。结果显示:分别有7588个基因的30243个选择性剪接事件和7466个基因的29204个选择性剪接事件在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。在60日龄大白猪中,内含子保留事件的比例最高;在180日龄大白猪中,外显子跳跃、内含子保留、可变的5’剪接位点和可变的3’剪接位点事件的比例都相对较高。2、BAG6基因选择性剪接调控睾丸支持细胞的生长和血睾屏障的研究（1）利用MISO软件筛选出差异表达的BAG6基因不同剪接体（|ΔPSI|≥10%）。通过q RT-PCR对BAG6基因不同剪接体进行验证,发现BAG6-FL剪接体在180日龄睾丸组织中高表达,而BAG6-Δ24剪接体在60日龄睾丸组织中高表达。通过免疫荧光检测BAG6不同剪接体在猪睾丸细胞（ST）中的亚细胞定位,发现两种剪接体都在细胞核和细胞质中表达,说明BAG6基因24号外显子跳跃对其亚细胞定位没有影响。（2）通过MTT、流式细胞仪和Western blot表明BAG6-FL剪接体可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡,而BAG6-Δ24剪接体可以抑制ST细胞增殖、促进ST细胞凋亡。Co-IP试验证明了BAG6-FL剪接体可以与热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）和丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase,RAF1）蛋白互作,而BAG6-Δ24剪接体由于24号外显子的缺失,导致其与HSP70和RAF1蛋白互作消失。在小鼠睾丸支持细胞中,通过免疫荧光发现BAG6-FL剪接体可以保持F-actin的束状结构,维持血睾屏障的完整性,而BAG6-Δ24剪接体导致F-actin排列紊乱,肌动蛋白丝被截短,血睾屏障完整性遭到破坏。（3）q RT-PCR和Western blot表明富含丝氨酸和精氨酸剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1）通过其第二个RRM结构域来调控BAG6基因选择性剪接,进而下调BAG6-Δ24剪接体的表达。构建不同缺失片段的BAG6小基因真核表达载体,将其与SRSF1超表达载体共转,发现在BAG6外显子24上18 bp-51bp位置处存在SRSF1的两个结合位点（35 bp-44 bp、45 bp-51 bp）,通过点突变证明了这两个结合位点对于SRSF1调控BAG6选择性剪接都是必需的。（4）通过MTT、流式细胞仪和Western blot表明SRSF1可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡。在小鼠睾丸支持细胞中,通过免疫荧光表明SRSF1可以保持F-actin的束状结构,维持血睾屏障的完整性。通过质粒共转表明SRSF1介导BAG6基因的选择性剪接,从而调控睾丸支持细胞的增殖、凋亡及维持血睾屏障的完整性。3、BAG6基因24号外显子敲除小鼠精子发生受损（1）通过CRISPR/Cas9技术成功构建了BAG6基因24号外显子敲除小鼠模型,对其生殖器官进行称量发现:与野生型小鼠相比,8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和精囊腺重量显着下降（P<0.01）,而附睾重量没有显着变化。通过H&E染色发现:与野生型小鼠相比,在8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和附睾组织中都观察到大量脱落的生殖细胞,部分长形精子细胞的极性发生了变化,朝管底的方向移动。通过Giemsa染色对其精子形态进行观察,发现BAG6exon24-/-小鼠精子的头部、颈部和中段出现大量的异常,且精子畸形率高达75.5%。BAG6exon24-/-小鼠产仔数显着下降。通过ELISA发现:与野生型小鼠相比,8周龄BAG6exon24-/-小鼠血清中睾酮含量显着上升（P<0.001）,而FSH和LH的含量没有显着变化,激素水平发生异常。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠精子发生受阻,生育能力下降。（2）对8周龄BAG6exon24+/+和BAG6exon24-/-小鼠进行蛋白组测序发现,在BAG6exon24-/-小鼠中有96个蛋白上调表达,31个蛋白下调表达。下调表达的蛋白显着富集到精子鞭毛“9+2”结构等细胞组分、HSP70蛋白绑定等分子功能及程序化细胞死亡等生物过程中。通过透射电镜对精子鞭毛超微结构进行观察,发现BAG6exon24-/-小鼠精子尾部中段的外周致密纤维发生了缺失。（3）通过Western blot和TUNEL染色发现:与野生型小鼠相比,4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠BAX表达量显着升高（P<0.05）,睾丸曲细精管中TUNEL阳性的曲细精管数量显着升高（P<0.05）,并且TUNEL阳性的曲细精管中TUNEL阳性的细胞数量也显着升高（P<0.01）。（4）通过Western blot和免疫荧光发现:与野生型小鼠相比,4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中血睾屏障相关蛋白除了OCLN之外,ZO-1、N-cadherin和β-catenin的表达量都显着下降（P<0.05）,同时这4种蛋白的定位也发生了变化,在整个曲细精管中散乱表达;8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中细胞骨架蛋白α-tubulin和F-actin表达杂乱无章;通过q RT-PCR发现:与野生型小鼠相比,BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中睾丸支持细胞相关基因AMH、AR、SOX9和GDNF的m RNA水平都显着下降（P<0.05,P<0.01）。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠血睾屏障受损。
李朝杰[10]（2019）在《功能未知基因1700121C10Rik对雄性小鼠生殖功能的影响及其作用机制的研究》文中研究表明哺乳动物精子发育及受精过程非常复杂,其确切分子机制远未阐明。睾丸特异性丝氨酸蛋白酶家族成员Prss54基因缺失导致雄鼠生殖障碍、精子顶体发育异常和精子穿过透明带的能力受损。在本研究中,我们通过基因芯片筛查及定量RT-PCR发现并证实1700121C10Rik RNAs在Prss54基因剔除小鼠的睾丸组织中几近完全缺失。1700121C10Rik基因定位于8号染色体C区5带,由3个外显子组成,可表达产生两个转录本。通过生物信息学分析及实验验证,我们发现1700121C10Rik基因表达产生的两个转录本均为长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）。组织表达谱分析显示,该基因的两个转录本均在成年雄性小鼠的睾丸组织中特异性表达,并且随着出生后睾丸组织的发育而呈现出一定的时空表达特征。原位杂交结果表明1700121C10Rik主要在圆形精子和延长期的精子中表达。进一步的研究发现,1700121C10Rik RNAs在睾丸细胞的核组分和胞质组分中均有分布。根据以上结果,我们推测1700121C10Rik在雄性生殖过程中发挥着重要作用。然而,随后通过对1700121C10Rik基因剔除小鼠研究发现,该基因缺失雄鼠的生育能力、睾丸及附睾发育、精子形态结构、精子活力以及精子的顶体反应等均不受影响。1700121C10Rik基因缺失也没有对睾丸组织中Prss54基因的表达造成影响,这提示PRSS54蛋白很有可能是1700121C10Rik的上游调控因子并参与了该基因的表达调控。综上所述,我们没有观察到1700121C10Rik基因剔除雄性小鼠生育能力缺陷。1700121C10Rik基因剔除雄鼠表型的缺失可能是由于功能冗余或代偿所致,其具体的生物学功能还有待进一步的研究。
二、Spatial and temporal expression of germ cell nuclear factorin murine epididymis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Spatial and temporal expression of germ cell nuclear factorin murine epididymis（论文提纲范文）
（1）腺苷酸环化酶3敲除小鼠雄性不育机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 腺苷酸环化酶3 |
| 1.2 睾丸结构及精子发生过程 |
| 1.2.1 睾丸结构 |
| 1.2.2 精子发生过程 |
| 1.2.3 精子形成过程 |
| 1.2.4 血睾屏障结构及功能 |
| 1.3 附睾结构 |
| 1.3.1 附睾结构组成及细胞功能 |
| 1.3.2 附睾结构中的纤毛结构及功能 |
| 1.3.3 附睾在精子成熟中的作用 |
| 1.4 精子的结构 |
| 1.4.1 精子头部和颈部结构 |
| 1.4.2 精子尾部结构 |
| 1.5 非标定量蛋白质组学 |
| 1.6 本研究思路与方法、主要研究内容 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设备 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 主要实验试剂配置 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.5.2 形态组织学分析 |
| 2.5.3 油红O染色 |
| 2.5.4 精子染色及计数 |
| 2.5.5 免疫染色 |
| 2.5.6 蛋白提取及质谱分析 |
| 2.5.7 Co-IP-MS |
| 2.5.8 Western Blot |
| 2.5.9 qRT-PCR和 RT-PCR |
| 2.6 生物信息学分析 |
| 2.6.1 差异蛋白GO功能注释及富集分析 |
| 2.6.2 差异蛋白互作网络分析 |
| 2.6.3 差异表达蛋白质的聚类分析 |
| 2.7 数据统计与分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 AC3 基因缺失后对小鼠睾丸形态及精子发生过程影响 |
| 3.1.1 WT和 AC3~(-/-)小鼠验证 |
| 3.1.2 WT和 AC3~(-/-)小鼠性腺指数比较 |
| 3.1.3 WT和 AC3~(-/-)小鼠睾丸组织形态学比较 |
| 3.1.4 AC3~(-/-)小鼠精子形成过程中顶体发生正常 |
| 3.2 AC3 基因缺失后对小鼠附睾形态及精子影响 |
| 3.2.1 WT和 AC3~(-/-)小鼠附睾组织形态学比较 |
| 3.2.2 AC3 基因缺失导致小鼠精子头部畸形以及精子数目减少 |
| 3.2.3 WT和 AC3~(-/-)小鼠附睾蛋白质组学比较 |
| 3.2.4 AC3 蛋白在附睾中的表达与定位 |
| 3.3 AC3 缺失对小鼠睾丸BTB功能的影响 |
| 3.3.1 睾丸蛋白质组学实验结果 |
| 3.3.2 AC3~(-/-)小鼠睾丸BTB结构紊乱 |
| 3.3.3 睾丸中AC3和Basigin蛋白相互作用 |
| 3.3.4 AC3~(-/-)小鼠生殖细胞增殖能力减弱,凋亡水平增加 |
| 3.3.5 AC3~(-/-)小鼠睾丸脂质代谢紊乱 |
| 3.3.6 AC3 缺失会导致睾丸及精子组蛋白替换过程异常 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（2）长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析（论文提纲范文）
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（4）藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 绪论 |
| 1 睾丸与附睾 |
| 2 间质细胞发育及睾酮生成调控机制 |
| 3 睾酮合成相关基因研究进展 |
| 3.1 STAR基因 |
| 3.2 CYP11A1和CYP17A1 基因 |
| 3.2.1 CYP11A1 基因 |
| 3.2.2 CYP17A1 基因 |
| 3.3 HSD3B1和HSD17B3 基因 |
| 3.3.1 HSD3B1 基因 |
| 3.3.2 HSD17B3 基因 |
| 3.4 GLOD4 基因 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二章 睾酮合成相关基因在藏绵羊睾丸中的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织样品收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 组织总RNA提取 |
| 1.4.2 cDNA合成 |
| 1.4.3 引物设计与合成 |
| 1.4.4 qRT-PCR |
| 1.4.5 总蛋白提取 |
| 1.4.6 蛋白浓度测定与变性 |
| 1.4.7 WesternBlot |
| 1.4.8 免疫荧光染色定位蛋白分布 |
| 1.5 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 睾酮合成相关基因mRNA在藏绵羊睾丸组织中的表达模式 |
| 2.2 藏绵羊睾丸组织中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.3 藏绵羊睾丸组织中睾酮合成相关基因蛋白的免疫定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 睾酮合成相关基因在藏绵羊附睾中的表达特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织样品收集 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 数据统计与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.2 藏绵羊附睾体组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.1.3 藏绵羊附睾尾组织中睾酮合成相关基因mRNA的表达 |
| 2.2 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.2 藏绵羊附睾体中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.2.3 藏绵羊附睾尾中睾酮合成相关基因蛋白的表达 |
| 2.3 藏绵羊附睾组织中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.1 藏绵羊附睾头中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.2 藏绵羊附睾体组织中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 2.3.3 藏绵羊附睾尾中睾酮合成相关基因蛋白的定位 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 miR-190-3p和 miR-363-3p与 HSD17B3 靶标关系验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要方法 |
| 1.3.1 组织总RNA提取 |
| 1.3.2 第一链c DNA合成 |
| 1.3.3 qRT-PCR |
| 1.3.4 HSD17B3 3'-UTR野生型及突变型序列的设计 |
| 1.3.5 HSD17B3 3′-UTR野生型(WT)和突变型(MUT)重组载体的构建和鉴定 |
| 1.3.6 miRNA模拟物化学合成 |
| 1.3.7 细胞转染 |
| 1.3.8 双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 潜在调控HSD17B3的miRNAs在雄性生殖器官中的表达特征 |
| 2.1.1 oar-miR-190-3p在藏绵羊睾丸和附睾组织的表达情况 |
| 2.1.2 oar-miR-363-3p在藏绵羊睾丸和附睾组织的表达情况 |
| 2.1.3 HSD17B3与miRNAs在藏绵羊睾丸和附睾组织中表达的相关性分析 |
| 2.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 2.3 双荧光素酶活性检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（5）hnRNPK在小鼠精子发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.1.1 精子发生的场所 |
| 1.1.2 精子发生过程 |
| 1.1.3 精子发生的特点 |
| 1.2 不均一核糖核蛋白K(hnRNPK) |
| 1.2.1 hnRNPK基因概述 |
| 1.2.2 hnRNPK调控生殖发育 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠基因组DNA提取 |
| 2.2.2 精子细胞基因组DNA提取 |
| 2.2.3 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.4 RNA提取及qRT-PCR |
| 2.2.5 蛋白质提取与Western blot |
| 2.2.6 苏木精-伊红染色 |
| 2.2.7 石蜡切片免疫荧光 |
| 2.2.8 TUNEL |
| 2.2.9 染色体铺展 |
| 2.2.10 生育力测试 |
| 2.2.11 形态学分析 |
| 2.2.12 RNA-Seq |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 hnRNPK的时空表达分析及蛋白表达定位 |
| 3.2 hnRNPK KO小鼠模型的制备及鉴定 |
| 3.2.1 条件性敲除hnRNPK小鼠的获得及鉴定 |
| 3.3 hnRNPK KO小鼠表型鉴定 |
| 3.3.1 hnRNPK敲除影响小鼠生育力 |
| 3.3.2 hnRNPK敲除影响小鼠睾丸发育 |
| 3.3.3 hnRNPK敲除影响睾丸曲细精管管腔直径、生殖细胞层及附睾精子生成 |
| 3.3.4 hnRNPK敲除导致细胞增殖减少、凋亡增多 |
| 3.3.5 hnRNPK敲除导致减数分裂期细胞减少 |
| 3.3.6 hnRNPK敲除影响减数分裂进程 |
| 3.4 hnRNPK在小鼠精子发生中的作用机制研究 |
| 3.4.1 RNA-Seq结果分析 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间获得与学位论文相关的科研成果目录 |
| 致谢 |
（6）内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源与精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞的应用 |
| 1.2.3 精原干细胞的移植 |
| 1.2.4 受体的制备 |
| 1.2.5 CRSPR/Cas9 技术的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 内源性精子发生消融的小鼠模型制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂与配置 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 F_0代小鼠获得及基因型鉴定 |
| 2.2.2 F_1代新生小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 Western blot鉴定ETV5 蛋白的缺失 |
| 2.2.4 不同基因型小鼠体重的检测 |
| 2.2.5 不同基因型小鼠睾丸重的检测 |
| 2.2.6 睾丸组织形态学比较 |
| 2.2.7 附睾中精子的检测 |
| 2.2.8 精子发生相关基因的表达 |
| 2.2.9 睾酮水平检测 |
| 2.2.10 繁殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的分离培养与检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备与耗材 |
| 3.1.3 主要试剂与配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 用小鼠胎儿成纤维细胞制备饲养层细胞 |
| 3.2.2 两种饲养层培养SSCs细胞体外增殖的比较 |
| 3.2.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 3.2.4 添加不同生长因子对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 3.2.5 精原干细胞体外增殖的碱性磷酸酶染色 |
| 3.2.6 精原干细胞体外增殖的免疫荧光染色 |
| 3.2.7 精原干细胞的标志基因表达检测 |
| 3.2.8 精原干细胞标志基因表达水平的实时定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 精原干细胞移植与精子来源的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与配制 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SSCs的移植 |
| 4.2.2 移植后睾丸重量的检测 |
| 4.2.3 睾丸的组织形态观察(H.E.染色) |
| 4.2.4 睾丸切片的免疫组织化学分析 |
| 4.2.5 附睾精子的检测 |
| 4.2.6 精子来源的检测 |
| 4.2.7 精子发生相关基因的表达 |
| 4.2.8 繁殖能力评估 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因敲除猪受体模型的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验设备与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与配制 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pX330-gRNA质粒的构建 |
| 5.2.2 质粒电转猪胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.3 电转后单克隆细胞团的收取 |
| 5.2.4 单克隆细胞团敲除方式的鉴定 |
| 5.2.5 ETV5 基因纯合敲除细胞系的获得 |
| 5.2.6 SCNT制备ETV5 基因敲除克隆猪 |
| 5.2.7 新生克隆猪的基因型鉴定 |
| 5.2.8 新生克隆猪ETV5 蛋白Western blot鉴定 |
| 5.2.9 睾丸发育的组织形态检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 全文总结与主要结论 |
| 6.2 主要创新点与后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要英文对照缩略表 |
| 附录2 全文 RT-PCR(Q-PCR)引物序列 |
| 附录3 细胞系测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 内分泌干扰物简介及危害 |
| 1.2 双酚AF研究进展 |
| 1.2.1 BPAF在环境中的普遍性 |
| 1.2.2 BPAF的毒理学效应 |
| 1.3 精子发生与血睾屏障 |
| 1.3.1 精子发生 |
| 1.3.2 支持细胞与血睾屏障 |
| 1.3.3 血睾屏障调控机制 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 实验材料及研究方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试验动物和伦理申明 |
| 2.1.2 主要生化试剂 |
| 2.1.3 实验所需溶液及配方 |
| 2.1.4 实验仪器设备 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 试验动物灌胃处理方案 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 精子质量分析 |
| 2.2.4 血清睾酮测定 |
| 2.2.5 睾丸和附睾形态学检测 |
| 2.2.6 血睾屏障功能完整性分析 |
| 2.2.7 支持细胞分离和体外培养 |
| 2.2.8 细胞毒性试验 |
| 2.2.9 支持细胞内ROS和Ca~(2+)浓度检测 |
| 2.2.10 支持细胞屏障功能检测 |
| 2.2.11 免疫荧光(Immunofluorescent,IF)和激光共聚焦 |
| 2.2.12 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.13 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BPAF对小鼠生长发育的影响 |
| 3.2 BPAF对小鼠睾丸和附睾组织结构的影响 |
| 3.3 BPAF降低小鼠血清中睾酮水平 |
| 3.4 BPAF对小鼠精子数量和质量的影响 |
| 3.5 BPAF诱导精子氧化损伤 |
| 3.6 BPAF降低精子顶体膜完整性并改变蛋白质翻译后修饰方式 |
| 3.7 BPAF破坏血睾屏障完整性 |
| 3.8 BPAF损伤支持细胞屏障功能 |
| 3.9 BPAF破坏支持细胞骨架结构 |
| 3.10 BPAF通过ERK1/2 信号通路干扰支持细胞屏障功能 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附表1:实验所用抗体信息 |
| 附录2 :在读期间学术成果 |
| 致谢 |
（8）GPx5在骆驼附睾上的时空表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 附睾的概述 |
| 1.2 附睾的功能 |
| 1.3 附睾蛋白分泌特点 |
| 1.4 附睾氧化应激 |
| 1.4.1 精子与活性氧 |
| 1.4.2 附睾中的主要抗氧化剂 |
| 1.5 附睾特异谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPx5) |
| 1.5.1 附睾特异谷胱甘肽氧化物酶的结构 |
| 1.5.2 谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPx5)的作用 |
| 1.5.3 GPx5表达特性 |
| 1.5.4 GPx5表达调控 |
| 1.5.5 GPx5基因的功能研究 |
| 1.5.6 GPx5和顶体反应的关系 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 2 技术路线 |
| 3 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 主要实验试剂 |
| 3.3 主要仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 总RNA的提取 |
| 3.4.2 总RNA反转录 |
| 3.4.3 目的基因荧光定量PCR |
| 3.4.4 总蛋白的提取 |
| 3.4.5 Western Blot |
| 3.4.6 石蜡切片 |
| 3.4.7 免疫组化 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 组织总RNA电泳检测 |
| 4.2 RT-qPCR产物检测 |
| 4.3 GPx5与GAPDH基因RT-qPCR结果 |
| 4.4 GPx5基因的时空表达特异性 |
| 4.5 蛋白浓度测定 |
| 4.6 GPx5蛋白在不同年龄骆驼附睾上的表达 |
| 4.7 GPx5蛋白在不同年龄骆驼附睾上的定位 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）BAG6基因外显子24跳跃影响哺乳动物睾丸细胞生长和血睾屏障组装及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究问题的由来 |
| 2 精子发生概述 |
| 2.1 精子发生的过程 |
| 2.2 睾丸支持细胞在精子发生过程中的功能 |
| 2.3 精子发生过程中激素的调控 |
| 3 选择性剪接 |
| 3.1 选择性剪接的概念 |
| 3.2 选择性剪接的调控 |
| 3.3 选择性剪接事件的鉴定 |
| 3.4 选择性剪接过程中的关键剪接因子 |
| 4 选择性剪接与精子发生 |
| 5 BAG6基因的研究进展 |
| 5.1 BAG6基因的概述 |
| 5.2 BAG6基因的生物学功能 |
| 5.3 BAG6基因的选择性剪接 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序及数据分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 1.4 常用试剂及配制 |
| 1.5 生物信息学软件及分析网站 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 猪睾丸组织总RNA的提取及浓度测定和质量检测 |
| 2.1.1 RNA的提取及反转录 |
| 2.1.2 RNA浓度测定及质量检测 |
| 2.1.3 cDNA检测 |
| 2.2 转录组测序和生物信息学数据分析 |
| 2.3 候选差异表达基因的验证 |
| 2.3.1 实时荧光定量引物的设计 |
| 2.3.2 普通PCR扩增 |
| 2.3.3 定量PCR扩增 |
| 2.4 PCR-RFLP及精液品质性状关联分析 |
| 2.4.1 精液DNA提取 |
| 2.4.2 PCR-RFLP方法检测多态性 |
| 2.4.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪睾丸组织总RNA的质量检测 |
| 3.2 RNA测序及生物信息学分析结果 |
| 3.2.1 数据的统计分析 |
| 3.2.2 基因差异表达分析 |
| 3.2.3 基因GO功能分类 |
| 3.2.4 KEGG通路分析 |
| 3.2.5 基因多态性分析 |
| 3.2.6 选择性剪接事件分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 BAG6基因选择性剪接调控睾丸支持细胞的生长和血睾屏障的研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 菌株、载体和抗体 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 1.5 主要试剂与试剂盒 |
| 1.6 常用试剂及配制 |
| 1.7 生物信息学软件及分析网站 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 使用MISO软件进行选择性剪接事件鉴定 |
| 2.1.1 数据准备 |
| 2.1.2 选择性剪接事件分析 |
| 2.2 BAG6基因不同剪接体的功能研究 |
| 2.2.1 BAG6基因不同剪接体的验证 |
| 2.2.2 BAG6基因不同剪接体表达载体的构建 |
| 2.2.3 BAG6不同剪接体干扰片段的合成 |
| 2.2.4 小鼠睾丸支持细胞的分离 |
| 2.2.5 细胞的培养和转染 |
| 2.2.6 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.7 cDNA的制备 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR检测基因m RNA的表达水平 |
| 2.2.9 蛋白质提取及浓度测定 |
| 2.2.10 Western blot |
| 2.2.11 MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)试验 |
| 2.2.12 细胞凋亡检测 |
| 2.2.13 免疫共沉淀 |
| 2.2.14 免疫荧光 |
| 2.3 调控BAG6基因选择性剪接的关键剪接因子及其功能研究 |
| 2.3.1 关键剪接因子真核表达载体的构建 |
| 2.3.2 剪接因子SRSF1干扰片段的合成 |
| 2.3.3 剪接因子SRSF1不同结构域缺失的表达载体的构建 |
| 2.3.4 BAG6小基因片段真核表达载体的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BAG6基因的表达模式 |
| 3.2 BAG6基因不同剪接体的鉴定 |
| 3.2.1 MISO筛选BAG6 基因选择性剪接事件 |
| 3.2.2 BAG6基因不同剪接体的表达模式 |
| 3.3 BAG6基因不同剪接体对睾丸支持细胞功能的影响 |
| 3.3.1 BAG6基因不同剪接体对睾丸支持细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 BAG6基因不同剪接体对睾丸支持细胞凋亡的影响 |
| 3.3.3 BAG6基因不同剪接体对睾丸支持细胞增殖凋亡的机制 |
| 3.3.4 BAG6基因不同剪接体对睾丸支持细胞血睾屏障的影响 |
| 3.4 调控BAG6基因选择性剪接的关键剪接因子的鉴定 |
| 3.5 剪接因子SRSF1 调控BAG6 基因选择性剪接 |
| 3.6 SRSF1对睾丸支持细胞功能的影响 |
| 3.6.1 SRSF1对睾丸支持细胞增殖的影响 |
| 3.6.2 SRSF1对睾丸支持细胞凋亡的影响 |
| 3.6.3 SRSF1对睾丸支持细胞血睾屏障的影响 |
| 3.7 SRSF1 介导BAG6 基因选择性剪接从而调控睾丸支持细胞的功能 |
| 3.7.1 SRSF1 介导BAG6 基因选择性剪接从而调控睾丸支持细胞的增殖 |
| 3.7.2 SRSF1 介导BAG6 基因选择性剪接从而调控睾丸支持细胞的凋亡 |
| 3.7.3 SRSF1 介导BAG6 基因选择性剪接从而调控睾丸支持细胞的血睾屏障 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BAG6不同剪接体的鉴定 |
| 4.2 BAG6不同剪接体在睾丸支持细胞中的功能 |
| 4.3 SRSF1对BAG6 不同剪接体的调控 |
| 第四章 BAG6基因24号外显子敲除小鼠精子发生受损 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 主要试剂与试剂盒 |
| 1.5 常用试剂及配制 |
| 1.6 生物信息学软件及分析网站 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 BAG6基因外显子24敲除小鼠的构建 |
| 2.1.1 相关引物设计与合成 |
| 2.1.2 CRISPR/Cas9 sgRNA的体外转录 |
| 2.1.3 显微注射 |
| 2.1.4 胚胎移植 |
| 2.1.5 突变小鼠的鉴定 |
| 2.2 BAG6基因外显子24敲除小鼠蛋白组测序 |
| 2.3 BAG6基因外显子24敲除小鼠表型研究 |
| 2.3.1 血清主要生殖激素检测 |
| 2.3.2 组织的固定及包埋 |
| 2.3.3 苏木精-伊红(H&E)染色 |
| 2.3.4 组织免疫荧光 |
| 2.3.5 精子形态染色 |
| 2.3.6 TUNEL(TdT-mediated d UTP nick-end labeling)染色 |
| 2.3.7 睾丸支持细胞相关基因引物的合成 |
| 2.3.8 统计学处理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BAG6基因24号外显子敲除小鼠的构建 |
| 3.2 BAG6基因24号外显子敲除小鼠精子发生受阻 |
| 3.2.1 BAG6~(exon24-/-)小鼠生精过程异常 |
| 3.2.2 BAG6~(exon24-/-)小鼠精子形态异常 |
| 3.2.3 BAG6~(exon24-/-)小鼠激素水平异常 |
| 3.3 BAG6基因24号外显子敲除小鼠睾丸组织蛋白组测序 |
| 3.4 BAG6~(exon24-/-)小鼠细胞睾丸组织细胞凋亡增加 |
| 3.5 BAG6~(exon24-/-)小鼠支持细胞相关功能受损 |
| 3.5.1 BAG6~(exon24-/-)小鼠血睾屏障受损 |
| 3.5.2 BAG6~(exon24-/-)小鼠睾丸支持细胞肌动蛋白骨架结构破坏 |
| 3.5.3 BAG6~(exon24-/-)小鼠中睾丸支持细胞相关基因表达量下降 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 创新与不足 |
| 下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文列表 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）功能未知基因1700121C10Rik对雄性小鼠生殖功能的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 1.绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 LncRNA概述及作用机制 |
| 1.1.2 LncRNA与雄性生殖 |
| 1.2 目的和意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 拟解决的关键性问题及主要研究成果 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验所用细胞 |
| 2.3 主要实验仪器 |
| 2.4 生化与分子细胞生物学试剂 |
| 2.5 主要溶液配方 |
| 2.6 PCR引物设计与合成 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 基因芯片分析 |
| 3.2 RNA抽提及反转录 |
| 3.3 Real-time PCR |
| 3.4 5’和3’RACE |
| 3.5 1700121C10Rik编码能力评估 |
| 3.6 细胞复苏、培养、冻存 |
| 3.6.1 细胞复苏 |
| 3.6.2 细胞培养与传代 |
| 3.6.3 细胞冻存 |
| 3.7 真核表达载体的构建 |
| 3.7.1 扩增目的片段并引入酶切位点 |
| 3.7.2 PCR产物胶回收纯化 |
| 3.7.3 双酶切消化 |
| 3.7.4 酶切产物连接 |
| 3.7.5 连接产物转化、筛选及鉴定 |
| 3.7.6 酚氯仿法质粒纯化 |
| 3.8 质粒转染与细胞总蛋白提取 |
| 3.8.1 细胞铺板 |
| 3.8.2 质粒转染 |
| 3.8.3 细胞总蛋白提取 |
| 3.9 体外转录翻译 |
| 3.10 Western blot |
| 3.10.1 蛋白样品的制备 |
| 3.10.2 蛋白样品浓度的测定 |
| 3.10.3 蛋白电泳、转膜与抗体孵育 |
| 3.11 半定量RT-PCR |
| 3.12 Northern blot |
| 3.13 原位杂交 |
| 3.14 小鼠睾丸细胞的核质分离 |
| 3.15 小鼠基因型鉴定 |
| 3.15.1 鼠尾基因组DNA的提取 |
| 3.15.2 小鼠基因型鉴定 |
| 3.16 雄鼠生育能力评价 |
| 3.17 三种基因型成年雄性小鼠的睾丸重量及其占体重的百分比 |
| 3.18 三种基因型成年雄性小鼠的睾丸、附睾尾及精子的组织学分析 |
| 3.19 PNA染色观察精子顶体的形态结构 |
| 3.20 体外诱导精子顶体反应 |
| 3.21 计算机辅助精液分析(CASA) |
| 3.22 图像拍摄及处理 |
| 3.23 统计学分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 1700121C10Rik在 Prss54~(-/-)小鼠睾丸组织中严重下调 |
| 4.2 1700121C10Rik基因表达产生两个转录本 |
| 4.3 1700121C10Rik基因的转录产物为LncRNA |
| 4.4 1700121C10Rik基因在成年小鼠各组织中的表达情况 |
| 4.5 1700121C10Rik基因在不同发育时期小鼠睾丸中的表达情况 |
| 4.6 1700121C10Rik RNAs在小鼠睾丸组织中的细胞和亚细胞定位 |
| 4.7 1700121C10Rik基因剔除小鼠模型的建立及鉴定 |
| 4.8 1700121C10Rik基因缺失对雄性小鼠生育能力无影响 |
| 4.9 1700121C10Rik基因缺失对睾丸及附睾发育、精子发生过程、精子形态结构均无影响 |
| 4.10 1700121C10Rik基因缺失对精子活力无影响 |
| 4.11 1700121C10Rik基因缺失对精子顶体反应的发生无影响 |
| 4.12 1700121C10Rik基因缺失对Prss54 基因的表达无影响 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
四、Spatial and temporal expression of germ cell nuclear factorin murine epididymis（论文参考文献）
- [1]腺苷酸环化酶3敲除小鼠雄性不育机制研究[D]. 陈廷荣. 河北大学, 2021
- [2]长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析[D]. 张飞. 安徽农业大学, 2021
- [3]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]藏绵羊睾酮合成相关基因在睾丸和附睾中的表达特征及生物学功能[D]. 王霞. 甘肃农业大学, 2021
- [5]hnRNPK在小鼠精子发生中的功能研究[D]. 韩秋. 信阳师范学院, 2021(09)
- [6]内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究[D]. 张仙玉. 湖南农业大学, 2020
- [7]双酚AF对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究[D]. 吴迪. 华中农业大学, 2020
- [8]GPx5在骆驼附睾上的时空表达研究[D]. 伊茹汗. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [9]BAG6基因外显子24跳跃影响哺乳动物睾丸细胞生长和血睾屏障组装及相关分子机制研究[D]. 宋惠彬. 华中农业大学, 2019
- [10]功能未知基因1700121C10Rik对雄性小鼠生殖功能的影响及其作用机制的研究[D]. 李朝杰. 上海交通大学, 2019(06)