一、肝脏再生中凋亡的基因调控（论文文献综述）
欧伟杰[1]（2021）在《昼夜节律紊乱通过TGF-β1介导的细胞衰老影响肝损伤预后》文中指出目的:急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）起病急,进展快,若控制不良可导致病情迅速恶化,引发不良预后的发生。肝损伤的预后取决于炎症的消退以及肝细胞的再生,这一过程受多种内外因素的影响,昼夜节律紊乱（Circadian rhythm disorder,CD）也参与其中。本研究拟通过建立昼夜节律紊乱合并肝损伤小鼠模型,评估节律紊乱对急性肝损伤严重程度的影响。随后探讨TGF-β/Smad信号介导的非细胞自主性衰老在这一过程中发挥的作用。最后通过药物干预的手段,研究TGF-β受体Ⅰ抑制剂对节律紊乱合并肝损伤小鼠的潜在治疗效果。为后续优化急性肝损伤患者的治疗及临床管理提供新的视角。方法:1、探究节律紊乱合并肝损伤小鼠模型的构建条件。通过持续光照法构建CD小鼠模型,并从小鼠一般情况、行为学改变及肝组织生物钟基因m RNA水平变化三个方面对该模型的有效性进行评估鉴定。同时,通过建立D-Gal N/LPS剂量梯度（200/2.5、400/5、800/10）,构建三种不同程度的ALI小鼠模型,确定实验条件下ALI造模药物的最适剂量。2、探讨TGF-β/Smad信号通路在节律紊乱合并急性肝损伤中的作用。通过持续光照联合D-Gal N/LPS腹腔注射法构建节律紊乱合并急性肝损伤小鼠模型,观察并对比对照组（Control）、节律紊乱组（CD）、急性肝损伤组（ALI）及节律紊乱合并肝损组（CD+ALI）小鼠的生存情况,采用干化学法检测血清转氨酶、ELISA法检测血清IL-6、TNF-α水平、组织形态学检查及TUNEL荧光染色等方式,对各组小鼠的肝损伤严重程度进行对比。通过q RT-PCR及Western-blot检测肝组织内P53、P21、γ-H2AX、细胞衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）等细胞衰老相关组分的转录表达水平,细胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）染色法评估肝内细胞衰老水平。同时,检测CD+ALI小鼠肝组织TGF-β/Smad信号组分的表达情况,并采用P53/P21双标免疫荧光染色法验证非细胞自主性衰老现象的存在。通过在多时间点采用q RT-PCR法检测CD小鼠TGF-β1 m RNA水平,寻找节律紊乱调控细胞衰老的潜在原因。3、探索TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预的治疗效果。在CD小鼠成模后,肝损伤造模前给予TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预,随后通过上述方法检测小鼠肝损伤严重程度及肝内细胞衰老水平,进一步评估TGF-β1信号抑制在节律紊乱合并肝损伤中的潜在治疗价值。结果:1、持续光照联合400 mg/kg D-Gal N+5μg/kg LPS腹腔注射可用于构建节律紊乱合并急性肝损伤小鼠模型。采用持续光照1个月的方法可导致小鼠出现显着的行为学改变,同时小鼠肝组织节律相关基因clock、bmal1、nr1d1、per1、per2、per3、及cry1的节律性发生明显变化,提示CD小鼠模型构建成功。通过剂量梯度干预实验,我们发现在400 mg/kg的D-Gal N与5μg/kg LPS联合腹腔注射下,小鼠于给药结束后5.5小时开始出现小鼠死亡,72小时生存率可达50%左右。炎症高峰期血清ALT、AST较Control组显着升高,肝组织镜下可见肝小叶结构紊乱,肝板断裂,肝细胞水肿及点状坏死,肝血窦内出血明显,并存在炎症细胞浸润。与ALI组小鼠相比,CD+ALI小鼠表现出更严重的肝损伤表型,该组于给药结束后4.5小时出现死亡事件,72小时生存率仅20%。炎症高峰期血清ALT、AST及IL-6、TNF-α水平较ALI组均显着升高（P<0.01）。CD+ALI小鼠肝组织HE染色结果显示,该组发生水肿及坏死的肝细胞较ALI组更多,肝窦内出血及炎症细胞浸润现象更为明显,同时TUNEL阳性的死亡细胞数量更多,分布更广。2、细胞衰老水平在CD+ALI小鼠肝组织中显着上调,同时存在TGF-β/Smad信号激活。在CD+ALI小鼠肝组织中,细胞衰老相关组分p21、TGF-β1、IL-1α及cyclin E转录水平较ALI组均有显着上调,cyclin D m RNA水平下降。P21、Cyclin D、Cyclin E蛋白表达水平与转录水平变化情况一致,γ-H2AX较ALI组显着升高,P53及其磷酸化、乙酰化蛋白水平虽较Control组有所升高,但与ALI组之间无显着差异。在CD+ALI组,SA-β-gal染色阳性区域较前两组更加密集。3、TGF-β受体Ⅰ抑制剂可有效减轻CD+ALI小鼠肝损伤程度及肝内细胞衰老水平。在TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预下,节律紊乱合并肝损伤小鼠生存率较CD+ALI更高,ALT、AST及IL-6、TNF-α水平也显着降低（P<0.01）。肝组织内TGF-β/Smad信号激活水平受到显着抑制,同时肝内细胞衰老相关组分P21、TGF-β1、IL-1α及Cyclin E较ALI组均有显着降低,Cyclin D回升,提示细胞衰老现象的改善。结论:持续光照诱导的昼夜节律紊乱可导致肝损伤预后不良。节律紊乱可能通过TGF-β/Smad介导的非细胞自主性衰老途径影响肝损伤预后。TGF-β受体Ⅰ抑制剂LY2157299可有效改善节律紊乱合并肝损伤小鼠肝内细胞衰老现象,并减轻肝损伤严重程度。
李佳益[2]（2021）在《红酵母红素对急性肝损伤的干预及作用机制研究》文中提出红酵母红素与番茄红素具有相似的结构,拥有很强的抗氧化、抗炎、免疫调节及抑制肿瘤等功能。本实验室前期研究证明,红酵母红素对多种疾病都有良好的预防和干预作用,但对急性肝损伤的干预效果和机制还未进行系统研究。药物、酒精、化学物质、病毒及自身免疫等因素均可导致急性肝损伤,如果治疗不及时或治疗方式不恰当,急性肝损伤很有可能转为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化,甚至发展为肝癌。本论文旨在研究红酵母红素对急性肝损伤的干预及作用机制,为开发功能食品奠定基础。本论文首先通过建立过氧化氢（H2O2）诱导大鼠肝细胞（BRL细胞）氧化损伤模型和四种急性肝损伤小鼠模型,采用转录组高通量测序（RNA-seq）和蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法探究红酵母红素对急性肝损伤的干预作用和机制。然后利用纳米乳液对红酵母红素进行包埋,通过建立体外模拟消化模型和小鼠灌胃模型,研究其体内吸收过程和对急性肝损伤干预效果的影响及潜在机制。主要研究内容和结果如下:1.基于H2O2诱导BRL细胞氧化损伤模型发现,红酵母红素能抑制氧化损伤导致的细胞活性氧自由基（ROS）增加,提高细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性,降低脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量,缓解氧化应激导致的细胞损伤,从而提高氧化损伤细胞的存活率。另一方面,红酵母红素干预提高了线粒体膜上SOD活性,恢复了氧化损伤导致的线粒体膜通透性变化,使线粒体膜电位（MMP）恢复正常,从而维持了线粒体的正常结构功能,抑制了线粒体破裂造成的细胞凋亡。2.基于四种常见急性肝损伤小鼠模型研究发现,红酵母红素干预显着缓解急性肝损伤模型小鼠肝脏肿大,降低模型小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的含量,使肝损伤程度得到缓解。对抗氧化酶系活性测定发现,红酵母红素干预显着提升急性肝损伤模型小鼠肝脏中SOD和GSH-Px的水平、降低MDA的含量,从而缓解模型小鼠肝脏氧化应激。对炎症相关细胞因子测定发现,红酵母红素干预显着降低急性肝损伤模型小鼠肝脏中炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的含量,从而减轻炎症反应。此外,HE染色观察模型小鼠肝脏病理组织发现,红酵母红素干预能够缓解不同诱因导致小鼠肝组织出血、炎症浸入及组织坏死等病理损伤。3.为探究红酵母红素干预H2O2诱导BRL细胞氧化损伤的机制,利用RNA-seq和Western Blot方法对红酵母红素干预细胞损伤后的差异表达基因（DEGs）进行分析并验证。结果显示,红酵母红素干预组与模型组之间DEGs共有2808个,其中1334个DEGs表达上调,1474个DEGs表达下调。通过对DEGs进行富集分析后发现,红酵母红素主要通过调控抗氧化及抑制凋亡等相关信号通路缓解H2O2对肝细胞的氧化损伤。Western Blot结果表明,红酵母红素干预抑制了H2O2诱导的p53、Bax、Caspase-3蛋白过量表达,提高了Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-MTOR以及Nrf2蛋白表达。说明红酵母红素通过调控细胞凋亡相关蛋白、PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白m TOR和Nrf2的表达,提高肝细胞内抗氧化酶活性,抑制细胞凋亡,从而起到对H2O2致BRL细胞氧化损伤的干预作用。4.为探究红酵母红素干预几种急性肝损伤的机制,利用RNA-seq和Western Blot方法对红酵母红素干预急性肝损伤小鼠DEGs进行分析并验证。结果显示,不同模型中红酵母红素干预组与模型组之间的DEGs数量不同。药物性急性肝损伤中干预组与模型组之间的DEGs共有1743个,其中1075个DEGs表达上调,668个DEGs表达下调;化学性急性肝损伤中干预组与模型组之间的DEGs共有1519个,其中263个DEGs表达上调,1256个DEGs表达下调;酒精性急性肝损伤中干预组与模型组之间的DEGs共有806个,其中506个DEGs表达上调,300个DEGs表达下调;免疫性急性肝损伤中干预组与模型组之间的DEGs共有434个,其中72个DEGs表达上调,362个DEGs表达下调。其中药物性急性肝损伤和化学性急性肝损伤模型中组间DEGs数量较多,酒精性急性肝损伤和免疫性急性肝损伤模型组间DEGs数量较少。通过对DEGs进行富集分析后发现,红酵母红素干预不同急性肝损伤模型小鼠调控的信号通路有所不同,但都同样影响到细胞凋亡及氧化相关信号通路。Western Blot结果表明,红酵母红素干预上调了p-PI3K、p-Akt、p-m TOR、Nrf2和HO-1蛋白表达水平,抑制了NF-κB蛋白表达水平。表明红酵母红素可以通过调节PI3K/Akt/m TOR和Nrf2/HO-1/NF-κB信号通路提高小鼠肝细胞抗氧化能力,抑制细胞凋亡,从而缓解急性肝损伤症状。5.以大豆分离蛋白（SPI）和多聚果糖（Polyfructosee）制备一种纳米乳液使红酵母红素纳米载体化,利用体外模拟消化实验及小鼠灌胃实验探究包埋对红酵母红素消化吸收及对急性肝损伤干预效果的影响。结果发现,利用纳米乳液包埋后,红酵母红素的体外生物可给率由油溶液中的18.62%提升至48.06%;小鼠模型中,小鼠小肠中红酵母红素含量提高2.55倍,肝脏中红酵母红素含量提高2.33倍,肝脏中视黄醇含量提高1.62倍,表明纳米乳液包埋能显着提高红酵母红素的生物利用率。基于四种急性肝损伤模型研究发现,相较于油溶液,纳米乳液包埋能显着提升红酵母红素对急性肝损伤的干预效果,包括缓解小鼠血清指标、提高肝脏抗氧化酶活性及抑制炎症因子水平。综上所述,红酵母红素对H2O2诱导BRL细胞氧化损伤和小鼠急性肝损伤都有显着的干预效果,但是干预效果明显受到红酵母红素生物利用率的制约。而纳米乳液包埋能显着提升红酵母红素的生物利用率,从而提高对小鼠急性肝损伤的干预效果。本论文不但为急性肝损伤的预防和干预提供了新思路,也为红酵母红素的资源利用以及开发功能保健品提供了科学依据和理论支持。
胡海权[3]（2021）在《MicroRNA-143-5p调控AMPK通路在颈椎间盘退行性变中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分椎间盘退行性变的病理改变和miRNA基因表达筛查目得:通过miRNAs基因芯片测序筛选及探索颈椎间盘退变组与正常组的软骨终板组织差异表达的miRNAs。方法:纳入21例需手术治疗的颈椎间盘退行性变患者为退变组,13例无颈椎间盘退行性变患者为正常组,采用基因芯片进行测序,退变组与正常组颈椎间盘软骨终板组织通过总RNA提取,分别进行RNA质量评估,c DNA文库建立,测序质量评估,miRNAs基因表达量变化和差异表达谱分析;应用miRNAs测序来筛选差异表达的miRNAs和应用GO功能分析和KEGG通路分析对预测的miRNAs靶基因进行详细分析。通过qRT-PCR验证5个符合候选标准的miRNAs变化。结果:总RNA提取和RNA质量分析均显示测序结果符合质量要求。通过miRNAs基因芯片测序筛选退变组与正常组间存在的差异表达的miRNAs;总共筛查出35条miRNA表达存在显着差异,22条上调,13条下调。采用GO和KEGG富集分析显示退变组差异表达的miRNAs靶基因主要参与DNA-模板化、转录调控等生物过程,参与AMPK、MAPK、Wnt、Hippo等信号通路。总共hsa-miR-143-5p,hsa-miR-222-5p,hsa-miR-140-5p-F,hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-132在正常组和退变组中表达存在显着差异。通过qRT-PCR验证显示,退变组的hsa-miR-143-5p具有显着差异,hsa-miR-222-5p,hsa-miR-140-5p-F,hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-132在正常组与退变组间无显着差异。结论:通过基因芯片测序筛选和qRT-PCR验证显示miR-143-5p在颈椎间盘退行性变中显着上调。miR-143-5p在椎间盘退行性变可作为一个新的治疗靶点。第二部分miRNA-143-5p通过AMPK介导颈椎间盘退行性变目得:探索miRNA-143-5p是否通过AMPK介导颈椎间盘退行性变及可能调控机制;方法:纳入21例需手术治疗的颈椎间盘退行性变患者,13例无颈椎间盘退行性变患者为正常组,13例为外伤所致需颈椎手术,切除椎间盘软骨组织。应用HE法探索退变组和正常组椎间盘软骨终板病理变化;运用western Blotting和免疫组织探索p-AMPK,AMPK,EEF2在退行性变软骨终板中的蛋白表达的变化。结果:与正常组相比,退行性变组病理结构紊乱改变明显;生物信息学显示e EF-2是理论上的靶基因。WB显示退行性变组p-AMPK显着增加,EEF-2显着降低,AMPK变化不限制。结论:miR-143-5p在颈椎间盘退行性变中显着上调,其机制可能与AMPK通路相关。miR-143-5p在椎间盘退行性变可作为一个新的治疗靶点。
郑超然[4]（2021）在《Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究》文中研究指明肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophiclateral sclerosis,ALS）,是一种影响脊髓和大脑运动神经元（Motorneuron,MN）的神经退行性疾病。其特征是在疾病过程中患者上（UMN）、下（LMN）运动神经元发生退行性变性,可导致多个脑区（包括大脑皮层运动区、脑干和脊髓部分）中的运动神经元丧失功能,进而影响肌力、呼吸、吞咽等功能,最终致使患者瘫痪以及死亡。ALS引起的神经元功能障碍导致的突触传递异常,神经元兴奋-抑制平衡失衡对于神经元影响深远,因此,了解在ALS病程中脊髓运动神经元是如何受到影响,能否通过其他途径来弥补以改变疾病的病程,能为推进疾病治疗方法的进步提供思路。Sigma1R是一种较小的（仅28 KDa）、高度保守的跨膜蛋白,位于运动神经元突触后C-终末的下池（Subsurfacecisternae）,通常特异性地在线粒体相关膜（MAM）区域的内质网膜上富集。在动物体内,Sigma1R选择性高表达于神经系统,尤其是脊髓的运动神经元中。研究显示Sigma1R的缺失突变可导致一种被称为ALS16的神经退行性疾病或者其它类似的运动神经元缺陷。此外,即使在非Sigma1R突变的病例中,Sigma1R也被发现参与ALS的发病。我们认为,Sigma1R在神经系统中可能参与介导神经发生等一系列过程的调节,并广泛参与疾病病程中的各种细胞过程。我们的前期实验已经验证Sigma1R敲除的大鼠表现出神经损伤相关的表型,随后我们分离大鼠背部的脊髓,采用RNA-seq技术进行对照组（野生型组）和基因敲除组（Sigma1RKnockout组）的转录组学研究。最终得到在Sigma1R-/-中上调的基因为551个,下调的基因为674个。通过Sigma1R敲除后上调基因的KEGG功能富集分析我们发现HVP感染过程和PI3K-Akt信号通路相关基因功能的富集。通过Sigma1敲除后分析下调基因的KEGG功能富集发现钙信号通路和γ-氨基丁酸等相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后上调基因的GO功能富集分析我们发现,神经元鞘和轴突鞘相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后下调基因的GO功能富集分析可以检测到大量神经递质和突触相关功能的富集。在对Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响进行研究的过程中,我们以脊髓腹角运动神经元的数量作为体现相应的脊髓目标脑区的功能受损程度的重要指标。尼氏染色结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元在六月龄时就已经存在数量减少,细胞体积萎缩的现象,该现象会随着年龄的增加而愈趋严重,在一年龄时神经元的数量显着降低,神经元的胞体体积也显着降低,提示敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元会发生进行性的退行,这种现象可能是Sigma1R基因参与神经退行性疾病的病理生理过程的重要证据之一。通过对突触囊泡糖蛋白（SV2B）的标记显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元胞体上的兴奋性突触连接数量显着减少,其原因可能与神经元的数量整体减少有关;同时神经元的突触发生和损伤修复功能的弱化也有可能导致神经元突触末梢的发育和维持发生障碍,从而无法将兴奋性突触的数量维持在原本的水平。随后我们使用透射电镜方法对脊髓运动神经元突触的超微结构进行了观察,结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元突触中突触前活性带的长度没有显着变化,突触间隙变宽,突触后致密区显着增厚,提示Sigma1R敲除对神经元突触前释放递质的能力影响不大,但会使突触可塑性降低。电生理技术是研究神经元生理学活动的直接手段。通过对急性分离脊髓脑片进行膜片钳记录,我们得出以下结论,Sigma1R敲除大鼠和野生型大鼠相比:（1）脊髓腹角运动神经元的兴奋性明显增高,静息膜电位明显降低,膜电阻无显着变化,被给予电流刺激之后所产生的动作电位的最大幅度明显增高。（2）动作电位的幅度略小,峰型更宽,复极化所需要的时间更长,并且后超极化电位更小,指示钾离子流出过程的减慢。（3）激发动作电位的频率普遍更高,指示Sigma1R敲除能使神经元更易兴奋,且兴奋水平更高。（4）PSC频率显着更高,说明在正常生理条件下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;而PSC的幅度在两者间没有显着差异,说明两者在正常生理条件下突触后受体水平方面差别不大。（5）mEPSC频率略高于野生型,说明在没有动作电位的作用下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;mEPSC幅度显着升高,说明缺失Sigma1R基因的神经元的兴奋性突触后受体水平和反应能力的升高;电流峰面积更大,说明突触后对信号接受能力更强。在上述研究之外,我们对肝细胞性肝癌（HCC）患者的GDC数据进行了整理和挖掘,寻找其中关键的lncRNA-miRNA-mRNA网络和竞争性内源RNA（ceRNA）。我们发现SNHG1在HCC患者中过表达。SNHG1的上调与几种主要生物学功能的富集有关,包括细胞增殖,转录和蛋白质结合。小核仁RNA宿主基因1（SNHG1）,E2F8（E2F转录因子8）,FANCE（FA互补组E）和LMNB2（编码lamin B2）的表达趋势相似。在与SNHG1相关的网络中,SNHG1（对数秩p值=0.0643）,E2F8（对数秩p值=0.000048）,FANCE（对数秩p值=0.00125）和LMNB2（对数秩p）的高表达水平值=0.0392)与低生存率显着相关。单细胞分析表明,E2F8可能参与肿瘤发生或癌症发展。
王家坚[5]（2020）在《基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究》文中研究表明在过去的三十年中,由于BCL2（B-Cell CLL/Lymphoma 2）家族蛋白在细胞凋亡、肿瘤发生和抗癌治疗中的重要作用,BCL2家族蛋白已被广泛研究。然而,BCL2基因家族在妇科肿瘤中多组学分子模式的相似性和差异性尚未得到很好的认识和探究,因此本研究利用TCGA、GEO等多个数据库的不同组学水平的数据,研究妇科和乳腺癌中BCL2家族突变频率、基因表达、染色质可及性和预后、免疫组化之间的相关性来探究BCL2基因家族在妇科肿瘤中的共性和差异的分子特征,以期系统全面揭示BCL2家族在妇科肿瘤的可能作用及调控网络,为妇科肿瘤治疗提供理论依据和可能的治疗靶标。本论文主要内容和结果如下:第一,利用大量的样本对BCL2家族成员的遗传变化、m RNA表达水平、预后和免疫染色水平进行研究。抗凋亡成员在妇科肿瘤中表达并不广泛,在一些患者样本中也观察到抗凋亡成员的低表达水平和深度缺失,如BCL2、BCL2L2（Bcl-2-Like Protein 2）和MCL1（Myeloid Cell Leukemia 1）都出现了扩增和m RNA表达上调,但相对于正常样本它们的表达是下调的;同时也发现了关键的成员如BCL2L1（Bcl-2-Like Protein 1）,是妇科肿瘤抗凋亡成员中唯一上调的成员。但是这些成员的表达模式和BCL2凋亡调控模型是相吻合的,与其他BCL2家族成员相比,BCL2L1和MCL1显示出更高的表达水平,这与基因扩增频率的结果一致。而促凋亡成员中的效应者BAK1（BCL2 Antagonist/Killer1）和BAX（BCL2 Associated X）出现显着差异的上调表达,这也是肿瘤细胞需要快速持续的维持其稳态的需要;还有起始者（PMAIP1（Phorbol-12-Myristate-13-Acetate-Induced Protein 1）、BIK（BCL2 Interacting Killer）和BID（BH3 Interacting Domain Death Agonist））也相对于正常样本出现了过表达。预后结果显示BAD（BCL2 Associated Agonist Of Cell Death）、BIK和BAK1在妇科肿瘤具有显着的预后效果。免疫组化分析发现,除BOK（BCL2 Related Ovarian Killer）、BMF（Bcl2Modifying Factor）、HRK（Harakiri,BCL2 Interacting Protein）外,这些BCL2家族基因均有免疫组化染色,且多分布于患者样本的细胞质和细胞膜区域。相比之下,正常组织中广泛的脂肪细胞、腺细胞和肌上皮细胞通常有低水平或未检测到的染色。在特定的正常组织中,包括鳞状上皮细胞、子宫内膜基质中的细胞、卵巢基质细胞、卵泡细胞,也观察到类似的低水平染色。正常组织与肿瘤样本之间表现出不同的染色,映射出BCL2家族不同的蛋白调控模式。第二,利用染色质的开放区域研究BCL2家族成员的表观调控,涉及DNA的甲基化、组蛋白修饰和远端调控。我们的研究首次对BCL2家族的远距离调控（活跃峰-启动子区域）进行了系统研究。远端非编码区与的染色质活跃区域具有性别和组织的特异性。同时我们还发现一类活跃的峰在靠近转录起始位点附近的区域始终没有性别和组织的特异性,这些区域在不同妇科肿瘤中基本都是活跃状态的,不管是抗凋亡成员还是促凋亡成员都遵循这个规律:启动子区域及其邻近区域的活跃峰是普遍存在的。同时我们还发现超过一半以上的BCL2家族成员都具有远端调控信号,这些成员转录活性普遍高于正常样本。基因组的染色质活跃程度与m RNA表达水平正相关。TCGA单个样本水平的活跃染色质和单个样本的m RNA水平进行比较,结果发现活跃峰的数量越多,m RNA的表达水平就越高;反过来,活跃峰的数量越少,m RNA的表达水平则越低。第三,利用整合前面的多组学数据（包括BCL2家族基因突变、表达等）以及PPI网络、转录调控等分析了BCL2家族在妇科肿瘤中的调控网络,探究BCL2家族调控网络在妇科肿瘤中存在哪些共同或不同的特点,发现TP53和PIK3CA与BCL2L1的共突变标志是特异的,在以前的妇科肿瘤研究中没有发现。TP53和PIK3CA的共突变是MOMP的抗凋亡蛋白抑制的主要媒介,可能可以导致乳腺癌出现更差的预后表型。这些蛋白质通过共突变标志连接起来。MCL1和BCL2L1的m RNA表达水平较高,与基因周围区域的染色质可及性一致,尤其可能是由于远端染色质可及性信号较强,增强了其转录表达。因此,我们推测TP53（Transformation-Related Protein 53）和PIK3CA（Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase 110 KDa Catalytic Subunit Alpha）的共突变信号作用于刺激BCL2L1基因位点染色质环的形成,以加强其转录活性。在妇科肿瘤中,BCL2L1作为唯一上调的抗凋亡成员和保护者,可以防止促凋亡成员的激活和寡聚,维持线粒体膜电位的平衡,从而防止细胞色素c的释放,抑制caspase。因此,将BCL2L1、TP53/TP63（Transformation-Related Protein 63）和PIK3CA作为可能的潜在预后标志物可能是妇科癌诊断和治疗的有效方法。另外,调控网络的特异之处:BRCA中YWHAZ（Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein Zeta）扩增、CESC中PIK3CB（Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate 3-Kinase 110 KDa Catalytic Subunit Beta）扩增、UCEC中PIK3R1（Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 1）突变以及OV中XRCC6（X-Ray Repair Cross Complementing 6）、NMT1（N-Myristoyltransferase 1）和CASP3（Caspase 3）下调等方面存在特异性差异,这表明BCL2家族蛋白网络可用于鉴别不同类型的妇科肿瘤,为靶向药物的设计提供新的思路。总之,本研究利用多组学技术对BCL2家族在妇科肿瘤中的DNA突变、表达、活跃染色质和调控网络进行了整合分析,全面系统地揭示BCL2家族在妇科肿瘤的分子变化模式及可能的作用和分子网络,为妇科肿瘤治疗提供理论依据和可能的治疗靶标,也为其他泛肿瘤、多组学研究提供了可借鉴的整合分析思路和经验。
孟霞[6]（2020）在《PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究》文中研究指明急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是一组以肾脏功能在短期内急速下降为标志的常见临床综合征,其病因复杂,常见的致病因素有肾毒性药物（如顺铂,cisplatin,CP）、缺血缺氧损伤、重症感染等,具有高发病率和高死亡率等特点。肾小管上皮细胞（Renal tubular epithelial cells,RTEC）损伤是AKI的主要病理基础,损伤后的细胞正常结构遭到破坏,骨架排列失常,管腔侧的刷状缘丢失,基底膜破坏,最终导致细胞变性或死亡。在AKI早期即存在线粒体形态结构和功能的异常,RTEC中富含线粒体,细胞生理功能的行使以及细胞修复和再生离不开线粒体的能量供给,细胞线粒体形态和功能的稳定对于肾功能的维持具有重要意义,线粒体损伤能够引起细胞凋亡坏死诱发肾脏疾病。目前导致AKI的确切致病机制尚不十分清楚,也缺乏有效的干预手段。孕烷X受体（Pregnane X receptor,PXR）是核受体（nuclear receptor,NR）超家族中NR1I亚家族的成员,主要在肝脏、肾脏、肠道等组织中高表达。PXR在机体对异源性/内源性源性物质的防御机制过程中发挥重要的生物调节作用和“解毒”功能,作为配体依赖性转录因子,能够调节多种靶基因转录和表达,广泛参与机体内异源性/内源性物质代谢、能量代谢、免疫炎症反应、细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡、肿瘤耐药等多种生理或病理生理过程,在肝脏、肠道、心血管等组织器官的多种疾病以及癌症的发生发展中具有重要的作用,但PXR在急性肾损伤中的作用尚不清楚,因此在本研究中,我们探讨了PXR在AKI中的作用及具体机制。醛酮还原酶（Aldo-keto reductase,AKRs）是一类NADPH依赖的氧化还原酶,可对脂肪醛、糖类、甾体类激素和致癌物等多种有害的过氧代谢产物进行还原,在氧化应激、药物代谢、激素合成、炎症反应、致癌物解毒等生命活动中发挥重要作用。AKR1B是AKRs中最大的一个家族,包括醛糖还原酶（AR）和AR样蛋白。AKR1B7（Aldo-Keto Reductase Family 1,Member B7,醛酮还原酶家族1,成员B7）在解毒脂质过氧化物的过程中发挥重要作用。在肝脏和结肠中,PXR特异性激动剂孕烯醇酮-16a-碳腈（pregnane-16α-carbonitrile,PCN）可以明显的上调AKR1B7的表达,在人肝癌细胞株细胞中也证实AKR1B7是PXR的下游基因,提示PXR和AKR1B7之间可能存在调控关系,但目前在肾脏中两者之间的关系尚无研究报道。基于既往研究背景和我们的前期实验,本研究推测,肾毒性药物或肾缺血再灌注损伤等各种损伤因素作用下肾脏PXR表达下降,下调其靶基因AKR1B7的表达,介导线粒体功能障碍,导致肾小管上皮细胞损伤及AKI的发生,上调或激活肾组织PXR可能对AKI具有重要保护作用。为探讨其中的机制,本课题将在动物、细胞和分子水平深入研究PXR/AKR1B7信号通路在AKI中的作用,我们设计了以下四部分实验进行探究。第一部分 PXR在急性肾损伤患者肾组织中的表达目的:观察急性肾损伤肾组织中PXR定位和定量表达,并分析其与肾功能的相关性。方法:1.（1）选取20例急性肾损伤患者的肾活检组织,并收集患者临床资料,6例肾癌切除术患者的癌旁正常肾组织作为对照。（2）C57BL/6J小鼠单次腹腔注射顺铂（20 mg/kg）制备AKI模型,分别在注射CP后的1 d、2 d、3 d处死小鼠,留取肾脏组织。（3）体外将在两种不同处理的细胞模型中完成:1)培养小鼠RTECs细胞系,待细胞长至70%80%时,分别给予不同浓度的CP（0、2、4、6、8μg/ml）诱导RTECs损伤,24 h后收取细胞;2)待培养的RTECs长至70%80%时,在不同的时间点给予CP（5μg/ml）刺激,并在CP刺激2 h、6 h、12 h和24 h后收集细胞。2.样品分析:免疫组化染色（IHC）检测肾脏组织中PXR的定位和表达,Real-time PCR和Western blot分别检测小鼠肾皮质组织和体外培养的RTEC中PXR的表达变化。结果:1.IHC结果显示正常肾组织中PXR主要表达于近端肾小管上皮细胞,远端肾小管和集合管表达相对较少,在肾小球的系膜细胞、内皮细胞和足细胞中也有表达,而AKI患者肾活检组织中PXR的表达明显减少,下降至对照组的33.67%（P<0.0001）。而且,AKI患者肾组织中PXR的表达与血尿素氮（BUN）（r=-0.6377,P<0.01）和血清肌酐（SCr）（r=-0.7819,P<0.001）峰值浓度呈负相关。2.IHC结果显示与在人肾组织中观察的结果一致,正常小鼠肾组织中可见PXR的表达,并且在近端肾小管上皮细胞中表达最多,而在CP作用3天后的AKI小鼠模型中PXR在近端小管中表达明显减少。同时在CP诱导的AKI小鼠模型的肾脏中PXR m RNA和蛋白表达也明显下调,呈时间依赖性性的下降,注射CP第1天,肾皮质中的PXR m RNA即明显下降,第3天最低,降至对照组的26.95%（P=0.0055）;PXR蛋白水平在注射CP后第2天开始下降,第3天最低,降至对照组的56.22%（P<0.0001）。3.体外培养的RTECs,CP呈剂量依赖性和时间依赖性方式抑制PXR表达,CP（5μg/ml）刺激细胞12 h,PXR m RNA表达出现明显下降,24 h达最低,降至对照组的60.84%（P<0.0001）。结论:急性肾损伤肾组织中PXR表达显着下降,与血尿素氮和血肌酐峰值浓度呈负相关。第二部分 PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用目的:探讨PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用。方法:1.模型制备:（1）动物模型:1)应用野生型（WT）SD大鼠和PXR基因全身敲除（PXR-/-）大鼠单次腹腔注射CP（7.5 mg/kg）诱导AKI模型,分为4组:野生型对照（WT）组、WT+CP组、PXR-/-对照组、PXR-/-+CP组,注射CP 72 h后处死大鼠,留取血清、肾脏标本;2)应用野生型C57/B6J小鼠给予PXR激动剂PCN（50 mg/kg/day,I.P）预处理2天后,给予CP（20 mg/kg,I.P）制备AKI小鼠模型,分为3组:对照组（Sham）、CP组、CP+PCN组,PCN继续给予3天,CP作用72 h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本;3)应用WT大鼠和PXR-/-大鼠给予PCN预处理2天后,给予CP（7.5 mg/kg,I.P）制备AKI大鼠模型,PCN继续给予3天,分为6组:WT组、WT+CP组、WT+CP+PCN组、PXR-/-组、PXR-/-+CP组、PXR-/-+CP+PCN组,CP作用72h后处死大鼠,留取血清、肾脏标本;4)应用C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射PXR过表达质粒/空载质粒,36 h后腹腔注射CP（20 mg/kg）制备AKI小鼠模型,分为3组:对照（NC）组、NC+CP组、PXR+CP组,72h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本。（2）细胞模型:1)RTECs给予PCN预处理2 h后,用CP（5μg/ml）刺激制备细胞损伤模型,分为3组:对照（Ctrl）组、CP组、CP+PCN组,CP刺激24 h后收取细胞。此外在稳定表达p Ds Red2-mito或mt-m Keima-cox8质粒（含有线粒体定位信号）的RTECs中构建此模型,收取细胞;2)RTECs瞬时转染PXR-si RNA,转染24 h后用PCN预处理,再用CP刺激制备细胞损伤模型,分为6组:si NC（Vehicle组、CP组、CP+PCN组）、si PXR（Vehicle组、CP组、CP+PCN组）,刺激24h后收取细胞和上清;3)制备稳定过表达PXR的RTECs给予CP（5μg/ml）刺激,分为4组:NC组（转染空载质粒）、NC+CP组、PXR组、PXR+CP组,CP作用24h后收取细胞,此外在稳定表达p Ds Red2-mito或mt-m Keima-cox8质粒的RTECs中构建此模型,收取细胞;4)应用自噬抑制剂BAFa1预处理稳定过表达PXR的RTECs,再给予CP刺激诱导细胞损伤模型,分为6组:NC（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）、PXR（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）,24 h后收取细胞。2.样品分析:血生化仪检测血清中Scr和BUN浓度,PAS染色观察肾脏组织病理损伤,透射电镜观察肾组织中线粒体形态结构,IHC检测促凋亡因子Cyt-c的释放和巨噬细胞标记分子F4/80的表达,TUNEL染色法检测肾脏组织的细胞凋亡情况,Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测体外细胞凋亡率,Real-time PCR检测肾皮质中肾小管早期损伤标志物KIM-1和NGAL的表达,Western blot、Real-time PCR或ELISA法检测肾皮质或RTEC中细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、OPA1）和线粒体自噬相关基因（LC3I、LC3II、P62、Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、fundc1、Nix）的表达水平。Mito Sox染色测定线粒体ROS含量,JC-1法检测线粒体膜电位（MMP）,荧光素酶法检测细胞ATP含量,Seahorse生物能量分析仪检测线粒体氧消耗率（OCR）,用p Ds Red2-Mito或mt-m Keima-cox质粒标记RTECs中线粒体,激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察线粒体数量和形态,并根据荧光变化评估线粒体自噬活性。结果:1.体内研究（1）顺铂处理后的WT大鼠SCr、BUN浓度与对照组相比均明显增高,PXR基因敲除进一步加重CP引起的大鼠SCr和BUN浓度增高（SCr:91.05±21.22 vs.215.70±41.55μmol/L,P<0.0001;BUN:32.98±5.70 vs.72.46±18.34 mmol/L,P<0.0001）;PXR激动剂PCN能保护小鼠肾功能,与CP组相比,PCN干预后小鼠SCr和BUN浓度明显下降（SCr:93.70±19.45 vs.44.20±10.61μmol/L,P<0.0001;BUN:73.62±11.72 vs.40.57±9.18 mmol/L,P<0.0001）;与PXR激动剂相似,小鼠尾静脉高压注射PXR质粒诱导其过表达亦显着改善AKI小鼠肾功能,与NC+CP组相比,PXR过表达组小鼠SCr和BUN浓度明显降低（SCr:219.23±29.17 vs.56.58±30.94μmol/L,P<0.0001;BUN:76.41±7.47 vs.47.55±11.56 mmol/L,P<0.0001）。（2）AKI模型肾小管上皮细胞出现不同程度的肿胀、变性、坏死,肾小管扩张、管型形成,肾组织中肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL表达均显着上调。PXR基因敲除显着加重CP诱导的肾损伤,肾小管上皮细胞变性坏死更加严重,损伤范围增大,同时肾脏中KIM-1和NGAL的表达进一步增高,给予PCN治疗或过表达PXR均显着减轻CP导致的肾损伤,逆转CP诱导的KIM-1和NGAL高表达。同时,透射电镜结果显示PXR基因敲除进一步加重CP导致的肾组织线粒体损伤,出现更为严重的线粒体肿胀、嵴断裂消失、基质见异常透亮区,PCN治疗或过表达PXR均显着改善CP引起的肾组织线粒体形态和结构损伤。（3）AKI模型肾组织中细胞凋亡增加,与对照组相比,TUNEL染色阳性凋亡细胞数显着增加,促凋亡蛋白Bax和活化的凋亡执行蛋白cleaved caspase 3表达明显上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显着降低,敲除PXR基因进一步增加CP诱导的肾组织细胞凋亡、促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白cleaved caspase 3的表达,抗凋亡蛋白Bcl-2也进一步下调,而PCN治疗或过表达PXR均显着减少CP诱导的细胞凋亡和促凋亡蛋白的表达,并上调Bcl-2表达,同时IHC显示PCN治疗或过表达PXR均显着抑制CP诱导的促凋亡因子Cyt-c的释放。（4）AKI模型肾组织中免疫细胞浸润增多,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌增加,PXR基因敲除进一步加重CP诱导炎症因子的表达和分泌,而PCN治疗或过表达PXR可明显减少CP诱导的巨噬细胞浸润和炎症因子表达。（5）AKI模型肾皮质中自噬相关基因（LC3II、Atg3、Atg5、Atg7）和线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）表达明显下降,而PXR基因敲除进一步下调上述基因的表达。2.体外研究（1）体外培养的RTECs在CP刺激后细胞凋亡率明显增高,促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved caspase 3、Cyt-c）和细胞炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和未活化的caspase 3下降;PCN预处理或PXR过表达均显着抑制CP诱导的细胞凋亡,减少促细胞凋亡相关蛋白和炎症因子的表达,逆转抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而敲低PXR则消除了PCN对RTECs损伤的保护作用。（2）RTECs在CP刺激后出现线粒体功能障碍,表现为线粒体内ROS产生增多,MMP降低,mt DNA拷贝数以及ATP含量减少,OCR和最大呼吸容量降低;PCN预处理或PXR过表达均明显减少CP诱导的线粒体ROS积累,阻断CP引起的线粒体MMP、mt DNA拷贝数以及ATP含量的下降,逆转了线粒体OCR和最大呼吸容量。（3）RTECs在CP刺激后,细胞中线粒体稳态失衡,线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、Opa1）和线粒体自噬相关基因（Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、Fundc1、Nix）表达均明显降低,自噬体底物P62表达增加,而PCN预处理或PXR过表达可明显恢复或增加上述线粒体质量控制相关基因的表达,维持线粒体稳态。（4）在LSCM镜下,转染含有线粒体定位信号p Ds Red2-mito质粒的RTECs中线粒体形态呈线状和网状,给予CP刺激后线粒体形态完整性受损,表现为红色荧光减少、强度减弱,异常的点状、片状线粒体增多,而PCN预处理或过表达PXR均可逆转CP诱导的线粒体形态损伤,与此一致,稳定表达mt-m Keima-cox8质粒的RTECs在给予CP刺激后,线粒体内红素荧光减弱,绿色荧光强度增加,线粒体自噬活性减弱,而PCN预处理或PXR过表达可逆转由CP导致的绿色荧光强度增加,并转换为红色荧光,提示线粒体自噬活性增强。（5）流式细胞术结果显示BAFa1抑制细胞自噬后,部分消除了过表达PXR对CP诱导的细胞凋亡的保护作用。结论:PXR基因敲除加重顺铂诱导的肾功能及肾脏病理损伤、肾小管细胞凋亡、炎症反应和线粒体功能障碍;PXR激动剂PCN或过表达能显着改善顺铂诱导的线粒体功能障碍和肾组织病理损伤。第三部分 PXR在肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用目的:探讨PXR在肾缺血再灌注损伤（I/R）诱导的急性肾损伤中的作用。方法:1.动物模型:（1）选取810周龄,雄性,PXR-/-大鼠和WT大鼠,分为4组:WT+Sham组、WT+I/R组、PXR-/-+Sham组、PXR-/-+I/R组,WT大鼠和PXR-/-大鼠用微动脉夹夹闭双侧肾动脉35 min后,再灌注24 h制备I/R诱导的AKI模型,处死大鼠留取血清、肾脏标本;（2）选取8周龄,雄性,C57BL/6J小鼠,分为3组:Sham组,I/R组,I/R+PCN组,给予PCN（50 mg/kg/day,I.P）预处理2天,每日一次（qd）,再给予微动脉夹夹闭双侧肾动脉35 min后灌注24 h制备I/R诱导的AKI小鼠模型,处死小鼠留取血清、肾脏标本。2.样品分析:血生化仪检测血清中的Scr和BUN浓度评估肾功能,PAS染色观察肾组织的病理学改变,TUNEL染色法检测肾脏细胞凋亡情况,Real-time PCR法检测肾组织肾小管早期损伤标志物KIM-1、NGAL m RNA表达水平。结果:（1）与对照组相比,WT模型组大鼠SCr和BUN均都明显升高,敲除PXR基因进一步加重肾功能损伤（SCr:61.00±7.96 vs.73.37±15.03μmol/L,P<0.05;BUN:8.40±1.82 vs.10.94±2.92 mmol,P<0.05）;在小鼠I/R模型中,给予PCN治疗后可明显降低SCr和BUN水平（SCr:154.70±11.49 vs.101.66±7.96μmol/L,P<0.0001;BUN:668.13±5.54 vs.44.11±6.48 mmol/L,P<0.0001）,保护肾功能。（2）I/R导致的AKI模型组肾脏出现不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、变性、坏死,管型形成,PXR基因敲除进一步加重I/R导致的肾小管坏死,累积的病变范围增大,肾小管上皮细胞萎缩,管腔扩张更加明显,肾小管损伤病理评分进一步升高（2.24±0.27 vs.2.67±0.31,P=0.0276）;给予PCN治疗能显着减轻I/R诱导的肾小管损伤,肾小管损伤病理评分显着降低（2.51±0.14 vs.1.40±0.08,P<0.0001）。同时,Real-time PCR结果显示I/R导致肾皮质中肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL m RNA表达均显着增加,与WT+I/R组相比,PXR-/-+I/R组KIM-1和NGAL的表达分别进一步上调了0.70倍（P<0.0001）和1.74倍（P<0.0001）;与I/R模型组相比,PCN+I/R治疗组小鼠肾皮质中KIM-1和NGAL的表达分别减少了48.40%（P<0.0001）和51.72%（P=0.0042）。（3）TUNEL染色结果显示WT模型组大鼠肾脏细胞凋亡数明显增加,PXR基因敲除进一步加重肾组织细胞凋亡数（9.67±2.33 vs.12.67±2.50,P=0.0408）。结论:PXR基因敲除加重肾缺血再灌注诱导的肾小管损伤和细胞凋亡;PCN激活PXR可改善肾缺血再灌注诱导的肾功能损伤和肾组织病理损伤。第四部分 AKR1B7介导PXR在急性肾损伤中的保护作用及其机制研究目的:筛选AKI肾组织中PXR的靶基因,明确PXR对AKR1B7表达的调控,并探讨AKR1B7在AKI中的作用及其对线粒体功能的影响。方法:1.PXR靶基因的筛选与鉴定:应用基于i TRAQ的定量蛋白质组学分析WT大鼠和PXR-/-大鼠肾脏组织中的差异蛋白质表达。Real-time PCR检测PXR-/-大鼠和过表达PXR后的RTEC细胞中AKR1B7的表达,及其在CP刺激后AKR1B7的表达变化。双荧光素酶报告基因法检测PXR与AKR1B7启动子序列的结合活性。RNA荧光原位杂交法（RNA-FISH）检测RTECs中AKR1B7的表达及亚细胞定位。2.PXR靶基因AKR1B7的作用研究（1）动物模型:1)C57BL/6J小鼠单次腹腔注射CP（20 mg/kg）制备AKI模型,分别在注射CP后1 d、2 d、3 d后处死小鼠,留取肾脏组织;2)C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射AKR1B7过表达质粒/空载质粒,36 h后给予CP（20 mg/kg）诱导AKI小鼠模型,分为三组:NC组、NC+CP组、AKR1B7+CP组,CP作用72 h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本。（2）细胞模型:1)RTECs分别给予不同浓度的CP（0、2、4、6、8μg/ml）刺激24 h;2)RTECs细胞给予CP（5μg/ml）刺激不同时间（0、2、6、12、24 h）;3)制备稳定过表达AKR1B7的RTECs给予CP（5μg/ml）刺激,分为四组:NC组、NC+CP组、AKR1B7组、AKR1B7+CP组,CP刺激24h后收取细胞,供后续检测。此外在稳定表达p Ds Red2-mito质粒的RTECs中构建此模型,收取细胞;4)应用自噬抑制剂BAFa1预处理过表达AKR1B7的RTECs,再给予CP刺激诱导细胞损伤,分为六组:NC（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）、AKR1B7（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）,24 h后收取细胞。（3）样品分析:血生化仪检测SCr和BUN的浓度,PAS染色观察肾脏组织病理学改变,透射电镜观察肾组织中线粒体形态,IHC检测促凋亡因子Cyt-c的释放和巨噬细胞标记分子F4/80的表达,TUNEL染色法检测肾组织的细胞凋亡情况,Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测体外培养细胞凋亡率,Real-time PCR检测肾皮质中肾小管早期损伤标志物KIM-1和NGAL的表达,Western blot或Real-time PCR法检测肾皮质或RTEC中AKR1B7、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体自噬相关基因（LC3II、P62、Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、fundc1、Nix）和线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、OPA1）等表达水平。线粒体分离、Mito-Tracher染色结合FISH技术检测线粒体中AKR1B7的表达,转录组测序技术分析过表达AKR1B7后的RTEC内的差异表达基因。Mito Sox染色测定线粒体ROS含量,JC-1法检测MMP,荧光素酶法检测细胞ATP含量,Seahorse生物能量分析仪检测线粒体呼吸功能指标OCR,LSCM观察转染p Ds Red2-mito质粒后的RTECs中线粒体形态变化。结果:1.（1）蛋白质组学分析显示PXR-/-大鼠和WT大鼠相比肾组织中差异表达蛋白（上调≥1.5倍或下调≤0.67倍,P<0.05）有152个,其中表达上调的有105个,下调的有47个。AKR1B7是显着下调差异蛋白之一。Real-time PCR显示AKR1B7在PXR-/-大鼠肾脏中表达降低了46.27%（P<0.001）,在RTECs中过表达PXR上调AKR1B7 1.30倍（P<0.0001）,双荧光素酶报告基因法检测显示AKR1B7是PXR的下游靶点,激活PXR能明显增加AKR1B7的启动子序列的荧光素酶活性。（2）在CP诱导的AKI小鼠模型肾组织中AKR1B7与PXR的表达趋势一致,呈时间依赖性的下降,注射CP第1天,肾皮质中AKR1B7 m RNA即明显下降,第3天最低,降至对照组35.26%（P<0.0001）。（3）RNA-FISH结果显示在CP刺激的RTECs中AKR1B7 m RNA表达减少,PCN预处理能恢复其表达;体外培养的RTECs中,CP呈时间依赖性和剂量依赖性地方式抑制AKR1B7表达,CP（5μg/ml）刺激细胞12 h,AKR1B7 m RNA表达出现明显下降,24 h达最低,降至对照组的60.19%（P<0.0001）。2.体内研究（1）尾静脉高压注射AKR1B7过表达质粒36 h后,在小鼠肾皮质中AKR1B7的表达增高了1.76倍（P=0.0005）。（2）过表达AKR1B7明显改善AKI小鼠肾功能,降低SCr和BUN水平SCr:82.21±38.90 vs.45.08±20.33μmol/L,P=0.034;BUN:28.65±5.99 vs.14.34±3.01 mmol/L,P<0.0001)。（3）过表达AKR1B7减轻CP诱导的肾小管病理损伤（1.53±0.29 vs.0.61±0.17,P<0.0001）,降低肾皮质KIM-1和NGAL表达,线粒体形态和结构损伤也得到恢复。（4）过表达AKR1B7显着减少CP诱导的肾脏细胞凋亡（12.38±3.11 vs.6.38±1.92,P=0.0001）,下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,同时IHC过表达AKR1B7显着抑制CP诱导的促凋亡因子Cyt-c的释放。（5）过表达AKR1B7明显减少CP诱导的巨噬细胞浸润和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达。3.体外研究（1）RTECs过表达AKR1B7显着降低CP诱导的细胞凋亡,下调促凋亡相关蛋白Bax和促凋亡因子Cyt-c的表达,逆转了抗凋亡相关蛋白Bcl-2的减少,同时明显抑制了CP引起的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌。（2）过表达AKR1B7明显改善了线粒体功能障碍,减少CP诱导的线粒体ROS积累,阻断MMP、mt DNA拷贝数以及ATP含量的下降,逆转CP对OCR和最大呼吸容量的抑制。（3）Mito-Tracher染色结合RNA-FISH分析和线粒体分离技术显示在线粒体中检测到AKR1B7 m RNA,转录组测序技术分析AKR1B7的过度表达显着增强包括LDHB、Eya2和Lars2在内的线粒体保护基因的表达。（4）过表达AKR1B7能恢复或上调与线粒体质量控制相关基因的表达,与NC+CP组相比,AKR1B7+CP组细胞线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体自噬相关基因（Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Fundc1、Nix）和线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、Opa1）的m RNA表达明显增加,而自噬体底物P62表达下调。（5）LSCM镜下显示,转染p Ds Red2-mito质粒后的RTECs中过表达AKR1B7逆转CP引起的的荧光强度改变,管状和网状线粒体增多,恢复线粒体形态完整性。（6）应用BAFa1抑制细胞自噬,部分消除了过表达AKR1B7对CP诱导的细胞凋亡的保护作用。结论:肾脏中AKR1B7是PXR的靶基因,过表达AKR1B7能通过调控线粒体质量控制减轻顺铂诱导的线粒体功能障碍,进而改善肾功能,减轻肾小管损伤、细胞凋亡和炎症反应。
刘爽[7]（2020）在《海豚链球菌诱导的牙鲆microRNA表达、调控及功能研究》文中认为海豚链球菌（Streptococcus iniae,S.iniae）是海水养殖鱼类重要的细菌性病原,给水产养殖业造成了巨大的经济损失,严重阻碍了鱼类养殖业的健康发展。目前,愈来愈多的国内外研究人员从宿主（海水鱼类）免疫防御机制等方面开展系统的研究,以此为海豚链球菌病的防御提供理论基础和科学依据。MicroRNA（miRNA）参与许多生物活动,包括对病原体的免疫防御。在本论文研究中,我们应用高通量测序技术分析海豚链球菌感染后不同时间点（6h和24h）牙鲆体内的miRNA表达情况。共鉴定出1038个miRNAs,其中249个miRNAs是新颖的miRNAs,81个miRNAs在感染海豚链球菌后呈现显着差异表达,被命名为DEmiRNAs（Differentially Expressed miRNAs）。在这81个DEmiRNAs中,34个和58个miRNA分别出现在感染后6小时和24小时。大多数DEmiRNAs具有很强的时间特异性,仅有13.6%的DEmiRNAs同时出现在两个时间点。对81个DEmiRNAs进行靶基因预测分析,发现了9582个预测靶基因。通过GO（Gene Ontology）分析,这些靶基因被富集到各种GO terms,主要包括生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析表明,这些靶基因也被富集到各种KEGG通路,主要包括内吞作用和溶酶体相关途径以及MAPK、Erb B和AMPK等信号传导途径。自上述发现的DEmiRNAs中,选择了两个DEmiRNAs,即pol-3p-10740＿175和pol-miR-216b,对其进行了调控与功能研究。发现pol-3p-10740＿175靶向双重特异性磷酸酶6（dual specificity phosphatase 6,Dusp6）,并抑制后者的表达。用pol-3p-10740＿175转染牙鲆FG细胞可显着性抑制海豚链球菌入侵。发现pol-miR-216b的表达水平在海豚链球菌和细胞肿大病毒（megalocytivirus）感染过程中发生显着变化。进一步研究发现pol-miR-216b靶向Fas凋亡抑制分子（Fas apoptotic inhibitory molecule,transcript variant X1,FAIM1）。pol-miR-216b通过与牙鲆FAIM1（命名为PoFAIM1）的3’-UTR相互作用而调控PoFAIM1表达。Fas凋亡抑制分子是一种抗凋亡蛋白,其在鱼类中的功能作用尚不清楚。我们发现PoFAIM1与哺乳动物FAIMs在结构上高度保守,都有一个FAIM1结构域。为了研究PoFAIM1的功能,我们构建了干扰PoFAIM1表达的RNAi干扰表达质粒,并检测了它们的体内效应,发现干扰表达质粒能显着抑制PoFAIM1在牙鲆肝、脾、肾、肠中的表达。综上所述,本论文研究首次鉴定了海豚链球菌诱导的牙鲆miRNA表达谱图,发现了海豚链球菌调控的大量miRNAs,证明了miRNA参与抗海豚链球菌感染免疫。这些研究结果加深了我们对鱼类miRNA在抗细菌感染免疫中的作用的理解。
关凯方[8]（2019）在《乳源MFG-E8介导MAPK信号通路调控及对衰老大鼠肌肉再生作用》文中认为乳脂肪球表皮生长因子8（MFG-E8）是从乳脂肪球膜（MFGM）中分离出来的一种具有多种生物学活性功能的外周膜糖蛋白,有关MFG-E8对改善老年性肌肉萎缩的生理活性及其作用机制方面的研究报道有限。本论文通过体外细胞实验和体内动物实验阐明了MFG-E8具有促进肌肉再生的功能,为MFG-E8作为一种功能性营养物质在预防和治疗老年性肌肉萎缩中的应用提供理论依据。通过体外细胞实验研究乳源MFG-E8对C2C12成肌细胞的增殖调控作用。通过MTT实验分析MFG-E8对C2C12成肌细胞活性的影响;通过荧光显微镜;透射电镜以及流式细胞仪进一步测定并分析了MFG-E8对C2C12细胞活性、细胞结构以及细胞周期的作用;采用qRT-PCR和Western Blot试验从分子水平上分析MFG-E8对MAPK信号通路中关键性调控因子表达的作用。基于体外细胞试验研究结果,从分子水平上证明了MFG-E8能够通过介导MAPK/ERK信号通路调控细胞周期促进C2C12细胞增殖。基于细胞试验的基础上,通过构建衰老肌肉萎缩大鼠模型进一步研究MFG-E8对大鼠肌肉萎缩的改善作用。利用D-半乳糖构建衰老SD大鼠肌肉萎缩模型,结果表明,D-半乳糖能够造成建模大鼠体重、脏器系数显着下降;比目鱼肌质量显着下降24.14%;血清中SOD含量显着下降28.10%、MDA含量显着上升38.54%,说明衰老大鼠肌肉萎缩模型构建成功。进一步探究MFG-E8对大鼠肌肉萎缩的改善作用,研究发现MFG-E8组的大鼠生理指标中比目鱼肌质量显着增加35.61%;血清生化指标中TG、MDA、NEFA含量分别显着下降44.83%,38.76%和51.50%;SOD含量显着上升32.31%;大鼠骨骼肌cyclin D1,cyclin E1的mRNA表达分别显着上调76%和98%;且ERK的磷酸化率显着升高34%,p38磷酸化率显着下降9%。基于体外细胞试验和体内大鼠试验从分子水平上证明了MFG-E8能够通过介导MAPK/ERK信号通路调控细胞周期促进衰老大鼠骨骼肌的再生作用,而MAPK/p38可能具有协同作用。
安志芳[9]（2019）在《高原鼢鼠p53基因对低氧的应答及对下游靶基因表达调控的特异性》文中研究表明高原鼢鼠（Myospalax baileyi）生活在海拔2 800 m-4 200 m的地区,是世居青藏高原的一种地下鼠,对严重的低氧环境有很强的适应性。p53是一个重要的肿瘤抑制因子,通过一系列下游靶基因调控细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复和血管生成等,对动物寿命和防癌具有重要的作用。为了进一步探讨高原鼢鼠对高海拔洞道严重低氧环境的适应机制,本文采用RT-PCR技术克隆得到了高原鼢鼠p53的编码区序列,利用生物信息学方法对p53及其下游细胞周期、细胞凋亡、DNA修复相关基因序列进行了进化特异性分析,并以SD大鼠为对照,研究了p53及其下游基因在不同海拔条件下（3 300 m和2 260 m）的表达模式。结果表明:（1）高原鼢鼠p53基因的编码区序列长1179bp,编码372个氨基酸残基。高原鼢鼠p53基因序列与编码的氨基酸序列与甘肃鼢鼠和以色列鼹鼠p53的同源性最高,分别为98.47%、98.98%和93.30%、95.41%;高原鼢鼠与甘肃鼢鼠、以色列鼹鼠、裸鼹鼠和大鼠p53氨基酸序列相比,分别有4、17、48和59处变异,其中在DNA结合域分别有2、3、12和16处变异;高原鼢鼠、甘肃鼢鼠、以色列鼹鼠和裸鼹鼠四种地下鼠中246号（相当于人的248号）和271号（相当于人的273号）位点的变异与人类p53热点突变一致;与甘肃鼢鼠、以色列鼹鼠和裸鼹鼠相比,高原鼢鼠309号位点的变异是其特有的变异位点。（2）高原鼢鼠肝脏、肺脏、胃、肠和骨骼肌组织中,p53的表达水平随着海拔的升高极显着升高（P<0.01）,而SD大鼠中不随海拔的改变发生变化（P>0.05）。（3）高原鼢鼠细胞周期、细胞凋亡和DNA修复相关基因的序列与以色列鼹鼠同源性最高,达到90%以上;高原鼢鼠细胞周期相关因子p21、CyclinD1、CyclinE、CyclinB1、细胞凋亡相关因子PIDD、PUMA、Apaf-1、IGFBP3、Bcl-2以及DNA修复相关的因子p48和p53R2与以色列鼹鼠存在明显的平行进化位点;SIFT评估发现p21和CyclinB1分别在27和105号位点的变异对其功能有显着影响,PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3分别在78、853、157、320和285号位点的变异对其功能有显着影响。（4）高原鼢鼠肝脏、肺脏和骨骼肌组织中,与细胞周期G1期调控相关的基因p21表达水平随海拔的升高极显着升高（P<0.01）;p21下游的基因在不同海拔条件下的表达模式具有组织特异性,在高原鼢鼠肝脏组织中,p21下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2的基因表达水平随海拔的升高显着降低（P<0.05）,在肺脏组织中CyclinD1、CDK6的表达水平随海拔的升高显着降低（P<0.05）,CyclinE和CDK2的表达水平不随海拔的变化发生变化（P>0.05）,在骨骼肌组织中p21下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达水平不随海拔的变化发生变化（P>0.05）;与G2期相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1在高原鼢鼠组织中不随海拔高度的变化发生明显的变化（P>0.05）。在SD大鼠组织中细胞周期相关基因的表达水平都不随海拔条件的改变发生变化（P>0.05）。（5）高原鼢鼠肝脏组织中,凋亡促进基因Bax、PUMA和Apaf-1的表达水平随着海拔的升高显着下降（P<0.05）;肺脏组织中,凋亡促进基因PIDD、Bax、PUMA和Apaf-1的表达水平随海拔的升高显着下降（P<0.05）;骨骼肌组织中,凋亡促进基因Fas、Bax、PUMA和Apaf-1基因的表达水平随着海拔的升高极显着下降（P<0.01）;在高原鼢鼠肝脏、肺脏和骨骼肌组织中,只有凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平随着海拔的升高其表达水平极显着升高（P<0.01）,并且Bcl-2/Bax比值随海拔的升高极显着上升（P<0.01）,而在SD大鼠中没有变化（P>0.05）。（6）高原鼢鼠肝脏、肺脏和骨骼肌组织中与DNA修复相关的基因p48和p53R2随着海拔的升高其表达水平极显着升高（P<0.01）,而在SD大鼠中没有变化（P>0.05）。以上结果提示,高原鼢鼠p53与其它地下鼠p53既有共同的变异位点,也有其特异的变异位点,物种亲缘关系越远,p53变异越大;高原鼢鼠p53与大鼠p53突变点差异大,说明生活环境对p53的变异有较大影响。低氧显着上调高原鼢鼠组织中p53的表达水平,而大鼠对环境氧浓度并不敏感。高原鼢鼠经过长期的低氧适应,通过上调p21基因的表达抑制下游基因的表达,可能导致细胞周期G1期阻滞,从而提供充足的时间修复受损的DNA,通过上调DNA修复基因p48和p53R2的表达对受损的DNA进行修复,提高DNA修复功能,保证DNA复制的准确性,这可能是地下鼠抗癌的共同特征;通过下调凋亡促进基因、上调凋亡抑制基因的表达抑制细胞凋亡,保证了细胞生存寿命,这可能与地下鼠的长寿有关。高原鼢鼠组织中细胞周期、细胞凋亡的调控不仅与基因的表达水平有关,而且可能与相关基因产物p21、CyclinB1、PIDD、PUMA、Apaf-1和IGFBP3结构发生变异有关,这些特征对高原鼢鼠适应低氧高二氧化碳的地下洞道生境具有重要的作用。
刘倩[10]（2018）在《苎麻对山羊胃肠道组织凋亡基因及蛋白表达的影响》文中进行了进一步梳理本研究以湘东黑山羊为研究对象,通过对山羊的日粮中添加不同水平的苎麻替代苜蓿（A、B、C、D替代比例依次为0%,35%,75%,100%）,对山羊的生长性能、消化代谢以及瘤胃发酵代谢指标进行测量,以得到日粮中苎麻替代苜蓿比例的适宜范围。在此基础上,获取山羊胃肠道组织,采用实时荧光定量PCR和蛋白印记等技术手段分别对内源性通路凋亡基因:Bcl-2,Bcl-xl,Bax,p53的mRNA表达水平和相应蛋白表达水平进行分析,以得到不同水平苎麻对胃肠道组织细胞中凋亡相关基因的mRNA表达及相应蛋白表达的影响,为反刍动物营养调控与应用提供技术支撑。在表观水平上,不同苎麻水平条件下,山羊的初始体重与试验结束时的体重没有显着的差异（P>0.05）。A、B与C三组间的增重、日增重没有显着差异（P>0.05）,但D组的增重与日增重显着低于其他三组（P<0.0001）。D组NDF摄入量显着低于A、B组（P<0.05）;D组P指标的摄入量显着高于A组（P<0.05）;C、D组Ash指标的粪便排泄量显着高于A组（P<0.05）;B、C、D组的Ca指标的粪便排泄量显着高于A组（P<0.05）;C、D组的CP消化率显着低于A组（P<0.05）;D组的NDF消化率显着低于A组（P<0.05）;B、C、D组的ADF、Ash、Ca消化率显着低于A组（P<0.05）;D组P消化率显着高于A组（P<0.05）。不同苎麻处理对DM、Energy、CP、ADF、Ash、Ca的摄入量均无显着影响（P>0.05）;不同苎麻处理对DM、Energy、CP、NDF以及P指标的粪便排泄量均无显着影响（P>0.05）;不同苎麻处理对DM以及Energy消化率均无显着影响（P>0.05）。在基因表达的mRNA水平上,在瘤胃中,与A组相比较,D组中Bcl-xl的mRNA表达显着上调（P=0.004）;D组相较于其它三组,Bax的mRNA表达显着上调（P=0.0007）;与C组相比较,D组Bcl-2/Bax的比值显着下调（P=0.02）;Bcl-2和p53在不同水平苎麻处理下mRNA表达差异均不显着（P>0.05）。在空肠中,相较于A,B两组,D组中p53的mRNA表达显着上调（P=0.01）;与C组相比较,D组中Bcl-2的mRNA表达有下调趋势（P=0.07）;与B组相比较,C,D两组中的Bcl-2/Bax的比值有下调趋势（P=0.06）;Bcl-xl和Bax在不同水平苎麻处理下mRNA表达差异均不显着（P>0.05）。在回肠中,Bcl-2基因、p53基因、Bcl-xl基因、Bax基因以及Bcl-2/Bax的值在不同苎麻处理组中的mRNA表达差异均不显着（P>0.05）。不同水平苎麻处理下Caspase-3酶活在瘤胃、空肠以及回肠中均无显着影响（P>0.05）。在基因表达的蛋白水平上,在瘤胃中,与B,C组相比较,D组Bcl-xl的蛋白表达显着下调（P=0.03）;D组Bax的蛋白表达较其它三组显着下调（P=0.002）。在空肠中,与A,C组相比较,B组p53的蛋白表达显着上调（P=0.001）;Bcl-2蛋白各苎麻处理组间的表达差异不显着（P>0.05）。根据试验结果,得出以下结论:（1）苎麻替代苜蓿比例不宜超过35%;（2）在基因表达的mRNA水平上,100%苎麻水平可能诱导瘤胃和空肠组织凋亡,造成组织损伤;（3）不同苎麻水平下的胃肠道凋亡通路可能不依赖于Caspase途径而由AIF（凋亡诱导因子）来实现;（4）在基因表达的蛋白水平上,100%苎麻水平可能影响瘤胃组织的凋亡水平,35%苎麻水平可能影响空肠组织的凋亡水平。
二、肝脏再生中凋亡的基因调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝脏再生中凋亡的基因调控（论文提纲范文）
（1）昼夜节律紊乱通过TGF-β1介导的细胞衰老影响肝损伤预后（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 节律紊乱小鼠模型的构建与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 D-Gal N/LPS急性肝损伤模型造模最适剂量探索 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于细胞衰老途径研究昼夜节律紊乱对小鼠急性肝损伤预后的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 TGF-β受体Ⅰ抑制剂LY2157299 对节律紊乱合并肝损伤的疗效研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝损伤后肝细胞再生机制及相关信号通路 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）红酵母红素对急性肝损伤的干预及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写符号 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 急性肝损伤概述 |
| 1.1.1 药物性肝损伤概述 |
| 1.1.2 化学性肝损伤概述 |
| 1.1.3 酒精性肝损伤概述 |
| 1.1.4 免疫性肝损伤概述 |
| 1.2 类胡萝卜素概述 |
| 1.2.1 红酵母红素概述 |
| 1.2.2 红酵母红素的生物利用 |
| 1.2.3 影响红酵母红素生物利用率的因素 |
| 1.3 类胡萝卜素纳米载体概述 |
| 1.3.1 生物聚合物纳米载体 |
| 1.3.2 脂质纳米载体 |
| 1.4 红酵母红素研究基础 |
| 1.5 论文立题背景及意义 |
| 1.6 论文的主要研究内容 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 研究思路 |
| 第二章 红酵母红素对H_2O_2致BRL细胞氧化损伤的干预作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞生长曲线的测定 |
| 2.3.3 不同H_2O_2 浓度损伤测定 |
| 2.3.4 红酵母红素作用浓度确定 |
| 2.3.5 BRL细胞氧化损伤模型建立 |
| 2.3.6 细胞形态学观察 |
| 2.3.7 红酵母红素干预BRL细胞损伤氧化酶系测定 |
| 2.3.8 荧光法(DCFH-DA)测定BRL细胞内ROS水平 |
| 2.3.9 免疫荧光法观察BRL细胞内线粒体及线粒体上SOD水平 |
| 2.3.10 荧光法测定BRL细胞线粒体膜电位 |
| 2.3.11 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 H_2O_2致BRL细胞氧化损伤模型建立 |
| 2.4.2 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞存活率的影响 |
| 2.4.3 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞内ROS的影响 |
| 2.4.4 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞内氧化酶系的影响 |
| 2.4.5 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞线粒体膜电位的影响 |
| 2.4.6 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞内SOD和线粒体的影响 |
| 2.4.7 红酵母红素干预对氧化受损BRL细胞形态的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 红酵母红素对四种急性肝损伤的干预作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物分组与饲养方法 |
| 3.3.2 不同急性肝损伤模型的建立与红酵母红素的干预 |
| 3.3.3 急性肝损伤模型小鼠肝重比测定 |
| 3.3.4 急性肝损伤模型小鼠血清中肝功能相关酶活性测定 |
| 3.3.5 急性肝损伤模型小鼠肝脏中氧化酶系水平测定 |
| 3.3.6 急性肝损伤模型小鼠肝脏中炎症因子水平测定 |
| 3.3.7 急性肝损伤模型小鼠肝脏HE染色组织学评价 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 红酵母红素干预对四种急性肝损伤模型小鼠肝重比的影响 |
| 3.4.2 红酵母红素干预对四种急性肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST活性的影响 |
| 3.4.3 红酵母红素干预对四种急性肝损伤模型小鼠肝脏中氧化指标的影响 |
| 3.4.4 红酵母红素干预对四种急性肝损伤模型小鼠肝脏中炎症因子水平的影响 |
| 3.4.5 红酵母红素干预对四种急性肝损伤模型小鼠肝脏病理变化的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 红酵母红素对H_2O_2致BRL细胞氧化损伤的干预机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 红酵母红素干预BRL氧化损伤细胞模型建立 |
| 4.3.2 细胞总RNA提取 |
| 4.3.3 转录组高通量测序 |
| 4.3.4 细胞蛋白质提取 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 转录组样本聚类分析 |
| 4.4.2 红酵母红素干预对于H_2O_2致BRL细胞损伤基因影响 |
| 4.4.3 通过GO富集分析干预组与模型组DEGs的功能 |
| 4.4.4 通过KEGG信号通路富集分析干预组与模型组DEGs的功能 |
| 4.4.5 红酵母红素干预对氧化损伤BRL细胞中凋亡通路相关蛋白影响 |
| 4.4.6 红酵母红素干预对氧化损伤BRL细胞中PI3K/Akt相关信号通路影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 红酵母红素对四种急性肝损伤的干预机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 红酵母红素干预四种急性肝损伤模型的建立 |
| 5.3.2 小鼠肝脏细胞总RNA提取 |
| 5.3.3 转录组高通量测序 |
| 5.3.4 肝脏组织蛋白提取 |
| 5.3.5 Western blot分析 |
| 5.3.6 数据统计与分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 转录组样本聚类分析 |
| 5.4.2 红酵母红素干预对于四种急性肝损伤模型小鼠基因影响 |
| 5.4.3 红酵母红素干预组与模型组差异表达基因GO富集分析 |
| 5.4.4 四种急性肝损伤模型中干预组与模型组差异表达基因KEGG代谢通路富集分析 |
| 5.4.5 红酵母红素干预对不同急性肝损伤小鼠肝脏内PI3K/Akt/m TOR和 Nrf2/HO-1/NF-κB信号通路的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 红酵母红素纳米乳液载体化对急性肝损伤干预效果的影响和机制研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 红酵母红素纳米乳液制备 |
| 6.3.2 体外模拟消化模型建立 |
| 6.3.3 不同形式载体下红酵母红素体外生物可给率测定 |
| 6.3.4 红酵母红素载体体外脂肪酸释放速度测定 |
| 6.3.5 荧光法观察不同红酵母红素载体体外消化过程中的形态变化 |
| 6.3.6 红酵母红素体内消化相关模型建立 |
| 6.3.7 红酵母红素提取与HPLC测定 |
| 6.3.8 红酵母红素纳米乳液干预急性肝损伤模型建立 |
| 6.3.9 各模型小鼠血清中肝功能相关酶活性测定 |
| 6.3.10 各模型小鼠肝脏中氧化酶系水平测定 |
| 6.3.11 各模型小鼠肝脏中炎症因子水平测定 |
| 6.3.12 数据统计与分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 红酵母红素纳米乳液粒径及Zeta结果 |
| 6.4.2 红酵母红素纳米乳液在模拟小肠中脂肪酸释放率结果 |
| 6.4.3 红酵母红素纳米乳液对模拟肠道消化中生物可给率的影响 |
| 6.4.4 红酵母红素纳米乳液在体外消化过程中的微观机构变化 |
| 6.4.5 不同载体中红酵母红素在小鼠小肠内吸收情况 |
| 6.4.6 不同载体中红酵母红素在小鼠血清情况 |
| 6.4.7 不同载体对红酵母红素在小鼠肝脏中积累情况的影响 |
| 6.4.8 不同载体对红酵母红素在小鼠肝脏中长期积累情况的影响 |
| 6.4.9 不同载体对红酵母红素干预急性肝损伤效果的影响 |
| 6.5 结果与讨论 |
| 主要结果与展望 |
| 主要结果 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）MicroRNA-143-5p调控AMPK通路在颈椎间盘退行性变中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词语 |
| 引言 |
| 第一部分 椎间盘退行性变的病理改变及miRNA基因表达筛查 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验主要试剂 |
| 2.2 实验主要仪器和设备 |
| 2.3 组织样本 |
| 2.4 实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 椎间盘退行性与正常组患者的椎间盘组织的病理结果 |
| 3.2 miRNA测序质量评估结果 |
| 3.3 miRNA数据分析结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 miRNA-143-5p通过AMPK介导颈椎间盘退行性变 |
| 1.前言 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 病理检查: |
| 2.2 免疫组化 |
| 2.3 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.实验结果 |
| 3.1 退变组较正常组的p-AMPK蛋白值显着增加,总AMPK两组蛋白表达变化不变 |
| 3.2 WB法显示AMPK下游EEF2 值显着降低 |
| 3.3 免疫组化法显示AMPK下游EEF2 值显着降低 |
| 4.讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 微小RNA(microRNA)在椎间盘退变的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
（4）Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文创新点 |
| Sigma1R 对大鼠脊髓运动神经元的功能影响 |
| 第一章 背景概述 |
| 1.1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症概述 |
| 1.2 Sigma1R概述 |
| 1.2.1 Sigma1R的发现及其分子药理学特征 |
| 1.2.2 Sigma1R的结构和定位 |
| 1.2.3 Sigma1R的分子功能 |
| 1.2.4 Sigma1R作为配体伴侣 |
| 1.2.5 Sigma1R的人类遗传学研究 |
| 1.3 Sigma1R与神经退行性疾病 |
| 1.4 ALS与脊髓运动神经元 |
| 1.5 转录组分析 |
| 1.6 电生理记录在研究神经元特性中的应用 |
| 1.6.1 动作电位 |
| 1.6.2 mEPSC微小兴奋性突触后电流 |
| 1.7 神经元功能与神经元膜表面各种通道的关系 |
| 第二章 Sigma1R敲除影响脊髓运动神经元的转录组分析及验证 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制和用具预处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠组织样本转录组测序分析 |
| 2.2.2 大鼠脊髓组织实时荧光定量PCR |
| 2.3 分析结果 |
| 2.3.1 数据产出及质控 |
| 2.3.2 差异基因分析 |
| 2.3.3 上调基因功能注释 |
| 2.3.4 下调基因功能注释 |
| 2.3.5 Quantitative Real-time PCR验证 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 上调基因的KEGG富集功能促进神经损伤 |
| 2.4.2 下调基因的KEGG富集功能影响神经的兴奋和抑制过程 |
| 2.4.3 上调基因的GO富集功能增强神经元和外周神经发育 |
| 2.4.4 下调基因的GO富集功能影响神经递质水平和突触功能 |
| 第三章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及分组 |
| 3.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验动物的基因组提取 |
| 3.2.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元数量的影响 |
| 3.2.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性突触数量的影响 |
| 3.2.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元数量和面积都存在变化 |
| 3.3.2 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元胞体兴奋性突触数量存在变化 |
| 3.3.3 Sigma1R敲除对脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元电生理学功能特性的影响 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物及分组 |
| 4.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 4.1.3 实验所需试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 大鼠脊髓脑片的制备和细胞活力评估 |
| 4.3.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的基本电生理性质的影响 |
| 4.3.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元动作电位的影响 |
| 4.3.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性特性的影响 |
| 4.3.5 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触后电流(PSC)的影响 |
| 4.3.6 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元m EPSC的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 肝细胞癌中SNHG1 的表达和基因调控网络的研究 |
| 第五章 背景概述 |
| 5.1 肝癌概述 |
| 5.1.1 肝癌的形成机制 |
| 5.1.2 肝癌相关的部分基因 |
| 5.1.3 肝癌的筛查 |
| 5.1.4 肝癌的治疗 |
| 5.2 肝癌发生与miRNA |
| 5.2.1 微小RNA |
| 5.2.2 miRNA沉默基因表达的机制 |
| 5.2.3 miRNA参与癌症发生的机制 |
| 第六章 肝细胞癌中SNHG1 的表达研究 |
| 引言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要数据库 |
| 6.1.2 主要软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 数据下载和组织 |
| 6.2.2 基因表达分析 |
| 6.2.3 功能分析 |
| 6.2.4 代谢通路分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 RNA在 HCC中的表达 |
| 6.3.2 差异表达基因的功能注释和富集分析 |
| 6.3.3 差异表达基因的功能调控网络 |
| 6.3.4 肝癌中差异表达基因所影响的代谢通路 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 肝细胞癌中SNHG1 的基因调控网络的研究 |
| 引言 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要数据库 |
| 7.1.2 主要软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 数据下载和组织 |
| 7.2.2 ceRNA网络分析 |
| 7.2.3 单变量生存分析 |
| 7.2.4 单细胞分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 肝癌中的生物相互作用网络 |
| 7.3.2 肝细胞癌共表达基因的单因素生存分析 |
| 7.3.3 血管内皮细胞和巨噬细胞SNHG1 相关mRNA的表达 |
| 7.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞凋亡及其涉及的代谢通路 |
| 1.1.1 细胞凋亡及其主要凋亡途径 |
| 1.1.2 细胞凋亡涉及的细胞代谢 |
| 1.2 BCL2家族研究进展 |
| 1.2.1 BCL2家族第一个成员的发现及其保守的特点 |
| 1.2.2 BCL2家族成员的扩增 |
| 1.2.3 BCL2家族成员之间结构基础及其互作关系 |
| 1.2.4 效应者BAX和 BAK1 对线粒体外膜的作用 |
| 1.2.5 细胞凋亡在人体系统稳态维持方面发挥重要作用 |
| 1.2.6 BCL2家族蛋白在肿瘤中扮演的角色 |
| 1.3 泛肿瘤研究 |
| 1.3.1 泛肿瘤研究趋势 |
| 1.3.2 泛妇科肿瘤的分子特征研究 |
| 1.4 本论文研究方法 |
| 1.4.1 使用c Bio Portal分析多种分子特征 |
| 1.4.2 使用GEPIA分析m RNA表达 |
| 1.4.3 调控网络分析方法 |
| 1.5 本论文研究的主要内容、目的和意义 |
| 第二章 BCL2 家族在妇科肿瘤中的突变、m RNA表达、免疫组化及其预后分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 BCL2家族成员之间的系统发育关系分析 |
| 2.2.2 BCL2 家族成员在妇科肿瘤中的突变频率及肿瘤样本间m RNA表达水平分析 |
| 2.2.3 BCL2 家族在妇科肿瘤中相对于正常样本的m RNA表达水平分析 |
| 2.2.4 预后分析 |
| 2.2.5 免疫组化分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 BCL2家族成员名称的规范和统一 |
| 2.3.2 BCL2家族成员之间的系统发育关系 |
| 2.3.3 BCL2家族成员在妇科肿瘤中的突变频率 |
| 2.3.3.1 乳腺癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.2 宫颈癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.3 子宫肉瘤样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.3 子宫内膜癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.3.4 卵巢癌样本的突变频率及其肿瘤样本的mRNA表达水平比较 |
| 2.3.4 BCL2 家族在妇科肿瘤中相对于正常样本的m RNA表达水平 |
| 2.3.5 BCL2家族在妇科肿瘤中的预后分析 |
| 2.3.6 BCL2家族在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.1 BCL2L1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.2 BAD蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.3 PMAIP1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.4 BAK1蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.5 BIK蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.3.6.6 BID蛋白在妇科肿瘤中的免疫组化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 BCL2家族在妇科肿瘤中的表观调控规律 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 BCL2 家族启动子甲基化和m RNA相关关系分析 |
| 3.2.2 活跃染色质和组蛋白修饰信号的数据收集 |
| 3.2.3 Ch IP-seq数据分析流程 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BCL2 家族m RNA的表达和启动子区域的甲基化程度呈负相关 |
| 3.3.2 基因组的染色质活跃程度与组织特异性 |
| 3.3.3 基因组的染色质活跃程度与mRNA表达水平正相关 |
| 3.3.4 染色质开放区域和组蛋白修饰信号的重叠 |
| 3.3.5 BCL2家族成员的增强子信号及其特点 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 BCL2家族在妇科肿瘤中的调控网络研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 BCL2家族在乳腺癌中的调控网络 |
| 4.3.2 BCL2家族在宫颈内膜腺癌中的调控网络 |
| 4.3.3 BCL2家族在子宫内膜癌中的调控网络 |
| 4.3.4 BCL2家族在子宫肉瘤的调控网络 |
| 4.3.5 BCL2家族在卵巢癌的调控网络 |
| 4.3.6 BCL2家族在妇科肿瘤的调控网络中出现共突变信号 |
| 4.3.7 BCL2家族在妇科肿瘤中预测的调控模型 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 本论文主要结论 |
| 本论文创新点 |
| 本论文的局限与展望 |
| 参考文献 |
| 附录:ChIP-seq数据分析脚本编写 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 PXR在急性肾损伤患者肾组织中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 PXR在肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 AKR1B7 介导PXR在急性肾损伤中的保护作用及其机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 研究创新与不足 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩略词 |
| 综述 孕烷X受体的生物学功能与疾病进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（7）海豚链球菌诱导的牙鲆microRNA表达、调控及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 MicroRNA研究进展 |
| 1.1.1 MiRNA的发现 |
| 1.1.2 MiRNA的合成途径 |
| 1.1.3 MiRNA的作用机制 |
| 1.1.4 宿主miRNA介导的免疫防御和对微生物感染进程的影响 |
| 1.1.5 MiRNA的临床应用 |
| 1.1.6 MiRNA在水产病害中的研究进展 |
| 1.2 海豚链球菌研究进展 |
| 1.2.1 海豚链球菌的病原学基本特征 |
| 1.2.2 海豚链球菌的地域分布 |
| 1.2.3 海豚链球菌的宿主范围 |
| 1.2.4 海豚链球菌感染的防控 |
| 1.3 双重特异性磷酸酶6(dual-specificityphosphatases6,Dusp6)的研究进展 |
| 1.3.1 MAPK信号通路 |
| 1.3.2 Dusp6与MAPKs |
| 1.3.3 Dusp6 与疾病治疗 |
| 1.3.4 Dusp6 在水生生物中的研究进展 |
| 1.4 Fas凋亡抑制分子(Fas apoptotic inhibitory molecule,FAIM)研究进展 |
| 1.4.1 细胞凋亡 |
| 1.4.2 FAIM |
| 1.4.3 FAIM与疾病治疗 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第2章 海豚链球菌感染条件下牙鲆miRNA表达谱的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 感染实验和样品采集 |
| 2.1.3 MiRNA文库建立和高通量测序 |
| 2.1.4 MiRNA测序数据分析 |
| 2.1.5 MiRNA靶基因预测 |
| 2.1.6 反转录荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 感染和未感染海豚链球菌牙鲆的miRNAs鉴定 |
| 2.2.2 海豚链球菌感染条件下牙鲆miRNAs的差异表达 |
| 2.2.3 差异表达miRNAs的 qRT-PCR验证 |
| 2.2.4 DEmiRNAs靶基因预测和富集性分析 |
| 2.3 讨论和结论 |
| 第3章 pol-3p-10740_175 对靶基因的调控及对海豚链球菌侵染的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 感染实验 |
| 3.1.3 qRT-PCR |
| 3.1.4 MiRNA模拟物(mimic) |
| 3.1.5 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.1.6 海豚链球菌的细胞感染实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 海豚链球菌感染对pol-3p-10740_175 预测靶基因表达的影响 |
| 3.2.2 pol-3p-10740_175对Dusp6 的调控作用 |
| 3.2.3 pol-3p-10740_175 对海豚链球菌感染的影响 |
| 3.3 讨论和结论 |
| 第4章 pol-miR-216b的靶基因鉴定及分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 感染实验 |
| 4.1.3 qRT-PCR |
| 4.1.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 4.1.5 PoFAIM1 的序列分析 |
| 4.1.6 PoFAIM1的RNA干扰 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 海豚链球菌和细胞肿大病毒感染对牙鲆pol-miR-216b和 PoFAIM1表达的影响 |
| 4.2.2 pol-miR-216b与 PoFAIM1 3’UTR的相互作用 |
| 4.2.3 PoFAIM1 序列分析 |
| 4.2.4 PoFAIM1 体内表达干扰 |
| 4.3 讨论和结论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 实验用溶液配制方法 |
| 附录二 实验用仪器 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）乳源MFG-E8介导MAPK信号通路调控及对衰老大鼠肌肉再生作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 肌肉萎缩研究进展 |
| 1.2.1 肌肉萎缩概述 |
| 1.2.2 肌肉萎缩的临床表现及其危害 |
| 1.2.3 肌肉萎缩的治疗研究进展 |
| 1.3 骨骼肌再生研究进展 |
| 1.3.1 肌肉再生概述 |
| 1.3.2 肌肉再生的分子机制 |
| 1.3.3 MAPK信号通路对C_2C_(12)成肌细胞的作用 |
| 1.3.4 肌肉再生的营养调控 |
| 1.4 MFG-E8的来源及其在肌肉再生中的作用 |
| 1.4.1 MFG-E8的来源与分布 |
| 1.4.2 MFG-E8在肌肉再生中的作用 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料和设备 |
| 2.1.1 主要原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞培养方法 |
| 2.2.1 试剂配方 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.3 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞的增殖调控作用 |
| 2.3.1 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞的增殖作用 |
| 2.3.2 MFG-E8对MAPK信号通路关键蛋白表达的调控作用 |
| 2.3.3 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞的修复作用 |
| 2.3.4 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞ERK信号通路和细胞周期相关基因mRNA表达的调控 |
| 2.4 MFG-E8对老年性大鼠肌肉萎缩的改善作用 |
| 2.4.1 实验动物与饲养条件 |
| 2.4.2 衰老性肌肉萎缩大鼠模型构建 |
| 2.4.3 MFG-E8对衰老大鼠骨骼肌萎缩的再生作用 |
| 2.4.4 大鼠脏器指标检测 |
| 2.4.5 大鼠生理指标检测 |
| 2.4.6 MFG-E8对衰老大鼠肌肉形态学的影响 |
| 2.4.7 MFG-E8对衰老模型大鼠MAPK和细胞周期相关蛋白mRNA表达的调控 |
| 2.4.8 MFG-E8对衰老模型大鼠MAPK信号通路蛋白表达的调控 |
| 2.5 数据处理 |
| 第3章 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞的增殖调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞活性作用 |
| 3.2.1 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞的增殖作用 |
| 3.2.2 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞的凋亡作用 |
| 3.2.3 MFG-E8对C_2C_(12)成肌细胞生长周期的影响 |
| 3.3 MFG-E8对MAPK信号通路中关键蛋白活化磷酸化作用 |
| 3.3.1 ERK信号通路中关键蛋白活化磷酸化作用 |
| 3.3.2 JNK信号通路中关键蛋白活化磷酸化作用 |
| 3.3.3 p38信号通路中关键蛋白活化磷酸化作用 |
| 3.4 MFG-E8介导的ERK信号通路对C_2C_(12)成肌细胞增殖作用 |
| 3.4.1 抑制剂U0126对MAPK/ERK信号通路的阻断和细胞损伤 |
| 3.4.2 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞的修复作用 |
| 3.4.3 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞的增殖作用 |
| 3.4.4 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞生长周期的影响 |
| 3.4.5 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞结构的影响 |
| 3.5 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞修复的作用机制 |
| 3.5.1 MFG-E8对损伤C_2C_(12)成肌细胞MAPK/ERK信号通路关键基因的调控作用 |
| 3.5.2 MFG-E8对C_2C_(12)细胞ERK蛋白表达的调控作用 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 MFG-E8对老年性大鼠肌肉萎缩改善作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 衰老大鼠肌肉萎缩模型的构建 |
| 4.2.1 D-半乳糖用药时间对大鼠体重和生长状态的影响 |
| 4.2.2 肌肉萎缩模型鼠的脏器指标 |
| 4.2.3 肌肉萎缩模型鼠的生理指标 |
| 4.2.4 肌肉萎缩模型鼠的生化指标 |
| 4.2.5 肌肉萎缩模型鼠肌肉形态的变化 |
| 4.3 MFG-E8对衰老大鼠肌肉生成量的影响 |
| 4.3.1 MFG-E8对衰老大鼠体征的影响 |
| 4.3.2 大鼠脏器指标的变化 |
| 4.3.3 大鼠生理指标的变化 |
| 4.3.4 MFG-E8对衰老大鼠生化指标的影响 |
| 4.3.5 MFG-E8对衰老大鼠肌肉组织形态的影响 |
| 4.4 MFG-E8对衰老大鼠肌肉再生作用的分子机制 |
| 4.4.1 MAPK信号通路关键基因的表达量 |
| 4.4.2 成肌细胞生长调控基因的表达 |
| 4.4.3 MAPK信号通路关键蛋白活化磷酸化的表达 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
（9）高原鼢鼠p53基因对低氧的应答及对下游靶基因表达调控的特异性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 青藏高原 |
| 1.1.1 青藏高原自然环境 |
| 1.1.2 高原低氧环境对人和动物的影响及其适应 |
| 1.2 地下鼠及其对低氧环境的适应 |
| 1.2.1 地下鼠及其生境特点 |
| 1.2.2 地下鼠对地下洞道生境的适应 |
| 1.2.3 高原鼢鼠及其生境特征 |
| 1.2.4 高原鼢鼠对地下低氧环境的适应 |
| 1.2.5 地下鼠长寿抗癌的机制 |
| 1.3 p53 |
| 1.3.1 p53及其结构 |
| 1.3.2 p53功能 |
| 1.3.3 p53突变 |
| 1.3.4 低氧与p53 |
| 1.3.5 地下鼠与p53 |
| 1.4 本论文的主要科学问题、研究内容、目的及意义 |
| 1.4.1 本论文的主要科学问题 |
| 1.4.2 本论文的研究内容 |
| 1.4.3 本论文的目的及意义 |
| 第二章 高原鼢鼠p53基因的克隆及其对不同低氧环境的应答 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 高原鼢鼠p53基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.2 高原鼢鼠p53变异位点分析 |
| 2.2.3 物种树的构建 |
| 2.2.4 高原鼢鼠p53选择压力分析 |
| 2.2.5 高原鼢鼠p53序列进化分析 |
| 2.2.6 高原鼢鼠p53变异位点对其功能影响的评估 |
| 2.2.7 不同海拔条件下高原鼢鼠和SD大鼠组织中p53表达水平 |
| 2.2.8 HIF-1α 与p53结合位点比对分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 高原鼢鼠p53下游细胞周期相关基因的进化和表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 高原鼢鼠细胞周期相关基因序列获取 |
| 3.1.3 高原鼢鼠细胞周期相关基因序列分析 |
| 3.1.4 高原鼢鼠细胞周期相关基因选择压力、进化分析 |
| 3.1.5 高原鼢鼠细胞周期相关基因变异位点对其功能影响的评估 |
| 3.1.6 表达水平测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 高原鼢鼠细胞周期相关基因序列分析及同源性比对 |
| 3.2.2 高原鼢鼠细胞周期相关基因选择压力分析 |
| 3.2.3 高原鼢鼠细胞周期相关基因序列进化分析 |
| 3.2.4 高原鼢鼠细胞周期相关基因序列变异位点对其功能影响的评估 |
| 3.2.5 高原鼢鼠和SD大鼠肝脏组织中细胞周期基因表达水平 |
| 3.2.6 高原鼢鼠和SD大鼠肺脏组织中细胞周期基因表达水平 |
| 3.2.7 高原鼢鼠和SD大鼠骨骼肌组织中细胞周期基因表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 高原鼢鼠p53下游细胞凋亡相关基因的进化和表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因序列获取 |
| 4.1.3 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因序列分析 |
| 4.1.4 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因选择压力、进化分析 |
| 4.1.5 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因变异位点对其功能影响的评估 |
| 4.1.6 表达水平测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因序列分析及同源性比对 |
| 4.2.2 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因选择压力分析 |
| 4.2.3 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因序列进化分析 |
| 4.2.4 高原鼢鼠细胞凋亡相关基因序列变异位点对其功能影响的评估 |
| 4.2.5 高原鼢鼠和SD大鼠组织中细胞凋亡基因表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 高原鼢鼠p53下游DNA修复相关基因的进化和表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 高原鼢鼠DNA修复相关基因序列获取 |
| 5.1.3 高原鼢鼠DNA修复相关基因序列分析 |
| 5.1.4 高原鼢鼠DNA修复相关基因选择压力、进化分析 |
| 5.1.5 高原鼢鼠DNA修复相关基因变异位点对其功能影响的评估 |
| 5.1.6 表达水平测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 高原鼢鼠DNA修复相关基因序列分析及同源性比对 |
| 5.2.2 高原鼢鼠DNA修复相关基因选择压力分析 |
| 5.2.3 高原鼢鼠DNA修复相关基因序列进化分析 |
| 5.2.4 高原鼢鼠DNA修复相关基因序列变异位点对其功能影响的评估 |
| 5.2.5 高原鼢鼠和SD大鼠组织中DNA修复基因表达水平 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 论文的不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）苎麻对山羊胃肠道组织凋亡基因及蛋白表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 苎麻的研究进展 |
| 1.1 饲用苎麻的研究进展 |
| 1.2 苎麻饲喂动物试验效果 |
| 1.3 饲用苎麻的质量评定标准 |
| 1.4 苎麻的营养特性与抗营养特性 |
| 1.5 苎麻的其它作用 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 细胞凋亡及其在反刍动物上的研究进展 |
| 2.1 细胞凋亡的生理意义 |
| 2.2 细胞凋亡的国内外进展 |
| 2.2.1 细胞凋亡的发生过程和通路途径研究 |
| 2.2.2 细胞凋亡的相关蛋白调控研究 |
| 2.3 细胞凋亡在反刍动物中的研究与应用 |
| 2.3.1 细胞凋亡对反刍动物繁殖类细胞影响的研究与应用 |
| 2.3.2 细胞凋亡对反刍动物瘤胃上皮细胞的影响 |
| 2.3.3 细胞凋亡对反刍动物肝和肾脏功能的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第3章 苎麻对山羊营养消化代谢指标的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验设计 |
| 3.1.2 动物的饲养管理 |
| 3.1.3 试验操作过程 |
| 3.1.4 测定指标与方法 |
| 3.1.5 数据统计 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同苎麻水平对山羊生长性能的影响 |
| 3.2.2 不同苎麻水平对山羊消化代谢的影响 |
| 3.2.3 不同苎麻水平对山羊瘤胃发酵特性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 苎麻对山羊胃肠道组织凋亡相关基因表达影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验设计 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 不同苎麻替代比例对山羊胃肠道凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.1.4 数据统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同苎麻替代苜蓿比例在瘤胃中凋亡相关基因的表达 |
| 4.2.2 不同苎麻替代苜蓿比例在空肠中凋亡相关基因的表达 |
| 4.2.3 不同苎麻替代苜蓿比例在回肠中凋亡相关基因的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 苎麻对山羊胃肠道组织凋亡相关蛋白表达影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验设计 |
| 5.1.2 山羊胃肠道组织样品的采集 |
| 5.1.3 主要仪器与试剂 |
| 5.1.4 样品准备 |
| 5.1.5 蛋白浓度测定 |
| 5.1.6 Western Blotting |
| 5.1.7 Caspase-3 酶活的测定 |
| 5.1.8 数据统计 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同苎麻处理对Caspase-3 基因表达的影响 |
| 5.2.2 不同苎麻替代苜蓿比例在瘤胃中凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.2.3 不同苎麻替代苜蓿比例在空肠中凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论与建议 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 个人简历 |
四、肝脏再生中凋亡的基因调控（论文参考文献）
- [1]昼夜节律紊乱通过TGF-β1介导的细胞衰老影响肝损伤预后[D]. 欧伟杰. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]红酵母红素对急性肝损伤的干预及作用机制研究[D]. 李佳益. 江南大学, 2021(01)
- [3]MicroRNA-143-5p调控AMPK通路在颈椎间盘退行性变中的作用及机制研究[D]. 胡海权. 南昌大学, 2021(01)
- [4]Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究[D]. 郑超然. 武汉大学, 2021(02)
- [5]基于多组学大数据的妇科和乳腺癌BCL2家族分子变化模式及其分子网络研究[D]. 王家坚. 华南理工大学, 2020(05)
- [6]PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究[D]. 孟霞. 南京医科大学, 2020(06)
- [7]海豚链球菌诱导的牙鲆microRNA表达、调控及功能研究[D]. 刘爽. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [8]乳源MFG-E8介导MAPK信号通路调控及对衰老大鼠肌肉再生作用[D]. 关凯方. 哈尔滨工业大学, 2019(02)
- [9]高原鼢鼠p53基因对低氧的应答及对下游靶基因表达调控的特异性[D]. 安志芳. 青海大学, 2019(05)
- [10]苎麻对山羊胃肠道组织凋亡基因及蛋白表达的影响[D]. 刘倩. 赣南师范大学, 2018(01)