一、吡喹酮氯仿油制剂治疗山羊日本血吸虫病研究（论文文献综述）
岳永程[1]（2021）在《东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究》文中指出东毕吸虫病是由东毕属的六种虫体引起的一种人畜共患寄生虫病。在中国,主要流行的是土耳其斯坦东毕吸虫,成虫主要寄生在羊和牛的肠系膜静脉和肝门静脉中,病变主要发生在肝脏组织。东毕吸虫寄生在牛羊等终末宿主的血管中,虫体自身需要氧化还原酶来抵抗宿主免疫系统或代谢产生的活性氧自由基（ROS）,而东毕吸虫没有Trx和Grx这两种相互独立的系统,取而代之的是一种多功能酶——硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR）系统,该酶具有硫氧还蛋白还原酶（Trx R）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷氧还蛋白（Grx）三种酶活性。鉴于这种独特性质,对寄生蠕虫TGR的研究受到寄生虫学者们的高度重视。本研究以常用的实验动物作为东毕吸虫的终末宿主,对其感染情况进行了探索。在实验室条件下,成功以山羊作为终末宿主维持东毕吸虫生活史循环;在大鼠和豚鼠体内可以获得虫体,但虫体发育迟缓;在小鼠和东方田鼠体内收集不到成虫。在兔子体内可以获得90-120天、发育成熟的虫体,并可用于后续实验;但180天后虫体发育受阻。利用PCR技术从东毕吸虫cDNA中扩增得到TGR基因的ORF序列,并将大肠杆菌含有的硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）插入到东毕吸虫TGR开放阅读框的末端。构建重组原核表达质粒p ET-28a（+）-Ot TGR和p ET-28a（+）-Ot TGRsec,并在在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过His-tag蛋白纯化磁珠对重组表达蛋白r Ot TGRsec和r Ot TGR进行纯化。将纯化的r Ot TGRsec蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用制备的抗体进行蛋白免疫印迹实验和免疫组织化学实验。实验结果表明,在大肠杆菌BL21（DE3）中,r Ot TGR以可溶性蛋白和包涵体形式表达,而r Ot TGRsec主要以可溶性蛋白的形式表达。制备得到了抗r Ot TGRsec的多克隆抗体,Western blotting的结果显示,可以检测到虫体蛋白中Ot TGRsec的存在,免疫组织化学结果显示,该蛋白在虫体中广泛分布,主要集中在虫体体被,其他组织有部分分布。通过TrxR、GR、Grx三种酶活性的检测体系,检测并计算了rOtTGRsec的Trx R、GR和Grx的酶活性。酶活性检测结果显示,r Ot TGRsec的Trx R酶活性为12.30±1.63 U/m L,GR酶活性为8.83±3.15 U/m L,Grx酶活性为0.31±0.07 U/m L。研究了Furoxan衍生物对r Ot TGRsec蛋白Trx R酶活性的抑制作用。利用实验室前期筛选的、对日本血吸虫、大片形吸虫TGR具有较好抑制效果的三种Furoxan衍生物LGM-35、ZWJ-19和CH-33,检测了其对东毕吸虫TGR酶Trx R活性的抑制作用,通过RNA干扰技术对东毕吸虫TGR基因进行了体外干扰,利用实时定量PCR和Western blot,比较分析了不同si RNA分子对该基因的体外干扰效果。结果显示,6个si RNA产生了不同的干扰效果,该基因的转录水平最高可降低46.1%,蛋白表达可降低30.6%。同时对不同浓度LGM-35的体外杀虫效果进行了观察和评价。实验结果表明,LGM-35对东毕吸虫具有一定的杀伤效果,当浓度为400m M,作用96 h后,杀虫效果可达100%,该结果略差于其对日本血吸虫的体外杀虫效果。本研究在实验室条件下维持了东毕吸虫的生活史循环,并对东毕吸虫TGR基因的生物学功能进行了初步研究,为后续开展东毕吸虫的实验室研究及以Ot TGR为靶标研制新的抗东毕吸虫药物奠定了基础。
黄文铃[2]（2020）在《日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析》文中提出血吸虫病是一种流行甚广、危害严重的人畜共患病。抗血吸虫病疫苗的研制对预防血吸虫病发挥重要作用。研究发现,血吸虫肺期童虫是宿主免疫攻击的主要靶标,其抗原分子被视为最佳的疫苗候选因子。本实验室前期研究已经筛选出腺苷酸激酶1（AK1）、组织蛋白酶L3（CL3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等105个在宿主因子影响下呈差异表达的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j）肺期童虫基因,其中SjAK1基因表达的重组蛋白可诱导50%的减虫率与40%的减卵率,但SjCL3与SjGAPDH基因的功能目前尚不明确。为此,本研究克隆表达了SjCL3与SjGAPDH,观察其在日本血吸虫不同发育时期的表达及其水平以及组织学定位,研究其单独及联合免疫对小鼠抗日本血吸虫感染的能力与可能的机制,探索其在免疫逃避及I型糖尿病治疗中的作用,为探索血吸虫与宿主的相互作用关系、抗虫靶点及血吸虫病疫苗研究增添了新内容,不仅既有理论意义,也具有现实意义。SjCL3与SjGAPDH基因经克隆表达后发现,rSjCL3与rSjGAPDH均为具活性的蛋白,酶活性分别为26822 U/g与3220 U/g;将重组蛋白分别免疫新西兰大白兔后,获得的多克隆抗血清anti-rSjCL3与anti-rSjGAPDH抗体滴度分别为1:160000与1:320000。免疫荧光化学结果显示,SjCL3主要定位于虫卵卵壳、消化道、虫体体被以及部分肌肉层;SjGAPDH主要定位于虫卵卵壳、虫体体被及绝大部分肌肉层。荧光定量PCR结果发现,SjCL3及SjGAPDH在血吸虫的各个发育阶段均有表达,其中SjCL3在虫卵中表达水平最高,在10天童虫中最低;SjGAPDH的表达水平在雄虫中最高,在18天童虫中最低。将rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,可诱导小鼠分别产生30.5%、37.8%、65.6%的减虫率与31.7%、38.1%、70.9%的减卵率,其肝脏肉芽肿面积减少率分别为29.5%、41.1%、74.6%,肝纤维化面积减少率分别为35.4%、52.4%、76%;但若无弗氏佐剂的作用,rSjCL3与rSjGAPDH联合免疫仅可诱导小鼠产生12.1%的减虫率与14.2%的减卵率,提示:rSjCL3不能发挥佐剂样作用。流式细胞术结果显示,rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,其Tregs百分率分别为3.94%、3.68%、2.61%,与弗氏佐剂对照组比较,联合免疫组Tregs百分率下降显着（P<0.05）;ELISA结果发现,3组小鼠的血清IgG1/IgG2a比值分别为0.8、0.71、0.48,均<1,表明免疫后小鼠均为Th1型偏移的免疫反应;体外研究显示,免疫血清介导的巨噬细胞对童虫的杀虫率分别是12.05%、14.08%、18.86%,与阴性血清组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。体外观察rSjCL3与rSjGAPDH在抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）对童虫的杀伤作用时发现,rSjCL3与rSjGAPDH均可通过减少巨噬细胞对童虫的黏附而破坏ADCC的杀虫作用;而且加入相应的酶抑制剂后,杀虫效果均有恢复,分别由8.17%上升至15.46%与6.1%上升至19.49%,黏附在童虫表面的巨噬细胞数分别由2.45上升至5.75个与1.43上升为6.57个,差异均具统计学意义（P<0.05）。当分别用SjCL3与SjGAPDH的dsRNA单独及联合抑制目的基因后,机械转变童虫的存活率分别为72.7%、62.5%、56.5%,与对照组比较,SjCL3组无差别,其余2组的差别显着（P<0.05）;21天童虫的存活率分别为92.77%、91.83%、90.56%,差异无统计学意义（P>0.05）;42天成虫的存活率分别为100%、96.15%、93.33%,差异也均无统计学意义（P>0.05）。此外,还构建了I型糖尿病小鼠模型,探索了rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫对糖尿病小鼠的治疗作用,结果显示:各组小鼠的血糖水平无差别（P>0.05）,血清IgG1/IgG2a比值分别为0.65、1.06、0.51。综上所述,本研究克隆表达了具有活性的肺期童虫rSjCL3与rSjGAPDH,发现两种蛋白分别定位于卵壳、消化道、体被、部分肌肉层以及与卵壳、体被及绝大部分肌肉层,表达水平最高的部位分别是虫卵与雄虫;它们能在逃避宿主免疫中发挥重要作用;重组蛋白免疫小鼠后,rSjCL3不能发挥佐剂样作用,但在弗氏佐剂的作用下其与rSjGAPDH联合可诱导小鼠产生65.6%的减虫率与70.9%的减卵率,值得进一步研究。
杨珊珊[3]（2020）在《日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究》文中研究说明日本血吸虫病是流行广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。肺期童虫体小且结构简单,是血吸虫在终末宿主体内发育的早期阶段,和在移行过程中虫体数量减少的最主要阶段。因此,肺期童虫被视作宿主免疫系统攻击的重要靶标。1.日本血吸虫3d肺期童虫蛋白质组分析利用非标记定量蛋白质组学比较分析了日本血吸虫3 d童虫与42 d成虫的蛋白组成和表达差异,结果显示3d虫体上调差异表达蛋白194个、下调差异435个。选取C1LVH1、Q86E32等19个差异表达蛋白进行PRM验证,结果与非标记定量蛋白质组学结果一致。GO分析显示,差异表达蛋白主要参与大分子复合物组装、ATP依赖性微管马达的调节、ATP活性的正调节及ATP依赖性微管正调控等生物学过程。2.日本血吸虫Prohibitin 1（SjPHB1）和Prohibitin 2（SjPHB2）的克隆表达及动物免疫保护效果评估利用PCR和RACE分别扩增获得SjPHB1和SjPHB2的基因片段。序列分析表明,SjPHB1含825bp的ORF,编码274个氨基酸,无信号肽和跨膜区;SjPHB2含900bp的ORF,编码299个氨基酸,无信号肽,具有1个跨膜结构区。成功构建和表达了pET-32a（+）-SjPHB1和pGEX-4T-1-SjPHB2重组表达质粒,诱导表达的融合蛋白均以包涵体的形式存在。在变性条件下,纯化获得rSjPHB1和rSjPHB2融合蛋白,分子量分别为47kDa和59kDa。Western blotting结果显示rSjPHB1和rSjPHB2免疫血清能识别特异性条带,表明rSjPHB1和rSjPHB2具有较好的免疫原性。将rSjPHB1和rSjPHB2分别结合ISA206佐剂免疫小鼠,结果重组蛋白未能诱导显着的免疫保护效果。3.SjPHB1和SjPHB2的表达、定位及RNA干扰研究利用qPCR分析SjPHB1和SjPHB2在虫体不同时期的表达情况,结果表明SjPHB1和SjPHB2在检测的日本血吸虫虫体发育的各个阶段均有表达,在童虫、成虫、虫卵、毛蚴和尾蚴等各个时期SjPHB1和SjPHB2的转录水平差异较大。SjPHB2在3d和7d童虫及虫卵中的表达明显高于SjPHB1及其它各个时期,但在毛蚴中SjPHB1的表达水平较SjPHB2高。SjPHB1和SjPHB2在雌虫中的转录水平均高于雄虫,但两者在雌雄虫的表达水平是相反的。免疫荧光结果显示SjPHB1和SjPHB2均在细胞膜和细胞质中表达,它们在膜部分也有重合。在体外培养中siRNA727可干扰SjPHB1转录水平降低4.6%22.67%,siRNA796和siRNA325可干扰SjPHB2转录水平降低5.8%19.7%,siRNA727和siRNA796组合干扰效果较好,可诱导SjPHB1和SjPHB2基因转录分别下降37.39%68.58%和34%68.31%,观察可见虫体发黑变粗,体表有破裂现象。在体内干扰时siRNA727/796组合干扰SjPHB1和SjPHB2转录水平降低31.20%和17.33%。与对照组相比,siRNA727/796组合诱导了BALB/c获得31.35%的减虫率。扫描电镜观察显示,siRNA727/796干扰组可致雌雄虫体表结构破坏。
李雪[4]（2020）在《日本血吸虫跨膜蛋白SjTMEM66P功能的初步探索》文中研究指明血吸虫病是由血吸虫尾蚴感染引起的一种人畜共患寄生虫病,对宿主造成严重病理性损害,是WHO确定的六大重点热带病之一。由于血吸虫的多阶段发育生活史比较复杂,虫体诱发宿主的免疫应答机制以及逃避机制不甚清晰,使获得良好保护效果的血吸虫病疫苗研究被制约。因此,寻找更有效的疫苗候选分子也许成为防控血吸虫病的一种重要途径。跨膜蛋白位于生物膜两端,贯穿细胞与外界之间,具有介导信号转导、分子运输、能量转换等多种重要的功能。位于血吸虫体被的跨膜蛋白,直接与宿主的免疫系统相接触,因此,体被跨膜蛋白可能为宿主与虫体信息交流的重要分子。开展跨膜蛋白的功能研究对日本血吸虫疫苗的开发也很有必要。本论文对跨膜蛋白TMEM66P在血吸虫寄生和生殖发育中的功能进行初步探索,主要包括以下三个方面的研究:（一）日本血吸虫TMEM66P基因编码cDNA的克隆表达及生物信息学分析根据日本血吸虫TMEM66P序列设计引物,进行PCR扩增出该序列的cDNA片段,序列分析表明扩增的该cDNA片段包括1008 bp的开放阅读框,编码蛋白预测分子量为37.93 kD。生物信息学分析表明TMEM66P存在跨膜区,TMEM66P序列与曼氏血吸虫同源性为67.79%,与小鼠同源性为44.54%。另外,本研究中成功构建了原核重组蛋白pET32a（+）-TMEM66P,并成功表达纯化。（二）TMEM66P在日本血吸虫不同发育时期和性别中的转录分析通过RT-PCR方法检测TMEM66P在日本血吸虫的不同发育时期及性别中的转录水平。结果显示TMEM66P基因在日本血吸虫不同发育时期均有表达,在日本血吸虫虫卵及感染小鼠的35 d虫体的表达量显着高于14 d、21 d,在感染的28 d虫体的表达量次之。此外,在感染小鼠的28 d虫体中,TMEM66P在雄虫中表达量高于雌虫,在感染的35 d虫体中,TMEM66P在雄虫中的表达显着高于雌虫。上述结果表明TMEM66P在不同发育时期及不同性别中具有表达差异性,提示该基因可能在日本血吸虫的生殖产卵和生长发育中起重要作用。（三）日本血吸虫TMEM66P的功能初步研究利用RNAi技术对日本血吸虫TMEM66P基因进行体外干扰实验,筛选出干扰效果最佳的小RNA分子（siRNA-664）。利用RT-PCR对干扰后虫体卵壳蛋白基因进行检测,发现卵壳蛋白基因AY222895.1,AY814244.1,M59318.1和D32205.1基因表达水平显着降低。利用CellTiter-Lumi?法检测干扰血吸虫后的虫体细胞活性,虫体细胞活力显着下降;对干扰后虫体产卵量进行统计分析,发现干扰后虫体产卵量显着降低;随着干扰时间延长,虫体活力逐渐降低。表明TMEM66P表达水平的下降对雌虫产卵及虫体活性均有影响,提示TMEM66P可能在日本血吸虫生殖发育中发挥重要调控作用。
张挺[5]（2020）在《捻转血矛线虫氨基肽酶的植物表达方法的建立及重组蛋白免疫效果评估》文中研究说明捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是牛、羊等反刍动物的一种重要消化道寄生线虫。成虫主要寄生于宿主第四胃以宿主血液为其营养来源,引起贫血及贫血综合征,严重的可致动物死亡,危害十分严重。捻转血矛线虫病的防控主要依赖化学药物的使用,然而长期不合理的使用化学药物导致耐药性问题日益严重,因此疫苗的研发刻不容缓。在捻转血矛线虫的疫苗研究中,虽然多种表达系统已有报道,但效果不佳。近些年,植物表达寄生虫抗原的研究报道日益增多,应用植物表达系统表达捻转血矛线虫抗原可以为捻转血矛线虫疫苗的研发提供新的思路。在融合植物双元表达载体p RI101并用农杆菌介导本氏烟草瞬时表达Hc-ap-10和Hc-ap-8的过程中,发现密码子优化的Hc-ap-10的表达水平要明显高于未经密码子优化的Hc-ap10和Hc-ap-8的表达水平。因此,在应用植物表达系统表达捻转血矛线虫氨基肽酶基因时,密码子的优化可能对于其蛋白的表达水平有明显的提高作用。进一步研究表明Hc-ap-8和Hc-ap-10都表达在植物细胞的细胞膜上,而目前对于植物细胞细胞膜蛋白的纯化有一定的难度,所以在表达这两种蛋白的时候需要将其引导到植物细胞的细胞核处进行表达。密码子优化的Hc-ap-10(AP10op)和未经优化的Hc-ap-8在植物双元表达载体p H7LIC瞬时表达于烟草叶片中,同样表达在烟草叶片细胞的细胞膜上,但其表达水平要高于p RI101载体。因此,利用p H7LIC载体构建了添加核定位信号（NLS）SV40的p H7d NLSAP8、p H7d NLSAP10op和p H7d NLSHc23。在烟草瞬时表达抗原时,密码子优化的Hc-ap-10比未优化的Hc-ap-8表达水平高,但是同样未经优化的Hc23分子却能够以更高的水平在烟草叶片中表达,说明目的蛋白分子量的大小可能会影响密码子优化的效果。在使用原核表达的HC-AP-5和HC-AP-10蛋白免疫山羊的实验中,联合使用两种抗原并没有明显降低山羊捻转血矛线虫的感染强度,其EPG和成虫负荷与佐剂对照组相比没有显着差异,说明两种原核表达的抗原HC-AP-5和HC-AP-10,可能并不适合作为捻转血矛线虫的疫苗候选分子。本研究成功建立植物表达捻转血矛线虫抗原的方法,并首次利用本氏烟草生产捻转血矛线虫抗原,同时原核表达的抗原HC-AP-5和HC-AP-10混合免疫山羊后,并不能成功刺激宿主产生明显保护力。
余新刚[6]（2019）在《miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究》文中提出黄牛和水牛是日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的重要天然宿主,也是我国血吸虫病的主要传染源。它们对日本血吸虫感染呈现不同的适宜性,进而导致血吸虫在宿主体内的生长发育、存活以及对宿主的致病作用呈现较大差异。为了探究miRNAs在血吸虫生长发育以及与宿主相互作用过程中的调节作用,本研究采用高通量测序技术（Illumina的Hiseq Xten测序）对来自黄牛（适宜性宿主）和水牛（非适宜性宿主）的日本血吸虫成虫以及感染前（T1）、感染后14 d（T2,早期感染）和感染后42 d（T3,急性感染）黄牛和水牛的血浆、外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的miRNA进行测序,比较黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的差别以及黄牛和水牛血浆和PBMC在感染前后miRNA表达谱的变化,并对日本血吸虫真核翻译起始因子（eukaryotic initiation factor 4,eIF4A）的生物学功能进行初探。上述研究可为抗血吸虫疫苗候选分子和新药靶标的筛选提供新的思路。1.黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛来源的日本血吸虫成虫miRNA的表达谱,分别获得了6378万和6321万条miRNA序列。通过生物信息学分析鉴定了206个miRNAs,包括79个已注释的日本血吸虫miRNAs、127个与其他物种miRNAs高度相似的新miRNAs。其中,5个已注释的miRNAs（sja-miR-124-3p、sja-miR-219-5p、sja-miR-2e-3p、sja-miR-7-3p和sja-miR-3490）在水牛组虫体中呈现显着性上调表达,10个新的miRNAs在两组虫体中呈现差异表达。sja-miR-124-3p在黄牛和水牛源虫体中的表达趋势与啮齿类宿主来源虫体一致,可参与调节日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A等的表达。双荧光素酶报告试验证实sja-miR-219-5p可与靶基因Hsc20特异序列结合。5个已注释的差异表达miRNAs可能参与268个靶基因的生物学功能调节,包括虫体的咽肌发育、嘌呤代谢、减数分裂的胞质分裂、减数分裂中纺锤体的定位、细胞骨架依赖性细胞内运输、r RNA加工、m RNA运输、蛋白质运输和繁殖等过程。其中,sja-miR-124-3p和sja-miR-219-5p可能通过调控虫体的神经系统发育、应激反应等进而影响虫体在两宿主体内的生存及发育。2.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛在血吸虫感染不同时期血浆中miRNA的表达谱。测序后共获得352,727,942条有效序列,平均每个样本有14,696,997条。黄牛和水牛组血浆miRNA的基因组比对率分别为90.80%和99.60%。黄牛和水牛血浆在血吸虫感染各期已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为444和438个。与感染前相比,黄牛和水牛血浆在感染早期分别有3个和9个miRNAs呈现特异性差异表达;在急性感染期黄牛和水牛血浆有9个miRNAs呈现共性差异表达,黄牛和水牛血浆分别有39和23个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,在急性感染期黄牛与水牛血浆有4个miRNAs呈现共性差异表达,分别有35和5个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在感染早期,黄牛和水牛血浆miRNAs在脂肪酸代谢和胰岛素信号通路调节中存在很大差异,可能影响虫体在两宿主体内的生存及发育。3.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛PBMC在血吸虫感染不同时期miRNA的表达谱。测序后共获得228,483,170条序列,平均每个样本有9,520,132条有效序列。在血吸虫感染各时期黄牛和水牛PBMC中已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为234和228个。与感染前相比,黄牛与水牛PBMC之间在T3/T1期有45个miRNAs呈现共性差异表达,另有111和69个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,黄牛和水牛PBMC在T3/T2期有64个呈现共性差异表达,另有147和36个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在急性感染期,黄牛和水牛PBMC的miRNAs在Th1/Th2型细胞因子、Toll样受体信号通路等方面存在差异,可能影响宿主的免疫应答。4.日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析。根据Gen Bank中日本血吸虫eIF4A的基因序列（FN315265.1）设计引物,扩增Sj-eIF4A基因;构建其重组表达质粒并转化感受态细胞。采用IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白。采用q RT-PCR法检测Sj-eIF4A在不同发育阶段以及不同适宜性宿主来源虫体的转录水平。在体内外对21 d童虫中该基因进行RNA干扰实验,通过扫描电镜观察RNA干扰对虫体繁殖和结构的影响。结果显示,Sj-eIF4A基因全长为1179 bp,编码392个氨基酸,融合蛋白Mr约为46 k Da。Sj-eIF4A在被检的日本血吸虫不同发育阶段均有表达,尤其在毛蚴、14 d童虫以及42 d雌虫体内转录水平较高;在适宜性宿主黄牛和BALB/c小鼠来源虫体内的转录水平高于非适宜性宿主水牛和Wistar大鼠。Sj-eIF4A特异性si RNA不仅能够有效抑制虫体Sj-eIF4A的转录水平并诱导小鼠产生20.63%的减虫率和31.21%的肝脏减卵率,而且能够引起雌虫的排卵异常以及虫体腹吸盘和雌雄虫部分体表结构发生改变。综上所述,本文对黄/牛来源日本血吸虫miRNA的表达差异及黄牛和水牛感染前后PBMC和血浆miRNA表达差异进行了比较分析,并对日本血吸虫真核翻译起始因子Sj-eIF4A进行了克隆表达和基因特性分析。发现了一些对血吸虫生长发育和宿主免疫应答至关重要的虫源性和宿主源性miRNA分子,初步探明了Sj-eIF4A在日本血吸虫生长发育中的重要作用,为揭示不同适宜性宿主与日本血吸虫间的相互作用提供了有价值的信息,也为寻找抗日本血吸虫有效的疫苗候选分子或新药靶标提供了新思路。
许蓉[7]（2018）在《日本血吸虫SjELAV-like 1基因的克隆、表达及功能的初步研究》文中研究说明血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种对社会、经济发展危害严重的人畜共患寄生虫病。雌虫产生的虫卵是血吸虫病导致病理损伤的主要因素,同时也是该疾病传播的根本原因。因此,研究血吸虫生殖发育相关的基因功能,从控制血吸虫生殖发育来控制血吸虫病的发生具有重要意义。本研究克隆和表达了日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,并分析了该基因在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。利用PCR技术获得SjELAV-like 1基因序列（Gene Bank登录号:MG515727）,获得的SjELAV-like 1基因序列长1797bp,其中编码序列为1533 bp,编码510个氨基酸。通过构建该序列的重组表达质粒pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集诱导0h,1h,2h,3h,4h,6h,8h的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳发现,重组蛋白主要存在于包涵体中,且在诱导4h时表达量最高。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blotting分析发现该重组蛋白具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验表明SjELAV-like 1蛋白主要分布在日本血吸虫体体被。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同时期和不同时期合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴和混合钉螺逸出的尾蚴分别感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体和合抱分开的雌、雄虫体,Trizol法提取总RNA,实时定量PCR分析SjELAV-like 1基因的表达情况发现,该基因在不同发育阶段和不同发育阶段雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。小鼠尾静脉注射法进行最佳小干扰RNA（siRNA）的筛选,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,与NC组相比,所筛选的小干扰RNA S2具有良好的干扰效果,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P<0.05）、40.59%（P<0.01）和74.58%（P<0.01）;电镜观察发现,与对照组相比,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。本研究成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显着性降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖器官的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。
何川川[8]（2018）在《水牛抗日本血吸虫再感染和吡喹酮预防水牛感染日本血吸虫作用的研究》文中研究指明由血吸虫引起的血吸虫病是一种严重的人畜共患疾病。我国流行的是日本血吸虫病,它主要分布在长江中下游多沼泽湖泊地区。日本血吸虫病流行区域中的家畜尤其是水牛,对其流行与传播有着重要作用。水牛在感染日本血吸虫后不经治疗能够自我治愈。流行病学调查显示治疗后的水牛可能对再感染具有抗性。了解水牛抗血吸虫再感染抗性的程度、产生过程以及相关机理,可以为研制抗血吸虫疫苗、寻找治疗药物靶标、制定血吸虫防治对策提供科学依据。吡喹酮（PZQ）是治疗人畜血吸虫病的首选药物。由于吡喹酮在体内代谢快的特点,研究者们普遍认为吡喹酮不能产生长时间预防作用。对PZQ的应用和研究也都是针对PZQ对血吸虫虫体的直接作用而开展。本研究对水牛抗血吸虫再感染能力的产生过程、抗再感染程度以及所涉及到的免疫机制进行了研究,同时还观察到PZQ可以诱导水牛产生抗日本血吸虫感染的效果。一、水牛抗日本血吸虫再感染程度及机制研究本项研究共进行了两次独立试验。每次试验中将动物随机分成4组,其中第一组（组1）为首次再感染实验组,第二组（组2）为首次再感染的对照组,第三组（组3）为两次再感染实验组,第四组（组4）为两次再感染对照组。两次试验结果显示水牛对第二次再感染具有极强的抗性。两次试验中,组3和组4相比,减虫率分别达到98.0%和97.3%,虫体长度明显变短,肝脏和直肠中的虫卵减少率为91.1%-100%,肝脏病变减轻至几乎没有病变。两次试验中第一组收获的虫体数均显着多于第二组,主要原因是第一次试验中感染与PZQ处理的间隔时间太短（18d）而第二次试验中PZQ的质量问题导致治疗不彻底。因此,本研究所获得的结果难以说明水牛是否对首次再感染的具有抗性。我们对第一次试验中各组外周血清中与免疫调节相关的细胞因子IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IFN-γ和特异性抗体IgG、IgG1进行了动态监测,结果显示在再感染后的大多数采样时点,第一组和第三组均高于其各自对照组。二、PZQ预防水牛感染日本血吸虫的效果观察本项研究共进行了两次试验观察。两次试验所用PZQ均为原药粉剂,其中第一次试验所用PZQ购自南京制药厂,第二次所用PZQ购自江苏钦强兽药公司（试验结束后用高效液相分析,其PZQ纯度为自南京制药厂PZQ粉剂的20%）。第一次试验的两个实验组D18和D34分别为水牛抗日本血吸虫再感染研究的两个对照组,分别在感染前19d和18d、35d和34d进行连续两日预服PZQ（25mg/Kg,最大剂量10g）,第二次试验的实验组D8在感染前9d和8d预服PZQ（实际有效剂量为5mg/Kg）。空白对照组不用PZQ处理。在第一次试验中,D18组和空白对照组相比,虫体发育率减少了91.1%,D34组则没有减少。D18组和D34组相比获得94.6%的减虫率,95.7%的肝脏虫卵减少率和97.9%的直肠虫卵减少率。在第二次实验中,D8组和空白对照组相比,获得的减虫率为31%,肝脏虫卵减少率为100%,但没有观察到直肠虫卵减少率。同时,形态学观察发现,收获的成熟虫体显着变短（D18组和D34组比,D8组和空白对照组比）。我们也对两次试验中不同时间点外周血血清中的细胞因子（IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IFN-γ）和抗体（IgG）水平进行了检测。结果显示,水牛在口服PZQ之后的8到18天（感染前）以及感染血吸虫后的早期（28天）,体内抗体和细胞因子含量高于对照组。研究结果首次发现水牛提前口服PZQ至少可以诱导18天的有效预防日本血吸虫感染,这对在日本血吸虫病流行季节提前给药预防水牛感染血吸虫具有很好的指导意义。总结全文,本研究论文首次发现水牛经过两次感染治疗可以有效预防再感染,以及水牛提前口服PZQ至少在18天内可以有效预防日本血吸虫感染。
唐仪晓[9]（2018）在《宿主miR181a调节血吸虫感染后免疫应答研究》文中认为日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的人兽共患寄生虫病,吡喹酮是目前唯一大规模使用的血吸虫病治疗药物,但该药主要对成虫有效且不能解决重复感染的难题,因而研制出有效、安全的疫苗成为血吸虫病防治的重要科技需求。血吸虫疫苗研究取得突破要以血吸虫感染免疫机制为基础。本实验室前期研究表明,miR181a可能在宿主抗日本血吸虫感染的早期免疫应答中发挥了重要作用,本文以实验动物和巨噬细胞作为研究对象,从体内外对miR181a在抗日本血吸虫感染中的调节作用作了初步的探讨。鉴于巨噬细胞在宿主抗血吸虫感染过程中和血吸虫病发生发展中发挥了作用,本文首先以RAW264.7巨噬细胞作为研究对象,探讨miR181a在血吸虫童虫抗原SSA刺激巨噬细胞中的免疫调节作用。用日本血吸虫童虫抗原SSA和miR181a模拟物分别或共同刺激/转染RAW264.7巨噬细胞,再用实时定量PCR技术或流式细胞术分析细胞miR181a和TNF-α等细胞因子及M1型和M2型巨噬细胞标记分子的表达变化。结果显示日本血吸虫童虫抗原SSA刺激RAW264.7巨噬细胞后,miR-181a及IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子上调表达,IL-13下调表达;miR-181a模拟物单独转染RAW264.7巨噬细胞后,细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和M1型巨噬细胞标记分子inos等下调表达,IL-4和M2型巨噬细胞标记分子arg-1上调表达。巨噬细胞先用SSA刺激后再转染miR181a模拟物,IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子都下调表达。流式细胞术结果显示miR181a对巨噬细胞M1型标记物CD16/32的表达起到下调作用,对M2型标记分子CD206的表达起上调作用。本研究提示miR181a对日本血吸虫SSA抗原刺激的巨噬细胞的免疫应答起负调节作用,并促进巨噬细胞向M2型细胞转化。本文应用实时定量PCR技术比较分析了适宜性宿主BALB/c小鼠和非适宜性宿主东方田鼠感染日本血吸虫前,及感染后3d、7d、10d、24d、32d、42d血清和肝脏中miR181a的表达情况,结果表明两种宿主感染日本血吸虫后miR181a表达呈现不同的趋势,其中小鼠感染后不同时期血清和肝脏中miR-181a的表达水平都高于未感染对照（感染后42 d肝脏样品除外）,而东方田鼠则都低于未感染对照。提示两种不同适宜性宿主感染日本血吸虫后miR181a的差异表达可能影响了寄生虫在宿主体内的生长发育及存活。为进一步阐述miR181a在日本血吸虫感染中的免疫调节机制,本文用TLR4受体的配体LPS刺激RAW264.7巨噬细胞,qPCR检测显示细胞TLR4的表达上升,miR181a的表达下调,IL-1β、IL-6、TNF-α三种TLR4通路相关的细胞因子上调表达。用日本血吸虫感染TLR4缺陷型小鼠与野生型小鼠,结果显示感染后10d TL4缺陷鼠血清中miR181a的表达量为野生型鼠的3倍多,提示在日本血吸虫感染中,miR-181a和TLR4信号通路之间存在着相互调节作用,miR181a可能通过TLR4受体通路调节细胞因子的表达,进而参与抗血吸虫感染的免疫调节作用。本研究结果为阐述miR181a在血吸虫感染中的免疫调节作用,及东方田鼠抗日本血吸虫病机制提供了有价值的实验依据。
黄帅钦[10]（2018）在《日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析》文中指出血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,全世界范围内有超过2.5亿人感染血吸虫,还有78个国家和地区的将近7.79亿人面临着被感染的危险;据不完全统计每年有超过20万人死于血吸虫病,并造成了巨大的经济损失。湖北钉螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸虫（Schistosomajaponicum）唯一的中间宿主,其在血吸虫病的传播和流行过程当中发挥着不可替代的作用。除此之外,湖北钉螺还可作为一种鱼类吸虫-外睾吸虫（Exorchissp.）的中间宿主,研究发现应用无害的外睾吸虫能够成功地在其媒介钉螺体内对血吸虫幼虫进行生物控制,即钉螺在先感染外睾吸虫之后可以拮抗再入侵的血吸虫幼虫,后进入钉螺体内的血吸虫幼虫发育全部不正常、受阻,并最终全部被杀死。本文首先对血吸虫病疫区江西省星子县鄱阳湖流域进行生物控制资源的初步调查,结果显示在2012-2016年间共解剖野生鲶鱼494条,其中感染外睾吸虫的鲶鱼共有325条,总的感染率约为65.79%,总的平均感染强度为14.21条;在2012-2015年间共检查了 19528粒钉螺,其中外睾吸虫阳性钉螺总数为216粒,感染率约为1.11%,血吸虫阳性钉螺为12粒,感染率约为0.06%。从调查结果可以看出鄱阳湖区鲶鱼外睾吸虫感染率很高,湖北钉螺外睾吸虫的感染率也要远远高于血吸虫的感染率,表明外睾吸虫的资源较为丰富,不仅能为后续的研究提供便利,更为重要的是能够为未来生物控制方法的普及和实施提供支持。鉴于目前在湖北钉螺内在分子和细胞机制等方面研究的文献资料极为匮乏,厦门大学生命科学学院的唐崇惕教授和郭跃博士、上海兽医研究所的林矫矫教授、上海交通大学生命科学学院的乔中东教授以及国家人类基因组南方研究中心的王升跃教授共同合作对四种不同感染情况的湖北钉螺转录组进行测序以及差异表达谱进行分析,我们从中筛选出了一些可能在生物控制过程中有着重要作用的蛋白质分子,例如MIF（Macrophage migration inhibitory factor,巨噬细胞迁移抑制因子）和TRX（Thioredoxin,硫氧还蛋白）等;通过数据分析、文献查阅和实验验证,并结合生物控制过程中所观察到的表型,我们确定了本文中所重点研究的目标分子湖北钉螺MIF,即OhMIF。MIF是一种具有多重功能的细胞因子,在宿主抵抗外来微生物和病原入侵以及免疫细胞促炎症反应中均发挥着重要的免疫调节功能。在本文中,我们根据钉螺转录组中得到的湖北钉螺MIF（OhMIF）全长cDNA序列,成功地从钉螺体内对OhMIF进行了克隆,接下来我们利用点突变以及原核表达系统成功地对重组OhMIF蛋白（rOhMIF）和其突变体OhMIFP2G重组蛋白（rOhMIFP2G）分别进行了表达和纯化,并对其互变异构酶活性进行了测定,结果显示rOhMIF呈现出依赖于第二位脯氨酸（Pro2）的D-多巴胺互变异构酶活性,并且该酶活性能够被哺乳动物MIF特异性抑制剂ISO-1所抑制,表明该结合位点是保守的;除此之外,我们又分别对rOhMIF和rHsMIF（人类MIF重组蛋白）的D-多巴胺互变异构酶活性的动力学常数进行测定和比较分析,结果显示出rOhMIF对底物的亲和力以及催化效率要均低于rHsMIF;接下来,我们通过实验证实rOhMIF还呈现出利用DTT作为还原剂来还原胰岛素的氧化还原酶活性,而哺乳动物MIF则是利用GSH作为还原剂;而且,我们还通过体外注射实验证实rOhMIF和其突变体rOhMIFP2G均能够促进ERK1/2的磷酸化和活化,表明rOhMIF的互变异构酶活性对于该功能的发挥并不是必需的。接下来,我们通过实验证实OhMIF在钉螺各个组织中均有表达,在钉螺血淋巴细胞中定位在细胞质;同时我们还发现当钉螺感染血吸虫之后,OhMIF的表达量有着明显的上调,表明其在钉螺对于血吸虫入侵进行免疫防御过程中可能发挥着重要的作用。为了能够更好地探究OhMIF在钉螺免疫系统中的功能,我们首先根据细胞体积和细胞颗粒密度对钉螺血淋巴细胞进行了较为系统的分类,并采用体外喂食法对OhMIF在钉螺体内的表达量进行敲低;实验结果显示OhMIF敲低之后能够显着地降低吞噬性血淋巴细胞在总的循环性血淋巴细胞中的比例,同时较大体积以及较高颗粒密度血淋巴细胞的比例也呈现出明显的降低趋势,表明OhMIF在血淋巴细胞的成熟和分化过程中具有重要的功能。除此之外,我们还通过实验证实OhMIF能够有效地促进吞噬性血淋巴细胞向着血吸虫感染部位进行迁移。由于我们从上述四种不同钉螺样品的转录组测序和差异表达分析中只是拿到了很少一部分数据,为了以后能够更好、更加深入地进行后续的研究,接下来我们又采用转录组与蛋白质组相结合的方式来探究生物控制作用的内在分子机制。结果显示共得到了 46162条独立的湖北钉螺unigene,利用iTRAQ技术共鉴定到了 3811个蛋白,分别对得到的基因和蛋白进行功能分类和注释分析,并以此作为数据库,对四种不同感染情况钉螺中差异表达的蛋白进行鉴定,然后针对其中我们比较感兴趣的两组差异蛋白进行更进一步的分析,即Common组（146个）和Only组（195个）,经过功能分类与注释分析,找到了一些可能在钉螺免疫防御系统中起着关键作用的蛋白。综上所述,本文基于利用外睾吸虫在钉螺体内对血吸虫进行生物控制的表型、四种不同感染情况钉螺转录组测序和差异表达分析以及MIF的研究进展和功能综述,进而确定了本文所要研究的目标分子-OhMIF。接着我们又对OhMIF进行了鉴定及其生物学活性的测定和分析,发现OhMIF在不同吸虫感染情况钉螺体内以及不同时间血吸虫感染钉螺体内的表达量均呈现出显着的差异;接下来我们又通过实验证实OhMIF在钉螺对于血吸虫先天性免疫反应过程中发挥着重要的作用;同时为了以后更广泛、全面地探究该生物控制过程的内在机制,我们还通过转录组与蛋白质组相结合的方式鉴定出了一些可能在此过程中具有重要作用的差异表达分子。本文是首次对湖北钉螺免疫相关分子进行功能性的探究,相信本文中所采用的方法和手段或许可为以后钉螺中其它关键分子的研究提供模板,本文中的内容也将会有助于更进一步地探究和理解宿主与寄生虫的相互关系。但是由于这些方面研究的信息和材料尚且不足,很多的实验研究仍处于早期的探讨摸索阶段,难免会存在许多不足和短缺之处,我们今后会更加仔细、全面地对钉螺的免疫防御系统展开深入的研究,进一步地了解钉螺与寄生虫之间的相互作用关系,为血吸虫在钉螺体内的生物控制提供更加详细的科学依据。
二、吡喹酮氯仿油制剂治疗山羊日本血吸虫病研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、吡喹酮氯仿油制剂治疗山羊日本血吸虫病研究（论文提纲范文）
（1）东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 东毕吸虫病的现状 |
| 1.1.1 东毕吸虫病的危害 |
| 1.1.2 东毕吸虫病的防治 |
| 1.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.1 生物体的氧化还原系统 |
| 1.2.2 寄生虫氧化还原系统 |
| 1.2.3 硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶 |
| 1.2.4 谷胱甘肽(GSH)系统 |
| 1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)系统 |
| 1.2.6 硫氧还蛋白(Trx)系统 |
| 第二章 东毕吸虫不同宿主适宜性观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 耳萝卜螺的饲养 |
| 2.3.2 土耳其斯坦东毕吸虫毛蚴孵化与耳萝卜螺感染 |
| 2.3.3 土耳其斯坦东毕吸虫尾蚴的释放、收集与终末宿主的感染 |
| 2.3.4 粪便毛蚴孵化检查 |
| 2.3.5 感染宿主的不同组织虫卵计数 |
| 2.3.6 兔子感染不同时间虫体发育情况统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同实验动物感染东毕吸虫的情况统计 |
| 2.4.2 兔子在感染后不同时间的虫体发育情况 |
| 2.4.3 兔子在感染后不同时间的虫卵分布情况 |
| 2.4.4 东毕吸虫不同时期虫体观察 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 东毕吸虫TGR的克隆表达和纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和实验试剂配制 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 东毕吸虫总RNA的提取和反转录 |
| 3.3.2 东毕吸虫TGR序列的生物信息学分析 |
| 3.3.3 OtTGR基因的扩增和pET-28a(+)-OtTGR表达质粒的构建 |
| 3.3.4 pET-28a(+)-OtTGRsec表达质粒构建 |
| 3.3.5 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.3.6 rOtTGR多克隆抗体的制备与免疫组织化学实验 |
| 3.3.7 蛋白免疫印记实验(Western blot) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 OtTGR、OtTGRsec基因的克隆及pET28a(+)-OtTGRsec和 p ET28a(+)-Ot TGR的重组质粒构建与鉴定 |
| 3.4.2 OtTGR的生物信息学分析 |
| 3.4.3 rOtTGR和 rOtTGRsec的表达和纯化 |
| 3.4.4 rOtTGR蛋白免疫印迹与重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.4.5 OtTGR的免疫组织化学结果 |
| 3.4.6 免疫小鼠抗体效价的测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 东毕吸虫TGR的酶特性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 rOtTGRsec硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活性检测 |
| 4.3.2 rOtTGRsec谷胱甘肽还原酶(GR)的活性检测 |
| 4.3.3 rOtTGRsec谷氧还蛋白(Grx)的活性检测 |
| 4.3.4 抑制剂对rOtTGRsec TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 rOtTGRsec TrxR的酶活性 |
| 4.4.2 rOtTGRsec GR的酶活性 |
| 4.4.3 rOtTGRsec Grx的酶活性 |
| 4.4.4 抑制剂对rOtTGRsec的 TrxR酶活性的抑制作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 东毕吸虫TGR的体外干扰及抑制实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 生物材料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 东毕吸虫收集 |
| 5.3.2 东毕吸虫培养 |
| 5.3.3 体外干扰东毕吸虫虫体实验 |
| 5.3.4 虫体RNA提取 |
| 5.3.5 qPCR分析干扰结果 |
| 5.3.6 Western blot分析siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达水平 |
| 5.3.7 LGM35 对东毕吸虫成虫的抑制效果评价 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 siRNAs干扰后OtTGR的转录水平 |
| 5.4.2 siRNAs干扰OtTGR后的蛋白表达分析 |
| 5.4.3 LGM35 对东毕吸虫成虫的杀伤效果评价 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 SjCL3与SjGAPDH基因的分子生物学信息分析、克隆表达及重组酶的活性测定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫不同发育时期的表达水平及其组织学定位 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫免疫逃避及生长发育中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第六章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫在治疗I型糖尿病中的作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 现存问题与局限性 |
| 展望 |
| 综述 血吸虫病早期诊断技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（3）日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫病的防治 |
| 1.1.1 血吸虫病流行现状 |
| 1.1.2 日本血吸虫病防治技术 |
| 1.2 血吸虫肺期童虫 |
| 1.3 血吸虫蛋白质组学研究进展 |
| 1.3.1 蛋白质组学背景介绍 |
| 1.3.2 日本血吸虫相关蛋白质组研究 |
| 1.4 抗增殖蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 布氏锥虫中Prohibitin的研究 |
| 1.4.2 秀丽隐杆线虫中Prohibitin的研究 |
| 1.4.3 利什曼原虫中Prohibitin的研究 |
| 第二章 日本血吸虫3d肺期童虫蛋白质组学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 日本血吸虫3d童虫的收集 |
| 2.3.2 日本血吸虫42d成虫的收集 |
| 2.3.3 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 2.3.4 LC-MS/MS |
| 2.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 2.3.6 生物信息学分析 |
| 2.3.7 LC-PRM/MS检测分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 日本血吸虫3d童虫的收集观察 |
| 2.4.2 3d童虫和42d成虫蛋白PAGE比较和质谱分析 |
| 2.4.3 筛选3d童虫和42d成虫差异表达蛋白 |
| 2.4.4 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白聚类分析 |
| 2.4.5 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 2.4.6 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质KEGG通路分析 |
| 2.4.7 3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质互作网络分析(PPI) |
| 2.4.8 日本血吸虫3d童虫和42d成虫差异表达蛋白质的PRM验证 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 SjPHB1与SjPHB2 的克隆、表达、及重组蛋白动物免疫保护效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 主要试剂及酶 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.2.5 主要实验器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SjPHB1与SjPHB2 基因克隆 |
| 3.3.2 SjPHB1及SjPHB2 基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3.3 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的构建 |
| 3.3.4 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的原核表达 |
| 3.3.5 rSjPHB1及rSjPHB2 重组蛋白的Western blotting和 ELISA分析 |
| 3.3.6 重组蛋白rSjPHB1和rSjPHB2 的动物保护实验 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SjPHB1和SjPHB2 基因的克隆 |
| 3.4.2 SjPHB1和SjPHB2 基因分析 |
| 3.4.3 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的构建 |
| 3.4.4 pET-32a(+)-SjPHB1及pGEX-4T-1-SjPHB2 重组表达质粒的原核表达 |
| 3.4.5 重组蛋白rSjPHB1及rSjPHB2的WB分析 |
| 3.4.6 rSjPHB1 重组蛋白特异性抗体ELISA检测 |
| 3.4.7 重组蛋白rSjPHB1及rSjPHB2 的动物免疫保护效果评估 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 SjPHB1与SjPHB2 表达、定位及RNA干扰研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 生物材料 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫荧光组化 |
| 4.3.2 日本血吸虫不同时期虫体cDNA模板合成 |
| 4.3.3 日本血吸虫PHB1和PHB2特异siRNA分子的筛选 |
| 4.3.4 siRNAs干扰试验 |
| 4.3.5 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 免疫荧光定位分析 |
| 4.4.2 qPCR分析SjPHB1和SjPHB2在日本血吸虫各时期虫体中表达水平 |
| 4.4.3 体外筛选干扰实验 |
| 4.4.4 体内干扰实验 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）日本血吸虫跨膜蛋白SjTMEM66P功能的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstracts |
| 第一章 引言 |
| 1.1 血吸虫及血吸虫病概况 |
| 1.1.1 血吸虫的分类和生活史 |
| 1.1.2 流行病学及防治 |
| 1.2 跨膜蛋白66的研究进展 |
| 1.3 RNA干扰技术 |
| 1.3.1 RNA干扰技术的原理 |
| 1.3.2 RNA干扰技术的发展与应用 |
| 第二章 日本血吸虫TMEM66P基因克隆、重组表达及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 生物信息学分析TMEM66P序列 |
| 2.2.2 PCR扩增及重组质粒构建 |
| 2.2.3 表达、纯化重组蛋白 |
| 2.2.4 Western Blot鉴定重组蛋白His标签 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 TMEM66P在日本血吸虫中的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 日本血吸虫TMEM66P在不同生长发育时期的表达 |
| 3.2.2 日本血吸虫TMEM66P在雌雄虫的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫TMEM66P的功能初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 筛选日本血吸虫TMEM66P的干扰si RNA |
| 4.2.2 si RNA-664 干扰日本血吸虫TMEM66P对其卵壳蛋白的影响 |
| 4.2.3 siRNA-664干扰日本血吸虫对虫体活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）捻转血矛线虫氨基肽酶的植物表达方法的建立及重组蛋白免疫效果评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 捻转血矛线虫及危害 |
| 1.1.1 捻转血矛线虫生活史及各阶段形态特征 |
| 1.1.2 捻转血矛线虫病流行病学特征 |
| 1.1.3 捻转血矛线虫病的危害、诊断及防控 |
| 1.2 寄生蠕虫疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 血吸虫病和片形吸虫病的疫苗研究进展 |
| 1.2.1.1 血吸虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1.2 片形吸虫疫苗研究进展 |
| 1.2.2 绦虫疫苗的研究进展 |
| 1.2.3 线虫疫苗的研究进展 |
| 1.2.4 合成多肽类疫苗在寄生蠕虫领域的研究 |
| 1.3 捻转血矛线虫的疫苗研究 |
| 1.3.1 捻转血矛线虫疫苗的研究现状 |
| 1.3.2 捻转血矛线虫优势抗原分子 |
| 1.3.2.1H11 |
| 1.3.2.2Hc23 |
| 1.3.3 捻转血矛线虫抗原Hc-ap-5、Hc-ap-8、Hc-ap-10和Hc23 的选择 |
| 1.3.4 疫苗免疫佐剂的选择 |
| 1.4 转基因植物表达抗原疫苗 |
| 1.4.1 植物表达系统的选择 |
| 1.4.2 转基因植物疫苗研究背景简述 |
| 1.4.3 植物表达制备寄生虫抗原的研究进展 |
| 1.4.4 转基因植物宿主的选择 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 3.3 主要试剂 |
| 3.4 主要溶液配置 |
| 3.5 试验方法 |
| 3.5.1 捻转血矛线虫人工感染方法的建立 |
| 3.5.2 捻转血矛线虫各时期虫体的收集 |
| 3.5.3 捻转血矛线虫iL3 g DNA的提取及鉴定 |
| 3.5.4 RNA的提取及c DNA的合成 |
| 3.5.5 Hc-ap-5、Hc-ap-8、Hc-ap-10及Hc23 c DNA的获取 |
| 3.5.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 3.5.7 PCR产物纯化及回收 |
| 3.5.8 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备 |
| 3.5.9 目的片段的连接与转化 |
| 3.5.10 菌液PCR鉴定 |
| 3.5.11 碱性裂解法提取质粒 |
| 3.5.12 植物双元表达载体pRIEGFP、pRIAP10、pRIAP8和pRIAP10op的构建 |
| 3.5.13 pRIEGFP、pRIAP10和pRIAP8 烟草瞬时表达 |
| 3.5.14 植物双元表达载体pH7AP8和pH7AP10~(op)的构建 |
| 3.5.15 pH7AP8和pH7AP10~(op)农杆菌介导烟草瞬时表达 |
| 3.5.16 pH7AP8、pH7AP10和pH7Hc23 核定位信号SV40 的添加 |
| 3.5.17 原核表达载体pE-SUMO-Hc-ap-5和pE-SUMO-Hc-ap-10 的构建 |
| 3.5.18 pE-SUMO-Hc-ap-5和pE-SUMO-Hc-ap-10的诱导表达,纯化和Western Blot鉴定 |
| 3.5.19 原核蛋白HC-AP-10和HC-AP-5 混合免疫山羊 |
| 3.5.20 粪便虫卵计数 |
| 3.5.21 真胃成虫计数 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 Hc-ap-5、Hc-ap-8、Hc-ap-10及Hc23 c DNA的获取 |
| 4.2 烟草表达pRI101-EGFP、pRIEGFP、pRIAP10和pRIAP8 |
| 4.2.1 pRIEGFP的构建 |
| 4.2.2 pRIAP8、pRIAP10和pRIAP10op的构建 |
| 4.2.3 农杆菌介导pRIEGFP、pRIAP8、pRIAP10和pRIAP10op烟草表达及Western Blot检测 |
| 4.2.3.1 农杆菌介导pRI101-EGFP表达 |
| 4.2.3.2 农杆菌介导pRIEGFP表达 |
| 4.2.3.3 农杆菌介导pRIAP10表达 |
| 4.2.3.4 农杆菌介导pRIAP8表达 |
| 4.2.3.5 农杆菌介导pRIAP10op表达 |
| 4.2.3.6 Western Blot检测pRI101-GFP、pRI EGFP、pRIAP8、pRIAP10和pRIAP10~(op)蛋白表达 |
| 4.3 烟草表达pH7AP8和pH7AP10~(op) |
| 4.3.1 植物双元表达载体pH7AP8和pH7AP10~(op)的构建 |
| 4.3.2 农杆菌介导pH7AP8和pH7AP10~(op)烟草表达及Western Blot检测 |
| 4.4 烟草表达pH7d NLSAP8、pH7d NLSAP10~(op)和pH7d NLSHc23 |
| 4.4.1 pH7d NLSAP8、pH7d NLSAP10~(op)和pH7d NLSHc23 表达载体的构建 |
| 4.4.2 pH7d NLSAP10~(op)、pH7d NLSAP8和pH7d NLSHc23 烟草表达及Western Blot检测 |
| 4.4.2.1 农杆菌介导pH7d NLSAP10~(op)的表达及Western Blot检测 |
| 4.4.2.2 农杆菌介导pH7d NLSAP8 的表达 |
| 4.4.2.3 农杆菌介导pH7d NLSHc23 的表达 |
| 4.5 Hc-ap-5和Hc-ap-10 的原核表达及动物实验 |
| 4.5.1 pE-SUMO-Hc-ap-5和pE-SUMO-Hc-ap-10的表达载体构建 |
| 4.5.2 pE-SUMO-Hc-ap-5和pE-SUMO-Hc-ap-10 的诱导表达 |
| 4.5.3 粪便虫卵计数 |
| 4.5.4 真胃成虫负荷 |
| 5.讨论 |
| 5.1 捻转血矛线虫氨基肽酶基因在植物双元表达载体构建时的元件对表达效率的影响 |
| 5.2 密码子优化对烟草表达寄生虫抗原的影响 |
| 5.3 重组Hc-AP-5和Hc-AP-10 混合物免疫保护性 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 捻转血矛线虫疫苗研究进展 |
| 附录二 植物表达寄生虫抗原的研究进展 |
| 附录三 寄生虫抗原在植物中表达时载体构建的元件 |
| 附录四 引物名称及序列(5’-3’) |
| 附录五 |
（6）miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 血吸虫及我国血吸虫病的流行及防控形势 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史及宿主的适宜性 |
| 1.1.2.1 日本血吸虫生活史 |
| 1.1.2.2 宿主适宜性 |
| 1.1.2.3 水牛和黄牛是我国血吸虫病主要传染源 |
| 1.1.3 血吸虫感染的免疫 |
| 1.1.3.1 宿主对血吸虫感染的天然免疫应答 |
| 1.1.3.2 宿主对血吸虫感染的适应性免疫应答 |
| 1.1.4 micro RNA及其在血吸虫上的研究 |
| 1.1.4.1 血吸虫宿主miRNA研究进展 |
| 1.1.4.2 虫体miRNA研究进展 |
| 1.1.5 真核翻译起始因子eIF4A研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 1.3.2 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.3 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 第二章 黄牛与水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 水牛和黄牛来源日本血吸虫成虫的收集 |
| 2.3.2 虫体RNA的提取 |
| 2.3.3 small RNA文库构建 |
| 2.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 2.3.5 已知显着性差异表达的miRNAs验证 |
| 2.3.5.1 引物设计 |
| 2.3.5.2 虫体miRNA提取 |
| 2.3.5.3 miRNA cDNA第一链合成 |
| 2.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 2.3.6 差异表达miRNAs的靶基因筛选及q RT-PCR验证 |
| 2.3.7 双荧光素酶验证实验 |
| 2.3.7.1 HEK293T细胞的培养 |
| 2.3.7.2 双荧光素酶共表达载体的构建 |
| 2.3.7.3 转染实验 |
| 2.3.7.4 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 2.4.2 黄牛和水牛源日本血吸虫已知miRNAs的比较分析 |
| 2.4.3 日本血吸虫成虫新miRNA的初步鉴定 |
| 2.4.4 采用qRT-PCR法验证五个差异表达的已知miRNAs |
| 2.4.5 五个显着性差异表达miRNAs的靶基因预测 |
| 2.4.6 靶基因的功能富集分析 |
| 2.4.7 采用qRT-PCR验证差异表达miRNAs的靶基因 |
| 2.4.8 双荧光素酶验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及血浆分离 |
| 3.3.2 血浆RNA的提取 |
| 3.3.3 small RNA文库构建 |
| 3.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 3.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 3.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 3.3.5.2 血浆miRNA提取及反转录 |
| 3.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 3.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 3.3.6 差异表达miRNAs的靶基因的q RT-PCR验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 3.4.2 黄牛和水牛血浆已知miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.4 黄牛和水牛感染血吸虫后血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.3 黄牛和水牛血浆新miRNAs的预测分析 |
| 3.4.4 差异表达miRNAs靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 3.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.3 黄牛和水牛在T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.5 黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 3.4.5.1 黄牛和水牛各时期血浆差异表达miRNAs的验证 |
| 3.4.5.2 血浆差异miRNAs的靶基因验证 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及PBMC的分离 |
| 4.3.2 PBMC中 RNA的提取 |
| 4.3.3 small RNA文库构建 |
| 4.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 4.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 4.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 4.3.5.2 PBMC中 miRNA的提取 |
| 4.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 4.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 4.3.6 差异表达miRNAs的靶基因预测及q RT-PCR验证 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 4.4.2 黄牛和水牛PBMC新 miRNAs的预测分析 |
| 4.4.3 黄牛和水牛PBMC已知miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.4 不同感染时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.4 差异表达miRNAs的靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 4.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.3 黄牛和水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.5 黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 4.4.5.1 黄牛和水牛各时期PBMC差异miRNAs的验证 |
| 4.4.5.2 PBMC差异miRNAs的靶基因验证 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物和尾蚴 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器及设备 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 Sj-eIF4A的生物信息学分析 |
| 5.3.2 Sj-eIF4A在日本血吸虫不同发育时期虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.2.1 不同发育时期的虫体收集 |
| 5.3.2.2 虫体RNA提取 |
| 5.3.2.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.3 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.3.1 不同宿主来源虫体的收集 |
| 5.3.3.2 虫体RNA的提取 |
| 5.3.3.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.4 原核表达质粒的构建 |
| 5.3.5 重组蛋白r Sj-eIF4A的表达与纯化 |
| 5.3.6 Sj-eIF4A基因特异性si RNA的筛选 |
| 5.3.6.1 Sj-eIF4A基因si RNA的合成 |
| 5.3.6.2 虫体的收集与体外培养 |
| 5.3.6.3 Sj-eIF4A基因的干扰效果分析 |
| 5.3.7 Sj-eIF4A基因体外最佳干扰时间的筛选 |
| 5.3.8 Sj-eIF4A基因的体内干扰实验 |
| 5.3.9 Sj-eIF4A基因的体外干扰实验 |
| 5.3.9.1 虫体收集与RNA长期干扰 |
| 5.3.9.2 体外长期干扰虫体结构变化观察 |
| 5.3.10 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 Sj-eIF4A基因的扩增与重组表达质粒的构建 |
| 5.4.2 日本血吸虫Sj-eIF4A基因的生物信息学分析 |
| 5.4.3 r Sj-eIF4A蛋白的纯化 |
| 5.4.4 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同发育时期的转录水平分析 |
| 5.4.5 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.4.6 siRNA干扰效果分析 |
| 5.4.7 RNA干扰引起Sj-eIF4A基因沉默的最佳时间分析 |
| 5.4.8 体内干扰Sj-eIF4A基因表达对虫荷数和肝脏虫卵数的影响 |
| 5.4.9 体外干扰Sj-eIF4A基因表达对虫卵的影响 |
| 5.4.10 体外干扰Sj-eIF4A基因对虫体形态的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与总结 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 6.1.2 黄牛和水牛血浆miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.3 黄牛和水牛外周血单核细胞miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A基因的克隆表达与特性分析 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 日本血吸虫 miRNA 测序流程图及Hsc20 扩增序列 |
| 附录 B 攻读博士学位期间主要学术成果和参加学术会议情况 |
（7）日本血吸虫SjELAV-like 1基因的克隆、表达及功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血吸虫概述 |
| 1.1.1 血吸虫的概况及防治 |
| 1.1.2 血吸虫的生活史 |
| 1.1.3 雌雄合抱是产卵、致病和传播的基础 |
| 1.2 胚胎致死异常视觉(ELAV)基因家族 |
| 1.2.1 ELAV概述 |
| 1.2.2 ELAV-like 1 概述 |
| 1.3 分子生物学技术及其应用 |
| 1.3.1 生物质谱技术 |
| 1.3.2 RNA干扰(RNAi)技术 |
| 1.3.3 电子显微镜技术 |
| 第二章 SjELAV-like 1 克隆、表达情况分析及组织定位 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种、质粒、血清和实验动物 |
| 2.1.2 生化试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 虫体的收集 |
| 2.2.2 SjELAV-like 1 基因的克隆 |
| 2.2.3 重组质粒p ET28a-SjELAV-like 1 的构建 |
| 2.2.4 SjELAV-like 1 的原核表达及重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 rSjELAV-like 1 重组蛋白多克隆抗体制备及Western Blot分析 |
| 2.2.6 SjELAV-like 1 在不同时期、不同状态虫体内转录水平分析 |
| 2.2.7 SjELAV-like 1 蛋白在虫体的定位分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SjELAV-like 1 基因的克隆及分析 |
| 2.3.2 SjELAV-like 1 基因的原核表达 |
| 2.3.3 SjELAV-like 1 蛋白具有较好的免疫原性 |
| 2.3.4 SjELAV-like 1 在不同时期虫体不同状态虫体内的表达情况 |
| 2.3.5 SjELAV-like 1 蛋白在虫体中主要分布于体被 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SjELAV-like 1 沉默对日本血吸虫的生物学影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 siRNA的筛选 |
| 3.2.2 siRNA的长期干扰 |
| 3.2.3 RNAi引起SjELAV-like 1 的沉默效果 |
| 3.2.4 SjELAV-like 1 沉默对虫体生物学的影响 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SjELAV-like 1 沉默效果检测 |
| 3.3.2 SjELAV-like 1 沉默肝脏荷卵数减少率和卵胚孵化减少率 |
| 3.3.3 SjELAV-like 1 沉默对虫体体被结构的影响 |
| 3.3.4 SjELAV-like 1 沉默对虫体生殖器官的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 致谢 |
（8）水牛抗日本血吸虫再感染和吡喹酮预防水牛感染日本血吸虫作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 血吸虫病概述 |
| 1.2 水牛在日本血吸虫病传播过程中的地位 |
| 1.2.1 水牛感染血吸虫后具有自愈能力 |
| 1.2.2 水牛感染日本血吸虫后自愈机制研究进展 |
| 1.3 吡喹酮对日本血吸虫的治疗及预防作用 |
| 1.3.1 吡喹酮的治疗作用 |
| 1.3.2 吡喹酮的预防作用 |
| 1.4 本研究的目的 |
| 第二章 水牛抗日本血吸虫再感染程度及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 生物材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 可溶性成虫抗原(SWA)的制备 |
| 2.3.2 试验安排 |
| 2.3.3 虫体收集及长度测量 |
| 2.3.4 水牛肝脏虫卵、直肠计数 |
| 2.3.5 水牛肝脏病变观察 |
| 2.3.6 外周血血清中IL-4、IL-5、IL-7、IL-10和IFN-γ含量差异分析 |
| 2.3.7 ELISA法测水牛血清中各抗体水平 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 2.4 试验结果 |
| 2.4.1 水牛虫体负荷数情况 |
| 2.4.2 虫体长度测量结果 |
| 2.4.3 水牛肝脏、直肠中虫卵情况 |
| 2.4.4 水牛肝脏病理病变观察 |
| 2.4.5 外周血清中细胞因子含量结果 |
| 2.4.6 水牛外周血清中抗体水平测定 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 PZQ预防水牛感染日本血吸虫的效果观察 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 生物材料 |
| 3.2.2 主要仪器及试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 试验安排 |
| 3.3.2 血清收集 |
| 3.3.3 扫描电镜观察虫体超微结构 |
| 3.3.4 其他试验方法 |
| 3.4 试验结果 |
| 3.4.1 虫体回收情况 |
| 3.4.2 虫体长度测量结果 |
| 3.4.3 水牛肝脏与直肠中虫卵情况 |
| 3.4.4 水牛肝脏病理病变观察 |
| 3.4.5 日本血吸虫成虫超微结构观察 |
| 3.4.6 外周血血清中细胞因子和抗体含量检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）宿主miR181a调节血吸虫感染后免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血吸虫概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 巨噬细胞在天然免疫应答中作用机制概述 |
| 1.4 宿主先天性免疫应答在抗日本血吸虫感染中的作用 |
| 1.5 miRNA生物学功能及研究概述 |
| 1.6 日本血吸虫宿主适宜性 |
| 1.7 本文总体研究思路 |
| 第2章 MiR181a对日本血吸虫童虫抗原刺激巨噬细胞的免疫应答起负调节作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SSA刺激RAW264.7巨噬细胞后miR-181a的表达变化分析 |
| 2.2.2 miR-181a模拟物、抑制剂转染RAW264.7细胞后促炎因子的表达分析 |
| 2.2.3 童虫抗原刺激RAW264.7细胞后细胞因子表达变化 |
| 2.2.4 miR-181a模拟物对SSA刺激RAW264.7细胞细胞因子表达的调节分析 |
| 2.2.5 miR-181a模拟物与抑制剂转染RAW264.7细胞INOS和arg-1的表达分析 |
| 2.2.6 流式细胞术检测巨噬细胞表面标志分子CD16/32、CD206的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 不同适宜性宿主感染日本血吸虫后体内miR-181a表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 miR181a表达水平的RT-qPCR检测 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 小鼠和东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后血清内miR181a表达分析 |
| 3.2.2 小鼠和东方田鼠感染血吸虫尾蚴后肝脏内miR181a表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 miR181a通过TLR4受体通路调节血吸虫感染促炎因子的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TLR4缺陷鼠体内miR181a的表达 |
| 4.2.2 LPS刺激巨噬细胞miR181a和TLR4表达分析 |
| 4.2.3 LPS刺激RAW264.7细胞后细胞因子的表达 |
| 4.2.4 miR181a通过TLR4受体通路调节细胞因子表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 血吸虫病与血吸虫 |
| 1.2 日本血吸虫 |
| 1.2.1 日本血吸虫的生活史 |
| 1.2.2 日本血吸虫的形态结构 |
| 1.2.3 日本血吸虫病的症状 |
| 1.2.4 中国血吸虫病的流行趋势及防治情况 |
| 1.3 湖北钉螺 |
| 1.3.1 湖北钉螺的分布及分类 |
| 1.3.2 湖北钉螺的形态结构及发育 |
| 1.4 外睾吸虫及其生活史 |
| 1.5 日本血吸虫幼虫在钉螺体内的生物控制 |
| 1.6 转录组比较分析湖北钉螺MIF (OhMIF)的差异表达 |
| 1.7 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的研究进展 |
| 1.7.1 MIF的发现 |
| 1.7.2 MIF的结构 |
| 1.7.3 MIF的生物学功能 |
| 1.8 立题背景及依据 |
| 第二章 鄱阳湖区生物控制资源初步调查及湖北钉螺MIF的鉴定与序列分析 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鄱阳湖区野生鲶鱼外睾吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.2 鄱阳湖区钉螺外睾吸虫及血吸虫感染情况调查与统计 |
| 2.3.3 OhMIF在四种不同感染情况钉螺中表达情况的验证 |
| 2.3.4 OhMIF的编码序列及理化性质分析 |
| 2.3.5 OhMIF多重序列比对及分析 |
| 2.3.6 OhMIF系统进化树的构建与分析 |
| 2.3.7 OhMIF的结构预测及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 湖北钉螺MIF细胞因子生物学活性的检测与分析 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 湖北钉螺总RNA的提取 |
| 3.3.2 OhMIF基因的克隆以及原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 OhMIF基因的原核诱导表达、纯化及浓缩 |
| 3.3.4 重组OhMIF蛋白多巴胺互变异构酶活性初步测定 |
| 3.3.5 氨基酸位点特异性突变 |
| 3.3.6 N端脯氨酸对于重组OhMIF多巴胺互变异构酶活性是必需的 |
| 3.3.7 ISO-1可有效地抑制重组OhMIF多巴胺互变异构酶的活性 |
| 3.3.8 重组OhMIF多巴胺互变异构酶动力学常数的测定 |
| 3.3.9 重组OhMIF氧化还原酶活性的检测 |
| 3.3.10 OhMIF抗血清的制备与纯化 |
| 3.3.11 互变异构酶活性对于OhMIF促进ERK1/2信号通路的活化并不是必需的 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 OhMIF在日本血吸虫感染不同时期的表达量变化 |
| 4.3.2 OhMIF在湖北钉螺体内的组织分布 |
| 4.3.3 OhMIF在湖北钉螺血淋巴细胞中的表达与定位 |
| 4.3.4 dsRNA介导的OhMIF表达水平的敲低 |
| 4.3.4.1 OhMIF dsRNA的合成 |
| 4.3.4.2 OhMIF表达水平的敲低及检测 |
| 4.3.5 湖北钉螺血淋巴细胞的鉴定与分类 |
| 4.3.5.1 基于血淋巴细胞的体积进行分类 |
| 4.3.5.2 基于血淋巴细胞的颗粒密度进行分类 |
| 4.3.6 敲低OhMIF表达水平能明显减少吞噬性血淋巴细胞的比例 |
| 4.3.7 OhMIF在血淋巴细胞的成熟与分化过程中起着重要的作用 |
| 4.3.8 OhMIF能够促进血淋巴细胞对日本血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.3.8.1 OhMIF在湖北钉螺体内能够促进血淋巴细胞向血吸虫感染部位的迁移 |
| 4.3.8.2 OhMIF能够在体外促进血淋巴细胞向血吸虫抗原的迁移和附着 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 湖北钉螺转录组和蛋白质组相结合鉴定生物控制血吸虫过程中差异表达的分子 |
| 5.1 实验目的 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 阴性湖北钉螺转录组分析 |
| 5.3.1.1 湖北钉螺原始转录组测序数据统计 |
| 5.3.1.2 转录组数据的从头组装 |
| 5.3.1.3 转录组数据基因注释信息统计 |
| 5.3.1.4 转录组数据基因功能注释结果分析 |
| 5.3.2 四种不同感染况钉螺全蛋白的完整性鉴定 |
| 5.3.3 利用iTRAQ技术对钉螺蛋白质组的测定与质量评估 |
| 5.3.3.1 肽段匹配误差分布 |
| 5.3.3.2 钉螺蛋白质鉴定的基本信息 |
| 5.3.4 iTRAQ蛋白质组学全谱分析 |
| 5.3.4.1 GO功能分类注释分析 |
| 5.3.4.2 KOG功能注释分类分析 |
| 5.3.4.3 KEGG注释通路分类分析 |
| 5.3.5 差异表达蛋白的鉴定与分析 |
| 5.3.5.1 差异表达蛋白统计 |
| 5.3.5.2 差异表达蛋白功能注释分析 |
| 5.4 讨论 |
| 总结与展望 |
| 附录1 图表索引 |
| 附录2 缩略语及中英文对照 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、吡喹酮氯仿油制剂治疗山羊日本血吸虫病研究（论文参考文献）
- [1]东毕吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶生物特性的初步研究[D]. 岳永程. 中国农业科学院, 2021
- [2]日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析[D]. 黄文铃. 武汉大学, 2020
- [3]日本血吸虫3天童虫蛋白质组学分析及SjPHB的生物学特性研究[D]. 杨珊珊. 中国农业科学院, 2020
- [4]日本血吸虫跨膜蛋白SjTMEM66P功能的初步探索[D]. 李雪. 中国农业科学院, 2020(01)
- [5]捻转血矛线虫氨基肽酶的植物表达方法的建立及重组蛋白免疫效果评估[D]. 张挺. 华中农业大学, 2020(02)
- [6]miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究[D]. 余新刚. 华南农业大学, 2019
- [7]日本血吸虫SjELAV-like 1基因的克隆、表达及功能的初步研究[D]. 许蓉. 山西农业大学, 2018
- [8]水牛抗日本血吸虫再感染和吡喹酮预防水牛感染日本血吸虫作用的研究[D]. 何川川. 中国农业科学院, 2018(12)
- [9]宿主miR181a调节血吸虫感染后免疫应答研究[D]. 唐仪晓. 上海师范大学, 2018(10)
- [10]日本血吸虫在钉螺体内被生物控制的分子机制初步探究以及MIF细胞因子在湖北钉螺对日本血吸虫免疫反应过程中的功能分析[D]. 黄帅钦. 厦门大学, 2018(08)