一、小鼠胚胎紧密化现象分子基础的研究进展（论文文献综述）
武彩霞[1]（2021）在《骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究》文中指出骡是马和驴种间杂交所生的杂种后代,大部分没有生殖能力。目前关于骡不育的原因还没有相关实验证明性结论。2011年,Saitou等人将小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）定向诱导为原始生殖样细胞（Primordial germ cell-like cells,PGCLCs）,成功得到了存活后代,并且在小鼠iPSCs上也得到了相同结果。在之后的研究中,利用不同方法也可将人和马iPSCs定向诱导为PGCLCs。本研究尝试利用干细胞具有多能性、可以长期稳定传代等优势将本实验室建立的可育母骡iPSCs（Fertile mule fibroblasts induced pluripotent stem cells）定向诱导为PGCLCs,为研究骡不育的生殖生物学机制提供科学依据。具体实验结果如下:1.克隆形态与碱性磷酸酶染色结果显示,骡FMF-iPSCs细胞核质比大,细胞之间连接紧密,克隆形态呈不规则扁平状,界限清晰且碱性磷酸酶染色呈阳性。2.核型分析结果显示,骡FMF-iPSCs染色体数目正常2N=63/XX,基因组稳定。3.实时荧光定量PCR及免疫荧光染色结果显示,骡FMF-iPSCs在RNA、蛋白水平均表达多能性标记基因OCT4、SOX2、NANOG。4.体外EBs分化结果显示:骡FMF-iPSCs具有体外分化为三个胚层的潜能,分化产物在RNA水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因HNF4A、HAND1、NESTIN,蛋白水平分别表达内、中、外三个胚层标记基因GATA6、T、NESTIN。5.骡FMF-iPSCs注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48 h后,组织切片荧光染色结果显示,该细胞系增殖、移动,有贡献到三个胚层与早期PGCs的潜能。6.PGCLCs定向诱导分化结果显示,三种不同诱导方法均可使FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs,RNA水平、蛋白水平分别表达PGCs标记基因NANOS3、BLIMP1、SOX17;VASA、BLIMP1。综上所述:本研究得到了在血清Li F培养体系中长期稳定传代的可育母骡FMF-iPSCs,该细胞系具有自我更新能力和多能性,并维持稳定的基因组特征;这类干细胞体外拟胚体分化具有贡献到三个胚层的潜能,注入6.5天小鼠胚胎内Epiblast处体外培养48h后干细胞能够增殖、移动,并贡献到三个胚层与PGCs。另一方面,通过三种不同诱导方法均可将FMF-iPSCs定向诱导为PGCLCs。上述研究探讨了骡FMF-iPSCs的干细胞特性及PGCLCs定向分化能力,为杂交动物细胞的干细胞诱导及相关研究提供重要科学依据。
王超群[2]（2021）在《基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响》文中进行了进一步梳理目的:通过体内动物实验,研究补肾经方母代干预对妊娠糖尿病（GDM）模型孕鼠胎鼠胰腺发育的影响;通过体外细胞诱导实验,研究补肾经方含药血清对小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的影响及其作用机制。方法:第一部分:通过雌雄大鼠2:1同笼合腹腔注射链脲佐菌素（STZ,正常对照组（N）注射生理盐水）的方法制备GDM孕鼠模型,将模型复制成功的孕鼠分为模型对照组（M）、门冬胰岛素组（MD）、六味地黄丸组（LW）、左归丸组（ZG）、右归丸组（YG）、肾气丸组（SQ）,门冬胰岛素以20U·kg-1的剂量皮下注射;其余组分别按5g·kg-1的剂量灌胃,灌胃体积为20m L·kg-1,N组和M组以等体积的生理盐水灌胃,每日一次,灌胃至P16d。实验过程中,观察孕鼠的一般情况,并定时检测其随机血糖、体重、摄食量;实验结束后取材,ELISA法检测孕鼠血清胰岛素水平;HE染色观察孕鼠胰腺、胎盘病理结构;称取胎盘重量,免疫荧光法检测胎盘IGF2的表达;Real Time-PCR及Western-blot法分别检测胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1和Insulin的m RNA及蛋白表达;免疫荧光法检测胎鼠胰腺DNMT1、DNMT3a、USP7等甲基化酶的表达;MSP及BSP法检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3甲基化情况。第二部分:按照小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的方法,分别用补肾经方含药血清干预诱导,分为正常组（N）、左归丸诱导组（ZG）、六味地黄丸诱导组（LW）、右归丸诱导组（YG）、肾气丸诱导组（SQ）,实验过程中每天观察细胞生长和诱导情况;分别于内胚层期、胰岛前体细胞期、胰岛内分泌前体细胞期、诱导结束后胰岛素分泌细胞期,检测各阶段标志物SOX17、FOXa2、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1的m RNA和蛋白表达;细胞成熟后,双硫腙染色鉴定细胞诱导是否成功;检测Insulin的m RNA和蛋白表达;不同浓度葡萄糖刺激后,检测培养液中Insulin及C-肽的表达,测定细胞的分泌能力。结果:第一部分:（1）模型制备结束后,GDM模型组孕鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状;胰腺组织出现胰岛体积缩小、胰岛细胞数量减少、空泡样改变以及炎性细胞浸润、明显出血点的病理变化;胎盘重量无变化,胎盘组织出现蜕膜区变窄、毛细血管扩张、滋养细胞溶解坏死、细胞胞质空泡样变化等病理改变;M组孕鼠随机血糖、摄食量明显高于N组（P<0.05）,体重显着降低（P<0.05）;M组胎盘IGF2、胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的m RNA和蛋白表达均较N组显着降低（P<0.05）;胎鼠胰腺DNMT1、DNMT3A、USP7甲基化转移酶蛋白表达均显着降低（P<0.05）;M组胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3甲基化率较正常组均显着降低（P<0.05）,且其甲基化率与基因表达呈依赖性相关趋势。（2）补肾经方干预后,GDM孕鼠状态改善,胰腺及胎盘病理改变均有不同程度好转;与M组比较,MD与补肾经方组孕鼠血糖均显着降低,体重显着升高（P<0.05）,但与MD组比较,补肾经方组孕鼠血糖显着升高,体重显着降低（P<0.05）;与M组比较,MD组与ZG组胎盘IGF2、胎鼠胰腺PDX-1、HNF-3β、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的m RNA及蛋白表达均显着升高（P<0.05）,LW组PDX-1、Ngn3、Nkx6.1的m RNA表达无差异,HNF-3β表达较M组升高（P<0.05）,Insulin的m RNA表达显着降低;YG组的Ngn3、Nkx6.1的m RNA表达显着升高（P<0.05）,Insulin的表达显着降低（P<0.05）,而PDX-1、HNF-3β的m RNA表达较M组无差异;SQ组的PDX-1、Ngn3、HNF-3β的m RNA表达较M组无差异,Nkx6.1的m RNA表达显着升高（P<0.05）,Insulin表达显着降低（P<0.05）;蛋白检测示,LW、SQ组各指标蛋白表达均较M组无差异,YG组HNF-3β、Ngn3蛋白表达较M组无差异,PDX-1、Nkx6.1蛋白表达显着升高（P<0.05）,Insulin的蛋白表达显着降低（P<0.05）;与M组比较,MD及补肾经方组DNMT1、DNMT3A、USP7甲基化转移酶蛋白表达均显着升高（P<0.05）,与MD组比较,ZG组DNMT1、DNMT3A、USP7表达显着升高（P<0.05）,其余组三者较MD组显着降低（P<0.05）或无差异;与M组比较,MD、ZG和LW组PDX-1、Ngn3甲基化率显着升高（P<0.05）,YG及SQ组显着降低（P<0.05）,与MD组比较,ZG组PDX-1甲基化率显着升高（P<0.05）,其余无差异。第二部分:（1）内胚层阶期:与N组比较,ZG、LW组SOX17免疫组化光密度值无差异,YG及SQ组显着降低（P<0.05）,ZG组FOXa2较N组显着增高（P<0.05）;与N组比较,ZG组SOX17蛋白表达显着升高（P<0.05）,其余组显着降低（P<0.05）;补肾经方组FOXa2较N组显着降低（P<0.05）,其余补肾经方组较ZG组显着降低（P<0.05）;与N组比较,SOX17、FOXa2 m RNA表达无差异,其余组显着降低（P<0.05）。（2）胰岛前体细胞期:与N组比较,ZG组PDX-1 m RNA表达及基因甲基化率均显着升高（P<0.05）,蛋白表达显着降低（P<0.05）,其余三组PDX-1 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均较ZG组显着降低（P<0.05）。（3）内分泌前体细胞期:与N组比较,ZG组Ngn3 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均无差异,其余组Ngn3 m RNA、基因甲基化率及蛋白表达均较ZG组显着降低（P<0.05）。（4）胰岛素分泌细胞期:与N组比较,ZG组Nkx6.1、Insulin的m RNA及蛋白表达均显着升高（P<0.05）,LW组Insulin m RNA表达显着升高（P<0.05）,其余均较ZG组显着降低;各组双硫腙染色均呈红棕色阳性表达;不同浓度葡萄糖刺激下,与N组比较,ZG组Insulin及C-肽分泌量无差异或显着升高,且随着葡萄糖浓度的升高,其分泌量有升高趋势;而其余组在不同浓度葡萄糖刺激下,均较N组显着降低（P<0.05）,且三组之间比较无差异。结论:（1）通过比较补肾经方对GDM胎鼠胰腺发育的影响作用发现,左归丸可以改善母代胰腺及胎盘的病理变化,并通过提升PDX-1、Ngn3的甲基化水平提升PDX-1通路上HNF-3β、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的基因表达,整体促进GDM孕鼠胎鼠胰腺的发育,六味地黄丸、右归丸、肾气丸对胎鼠胰腺发育无明显促进作用。（2）通过比较补肾经方对小鼠胚胎干细胞定向诱导的作用发现,左归丸可以通过提升PDX-1、Ngn3的甲基化水平提升诱导各阶段标志物HNF-3β、PDX-1、Ngn3、Nkx6.1及Insulin的基因表达,促进小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞方向的诱导分化,六味地黄丸、右归丸及肾气丸对小鼠胚胎干细胞的诱导分化无促进作用。（3）左归丸对胎鼠胰腺发育及小鼠胚胎干细胞定向诱导分化的促进作用可能与其填补肾精的作用有关,反映出填补先天肾精对胚胎组织器官发育的重要性,从分子生物水平为中医“元精乃无形之水”、“精者,身之本也”等理论提供了科学依据。
祝振硕[3]（2020）在《OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制》文中指出猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显着下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显着升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显着下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞（Feeder free,F-）时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX（Feeder and DOX free,FD-）会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因（OCT4/SOX2）整体蛋白水平也显着下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显着升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显着上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显着降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显着影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS）来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。
彭颖[4]（2020）在《Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究》文中研究表明Notch信号是一种进化保守且能调节多种细胞发育的信号通路,在发育过程中其对细胞间的通讯和细胞命运的决定具有重要意义,也是组织稳态所必需的。Notch的配体（Dll1、3、4和Jag1、2）和受体（Notch1-4）均为跨膜蛋白,经典的Notch激活方式是当膜上的配体与相邻受体结合后会促使受体胞内结构域剪切入核,作为转录共激活子与RBPJ共同激活下游靶基因的转录。大量的研究已表明,Notch信号通路在早期肌节和四肢骨骼肌的发育过程中均具有重要的作用;在胎儿期,Notch可以调控肌肉干细胞定位到基质膜与肌纤维膜之间形成出生后再生过程所必须的肌卫星细胞（SCs）;而在成年期,Notch调控着肌卫星细胞静息状态的维持、自我更新和分化的平衡。虽然在肌肉发育过程中Notch信号的作用已经明确,但在活体水平具体是来自何种肌肉细胞的哪一种配体主要调控Notch信号及肌肉干细胞功能还不明确。因此本试验首先通过分析肌肉组织和肌肉干细胞数据库解析了5个配体在肌肉中的表达模式以及表达水平,并通过实验验证其表达,确定了Dll1是肌肉发育过程中高表达的配体。接着,通过制备Myo DCre、MLCCre以及Pax7Cre ER驱动的Dll1肌肉细胞特异性敲除鼠,探索来自哪类肌细胞的Dll1对肌肉的发育和再生产生影响。随后,通过成肌细胞及肌纤维培养、活体追踪等实验进一步明确了Dll1对肌肉干细胞命运的调控。最后,探索了在肌肉干细胞中Dll1调控Notch信号的作用方式。获得主要结果如下:1.对已有的肌肉相关测序数据分析显示,在肌肉组织和肌肉干细胞中配体Dll1和Jag1的表达水平较高;在成肌分化过程中Dll1、Jag2和Dll4表达水平显着上升,Jag1变化波动不明显。2.通过cre-loxp系统构建了MLCCre-Dll1(Dll1MLCKO)敲除鼠。分析肌肉显示,肌纤维中敲除Dll1并不影响肌肉的发育;肌纤维中敲除Dll1并不能显着影响肌肉的再生且对SCs的数目无显着调节;跑步测试实验证明肌纤维中敲除Dll1不影响肌肉的运动能力。3.Myo DCre-Dll1(Dll1Myo DKO)敲除鼠在15天左右出先胚胎死亡。肌肉细胞中敲除Dll1导致了严重肌肉发育不良,并且出现肌肉干细胞的严重缺失。进一步研究发现Dll1Myo DKO敲除鼠从E11.5天开始出现肌节和四肢骨骼肌肌肉干细胞的消耗。这一过程伴随着Myo G阳性细胞数比例的瞬时上调。4.Pax7Cre ER-Dll1(Dll1Pax7KO)敲除鼠在出生后诱导Dll1敲除,下调了肌肉重量及肌纤维大小,同时伴随着肌肉干细胞数目的显着下降。出生后敲除Dll1损害了肌肉的再生,且显着下调了再生状态下SCs的数目。成年期注射TMX诱导Dll1在肌肉干细胞中特异性敲除,显着下调了稳态下的SCs数目。在单次CTX损伤后,敲除Dll1并不能显着影响再生,但SCs数目显着下调。CTX诱导多次损伤后,Dll1Pax7KO鼠出现严重的再生缺陷且伴随着SCs大量缺失。5.体内外实验显示,敲除Dll1抑制了肌肉干细胞的自我更新,对成肌细胞的增殖无显着影响,但促进了成肌细胞的分化。6.共培养成肌细胞实验证明,野生鼠成肌细胞与Dll1KO成肌细胞共培养后并不能回补Dll1的作用,且Notch信号无差异。综上所述,在肌肉组织中肌纤维源的Dll1对肌肉干细胞的功能无显着影响,而肌肉干细胞特异的Dll1对其功能的维持是必不可少的。Dll1能够通过调控肌肉干细胞的稳态的维持、自我更新和分化来调控肌肉干细胞库。并且在这一调控过程中Dll1以细胞自主的方式调控自身Notch和细胞功能。
郑小曼[5]（2020）在《利用RNA-Seq技术分析KDM4A在小鼠早期胚胎发育过程中的作用研究》文中指出小鼠早期胚胎发育是一个复杂而精细的过程,其中包含合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）、胚胎致密化（Compaction）以及第一次细胞分化（即第一次命运决定）等多个关键性的事件,在这些过程中有多个转录因子和表观修饰因子发挥重要作用。对这些关键调控因子在胚胎发育过程中的作用机制进行探究,是我们了解发育过程复杂性和系统性的基础。然而在小鼠胚胎早期发生过程中ZGA的主要决定因素尚有争议。本实验室通过高通量测序技术研究发现由KDM4D和KDM4E调控牛IVF胚胎ZGA时期组蛋白H3的赖氨酸9二甲基和三甲基化修饰的抹除和胚胎发育,并在SCNT胚胎中影响体细胞重编程。KDM4A（JMJD2A）作为一种赖氨酸脱甲基酶,也能够从组蛋白H3的赖氨酸9去除二甲基和三甲基化,从而维持转录活性。但迄今为止,还没有研究详细探讨KDM4A在正常发育过程中的生理作用。本研究通过对KDM4A敲除型和野生型早期胚胎的高通量测序数据进行生物信息学分析,并通过显微注射技术对小鼠受精卵中KDM4A基因的表达进行干扰,以此研究KDM4A在小鼠早期胚胎发育中的生物学功能。研究结果如下:（1）通过生物信息学方法对KDM4A敲除和野生型小鼠的RNA-Seq数据进行差异基因和可变剪接分析,结果显示KDM4A敲除型与野生型小鼠胚胎相比,基因表达和剪接模式有显着差异,这些基因具有差异明显的生物学功能,而这些差异可能是由于KDM4A通过调控组蛋白修饰和剪接因子相关基因的表达产生的。（2）通过定量实验,确定了小鼠早期胚胎发育过程中KDM4A基因表达模式。（3）通过干扰片段显微注射实验,研究敲降KDM4A基因对小鼠胚胎发育的影响。结果发现,干扰KDM4A基因不影响2细胞期胚胎的卵裂率,但早期胚胎的囊胚率降低,证明其对早期胚胎发育有促进作用。（4）对干扰KDM4A的小鼠2细胞期胚胎进行HSP70.1、Zscan4d等合子基因表达的定量验证,结果表明KDM4A参与部分小鼠合子基因的激活。（5）免疫荧光染色和Western Blot实验检测敲降KDM4A基因的2细胞期小鼠胚胎中H3K9me3的修饰,并通过定量对DDX39、Hnrnpu、Prpf38a以及Rbm39剪接因子基因进行检测,实验结果表明KDM4A可通过去除2细胞期H3K9me3修饰以及影响剪接因子相关基因的表达调控小鼠早期胚胎发育。综上所述,本论文研究了赖氨酸脱甲基酶KDM4A在小鼠早期胚胎发育过程中的生物学功能,验证了KDM4A通过参与去除2细胞期小鼠胚胎H3K9me3修饰以及影响剪接因子相关基因的表达调控小鼠胚胎后续发育。
张辰[6]（2020）在《有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究》文中提出在心脏发育过程中,心肌细胞增殖对心室壁形态发生和心肌致密化过程起到了关键作用,心肌细胞增殖异常与心肌致密化不全的发生密切相关。有机氯农药五氯硝基苯（Pentachloronitrobenzene,PCNB）是一种农业生产中广泛使用的土地杀菌剂,在生态系统中具有较强的生物富集性,给农作物生产和食品安全带来了严重的隐患。本研究基于前期工作基础进一步探究了 PCNB影响心肌细胞增殖以及诱导心脏发育毒性的机制。我们对E8.5天的孕鼠（C57BL/6N）分别进行玉米油和PCNB连续灌胃给药,对E14.5和E17.5胎鼠心脏组织进行病理学检测。HE染色结果显示PCNB处理没有引起明显的心脏发育结构缺损,而对心室小梁区和心肌致密层区域厚度进行测定发现,PCNB孕期暴露引起胎鼠心脏组织左右心室过度小梁化,致密层区变薄,心室非致密化比例显着升高,表现出心室致密化不全样病理表型。为了探究PCNB引起心肌致密化不全的可能机制,我们对心脏组织及心肌细胞的增殖和凋亡情况进行检测。免疫荧光染色检测结果显示PCNB处理引起胎鼠心室壁致密层区心肌细胞周期标志物Ki67和有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）水平降低,TUNEL染色结果显示PCNB处理没有诱导明显的胎鼠心肌细胞凋亡,表明PCNB主要诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常,抑制增殖。进一步我们利用体外心肌细胞探究了 PCNB的毒性效应,分别用不同浓度PCNB处理大鼠心肌细胞H9c2,EdU染色发现PCNB剂量依赖性抑制心肌细胞增殖,pH3免疫荧光染色显示PCNB抑制体外心肌细胞有丝分裂,而流式检测表明PCNB没有诱导细胞发生明显的凋亡现象。这些结果表明PCNB可能通过诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常,抑制细胞增殖活性而引起心室致密化不全。为了探索PCNB诱导心室致密化不全表型的分子机制,对照组和PCNB处理组E17.5胎鼠心脏组织进行RNA-seq分析,结果显示PCNB处理导致心脏组织内97个基因上调,92个基因下调。GO分析结果表明差异表达基因主要与细胞有丝分裂、染色体分离以及动粒和微管结合相关。差异表达基因互作网络分析表明动粒核心组分（包括NDC80复合物成员Hec1、Nuf2、Spc25）以及动粒微管互作调控因子位于差异表达基因互作网络的中心位置,候选基因RT-PCR分析也验证转录组测序结果。作为有丝分裂过程的核心事件,染色体的正确排列与分离由动粒和纺锤体微管的动态相互作用协调实现,其中Hec1构成动粒上核心的微管结合位点,在染色体分离中发挥核心作用。我们初步候选Hec1作为PCNB作用的关键靶分子进行进一步探究。免疫组化检测结果显示Hec1在胎鼠心脏组织内整体均有分布,在心肌细胞增殖活性较高的心室壁致密层区高表达。PCNB处理下调心脏组织内Hec1的mRNA和蛋白水平。对心脏组织切片HE染色进行观测发现PCNB处理引起细胞核型异常比例显着增加,对纺锤体标志物β-tubulin免疫荧光染色发现PCNB引起心脏组织内细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常。体外心肌细胞实验结果表明,PCNB处理下调Hec1的表达,诱导心肌细胞纺锤体的形态和染色体排列、分离异常,干扰细胞有丝分裂,抑制细胞增殖活性。细胞免疫荧光染色结果显示,心肌细胞内源性Hec1主要表达分布于有丝分裂期细胞动粒内。利用siRNA敲低Hec1抑制心肌细胞增殖和有丝分裂,导致单极和多极纺锤体比例显着增加,而正常的双极纺锤体比例明显降低,加剧了 PCNB对心肌细胞增殖和有丝分裂的抑制作用,心肌细胞内过表达Hec1能够显着抑制 PCNB引起的心肌细胞纺锤体形态异常以及细胞增殖和有丝分裂活性的降低。这些研究结果提示PCNB抑制心肌细胞增殖和有丝分裂可能因为下调Hec1的表达,影响动粒与纺锤体微管的相互结合。本研究结果表明PCNB暴露抑制心肌细胞增殖,引起胎鼠心肌致密化不全样表型,其作用机制可能与PCNB下调NDC80复合物组分Hec1等动粒相关蛋白的表达,诱导心肌细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常,导致有丝分裂阻滞有关。
李涛[7]（2019）在《1-氨基环丙烷-1-羧酸：恶臭假单胞菌UW4向作物根际定殖的关键趋化物》文中认为进入二十一世纪,化肥和农药滥施对我国土地资源破坏严重且带来了一系列食品安全问题。植物促生菌肥即植物根际促生细菌（plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR）制成的生物制剂,PGPR主要包括固氮根瘤菌、溶磷或解钾菌、其他生防菌类等,可在作物根系或根际土壤中定殖存活,从而促进作物生长发育或抑制周围环境中病原菌的生长。PGPR作为一种微生物肥料,在发展绿色农业上应用前景广阔。然而,PGPR菌肥在实际应用中的促生效果并不稳定,实验室肥效显着,大田施用后效果并不稳定,会因地块地理位置、土壤营养状况、作物品种及施用年份不同受到影响,因此开展高效PGPR菌株选育及其促生机理的研究具有十分重要的意义。PGPR能否有效发挥作用,主要决定于能否和作物根际其他土着微生物群落竞争取胜,从而在作物根部或根际土壤中稳定生长繁殖。PGPR可感知作物根际环境中根系分泌物的浓度变化,借助趋化作用到达植株根际并在根际形成稳定的菌膜结构。趋化性是指细菌感知周围环境中化学物质的浓度梯度后借助鞭毛等运动器官所作出的趋向引诱剂或远离排斥物的反应。将PGPR与趋化作用相关的基因敲除后,PGPR在作物根际的生存繁殖能力显着下降,大量研究表明PGPR在作物根际的定殖数量直接影响其对作物的促生效果。通过本课题研究我们尝试找出促使PGPR向作物根际定殖的关键趋化物质,同时开展高效PGPR菌株选育,以期稳定和提高PGPR的大田施用效果,主要研究成果如下:1、ACC是恶臭假单胞菌UW4的强趋化物采用平板点滴趋化分析方法,将UW4对ACC、植物根系分泌物中常见的其他8种氨基酸以及7种有机酸的趋化响应强度进行了对比,结果发现:精氨酸和琥珀酸对于UW4是强趋化物,然而,UW4对ACC的趋化强度要显着高于这二者。毛细管趋化法定量测定了UW4对ACC、精氨酸和琥珀酸趋化响应阈值及峰值浓度,发现UW4对ACC的趋化阈值为5×10-5M,峰值浓度为5×10-2M,其趋化响应强度高于精氨酸及琥珀酸。同时用定量毛细管趋化法比较了UW4对ACC和人工模拟根系分泌物（artificial root exudate,ARE）的趋化能力,试验结果发现:UW4对ACC的趋化响应最强,对ACC和ARE混合物趋化较弱,对ARE趋化最弱,表明ACC是UW4的强趋化物。2、ACC应是恶臭假单胞菌UW4向作物根际和真菌菌丝定殖的关键趋化物将UW4、UW4△AcdS及构建的cheR基因缺失突变及回补菌株与双孢蘑菇进行共培养,测得UW4及UW4△cheR+cheR菌株在真菌菌丝表面的定殖数量较多,而UW4△AcdS和UW4△cheR菌株数量较少（p＜0.05）。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）具有和植物相同的乙烯合成途径,菌丝分泌物中也含有ACC。采用组培瓶栽小麦的方法测定了各菌株在小麦根际的定殖情况与双孢蘑菇相似。将上述菌株接种至小麦种子进行盆栽实验,结果发现:UW4和UW4△AcdS和UW4△cheR+cheR处理的小麦根长、根重、茎长、茎重均显着高于UW4 △AcdS和UW4 △cheR（p ＜0.05）。表明ACC应是恶臭假单胞菌UW4向作物根际和真菌菌丝定殖的关键趋化物。3、提高恶臭假单胞菌UW4对ACC的代谢速率增强其对ACC的趋化响应强度和根际定殖量提高对代谢依赖型趋化物的代谢速率是否能够增强细菌的趋化响应强度尚未见报道。我们采用同源重组技术将细菌组成型强启动子PB20序列无痕敲入UW4的AcdS基因的上游,成功构建了 ACC脱氨酶高效表达菌株UW4-PBA。采用荧光定量PCR测定UW4-PBA菌株AcdS基因表达量,在未加入ACC时是对照的约30倍,加入ACC诱导45min后上升至约81倍,其AcdS基因表达量与ACC诱导后的UW4的表达量间无显着性差异（p＜0.05）。此外,UW4-PBA菌株的ACC脱氨酶活力比UW4高约6μmoL/(μg·min,且数据间差异显着（p＜0.05）。定性趋化结果显示,UW4-PBA对ACC、γ-氨基丁酸、精氨酸及琥珀酸的趋化圈直径明显大于UW4,且数据间有显着性差异（p＜0.05）。将其与本课题组成员前期构建的带有强中弱启动子PB20、PB10、PB1及UW4AcdS基因自身启动子的 UW4 △AcdS+PB20-AcdS、UW4△AcdS+PB10-AcdS、UW4△AcdS+PB1-AcdS、UW4△AcdS+PA-AcdS菌株、野生株UW4及UW4△AcdS接种至小麦根际,无菌瓶栽实验结果显示,UW4-PBA菌株在小麦根际的定殖数量最多,UW4△AcdS+PB1-AcdS及UW4△AcdS菌株定殖数量则较少,各数据间存在显着性差异（p＜0.05）;将上述菌株接种小麦种子后进行盆栽（非无菌条件）,实验发现:UW4-PBA菌株在盆栽小麦根际定殖数量显着高于其他6个菌株（p＜0.05）,UW4 △AcdS+PB20-AcdS和UW4-PBA处理的小麦根长显着高于其他菌株,UW4 △Acds+PB20-AcdS、UW4-PBA和UW4菌株处理后的小麦根重显着高于其他几个菌株,UW4 △AcdS+PB20-AcdS、UW4-PBA菌株处理后的小麦茎重也显着高于其他几个菌株（p＜0.05）。综上所述,提高对ACC的代谢速率能够显着增强UW4对ACC的趋化响应强度及向根际趋化的能力,这一结果更证实ACC确是UW4向作物根系或根际土壤趋化定殖的关键趋化物。4、恶臭假单胞菌UW4的ACC趋化受体的鉴定采用荧光定量PCR测定了 UW4中28种拟趋化受体蛋白的表达情况,筛选出了 ACC诱导下高表达的四个候选拟趋化受体蛋白分别为wp116、wp375、wp616和wp718;分别构建出这四个拟趋化受体基因的敲除突变株及回补株,平板点滴趋化实验发现:与野生株UW4相比,UW4△wp116完全丧失了对ACC、γ-氨基丁酸和精氨酸的趋化,但对琥珀酸的趋化基本未受影响,UW4△wp116+wp116则恢复了对 ACC、γ-氨基丁酸和精氨酸的趋化作用,UW4△wp375、UW4△wp616、UW4△wp718 对 ACC、γ-氨基丁酸、精氨酸及琥珀酸的趋化强度有一定影响但并未造成趋化丧失,因此推断wp116可能是ACC的趋化受体,但并非特异性受体,ACC与部分蛋白质类氨基酸的趋化受体可能同为wp116。将wp116的配体结合结构域在大肠杆菌中表达并纯化,应用荧光热漂移分析发现,该配体结合结构域与ACC亲和力最强,据此推测wp116应为ACC的趋化受体。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC）是植物根际分泌物的重要成分,是否是细菌的趋化物尚未见报道。通过本研究我们发现,UW4能够趋化ACC,而其ACC脱氨酶（ACC deaminase,AcdS）基因缺失突变株 UW4 △AcdS和趋化蛋白甲基转移酶（chemotaxis protein methyltrans-ferase,CheR）基因缺失突变株UW4 △cheR则不趋化ACC。与其他趋化物质相比UW4对ACC的趋化响应最强,提高恶臭假单胞菌UW4对ACC的代谢速率可显着增强其对ACC的趋化响应强度和根际定殖量,推测ACC是UW4的一种新的代谢依赖型趋化物且为UW4竞争性定殖于作物根际的关键趋化物质。
关震[8]（2019）在《Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析》文中指出血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）是多种类型细胞的分裂刺激素,在胚胎发育过程中,与多种器官间充质细胞、平滑肌细胞、血管周细胞以及肾脏的系膜细胞的发育密切相关,起到重要的调控作用。PDGF有四种亚型,包括PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD。具备生物活性的PDGF是由二条PDGF蛋白肽链组成的二聚体。一共可以形成五种具有活性PDGF配体,其中四种为同源二聚体,包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD;一种为异源二聚体PDGF-AB。PDGF通过激活二种酪氨酸激酶受体发挥作用,分别是血小板源性生长因子受体α和β（platelet-derived growth factor receptors,PDGFRαand PDGFRβ）。当PDGF配体结合到PDGFR时,可促使PDFGR二聚体化,从而激发受体激酶的活性。因此,PDGF信号可以通过三种类型的PDGFR二聚体传导,包括同源二聚体PDGFRαα和PDGFRββ和异源二聚体PDGFRαβ。有关PDGF信号通路在心脏发育中的功能及其调控机制所知甚少。本研究利用转基因和基因敲除小鼠模型,对Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能及调控机制进行了深入的研究,为进一步理解PDGF信号通路在心脏中的作用提供了重要的实验数据。首先,系统检测了Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏中的表达。收集E10.5-E16.5各时期野生型小鼠胚胎,利用免疫荧光检测了Pdgfrα蛋白在各时期小鼠胚胎心脏中的表达模式。在E10.5-E11.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中显着表达,在心房细胞中几乎不表达。在E12.5时,Pdgfrα的表达与E10.5-E11.5一致,只是其在心室细胞中的表达强度下调。到了E13.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中也不再表达。到了E14.5-E16.5小鼠胚胎胚中,Pdgfrα在心脏的心室细胞中又开始出现表达,只是其整体表达强度较E10.5-12.5时期的低,同时其仍不在心房中表达。进一步利用Nkx2.5（工作心肌细胞的特异标记蛋白）抗体,检测其与Pdgfrα在心室中共表达情况,发现在E14.5-E16.5时期的胚胎心脏中,表达Pdgfrα的心室细胞不属于工作心肌细胞,而是心室中其他类型细胞（如成纤维细胞等）。此外,利用免疫荧光检测了Pdgfrα在E12.5-E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中的表达模式。结果发现,从E12.5开始,Pdgfrα在窦房结中就有强烈的表达。随着小鼠胚胎不断发育,Pdgfrα在窦房结的表达量不断增强,一直到E15.5。但在E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中,Pdgfrα的表达反而显着下调。Pdgfrα在早期（E10.5-E12.5）胚胎几乎所有的心室细胞（前体细胞）中表达,随后其表达转移到非工作心肌细胞中（主要为心肌间成纤维细胞等）。这预示着,Pdgfrα基因可能在调控心脏细胞的发育分化过程中发挥重要的作用。而且,可能与窦房结的形态发育有关。已有的报道表明,在PdgfrαEgfp/Egfp小鼠中,全敲除Pdgfrα可导致包括窦房结在内的静脉窦心肌细胞发育不全,并伴随Nkx2.5表达的上调。由于全敲除小鼠在E8.5后开始死亡,很难对其中的发育机制开展深入的研究。在本研究中,为解决早期胚胎死亡问题,我们利用Shox2-Cre和Pdgfrαflox/flox位点制备Pdgfrα在窦房结特异性敲除的小鼠模型,进一步开展研究。但我们惊奇的发现,与同窝对照小鼠比较,在Pdgfrα敲除小鼠中,未见窦房结的形态发育及心率和心电图异常。本研究又回头对E13.5PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的窦房结进行了深入的检查,发现截止E13.5时,突变小鼠的窦房结形态也同窝野生型小鼠比较也未见任何异常,免疫荧光检测显示,Nkx2.5的表达水平也没有改变。我们认为,在小鼠窦房结的早期形态发生过程中,Pdgfrα不是必须的。我们的研究结果修正了前人有关对窦房结发育过程中Pdgfrα所起的作用的认识。在上一章的研究中,我们发现了PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的心室壁的内层心肌发育异常,表现出人类心肌致密化不全的表型。由于PdgfrαEgfp/Egfp小鼠是全身性敲除了Pdgfrα,头部等器官发育异常,大部分胚胎约在E8.5死亡。虽然孕鼠在注射异丙肾上腺素后,可少量获得发育到E13.5的胚胎,但很难有效的进行Pdgfrα的敲除研究。因此我们进一步利用心肌细胞特异性的c Tn T-Cre小鼠与Pdgfrα条件性敲除小鼠(Pdgfrαflox/flox)交配,构建的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠可存活至出生左右。收获E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox胚胎进行细胞增殖、凋亡和下游分子机制等研究。我们首先精确分析了在野生型不同胚胎期小鼠心肌细胞的增殖情况,发现从E13.5开始,随着胚胎的发育,工作心肌细胞的增殖率呈现逐渐降低的趋势。其次我们对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠心肌进行了细胞增殖测定,发现在心肌中Pdgfrα表达缺失明显导致了该时期心肌细胞增殖速率下调。随后我们还进行了细胞凋亡检测的发现,心肌中Pdgfrα表达缺失并不会导致细胞凋亡异常。我们进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox和同窝对照的野生型小鼠的心室心肌进行了转录组差异基因分析,筛选出133个在敲除小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和52个在敲除小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。进一步对这些基因进行了GO功能富集分析。发现上调和下调基因都在心肌组织发育,调节心脏生长等功能注释中大量富集。在这些差异基因中,Nkx2.5的表达随着Pdgfrα的敲除呈现明显的上调。利用免疫荧光,在E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox心肌中验证了这一结果,同时也通过荧光定量PCR验证了部分转录组筛选出来的差异基因在c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox中的表达水平。综上所述,我们发现了在心肌中敲除Pdgfrα会导致细胞的增殖明显下调,并且导致心肌分化的关键基因Nkx2.5表达量明显上调,因此PDGF信号通路在心室心肌分化中有可能是通过Nkx2.5来发挥调控心肌增殖与发育分化。基因的缺失和过表达是遗传学小鼠研究中常见的研究方法。在第三章节的实验结果之上,我们进一步利用PDGFRα信号通路的条件性激活PdgfrαJ/+和PdgfrαK/+小鼠分别与c Tn T-Cre小鼠交配,在心脏中特异性激活Pdgfrα信号通路,并且进行表型分析和分子机制探究。其中PdgfrαJ/+小鼠是通过Pdgfrα的激酶区域位点的突变,实现PDGFRα信号通路的持续激活;PdgfrαK/+小鼠是通过突变Pdgfrα的活性抑制位点,实现PDGFRα信号通路的持续激活;K位点突变的活性增加量是J位点5倍。实验结果显示c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠均能正常出生,而且成年。对这2种PDGFRα信号通路激活小鼠在成年和出生时的心电图检测发现,只有c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠的心电图呈现电轴右转,ST段下移的异常特征,而c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠只呈现细微的异常。对P0的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠心脏进行了表型分析,结果显示c Tn T-Cre;Pdgfrα+/K小鼠的心脏呈现心室肥大的表型,但是c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠与同窝野生型比较未见异常。其次,通过心脏切片的苯胺蓝染色,发现与同窝野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠胶原纤维含量在心室的内层心肌呈现明显增多,而c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠未见异常。进一步通过天狼猩红染色,发现c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中III型胶原蛋白的比例大幅度提高,同时我们通过免疫荧光染色鉴定出c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中Collagen蛋白表达同野生型相比明显提高,这些结果相互验证了心脏中PDGFRα信号通路的激活导致了心肌的纤维化程度提高。为力图解析发生这一表型的机制,检测了c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的增殖和凋亡情况。发现同野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的工作心肌细胞增殖速率增强,但凋亡未见变化。因此我们证明了PDGFRα信号通路的持续激活导致了小鼠心肌细胞增殖上调,进而导致了心肌纤维化细胞增多。进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠和对照小鼠的心肌组织进行差异表达基因分析,筛选出132个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和35个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。对这些基因进行了GO功能富集分析,发现上调基因都大量富集在纤维化相关的功能注释中,而下调的基因的功能注释没有很显着的富集结果,但是下调基因集中我们发现了抑制心肌细胞增殖功能相关的基因,如Cdkn2a和Meis1的表达量随着PDGFRα信号通路的激活而下调,进一步证明了PDGFRα信号的激活将导致心脏细胞的增殖。而后,我们通过荧光定量PCR对与胶原合成表达以及细胞增殖相关基因进行了表达验证,证明了转录组数据的有效性。因此,在此章节的内容中,我们发现了在心肌中大幅度激活PDGFRα信号通路会导致心肌细胞的增殖速率上调,进而导致了心肌的纤维化程度提高,高强度的PDGFRα信号与激发心脏纤维化的发生和进展密切相关。
曹菲[9]（2019）在《维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究》文中研究说明心肌致密化不全（non-compaction of ventricular myocardium,NVM）又称之为心室肌小梁过多、海绵状心肌,是一种特殊类型的心肌病,由薄而致密的心外膜下心肌层和增厚的非致密的心内膜下心肌层的双层心肌构成,且非致密化心内膜下心肌层表面可见多个显着突起的肌小梁和小梁间深凹的隐窝与心室腔相通并有血流进出。本文第一章对NVM的命名、流行病学、分类、病因和发病机制、病理解剖学、病理生理学和临床表现、临床诊断与鉴别诊断、治疗及其预后等国内外研究进展进行系统性综述。因NVM具有发病率高、病因不明、无有效治疗方法,死亡率高及预后差等特点,故通过建立NVM动物模型揭示其发病机制具有重要科学价值和临床价值。本课题主要针对维甲酸（retinoic acid,RA）诱导NVM小鼠模型并进行相关基础研究。研究内容分为三部分:1.探讨如何运用RA诱导孕鼠子代建立NVM小鼠模型;2.在成功建立NVM小鼠模型后,运用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（tandem mass tag,TMT）检测NVM心脏组织差异蛋白;3.运用平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）技术对NVM差异蛋白进行验证和定量分析,进而发现潜在的与NVM发生相关蛋白,为后续蛋白功能验证、探索NVM相关发病机制以及潜在治疗靶点的可能性提供研究基础。第一部分:根据前期关于精确浓度RA与正常胚胎心肌致密化发育过程密切相关的研究报告,提出了采用过量RA干扰孕鼠胚胎心肌致密化过程而诱导孕鼠子代建立NVM模型的假设。本研究在孕鼠怀孕第8.5天给予全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）70mg/kg诱导孕鼠胎儿NVM。组织病理学证实RA干预组孕鼠子代表现出典型的NVM病理学特征。研究中进一步发现与对照组相比,RA干预组孕鼠子代平均体重明显减低,显示统计学显着差异（P<0.0001）。给予ATRA10天后母鼠平均体重较给药前明显下降,表现出显着的统计学差异（P<0.0001）。结论:过量的ATRA可诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型,并提示过量的ATRA可能参与母鼠及其子代能量代谢过程。该动物模型为下一步TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织建立基础。第二部分:在RA诱导孕鼠子代建立NVM幼鼠模型后,运用TMT相对定量蛋白质组学技术开展RA诱导NVM的基础研究。在RA干预组（RA）与空白对照组（Control）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白68个;在RA干预组（RA）与DMSO对照组（DMSO）进行差异表达蛋白筛选,发现差异蛋白48个。经过基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析发现,RA与两个对照组的共同差异表达蛋白及其通路主要表现在能量代谢和凝血功能方面。结论:根据已有大量此类蛋白功能相关研究,初步推测RA诱导孕鼠子代NVM与能量代谢异常相关的可能性较大,而NVM心室内血栓形成与凝血功能异常相关的可能性较大,其具体致病机制尚待进一步研究。第三部分:在TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织进行差异表达蛋白筛选和分析之后,运用PRM技术对差异蛋白进行验证和定量分析。分别对Control、DMSO以及RA三组中9例幼鼠心脏样品中6种差异蛋白激肽原1（kininogen-1,KNG1）、α1抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin,A1AT）、载脂蛋白 A1（apolipoproteinA-I,ApoAI）、β2 糖蛋白 1（beta-2-glycoprotein1,β2GP1）、微管蛋白β4a 链（tubulinbeta-4Achain,TUBB4A）、水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）的 12条肽段进行PRM定量分析,结果表明:这6种蛋白的表达与TMT检测的相对定量结果一致,存在显着差异。对这6种蛋白的结构、功能及所在相关通路以及与NVM可能的相关性进行分析总结,将为后续NVM相关蛋白功能验证,了解NVM相关发病机制及靶向治疗提供进一步的研究方向。
陈奕姗[10]（2019）在《化学重编程成纤维细胞为关节软骨细胞的效应和机制研究》文中指出关节软骨的退变会给患者带来严重的疼痛,会导致生活质量下降和劳动力丧失等,其对全球老龄人群的危害逐年上升。由于成年人关节软骨细胞再生能力低下、数量有限,寻找新的功能性软骨细胞来源成为关节软骨再生的关键。利用容易获取的成纤维细胞直接重编程（转分化）为软骨细胞,是一种快速、有效的再生手段。目前,已有科学家通过病毒过表达特定转录因子,成功诱导成纤维细胞成软骨细胞。然而,该方法不可避免的缺点包括:肿瘤生成、基因组突变、操作复杂等,为其临床应用带来了风险。小分子药物易于储存、运输,且容易扩散进入细胞,不完全依赖于递送载体。利用小分子药物组合调控细胞命运,是一种方便、安全的方法,更具应用前景。但是,利用小分子药物诱导生成关节软骨细胞的方法,目前尚待开发。为解决软骨细胞来源问题,在本研究中,我们通过筛选小分子药物组合的方法,建立成纤维细胞向软骨细胞转分化的诱导体系;利用三维培养技术,诱导成纤维细胞形成软骨细胞团;利用高通量单细胞测序技术,解析成纤维-软骨细胞重编程多时间点的细胞表型动态变化,探究这一复杂过程的分子机制;通过体内关节软骨修复模型,验证化学诱导软骨细胞的体内再生功能。我们的发现包括:1)组合式筛选获得小分子化合物组合VCRTc,VPA（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）、CHIR-98014（糖原合酶激酶3抑制剂）、Repsox（转化生长因子β通路抑制剂）、TTNPB（视黄酸受体激动剂）和Celecoxib（环氧合酶2抑制剂）5种小分子化合物组合,可实现成纤维-软骨细胞化学重编程;2)成功建立化学诱导软骨细胞团三维培养体系,显着提升诱导效率,使软骨标志物表达阳性率超过20%;3)单细胞转录组检测系统性解析成纤维-软骨细胞重编程多时间点细胞表型动态变化,发现了化学诱导软骨细胞和关节软骨细胞的相似性,其重编程过程与胚胎软骨发育具有相似性;4)通过进一步探究分子机制,发现重编程早期成纤维表型受到抑制而软骨发育信号通路激活,成纤维细胞转化为软骨前体细胞;5)体内软骨缺损模型的修复,展示了化学诱导软骨细胞团可改善关节表面软骨再生,使力学功能恢复至正常情况的60%左右。综上,我们通过建立成纤维-软骨细胞化学重编程系统,成功诱导出具有体内修复功能的关节软骨细胞,并利用单细胞测序解析其转化动态细胞图谱和分子机制。该研究为软骨再生的种子细胞制备提供了新的方案,为软骨原位抗纤维化治疗提供了潜在靶点,也为化学重编程的复杂分子机制研究提供了理论依据。
二、小鼠胚胎紧密化现象分子基础的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠胚胎紧密化现象分子基础的研究进展（论文提纲范文）
（1）骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骡子部分可育研究进展 |
| 1.1.1 骡子部分可育原因假说 |
| 1.1.2 骡子部分可育实验进展 |
| 1.2 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.3 哺乳动物生殖细胞的发生及体外诱导概况 |
| 1.3.1 配子发生 |
| 1.3.2 PGCLCs研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 骡子iPSCs的培养及生物学特性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备与器材 |
| 2.1.2 实验试剂及抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.3 FMF-iPSCs的培养、冻存与复苏 |
| 2.2.4 FMF-iPSCs碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.5 FMF-iPSCs核型分析 |
| 2.2.6 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.7 FMF-iPSCs免疫荧光染色 |
| 2.2.8 FMF-iPSCs中转染红色荧光蛋白 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 feeder生物学特性 |
| 2.3.2 FMF-iPSCs形态学鉴定与碱性磷酸酶染色鉴定 |
| 2.3.3 FMF-iPSCs核型分析鉴定 |
| 2.3.4 FMF-iPSCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 2.3.5 FMF-iPSCs免疫荧光染色鉴定 |
| 2.3.6 FMF-iPSCs荧光蛋白质粒转染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 骡子iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备与器材 |
| 3.1.2 实验试剂及抗体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 培养液的配制 |
| 3.2.2 FMF-iPSCs体外拟胚体分化 |
| 3.2.3 EBs实时荧光定量PCR检测 |
| 3.2.4 EBs免疫荧光染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 EBs分化形态学鉴定 |
| 3.3.2 EBs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 3.3.3 EBs免疫荧光染色鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 骡子iPSCs嵌合体制备及定向诱导分化PGCLCs |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备与器材 |
| 4.1.2 实验试剂及抗体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要试剂的配制 |
| 4.2.2 嵌合体制备 |
| 4.2.3 FMF-iPSCs经 AF重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.4 FMF-iPSCs经4i重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.5 FMF-iPSCs经 FTW重编程后向PGCLCs分化 |
| 4.2.6 PGCLCs实时荧光定量PCR检测 |
| 4.2.7 PGCLCs免疫荧光染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 FMF-iPSCs在 E6.5 天小鼠胚胎中分化能力鉴定 |
| 4.3.2 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs形态学鉴定 |
| 4.3.3 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs实时荧光定量PCR鉴定 |
| 4.3.4 FMF-iPSCs定向诱导PGCLCs免疫荧光染色鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（2）基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基于PDX-1 通路探究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 主要试剂和溶液的配制 |
| 2.1.1 柠檬酸缓冲液(p H4.4)的配制 |
| 2.1.2 链脲佐菌素注射液的配制 |
| 2.2 GDM孕鼠模型的制备 |
| 2.3 孕鼠分组及给药 |
| 2.4 样本采集及指标检测 |
| 2.4.1 孕鼠一般状态观察 |
| 2.4.2 孕鼠血清胰岛素的检测 |
| 2.4.3 孕鼠胰腺组织病理结构观察 |
| 2.4.4 孕鼠胎盘组织病理结构观察 |
| 2.4.5 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路相关因子的m RNA表达 |
| 2.4.6 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路相关因子的蛋白表达 |
| 2.4.7 胎鼠胰腺组织甲基化转移酶的表达 |
| 2.4.8 胎鼠胰腺组织PDX-1 通路因子的甲基化表达 |
| 2.4.8.1 MSP法检测胎鼠胰腺组织PDX-1、Ngn3的甲基化情况 |
| 2.4.8.2 BSP法检测胎鼠胰腺组织PDX-1、Ngn3 的甲基化率 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 孕鼠一般状态观察 |
| 3.1.1 孕鼠一般状况观察 |
| 3.1.2 对孕鼠随机血糖的影响 |
| 3.1.3 对孕鼠体重的影响 |
| 3.1.4 对孕鼠胎盘重量的影响 |
| 3.1.5 对孕鼠平均摄食量的影响 |
| 3.2 对孕鼠胰腺病理结构的影响 |
| 3.3 对孕鼠胎盘病理结构及IGF2 表达的影响 |
| 3.3.1 对孕鼠胎盘组织病理结构的影响 |
| 3.3.2 对孕鼠胎盘组织IGF2 蛋白表达的影响 |
| 3.4 对胎鼠胰腺PDX-1 通路因子表达的影响 |
| 3.4.1 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 mRNA表达的影响 |
| 3.4.2 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 对胎鼠胰腺HNF-3β、Nkx6.1、Insulin mRNA表达的影响 |
| 3.4.4 对胎鼠胰腺HNF-3β、Nkx6.1、Insulin蛋白表达的影响 |
| 3.5 对胎鼠胰腺甲基化转移酶表达的影响 |
| 3.5.1 对胎鼠胰腺DNMT1 表达的影响 |
| 3.5.2 补肾经方对胎鼠胰腺DNMT3a表达的影响 |
| 3.5.3 补肾经方对胎鼠胰腺USP7 表达的影响 |
| 3.6 对胎鼠胰腺PDX-1 通路因子甲基化的影响 |
| 3.6.1 MSP定性检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化的影响 |
| 3.6.2 BSP法定量检测胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化率的表达 |
| 3.7 PDX-1、Ngn3 甲基化率与m RNA表达线性关系分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 对孕鼠整体状态的影响 |
| 4.1.1 对孕鼠一般状态的影响 |
| 4.1.2 对孕鼠随机血糖的影响 |
| 4.1.3 对孕鼠胰腺病理结构的影响 |
| 4.1.4 对孕鼠胎盘病理结构及IGF2 表达的影响 |
| 4.2 对胎鼠胰腺PDX-1 通路相关指标甲基化的影响 |
| 4.2.1 对胎鼠胰腺PDX-1、Ngn3 甲基化的影响 |
| 4.2.2 对胎鼠胰腺甲基化转移酶表达的影响 |
| 4.3 对胎鼠胰腺PDX-1 通路相关指标表达的影响 |
| 4.3.1 对胎鼠胰腺HNF-3β表达的影响 |
| 4.3.2 对胎鼠胰腺PDX-1 表达的影响 |
| 4.3.3 补肾经方对胎鼠胰腺Ngn3 表达的影响 |
| 4.3.4 对胎鼠胰腺Nkx6.1 表达的影响 |
| 4.3.5 补肾经方对胎鼠胰腺Insulin表达的影响 |
| 5 小结 |
| 第二部分 补肾经方含药血清干预对小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 含药血清的制备 |
| 2.2 MEF细胞的培养 |
| 2.2.1 MEF细胞的复苏 |
| 2.2.2 MEF细胞的传代 |
| 2.2.3 MEF细胞的冻存 |
| 2.3 ES-E14 细胞饲养层的制备 |
| 2.4 ES-E14 细胞的培养 |
| 2.4.1 ES-E14 细胞的复苏 |
| 2.4.2 ES-E14 细胞的传代 |
| 2.4.3 ES-E14 细胞的冻存 |
| 2.5 含药血清浓度的确定 |
| 2.6 ES-E14 细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化 |
| 2.6.1 诱导培养基的配制 |
| 2.6.2 小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞方向的诱导过程 |
| 3 指标检测 |
| 3.1 细胞形态学观察 |
| 3.1.1 观察各阶段细胞的形态学变化 |
| 3.1.2 DTZ染色鉴定胰岛素分泌细胞的成熟 |
| 3.2 MTT法检测细胞增值率 |
| 3.3 内胚层期SOX17、Foxa2 的蛋白表达 |
| 3.4 细胞诱导分化各阶段标志物的mRNA表达 |
| 3.5 细胞诱导分化各阶段标志物蛋白的表达 |
| 3.6 不同浓度葡萄糖刺激下Insulin及 C-肽的表达 |
| 3.7 PDX-1、Ngn3 的甲基化情况检测 |
| 3.8 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 细胞形态学观察 |
| 4.1.1 细胞一般生存状态观察 |
| 4.1.2 细胞诱导分化各阶段形态学变化 |
| 4.2 补肾经方含药血清浓度的确定 |
| 4.2.1 ES-E14 细胞在不同浓度含药血清干预24h的增殖情况 |
| 4.3 对细胞诱导分化不同阶段标志物表达的影响 |
| 4.3.1 对内胚层期SOX17、Foxa2 蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 对胰腺前体细胞期PDX-1 表达的影响 |
| 4.3.3 对胰腺内分泌前体细胞期标志物Ngn3 表达的影响 |
| 4.3.4 对胰岛素分泌细胞期Nkx6.1及Insulin表达的影响 |
| 4.4 对PDX-1、Ngn3 甲基化率的影响 |
| 4.4.1 胰岛前体细胞期PDX-1 甲基化率的结果 |
| 4.4.2 胰岛分泌前体细胞期Ngn3 甲基化率的结果 |
| 4.5 甲基化率与其mRNA表达的线性关系分析 |
| 4.6 对胰成熟胰岛素分泌细胞Insulin、C-肽分泌量的影响 |
| 4.6.1 不同浓度葡萄糖刺激后Insulin分泌量 |
| 4.6.2 不同浓度葡萄糖刺激后C-肽分泌量 |
| 5 讨论 |
| 5.1 对细胞诱导分化形态的影响 |
| 5.2 对诱导分化各阶段标志物表达的影响 |
| 5.2.1 对内胚层期标志物SOX17、FOXa2 表达的影响 |
| 5.2.2 对胰岛素前体细胞阶段PDX-1 表达的影响 |
| 5.2.3 对胰腺内分泌细胞前期Ngn3 表达的影响 |
| 5.2.4 对胰岛素分泌细胞期Nkx6.1 表达的影响 |
| 5.3 对胰岛素分泌细胞分泌功能的影响 |
| 6 小结 |
| 结语 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 娠糖尿病发病机制及治疗方法的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间公开发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 多能干细胞研究进展 |
| 1.1 多能干细胞的建立及分类 |
| 1.1.1 多能干细胞的概述 |
| 1.1.2 胚胎干细胞研究进展 |
| 1.1.3 细胞重编程的研究进展 |
| 1.1.3.1 诱导性多能干细胞的建立 |
| 1.1.3.2 猪诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.2 多能干细胞的维持机制研究 |
| 1.2.1 多能性核心转录因子的研究进展 |
| 1.2.1.1核心转录因子Oct4 |
| 1.2.1.2核心转录因子Sox2 |
| 1.2.2 多能性调控通路 |
| 1.2.2.1 细胞因子维持多能性 |
| 1.2.2.2 小分子抑制剂维持多能性 |
| 1.2.2.2.1 Wnt信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.2 MAPK/Erk信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信号通路抑制剂SB431542 |
| 1.2.2.3 MEF饲养层细胞 |
| 第二章 H3K9甲基化修饰的研究进展 |
| 2.1 细胞重编程过程中的表观遗传调控 |
| 2.1.1 表观遗传学 |
| 2.1.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.1.2 组蛋白共价修饰 |
| 2.1.3.1 组蛋白乙酰化修饰 |
| 2.1.3.2 组蛋白甲基化修饰 |
| 2.2 H3K9甲基化及功能 |
| 2.3 多能态建立过程中H3K9甲基化的作用 |
| 2.3 组蛋白去甲基化酶的研究进展 |
| 2.4 组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的研究进展 |
| 2.5 多能态建立过程中组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的作用 |
| 2.6 小结与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪iPSCs多能态转换过程中H3K9 甲基化的变化规律 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 撤去DOX及多能培养体系对猪DOX-i PSCs的影响 |
| 3.2.2 piPSCs多能性丧失过程中H3K9与H3K4 甲基化修饰水平的变化 |
| 3.2.3 筛选影响H3K9甲基化的主要因素 |
| 3.2.4 F-与FD-处理下pi PSCs表型检测 |
| 3.2.5 F-与FD-处理下pi PSCs多能基因检测 |
| 3.2.6 F-与FD-处理下pi PSCs组蛋白甲基化修饰水平的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Feeder与外源基因协同维持猪i PSCs多能性机制解析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 转录组测序揭示F-与FD-组的基因表达变化 |
| 4.2.2 功能富集分析揭示整个分化过程中转录变化 |
| 4.2.3 H3K9me2/me3 在基因组上的分布情况 |
| 4.2.4 Ch IP-seq分析分化过程中H3K9me2和H3K9me3 的变化情况 |
| 4.2.5 多能性丧失过程中H3K9 甲基化motif变化分析。 |
| 4.2.6 H3K9甲基化与转录组联合分析揭示其作用机理 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 KDM3A与 KDMB协同调节H3K9 甲基化修饰维持猪多能性调控网络 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料与耗材 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 KDM3A与 KDM3B共干扰导致猪i PSCs丧失多能性 |
| 5.2.2 猪i PSCs中共干扰KDM3A与 KDM3B后的转录组变化 |
| 5.2.2 干扰KDM3A与 KDM3B抑制PI3K-AKT信号通路影响多能性 |
| 5.2.4 KDM3A与 KDM3B过表达对猪i PSCs多能性的影响 |
| 5.2.5 转录组测序揭示KDM3A与 KDM3B过表达的分子作用机制 |
| 5.2.6 KDM3A过表达可抑制F-处理下引发的细胞分化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转录因子OCT4与SOX2 是维持猪i PSCs多能性调控网络的核心 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料与耗材 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同DOX浓度下猪i PSCs的表型变化 |
| 6.2.2 筛选维持猪iPSCs多能性的关键转录因子 |
| 6.2.3 无DOX下过表达OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性 |
| 6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性机理 |
| 6.2.5 转录因子之间调控网络建立 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 OCT4/SOX2 与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B互作维持猪i PSCs多能性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 试验材料与耗材 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 OCT4与SOX2 并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达 |
| 7.2.2 H3K9去甲基化作用与核心转录因子之间的协同关系 |
| 7.2.3 转录调控水平揭示KDM3A与 OCT4/SOX2 之间的协作关系 |
| 7.2.4 IP-MS揭示KDM3A与 KDM3B的蛋白互作网络 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及下一步研究方向 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 骨骼肌发育、NOTCH信号通路及其配体Dll1的研究进展 |
| 引言 |
| 1.1 骨骼肌的发育 |
| 1.1.1 骨骼肌简介 |
| 1.1.2 骨骼肌的起源、形成和发育 |
| 1.1.3 骨骼肌卫星细胞 |
| 1.1.4 肌卫星细胞的静息、激活、增殖、不对称分裂及自我更新 |
| 1.1.5 成年骨骼肌损伤后再生的修复机制 |
| 1.1.6 肌肉干细胞成肌分化的分子机制 |
| 1.1.7 肌纤维类型及肉质 |
| 1.2 NOTCH信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 NOTCH信号通路在肌肉方面的研究 |
| 1.2.2 NOTCH信号通路在脂肪方面的研究 |
| 1.2.3 NOTCH信号通路在其他领域的研究 |
| 1.3 Dll1的研究进展 |
| 本研究的主要目的、意义及研究内容 |
| 第二章 NOTCH各配体在骨骼肌发育过程的表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据统计 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 肌肉测序数据库分析各配体在肌肉组织中的表达水平 |
| 2.2.2 NOTCH信号通路各配体在肌卫星细胞分化过程中的表达模式 |
| 2.2.3 配体Dll1在静息期和激活期的肌卫星细胞中的表达 |
| 2.2.4 Dll1在肌卫星细胞静息、激活、增殖、分化过程中的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 肌纤维源的Dll1敲除对肌卫星细胞及肌肉发育和再生的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据统计 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Dll1在肌纤维中的表达及Dll1肌纤维特异性敲除鼠的构建 |
| 3.2.2 肌纤维源Dll1的敲除对肌肉发育及功能的影响 |
| 3.2.3 肌纤维中敲除Dll1对肌肉再生的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 肌肉细胞中特异性敲除Dll1对胚胎期肌肉发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MyoD~(Cre)特异性敲除Dll1小鼠的构建 |
| 4.2.2 敲除Dll1对小鼠胚胎期肌肉形态的影响 |
| 4.2.3 敲除Dll1对肌肉干细胞的影响 |
| 4.2.4 敲除Dll1对肌肉起源的体节发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 肌肉干细胞特异性敲除Dll1对出生后肌肉发育及成年肌肉再生的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据统计 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 肌肉干细胞中Dll1特异性敲除鼠的构建 |
| 5.2.2 出生后敲除Dll1对肌肉发育的影响 |
| 5.2.3 出生后敲除Dll1对青年小鼠肌肉再生的影响 |
| 5.2.4 成年后敲除Dll1对肌卫星的影响 |
| 5.2.5 成年后敲除Dll1对CTX诱导损伤后8天肌肉再生的影响 |
| 5.2.6 成年后敲除Dll1对CTX诱导损伤28天肌肉再生的影响 |
| 5.2.7 成年后敲除Dll1对CTX诱导的多次损伤后肌肉再生的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 Dll1 调控SCs的自我更新和定向分化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验动物及细胞 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.1.3 数据统计 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.2 Dll1通过调控SCs的非对称分裂影响SCs的自我更新 |
| 6.2.3 体外敲除Dll1对成肌细胞的增殖无显着影响,但促进了成肌细胞的分化 |
| 6.2.4 出生后体内敲除Dll1促进了SCs的过早分化 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 Dll1以细胞自主的方式调控肌肉干细胞的功能 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验细胞 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.1.3 数据统计 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 SCs中缺失Dll1对肌肉组织中巨噬细胞和内皮细胞的数目无显着影响 |
| 7.2.2 Dll1主要以细胞自主的方式调控肌肉干细胞的功能 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 后续研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）利用RNA-Seq技术分析KDM4A在小鼠早期胚胎发育过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 早期胚胎发育与转录组测序的研究进展 |
| 1.1 小鼠早期胚胎发育 |
| 1.1.1 合子基因组激活 |
| 1.1.2 细胞分化与命运决定 |
| 1.2 转录组测序(RNA-seq)技术的研究进展 |
| 1.2.1 RNA-seq技术的发展 |
| 1.2.2 RNA-seq技术的相关应用 |
| 1.2.3 可变剪接的研究进展 |
| 1.3 KDM4A的研究进展 |
| 1.3.1 KDM4A与癌症 |
| 1.3.2 KDM4A与胚胎发育 |
| 试验研究 |
| 第二章 KDM4A敲除型与野生型小鼠胚胎转录组差异表达分析 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA-Seq原始数据的下载 |
| 2.2.2 RNA-Seq数据的评估和质控 |
| 2.2.3 RNA-Seq数据的基因组比对和转录本组装 |
| 2.2.4 差异表达分析与结果可视化 |
| 2.2.5 差异表达基因的功能富集 |
| 2.2.6 可变剪接的差异分析 |
| 2.2.7 可变剪接事件的功能富集 |
| 2.2.8 可变剪接事件可视化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 RNA-Seq数据质量 |
| 2.3.2 RNA-seq数据样品相关性分析 |
| 2.3.3 KDM4A敲除型与野生型早期胚胎发育不同阶段总体转录本水平 |
| 2.3.4 KDM4A敲除型与野生型小鼠胚胎在MII到2 细胞发育过程中的差异表达 |
| 2.3.5 敲除型与野生型小鼠胚胎在MII到2细胞发育过程中的差异表达基因的功能富集 |
| 2.3.6 野生型和敲除型小鼠胚胎在MII到2细胞发育过程中的特异性差异表达分析和功能富集 |
| 2.3.7 KDM4A敲除型和野生型小鼠早期胚胎发育过程中可变剪接全局分析 |
| 2.3.8 敲除型与野生型小鼠胚胎在MII到2细胞发育过程中的可变剪接事件分析 |
| 2.3.9 在MII到2细胞发育过程中在野生型和敲除型小鼠胚胎发生的特异性可变剪接事件分析与功能富集 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 KDM4A对小鼠早期胚胎发育的影响 |
| 3.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂与耗材 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠卵母细胞与胚胎的获取培养 |
| 3.2.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR |
| 3.2.4 KDM4A干扰片段的设计与合成 |
| 3.2.5 胚胎中KDM4A干扰及效率验证 |
| 3.2.6 胚胎基因组激活相关基因的定量分析 |
| 3.2.7 胚胎免疫荧光染色 |
| 3.2.8 Western blot检测 |
| 3.2.9 剪接因子相关基因的定量分析 |
| 3.2.10 实验数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 KDM4A在小鼠卵母细胞及早期胚胎中的表达模式 |
| 3.3.2 高效干扰KDM4A表达的Si RNA筛选 |
| 3.3.3 干扰KDM4A表达后胚胎发育率统计 |
| 3.3.4 干扰KDM4A表达对胚胎H3K9me3 修饰的影响 |
| 3.3.5 干扰KDM4A表达对胚胎合子基因的影响 |
| 3.3.6 干扰KDM4A表达对剪接因子基因的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 A 测序数据与参考基因组比对结果 |
| 附录 B 野生型小鼠胚胎在MII到2 细胞发育过程中的差异表达基因GO富集 |
| 附录 C 敲除型小鼠胚胎在MII到2 细胞发育过程中的差异表达基因GO富集 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 心肌细胞增殖调控机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 小G蛋白RablO通过降低线粒体氧化应撖抑制阿霉素诱导的心脏毒性 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）1-氨基环丙烷-1-羧酸：恶臭假单胞菌UW4向作物根际定殖的关键趋化物（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微生物肥料及应用 |
| 1.2 植物促生根际细菌及其促生机制 |
| 1.2.1 植物促生根际细菌(PGPR)概述 |
| 1.2.2 PGPR促生机理 |
| 1.3 细菌趋化作用机制及意义 |
| 1.3.1 细菌趋化作用及机制 |
| 1.3.2 细菌趋化作用的意义 |
| 1.3.3 细菌趋化性检测方法 |
| 1.4 基因敲除技术研究进展 |
| 1.4.1 基于同源重组的基因敲除 |
| 1.4.2 不依赖于同源重组的基因敲除 |
| 1.5 立题依据及意义 |
| 1.5.1 在作物根际定殖存活是PGPR发挥作用的关键所在 |
| 1.5.2 推测ACC是PGPR向作物根际定殖的关键趋化物质 |
| 1.5.3 假单胞菌趋化机理及受体蛋白的鉴定 |
| 1.5.4 思路及意义 |
| 第二章 恶臭假单胞菌UW4cheR基因突变株及回补株的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 所用菌种及质粒 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 药品及耗材 |
| 2.2.4 培养基及试剂配制 |
| 2.3 UW4cheR基因突变株构建方法 |
| 2.3.1 cheR基因上下游同源臂及融合片段克隆 |
| 2.3.2 无痕敲除cheR基因载体的构建 |
| 2.3.3 大肠杆菌高效感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 同源重组无痕敲除cheR基因 |
| 2.3.5 UW4ΔcheR的Southern blot鉴定 |
| 2.4 UW4cheR基因突变株构建结果及分析 |
| 2.4.1 cheR基因上下游同源臂及融合片段克隆结果 |
| 2.4.2 融合片段连至pEASY-Blunt E1载体 |
| 2.4.3 无痕敲除cheR基因载体的构建及鉴定 |
| 2.4.4 UW4Δche R菌株获得及筛选 |
| 2.4.5 UW4ΔcheR 的 Southern blot 验证 |
| 2.5 UW4cheR基因回补及空载菌株构建方法 |
| 2.5.1 cheR基因的克隆 |
| 2.5.2 cheR基因回补载体的构建 |
| 2.5.3 三菌杂交构建cheR基因回补及空载菌株 |
| 2.6 UW4cheR基因回补及空载菌株构建结果及分析 |
| 2.6.1 cheR基因克隆结果 |
| 2.6.2 将cheR基因片段连至pMD19-T质粒 |
| 2.6.3 cheR基因回补载体的构建及筛选 |
| 2.6.4 UW4△cheR+cheR菌株的获得及筛选 |
| 2.6.5 UW4△cheR+pBBR1MCS-2空载菌株的获得及筛选 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 实验菌株的趋化响应及在作物根际的定殖研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 所用菌种及质粒 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 药品及耗材 |
| 3.2.4 培养基及试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 定性和定量趋化筛选强趋化物质 |
| 3.3.2 实验菌株的定性趋化分析 |
| 3.3.3 扫描电镜(SEM)观察各菌株与双孢蘑菇菌丝吸附 |
| 3.3.4 实验菌株生长曲线测定 |
| 3.3.5 实验菌株在双孢蘑菇菌丝上定殖数量测定 |
| 3.3.6 实验菌株在小麦根际定殖菌数测定 |
| 3.3.7 实验菌株处理下小麦生物量的测定 |
| 3.4 结果及分析 |
| 3.4.1 平板点滴趋化筛选强趋化物质结果 |
| 3.4.2 UW4对几类强趋化物的定量趋化结果 |
| 3.4.3 UW4对模拟根系分泌物的定量趋化结果 |
| 3.4.4 暗视野显微镜下观察趋化现象 |
| 3.4.5 实验菌株的定性趋化结果 |
| 3.4.6 扫描电镜观察细菌与双孢蘑菇菌丝吸附结果 |
| 3.4.7 各菌株生长曲线测定结果 |
| 3.4.8 各菌株在双孢蘑菇菌丝及小麦根际的定殖数量统计 |
| 3.4.9 各菌株处理后小麦生物量测定结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 ACC脱氨酶高效表达菌株的构建及促生效果研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 PBA上下游同源臂及融合片段克隆 |
| 4.3.2 无痕敲入PB20序列载体的构建 |
| 4.3.3 无痕敲入PB20序列供体菌的构建 |
| 4.3.4 同源重组无痕敲入PB20序列 |
| 4.3.5 UW4-PBA菌株生长曲线测定 |
| 4.3.6 UW4-PBA菌株AcdS基因表达量测定 |
| 4.3.7 UW4-PBA菌株ACC脱氨酶的活性测定 |
| 4.3.8 UW4-PBA菌株的定性趋化实验 |
| 4.3.9 验证UW4-PBA菌株对小麦的促生效果 |
| 4.4 结果及分析 |
| 4.4.1 PBA上下游同源臂及融合片段克隆结果 |
| 4.4.2 将PBA上下游同源臂融合片段连至pEASY-Blunt E1载体 |
| 4.4.3 无痕敲入PB20序列目标载体的构建及鉴定 |
| 4.4.4 UW4-PBA菌株获得及筛选 |
| 4.4.5 UW4-PBA菌株生长曲线测定结果 |
| 4.4.6 UW4及UW4-PBA菌株中AcdS基因表达量比较 |
| 4.4.7 UW4及UW4-PBA菌株ACC脱氨酶活性对比 |
| 4.4.8 UW4-PBA菌株定性趋化结果 |
| 4.4.9 瓶栽小麦根际定殖菌数测定结果 |
| 4.4.10 盆栽小麦根际定殖菌数测定结果 |
| 4.4.11 盆栽小麦生物量测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 恶臭假单胞菌UW4对ACC的趋化受体的鉴定及表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 所用菌种及质粒 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 药品及耗材 |
| 5.2.4 主要试剂配制方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实时荧光定量(Quantitative Real-time)PCR测定各拟趋化受体蛋白表达量 |
| 5.3.2 对筛选到的拟趋化受体蛋白进行生物信息学分析 |
| 5.3.3 拟趋化受体蛋白敲除突变株的构建并验证其趋化 |
| 5.3.4 拟ACC趋化受体的LBD域克隆、表达及纯化 |
| 5.4 结果及分析 |
| 5.4.1 细菌RNA提取质量检测 |
| 5.4.2 实时荧光定量PCR筛选拟ACC趋化受体结果 |
| 5.4.3 拟趋化受体突变株及回补株的定性趋化响应 |
| 5.4.4 拟ACC趋化受体蛋白的生物信息学分析 |
| 5.4.5 LBD116功能域克隆、表达及纯化 |
| 5.4.6 LBD116蛋白的荧光热漂移实验 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论及讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 乙烯是否为关键趋化物质 |
| 6.2.2 糖类是否为关键趋化物质 |
| 6.2.3 有机酸类是否为关键趋化物质 |
| 6.2.4 氨基酸类是否为关键趋化物质 |
| 6.2.5 ACC趋化受体蛋白的表征 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（8）Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一章 Pdgfrα在小鼠心脏发育过程中的表达模式 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 1.3.1 Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏中的表达模式 |
| 1.3.2 Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏窦房结中的表达模式 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 Pdgfrα的缺失不影响窦房结的形态发生及功能 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 2.3.1 小鼠窦房结的形态发生 |
| 2.3.2 Pdgfrα与Shox2在窦房结的共表达 |
| 2.3.3 Shox2-Ce;Pdgfrα~(flox/flox)小鼠窦房结中的Pdgfrα敲除验证 |
| 2.3.4 条件性敲除窦房结中的Pdgfrα未导致窦房结发育异常 |
| 2.3.5 条件性敲除窦房结Pdgfrα未导致Nkx2.5在窦房结头部的异位表达 |
| 2.3.6 Pdgfrα条件性基因剔除小鼠呈现正常的心电图 |
| 2.3.7 Pdgfrα~(Egfp/Egfp)小鼠窦房结的Pdgfrα敲除验证 |
| 2.3.8 全身性敲除Pdgfrα未导致小鼠窦房结形态发生异常 |
| 2.3.9 Pdgfrα全敲除小鼠窦房结中Nkx2.5的正常表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 Pdgfrα的缺失导致小鼠心肌致密化不全 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 3.3.1 E13.5 Pdgfrα~(Egfp/Egfp)小鼠胚胎心室出现心肌致密化不全 |
| 3.3.2 E11.5-E16.5野生型小鼠胚胎心脏工作心肌细胞增殖速率 |
| 3.3.3 心脏特异性的Pdgfra敲除小鼠的工作心肌细胞增殖速率检测 |
| 3.3.4 心脏特异性的Pdgfra敲除小鼠的工作心肌细胞的凋亡检测 |
| 3.3.5 心脏特异性的Pdgfra敲除和野生型小鼠心脏的转录组数据测序过滤 |
| 3.3.6 cTnT-Ce;Pdgfrα~(flox/flox)和野生型小鼠心脏的差异基因分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 Pdgfrα的持续性激活导致小鼠心肌纤维化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 4.3.1 心脏特异性激活PDGFrα信号通路的小鼠的表型分析 |
| 4.3.2 cTnT-Ce; Pdgfrα~(K/+)和野生型小鼠心脏的转录组数据测序过滤 |
| 4.3.3 cTnT-Ce; Pdgfrα~(K/+)和野生型小鼠心脏的转录组差异基因分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（9）维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌致密化不全的研究背景与意义 |
| 1.1.1 心肌致密化不全的研究背景 |
| 1.1.2 维甲酸在心肌发育中关键的生理病理机制 |
| 1.1.3 心肌致密化不全基础研究的意义 |
| 1.2 心肌致密化不全的国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 心肌致密化不全的发现和命名 |
| 1.2.2 心肌致密化不全的流行病学调查 |
| 1.2.3 心肌致密化不全的分类 |
| 1.2.4 心肌致密化不全的病因和发病机制 |
| 1.2.5 心肌致密化不全的病理解剖学 |
| 1.2.6 心肌致密化不全的病理生理学和临床表现 |
| 1.2.7 心肌致密化不全的临床诊断与鉴别诊断 |
| 1.2.7.1 心肌致密化不全的临床诊断 |
| 1.2.7.2 心肌致密化不全的鉴别诊断 |
| 1.2.8 心肌致密化不全的治疗 |
| 1.2.9 心肌致密化不全的疗效与预后 |
| 1.2.10 心肌致密化不全的动物模型研究现状 |
| 1.2.11 心肌致密化不全基础和临床研究存在的问题 |
| 1.2.12 心肌致密化不全的基础和临床研究展望 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 建立心肌致密化不全动物模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验小鼠 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 心肌致密化不全小鼠模型给药前准备 |
| 2.3.2 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 2.3.3 心肌致密化不全小鼠模型组织收集和组织病理学染色 |
| 2.3.4 幼鼠心脏组织诊断标准与显微镜下观察 |
| 2.3.5 心肌致密化不全小鼠模型实验数据统计学分析 |
| 2.4 心肌致密化不全小鼠模型实验结果与分析 |
| 2.4.1 小鼠合笼后交配情况统计与分析 |
| 2.4.2 小鼠合笼后交配后怀孕情况统计与分析 |
| 2.4.3 RA干预组与对照组孕鼠生产情况统计与分析 |
| 2.4.4 RA干预组与对照组出生幼鼠体重统计与分析 |
| 2.4.5 RA干预组与对照组母鼠体重统计与分析 |
| 2.4.6 心肌致密化不全心脏病理学结果与分析 |
| 2.5 心肌致密化不全小鼠模型建立技术路线 |
| 2.6 本章讨论和结论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 TMT相对定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 实验小鼠 |
| 3.2.3 心肌致密化不全小鼠模型药物干预前准备 |
| 3.2.4 心肌致密化不全小鼠模型药物干预 |
| 3.2.5 心肌致密化不全小鼠模型心脏组织样品收集 |
| 3.2.5.1 RA干预组与对照组孕鼠及剖腹后幼鼠情况统计与分析 |
| 3.2.5.2 RA干预组与对照组幼鼠心脏组织样品收集与保存 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 蛋白质提取和肽段酶解 |
| 3.3.2 小鼠心脏组织样品TMT标记 |
| 3.3.2.1 样品蛋白组TMT分析预实验 |
| 3.3.2.2 蛋白组TMT分析正式实验 |
| 3.3.3 肽段分级 |
| 3.3.4 液相色谱串联质谱法数据采集 |
| 3.3.5 蛋白质鉴定和定量分析 |
| 3.3.6 生物信息学分析 |
| 3.3.6.1 GO功能注释 |
| 3.3.6.2 KEGG通路注释 |
| 3.3.6.3 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
| 3.3.6.4 蛋白质聚类分析 |
| 3.3.6.5 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.4 TMT定量蛋白质组学检测心肌致密化不全相关蛋白结果分析 |
| 3.4.1 主要结果和结论 |
| 3.4.2 实验和生物信息学分析结果 |
| 3.4.2.1 蛋白质鉴定结果汇总 |
| 3.4.2.2 差异表达蛋白质筛选 |
| 3.4.2.3 差异表达蛋白质聚类分析 |
| 3.4.2.4 差异表达蛋白质GO功能富集分析 |
| 3.4.2.5 差异表达蛋白质KEGG通路富集分析 |
| 3.4.2.6 蛋白质相互作用网络分析 |
| 3.5 附件 |
| 3.5.1 质量控制 |
| 3.5.1.1 肽段离子质量偏差分布 |
| 3.5.1.2 肽段离子得分分布 |
| 3.5.1.3 蛋白质丰度比分布 |
| 3.5.2 鉴定蛋白质和肽段特性 |
| 3.5.2.1 蛋白质相对分子质量分布 |
| 3.5.2.2 蛋白质等电点分布 |
| 3.5.2.3 肽段序列长度分布 |
| 3.5.2.4 肽段序列覆盖度 |
| 3.5.2.5 鉴定肽段数量分布 |
| 3.5.3 数据库介绍 |
| 3.5.3.1 NR数据库 |
| 3.5.3.2 UniProt数据库 |
| 3.5.3.3 GO数据库 |
| 3.5.3.4 KEGG通路数据库 |
| 3.5.3.5 STRING数据库 |
| 3.6 TMT相对定量蛋白质组学检测NVM心脏组织技术路线 |
| 3.7 实验结果和讨论 |
| 3.7.1 能量代谢讨论 |
| 3.7.2 凝血功能讨论 |
| 3.8 本章小结 |
| 第四章 PRM技术验证和定量分析心肌致密化不全差异蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 项目样品基本信息 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白提取 |
| 4.3.2 蛋白酶解 |
| 4.3.3 液相色谱平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.3.3.1 高效液相色谱分析 |
| 4.3.3.2 高分辨平行反应监测质谱定量分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 目标肽段PRM检测结果分析 |
| 4.4.2 差异蛋白表达量分析 |
| 4.4.3 实验结果与结论 |
| 4.5 差异蛋白结构及功能的讨论及分析 |
| 4.5.1 激肽原1结构与功能 |
| 4.5.2 α1抗胰蛋白酶结构与功能 |
| 4.5.3 载脂蛋白AI结构与功能 |
| 4.5.4 β2糖蛋白1结构与功能 |
| 4.5.5 微管蛋白β4α链结构与功能 |
| 4.5.6 通道蛋白4结构与功能 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 5.2.1 针对本实验不足的补充研究 |
| 5.2.2 针对本研究后续的工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（10）化学重编程成纤维细胞为关节软骨细胞的效应和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词/术语表 |
| 绪论 |
| 第一章 组合式筛选建立成纤维-软骨细胞重编程体系 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验试剂与仪器 |
| 1.2.1 材料和试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
| 1.3.2 成纤维-软骨细胞重编程的“两步法”化学诱导 |
| 1.3.3 小分子化合物的初步筛选 |
| 1.3.4 小分子化合物的组合式筛选 |
| 1.3.5 新生小鼠关节软骨细胞的分离和培养 |
| 1.3.6 番红O-固绿染色 |
| 1.3.7 免疫荧光染色 |
| 1.3.8 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 成纤维-软骨细胞化学重编程基本模型的建立 |
| 1.4.2 成纤维-软骨细胞重编程的药物组合优化 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 实现成纤维-软骨细胞重编程的三维诱导 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
| 2.3.2 成纤维-软骨细胞重编程的micromass培养 |
| 2.3.3 成纤维-软骨细胞重编程的pellet培养 |
| 2.3.4 新生小鼠关节软骨细胞的分离和培养 |
| 2.3.5 免疫荧光染色 |
| 2.3.6 台盼蓝活死细胞染色 |
| 2.3.7 组织学鉴定 |
| 2.3.8 流式细胞检测的样品制备及检测 |
| 2.3.9 单细胞荧光定量PCR |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 成纤维-软骨细胞重编程的micromass培养 |
| 2.4.2 成纤维-软骨细胞重编程的pellet培养 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 单细胞转录组测序鉴定重编程细胞表型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
| 3.3.2 小鼠原代软骨细胞的分离和培养 |
| 3.3.3 成纤维-软骨细胞重编程的pellet诱导 |
| 3.3.4 单细胞的捕获和逆转录 |
| 3.3.5 DNA文库建立和二代测序 |
| 3.3.6 单细胞测序数据分析 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 成纤维-软骨细胞重编程多时间点细胞表型比较 |
| 3.4.2 中间态细胞亚群高表达软骨发育标志物 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 成纤维表型抑制和软骨发育通路激活启动重编程 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
| 4.3.2 小鼠原代软骨细胞的分离和培养 |
| 4.3.3 成纤维-软骨细胞重编程的pellet诱导 |
| 4.3.4 单细胞测序数据分析 |
| 4.3.5 高通量转录组测序 |
| 4.3.6 小干扰RNA的转染 |
| 4.3.7 单细胞荧光定量PCR |
| 4.3.8 免疫荧光染色 |
| 4.3.9 细胞骨架染色 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 中间态细胞形成的分子机制 |
| 4.4.2 中间态细胞的表型特征验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 成纤维细胞来源软骨细胞修复关节软骨 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 |
| 5.3.2 成纤维-软骨细胞重编程的pellet诱导 |
| 5.3.3 皮下异位成软骨模型的建立 |
| 5.3.4 关节软骨全层缺损模型的建立 |
| 5.3.5 组织样本收集和组织学包埋、切片 |
| 5.3.6 番红O-固绿染色 |
| 5.3.7 ICSR-II关节软骨修复评分 |
| 5.3.8 关节软骨力学性能检测 |
| 5.3.9 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 化学诱导软骨细胞团的皮下异位软骨形成 |
| 5.4.2 化学诱导软骨细胞团修复关节软骨 |
| 5.5 讨论 |
| 总结 |
| 局限与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 骨关节炎药物治疗的现状及发展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
四、小鼠胚胎紧密化现象分子基础的研究进展（论文参考文献）
- [1]骡子诱导多能干细胞生物学特性分析及体外分化的研究[D]. 武彩霞. 内蒙古大学, 2021(12)
- [2]基于PDX-1通路研究补肾经方对GDM模型孕鼠胎鼠胰腺发育及胰岛素分泌细胞形成的影响[D]. 王超群. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制[D]. 祝振硕. 西北农林科技大学, 2020
- [4]Dll1在小鼠骨骼肌发育和再生中的作用及机制研究[D]. 彭颖. 西北农林科技大学, 2020
- [5]利用RNA-Seq技术分析KDM4A在小鼠早期胚胎发育过程中的作用研究[D]. 郑小曼. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [6]有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究[D]. 张辰. 北京协和医学院, 2020(05)
- [7]1-氨基环丙烷-1-羧酸：恶臭假单胞菌UW4向作物根际定殖的关键趋化物[D]. 李涛. 河南农业大学, 2019(06)
- [8]Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析[D]. 关震. 福建师范大学, 2019(04)
- [9]维甲酸诱导心肌致密化不全的基础研究[D]. 曹菲. 电子科技大学, 2019(04)
- [10]化学重编程成纤维细胞为关节软骨细胞的效应和机制研究[D]. 陈奕姗. 浙江大学, 2019(01)