一、海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究（论文文献综述）
谌芳[1]（2020）在《分子改造提高融合酶特性的研究》文中提出海藻糖是一种非还原性二糖;是通过1,1糖苷键连接两个吡喃型葡萄糖单体所构成的;化学名称为α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）,被称为生命之糖。海藻糖的化学性质很稳定,在生物体内具有抗脱水功能,因此生物在干旱、寒冷、高盐碱等胁迫条件下,海藻糖能够保护生物膜以及蛋白质等减少伤害,对生物体具有非常好的非特异性保护作用。由于海藻糖的制备工艺比较复杂,生产成本高,因此海藻糖的市场应用受到一定的阻碍。本实验以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的β-淀粉酶和海藻糖合酶为出发点,通过替换海藻糖合酶生产菌以及改变融合酶的连接方式,构建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶,并对融合酶的一些酶学性质进行初步的探索。本研究内容主要包括以下几方面:（1）β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶双功能融合酶的构建与表达:通过PCR分别克隆了来源于菌种Pseudomonas stutzeri、Thermobaculum terrenum、Pseudomonas putide P06的海藻糖合酶基因,并且通过连接肽（EAAAK）3构建了β-淀粉酶和海藻糖融合酶菌株E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Ps）,E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Tt）,E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Pp）。重组菌株诱导表达后,通过SDS-PAGE对融合蛋白验证显示,3种融合蛋白均已表达。在催化6%直链淀粉中,3株重组融合酶都表现出了双功能活性,这三种融合酶45℃与6%直链淀粉反应12h后,融合酶转化率分别为26.587%,23.473%,23.7654%。经过酶学性质的测定,这3种融合酶最适反应温度均为45℃;最适p H分别为6.5、7.5、7.5;EDTA和Co2+对融合蛋白酶有抑制作用,Mn2+,Ca2+对融合蛋白酶酶活没有明显影响。（2）利用抗蛋白酶降解连接肽构建β-淀粉酶-海藻糖合酶双功能融合酶:本实验设计连接肽（PT）8P,以pET-28a-bap1ts Ps为质粒,利用限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ,通过T4连接酶连接的方式将连接肽插入到β-淀粉酶与海藻糖合酶之间,构建β-淀粉酶和海藻糖合酶融合酶菌株E.coli BL21（pET-28a-bap4ts Ps）,SDS-PAGE显示,融合蛋白已表达。该融合酶的最适反应条件为:温度45℃,p H 6.5,在此条件下催化6%直链淀粉12h的转化率为86%,通过CDNN软件对圆二色光谱数据进行的分析显示,替换连接肽的融合酶与原始融合酶E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Ps）相比,其空间结构并没有发生明显变化,但与单酶β-淀粉酶和海藻糖合酶相比,两种融合酶在反向平行构像上发生了明显变化。（3）利用插入融合构建β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶:通过无缝克隆的方式将海藻糖合酶基因插入到β-淀粉酶基因第446位氨基酸之后即苏氨酸与脯氨酸之间,构建β-淀粉酶和海藻糖合酶融合酶,并且在大肠杆菌中得到了表达。在发酵培养基（M9-ZJ-LM）诱导表达后,尽管SDS-PAGE显示融合蛋白已表达,但是融合酶仅表现出了β-淀粉酶活性,而海藻糖合酶并没有酶活。
邓丹丹,李美,凌婉阳[2]（2020）在《海藻糖的生产及分析方法的国内研究进展》文中研究指明简述了海藻糖的化学结构以及生物学功能,对我国海藻糖生产方法的最新研究进展进行了概述,包括微生物提取法、微生物发酵法、基因工程法和酶转化法;同时介绍了用于海藻糖定性定量分析的方法,如蒽酮比色法、纸层析法、薄层层析法、DNS比色法、高效液相色谱法等;以期为海藻糖获得更广泛的应用提供参考。
李健[3]（2017）在《甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（SoP5CS）的抗旱功能分析》文中提出甘蔗是重要的糖料和能源作物,也是很多工业产品的原料来源,但是中国的甘蔗80%以上种植在旱坡地上,缺乏灌溉条件,干旱己经成为制约我国甘蔗生产和蔗糖业发展的重要因素。基于此,我们在前人工作的基础上,从广西自育的抗旱性较强的桂糖21号（GT21）甘蔗品种中克隆了甘蔗△1-吡咯啉-5-竣酸合成酶基因（SoP5CS）,并对其序列特征进行了分析,通过荧光定量PCR分析了其在甘蔗不同组织及在不同处理下的表达特性;通过构建SoP5CS基因的原核表达载体,使目的蛋白在大肠杆菌中表达,蛋白经纯化后制备了单克隆抗体;通过构建基因的植物表达载体,遗传转化甘蔗和烟草进行过量表达研究。本研究希望通过综合研究SoP5CS的抗旱功能,为进一步利用该基因改良甘蔗及其他作物的抗旱性提供必要的研究基础和参考依据。本研究所获得的主要结果如下:1.运用RT-PCR技术,从GT21甘蔗叶片中克隆了 SoP5CS基因全长,获得了在NCBI上登陆号为KJ546350.1 的基因序列。该基因具有2151bp完整的开放阅读框,编码716个氨基酸,所编码的蛋白质分子量为77.72 kDa;是定位于内质网、不具有跨膜结构的亲水性蛋白。其核苷酸序列与其它禾本科物种同源性较高,所编码的蛋白也具有高度保守的高等植物P5CS功能域。2.通过qRT-PCR分析了 SoP5CS基因在甘蔗品种GT21不同器官中的表达特性,发现SoP5CS基因在叶片中的表达量是最高的,茎中次之,根中最低。此外还分析了GT21甘蔗幼苗在0.1 mM ABA、4℃低温、15%PEG以及200 mM NaCl四种处理下叶片SoP5CS基因的表达特性,结果表明四种处理均能不同程度的诱导SoP5CS基因的上调表达,因此推测该基因在甘蔗应对各种逆境胁迫时有重要的作用。3.以PET-30a作为载体,成功构建了 SoP5CS基因的原核表达重组质粒pET30a-SoP5CS,并成功诱导了重组蛋白的表达。原核表达的蛋白经纯化合格后作为抗原,通过对小鼠进行免疫及细胞融合和培养,制备了单克隆抗体。制备的单克隆抗体效价高,特异性也较好,并运用Western blotting技术成功检测了不同干旱胁迫下甘蔗叶片SoP5CS蛋白的表达。4.构建了以玉米UBI（Ubiquitin）启动子驱动、具有除草剂抗性的bar基因作为抗性筛选标记的植物表达载体,运用农杆菌介导的转化甘蔗愈伤方法,将SoP5CS基因在甘蔗中进行过量表达研究。获得了一批PCR阳性转化植株,并挑选了其中的四个株系进行抗旱性研究,发现在干旱胁迫下,S3、S4和S5三个株系的SoP5CS相对表达量显着高于对照,分别是对照的4.78倍、4.82倍和2.23倍,但是S1株系的表达量却比对照低,为对照的0.64倍。SoP5CS蛋白的相对表达量则与基因的相对表达量差异较大,SI、S4和S5株系的均与对照相当,S3中则是为对照的2.53倍。S3、S4和S5转基因株系中的脯氨酸含量也显着高于对照,S1中则显着低于对照。SOD活性也是S3、S4和S5的显着高于对照,S1则和对照相差不大。对于MDA含量,对照和S1显着高于另外三个株系。此外,在ABA含量上,S3、S4和S5均高于对照,S1则略低于对照。S3、S4和S5三个株系的抗旱表现较好,可对它们作进一步研究。5.以转化甘蔗的植物表达载体进行转化烟草研究,通过除草剂的筛选、PCR检测及拷贝数测定,对拷贝数较低的四个转基因株系做抗旱性分析,发现在干旱胁迫下,T9株系中SoP5CS及其编码的蛋白的相对表达量都是最低的,T1、T4、T6中SoP5CS的相对表达量分别是T9的9.02、3.93和8.51倍,SoP5CS蛋白则分别是2.22、3.91和1.36倍。进一步分析发现叶片脯氨酸和ABA含量在T1和T6中相对较高,且四个株系均显着高于对照。MDA含量则是对照显着高于转基因植株,其中T1的MDA累积量最低。P5CR和P5CS活性在对照和转基因植株间表现不一,在T1和T4,两个酶的活性均与对照相当,T6和T9则是显着高于对照。CAT活性在T6中最高,T1、T4、T9也显着高于对照。对于SOD活性,转基因株系均显着比对照高,其中T4和T6的相对较高。转基因株系的叶片相对含水量上明显高于对照,叶绿素减少量则低于对照。综合分析发现T6株系的抗旱性表现最好,T1株系也较好,这两个株系将用于进一步研究。
李春瑶[4]（2016）在《转SoDREB2烟草抗旱性及甘蔗转SoDREB2研究》文中认为甘蔗是食糖生产的主要原材料,由于近年来的天气变化极端,甘蔗生长发育受到极大的危害,干旱的危害尤为严重,造成大量减产,因而选育出高抗旱性新品种迫在眉睫。传统的育种手段由于周期长,进度较为缓慢,已经不能满足现代农业育种的要求,而利用基因工程手段使外源基因导入甘蔗中,培育出高抗性的新品种,逐步建立起一套完整快捷的体系,有效提高了甘蔗新品种选育效率。本实验以甘蔗中克隆得到的SoDREB2基因,鉴定了该基因的功能以及在烟草中的遗传稳定性,同时进行了甘蔗的遗传转化研究,本实验以主要结果如下：1.对转SoDREB2基因烟草的T1代进行鉴定,检测结果显示：T1代正义转基因烟草检出率为73.33%,反义转基因烟草检出率为65.56%,说明转基因烟草经过T1代遗传,有近1/3出现性状分离或丢失,其中正义转基因烟草比反义转基因烟草稳定。同时经检测结果表明SoDREB2基因在烟草中表达上调,并符合孟德尔遗传定律。2.对苗期进行土壤干旱胁迫处理,测定生理生化指标。包括细胞膜透性、叶绿素含量、脯氨酸含量（Pro）、丙二醛含量（MDA）,以及酶活性测定,包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）,烟草抗旱性表现为正义转基因烟草>对照野生型烟草>反义转基因烟草。进一步验证甘蔗SoDREB2基因对提高植株抗旱性起到正向调节作用。3.对诱导甘蔗胚性愈伤组织培养技术进行了优化。实验采用甘蔗生长最旺盛时期—生长期的心叶为外植体,用75%酒精进行表面消毒后,分别采用MS和N6两种不同培养基诱导愈伤组织,MS愈伤组织诱导率为55%,N6培养基愈伤组织诱导率为62%。4.以由新台糖22号新叶为原材料诱导出的Ⅱ型胚性愈伤为受体材料,EH105为转化的农杆菌菌株,载体为PBI121,利用农杆菌介导转化法,将从甘蔗中克隆得到的SoDREB2基因利用农杆菌介导至甘蔗品种新台糖22中,经过抗生素G418筛选后,对目的基因和标记基因分别进行PCR检测,有2株ROC22初步确认导入正义SoDREB2基因,转化率为14.2%。
周定港[5]（2016）在《转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究》文中进行了进一步梳理甘蔗（Saccharum spp.）是最重要的糖料作物,虫害是影响甘蔗产量、品质和宿根年限的主要限制因素之一,其中螟虫危害最为严重,并具有全生长季危害的特点,对产业造成严重损失。与大多数作物一样,甘蔗基因池中缺乏抗虫基因,加上甘蔗遗传背景复杂,因此,传统杂交育种培育抗虫品种难度大,导致甘蔗栽培品种抗虫性差。转cey1Ac基因在玉米、棉花等作物抗虫性改良上效果显着并已大面积商业化应用,且其安全性已经得到证实,因此,通过转基因技术改造甘蔗抗虫性,培育抗虫品种并创制可用于杂交利用的抗虫种质是目前最为有效的途径。甘蔗又是工业原料作物和营养繁殖作物,转基因安全风险等级为最低（I级）,而蔗糖结晶经过107℃高温过程,并未在转基因甘蔗加工而成的蔗糖中检出外源基因成分或蛋白成分,因此,转基因甘蔗的商业化应用值得期待。本研究以基因枪轰击获得的转cry1Ac基因甘蔗群体为实验材料,开展了外源基因成分特异、高效、灵敏的检测技术研究以及对抗性拟转基因甘蔗株系进行了真实性鉴定,奠定了转基因甘蔗深入研究的重要基础性工作;而外源基因的相对低拷贝是外源基因稳定整合和适度表达的前提,甘蔗上是否也有类似情况尚未可知。考虑到甘蔗基因组高达10Gb且倍性复杂,生物素标记的Southern杂交信号弱、效果差,我们建立了高效、安全稳定的外源基因拷贝数鉴定技术,实现了对转基因群体外源基因的拷贝数的高效低成本鉴定;继而探究了转基因甘蔗株系的遗传稳定性及外源基因的插入位点或旁侧序列,探究了转基因群体cry1Ac蛋白的时空表达特性等,对后续系统生物学研究具有重要意义。在此基础上,对外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质性状和抗虫性进行了关联分析,以期探索转cry1Ac基因甘蔗的分子特征与生物学特性之间的关系,并对外源目的蛋白表达对甘蔗根际土壤微生态中微生物的影响进行了评价。进一步,通过典型转基因株系与非转基因对照的RNA-seq转录组学分析转基因的非预期效应,试图从分子和基因整体水平上,揭示抗虫转基因甘蔗及其受体FN15非转基因甘蔗相关代谢和信号通路应答机制的差异,从而解析生物学特性差异的分子基础。该研究具有重要的科学意义和实际应用价值。本研究得到国家自然科学基金项目（No.31271782）和福建农林大学优秀博士学位论文基金（No.1122YB015）的资助。相关研究的主要结果与结论如下:1.基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术原理,针对转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac序列（GenBank:KF630361.1）和bar基因序列（GenBank:EU048867.1）设计特异性的LAMP扩增引物,优化了 cry1Ac-LAMP的主要体系成分,25.0μL反应体系含有:5.25mMMg2+、4:1的内外引物比、2.0U的M大片段DNA聚合酶,其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限为43.1 copies的质粒1Ac0229和1.0 ng·μL/-1的转基因甘蔗（cry1Ac拷贝数为21.89 copies·cell-1）基因组DNA。bar-LAMP优化后的25.0μL反应体系含有:5.25 mMMg2+、6:1的内外引物比、6.0 U的Bst大片段DNA聚合酶;其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限是10 copies的质粒1Ac0229;特异性探究实验发现cry1Ac-LAMP和bar-LAMP只能检测到含有特异cry1Ac基因或bar基因的甘蔗样品,拟转基因系的应用检测试验发现所建立的方法cry1Ac-LAMP和bar-LAMP技术是可靠的。结果表明,建立的cry1Ac-LAMP和bar-LAMP检测技术方法特异性强、灵敏度高、快速省时、结果可靠,可视化检测尤其适用于转基因甘蔗的田间现场筛查检测与监管,具有很好的应用价值和推广前景。2.基于前人报道腺苷 5-磷酰硫酸还原酶（Adenosine 5’-phosphosulfatereductase,APRT）、细胞周期素（Cyclin,CYC）和脯氨酰-4-羟化酶（Prolyl4-hydroxylase,P4H）三个基因是甘蔗潜在的具有高特异性和低拷贝数内标准基因。我们克隆了APRT、CYC和P4H基因并构建了多元内标准基因靶标标准质粒（p1AcAPC）,建立了基于这个标准质粒的TaqMan实时荧光定量PCR技术,对转cry1Ac基因的抗性再生甘蔗植株群体的拷贝数进行了鉴定。该方法具有高特异性和高敏感性,检测操作简便,效率高等特点,其定量结果不仅可作为转cry1Ac基因甘蔗真实性鉴定的佐证,更主要的是可以实现快速鉴定转基因甘蔗的拷贝数,相关研究也是转cry1Ac基因甘蔗遗传稳定分析及后续系统生物学研究的基础。3.外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质和抗虫性进行关联分析的研究结果与结论如下:（1）外源目的基因cry1Ac以中等拷贝数导入和整合,有利于抗虫目标性状改良,并增加获得对非目标性状影响不大的转化事件的几率,可能是由于现代甘蔗栽培种至少为八倍体,且染色体数目约为120条,基因组达10 Gb,因此,低拷贝数外源目的基因的导入和整合,其所表达的蛋白对抗虫目标性状的改良效果不明显,这与二倍体物种如水稻等有较大的不同,但高拷贝的导入和整合又导致非目标性状如甘蔗产量和品质性状变劣。此外,我们还观察到蛋白表达与外源基因拷贝数之间没有确定的线性关系或剂量效应;（2）在FN15为受体的转基因系群体中,中拷贝型的转基因株系表现出更好的产量与品质性状表型,并从中筛选到1个（a1株系）单位面积产糖量优于非转基因对照、2个（a5和a6株系）与对照相当但螟害率显着低于对照的株系,待完成安全性评价后,有望直接作为甘蔗生产性品种利用或作为杂交亲本用于甘蔗抗螟虫育种。4.转基因甘蔗的蛋白时空表达情况,其研究结果如下:（1）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在甘蔗不同的组织部位的表达均呈现出蔗叶中表达量最高、根次之、茎中最低的趋势;（2）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在不同生长阶段的表达呈现出分蘖期最高、成熟期次之、拔节期最低的趋势;（3）根中的cry1Ac蛋白表达情况最为复杂:FN15受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出成熟期最高、拔节期次之、分蘖期最低的趋势;而ROC22受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出分蘖期最高、拔节期次之、成熟期最低的趋势;（4）对于FN15受体的转基因株系,中拷贝型的al和a5株系在各生育期其cry1Ac表达量均高于低拷贝型的19b-2和19b-4株系;而ROC22为受体的转基因株系,则没有这个趋势。发现转cry1Ac基因甘蔗外源cry1Ac蛋白存在一定的动态时空表达特性,并具有受体基因型的差异。5.通过单引物PCR、Genome walking试剂盒（TaKaRa）和hi-Tail PCR等三种方法,对转cry1Ac基因甘蔗外源基因插入位点进行了研究。研究发现,单引物PCR法特异性较低;Genome walking试剂盒（TaKaRa）获得克隆条带过大（约5 Kb）、加上随机引物（AP）为混合物且为专利产品,给TA克隆测序带来了挑战、实验成本和周期长,不利于序列分析;hi-Tail PCR法中加入了 AC1及其LAD引物的巧妙设计,极大地提高了获得旁侧序列的能力。采用hi-Tail PCR法,成功鉴定了 a1株系左右边界和a5株系右边界的旁侧序列,发现基因枪法轰击转化的转基因甘蔗外源基因趋向于整合到线粒体等环状DNA中。6.通过PCR-DGGE法,对6个转cry1Ac基因甘蔗株系根际土壤微生态的微生物物群落和进化关系进行了研究,发现土壤微生物群落的变化是动态的,可能与生长时期、季节和环境等因素有关,但从整体和长期趋势来看,转基因系和非转基因系对土壤微生态的作用是一致的。7.转cry1Ac基因甘蔗及非转基因对照的RNA-seq转录组表达谱分析转基因甘蔗的非预期效应,其研究结果如下:（1）本研究RNA-seq测序与组装的质量高。12个甘蔗样品共获得了 83.50 Gb的数据量和668,017,350条的总reads数。组装得到的甘蔗Unigene库总共含有65,995条Unigenes,N50长度达到了 1,049 bp,平均组装长度为715.14 bp。（2）差异基因表达统计发现,上/下调表达情况较丰富,转基因系和非转基因系差异表达的基因总共有1,067个,共同上调表达的基因总共有199个,共同下调表达的基因总共有473个。（3）转基因系和非转基因系相比,上调表达基因的代谢途径主要涉及与植物次生代谢途径相关,有苯丙氨酸代谢途径、甘油酯代谢途径、亚油酸代谢途径、类黄酮生物合成和二萜生物合成途径等,其次是植物激素转导途径。下调表达基因的代谢途径主要涉及异羟肟酸生物合成等化学防御代谢途径,脂肪酸代谢等基础代谢途径以及植物激素信号转导、植物-病原互作等代谢通路。这些有关转基因甘蔗转录本潜在功能的分析,初步揭示了转基因甘蔗典型株系的抗虫性和其他表型性状形成的分子基础,而这些途径中与植物抗逆和防御相关的基因以及中、低拷贝型株系间的差异基因是后续深入研究的重点,不仅有助于揭示上述基因在甘蔗抗逆、防御和产量形成中的作用,还有助于指导培育抗虫性、产量和品质兼优符合育种目标的转基因新品系。
陈忠伟[6]（2014）在《基因枪介导抗花叶病和黄叶病RNAi转化甘蔗及分子鉴定研究》文中指出甘蔗是重要的糖料作物和能源作物,但甘蔗花叶病、黄叶病等主要甘蔗病害却制约了甘蔗产业的发展,同时由于甘蔗遗传背景复杂、杂交过程的周期较长以及通过组织培养脱毒存在工作量大和易被病毒再感染等问题,严重制约了通过组织培养获得脱毒甘蔗幼苗和杂交育种获得抗病性的进行,因此利用基因工程技术改良甘蔗抗病虫性状已成为一种有效途径。本研究利用实验室已经构建的具有甘蔗花叶病病毒HC-Pro基因和甘蔗黄叶病病毒CP基因干扰结构的双价干扰表达载体pART27-MC1Y和pART27-MC2Y,具有甘蔗花叶病病毒和黄叶病病毒CP基因干扰结构的pART27-MPY,在验证表达载体的完整性和建立甘蔗品种FN15愈伤组织和分化最适G418筛选浓度的基础上,通过基因枪轰击将三种表达载体分别转入甘蔗品种FN15愈伤组织,而后对遗传转化获得的抗性再生植株进行分子检测,获得了转基因植株。本论文的主要研究成果:1、通过PCR、酶切验证确认实验室保存的RNAi表达载体pART27-MC1 Y、pART27-MC2Y和pART27-MPY完整可用,并通过基因枪转化甘蔗品种FN15愈伤组织。2、通过G418的梯度筛选确立了 FN15在愈伤组织时期的G418筛选浓度为35mg/L,分化苗阶段的筛选浓度为40mg/L。3、通过PCR检测筛选到12株转基因甘蔗植株,通过实时荧光定量PCR检测确定了 5株转甘蔗花叶病病毒和黄叶病病毒CP基因RNAi双价干扰结构的甘蔗植株的拷贝数,利用半定量和定量PCR的方法来分析转基因甘蔗植株的表达量,显示转基因植株中目的基因发生了表达,同时还利用定量PCR的方法对转基因拷贝数和表达量进行了分析,显示转基因甘蔗植株的拷贝数在3.15-5.93个拷贝之间,相对表达量并未与之形成明显的对应关系。
吴凯朝[7]（2013）在《干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究》文中进行了进一步梳理干旱是制约我国甘蔗生产的主要影响因子。选育抗旱能力强、地域适应性广的高产高糖新品种是解决季节性干旱给我国甘蔗生产带来不利影响的有效途径。挖掘抗旱力强、水分高效利用的基因并通过遗传转化进行分子育种是提高甘蔗抗旱能力研究的新方向。抗旱甘蔗品种既应具有在干旱胁迫状态下的耐受能力,还应具有干旱胁迫状态解除后恢复快速生长的能力,因此研究甘蔗对干旱和干旱后复水的生理和分子响应机理对如何提高甘蔗抗旱能力的遗传改良都具有同样重要的意义。甘蔗是高光效C4作物,具有耐旱、耐涝、耐瘠、抗病、高生物量等特性,是作物重要耐旱基因资源。为了研究甘蔗响应水分胁迫的生理和分子机理,挖掘甘蔗的耐早、水分高效利用及促进生长的基因,本研究选用优良抗旱育种杂交亲本GT11为试验材料,在渗透调节、保护酶活性、物质代谢和内源激素等几个方面探讨甘蔗伸长期在干旱及干旱后复水状态下生理响应；利用cDNA-AFLP和cDNA-SCoT两种基因差异分析方法分离和筛选甘蔗在干旱及干旱后复水诱导的差异表达基因,并对获得的部分特异基因片段进行克隆获得基因全长cDNA,为作物抗旱性的遗传改良提供相应的基因资源。主要研究内容和结果如下：1.在干旱胁迫下,甘蔗品种GT11伸长期在渗透调节、保护酶系统、物质代谢和内源激素等几个方面都做出积极的生理响应,表明了GT11在水分胁迫下可能有较强的适应能力。（1）干旱胁迫下,甘蔗的渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸大量增加,P5CS活力增强,而可溶性蛋白质含量下降,ProDH活力受到限制。复水处理后,叶片中可溶性糖含量急剧下降后回调；脯氨酸含量很快下降；可溶性蛋白质含量快速回升；P5CS活力很快下降；ProDH活力急剧上升。（2）干旱胁迫下,甘蔗的丙二醛含量和超氧阴离子含量升高,保护系统酶POD、 CAT、SOD和GSH-R活力都在不同程度提高。复水处理后,丙二醛含量和超氧阴离子含量很快下降,保护系统酶SOD和GSH-R活力降低,CAT活性表现为先下降后升高。与对照相比,保护系统酶活力在复水前期保持较高活力水平。（3）干旱胁迫下,甘蔗的ABA含量随受干旱胁迫进程不断加大累积,PAO活力上升。复水处理后,ABA含量先上升后下降,PAO活力很快降低。2.使用cDNA-AFLP差异显示方法分离得到406个与水分胁迫相关TDFs,167个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。通过对27个TDFs进行克隆、测序、比对分析,涉及新陈代谢、能量代谢、转录调控、结合功能蛋白、环境互作等相关功能基因。3.使用cDNA-SCoT差异显示方法分离得到316个与水分胁迫相关TDFs,180个TDFs反向Northern印迹杂交验证为阳性。对177个TDFs进行克隆、测序、比对分析,其中107个TDFs在NCBI数据库有较高相似度已知功能基因,28个TDFs在NCBI数据库有相似性很高的未知功能基因和假想蛋白。135个TDFs可以分为14类：新陈代谢、能量代谢、运输途径、通信及信号转导、细胞循环及DNA加工、转录调控因子、蛋白质合成、蛋白质加工、结合功能蛋白、转座子、毒性及质粒蛋白、细胞分生物合成、防御和未分类蛋白。4.利用半定量RT-PCR对12个从cDNA-SCoT分离获得的TDFs进行表达验证分析,全部12个基因表达量都在一定程度上受到干旱诱导或干旱后复水的诱导。其中4个基因受到干旱胁迫诱导上调表达,为抗旱类基因；7个基因受复水诱导上调表达,为恢复生长调节类基因；1个基因在干旱和复水都被诱导上调表达,为双重功能基因。从12个基因的表达模式分类结果和该基因的生物学信息功能分析结果基本是一致的。5.以GT11的cDNA第一链为模板,采用同源克隆方法成功克隆到5个水分胁迫相关基因全长cDNA,分别为Sc-atpI基因、Sc-SUTl基因、Sc-SAMDC3基因、Sc-Tuba3基因和Sc-HSP70基因,并对这些基因的核苷酸序列及其编码氨基酸序列进行分析,结果表明5个基因在NCBI数据都有同源性很高的禾本科作物（玉米、高粱）基因。Sc-atpI基因、Sc-Tuba3基因、Sc-HSP70基因、Sc-SAMDC3基因为首次在甘蔗中克隆得到。
郭晋隆[8]（2013）在《PEG胁迫下的甘蔗RNA-Seq定量分析与差异表达基因鉴定》文中认为甘蔗（Saccharum officinarum L.）是重要的糖料作物和能源作物,蔗糖分别占世界食糖和我国食糖总产量的70%和90%以上,甘蔗燃料乙醇产量约占世界生物质燃料乙醇总产量的40%。干旱是造成甘蔗等作物减产的重要因素,我国甘蔗85%种植在盐碱地或旱坡地,甘蔗水分需求与供给不平衡的矛盾尤为突出。挖掘甘蔗抗旱基因是甘蔗抗逆性育种的重要基础工作。转录水平调节是作物从分子水平上适应干旱胁迫的一个重要机制,利用干旱胁迫应答基因在转录水平的表达差异来筛选并鉴定抗旱相关基因,是挖掘作物抗旱基因的有效手段。斑茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近缘属植物,具有优异的抗逆基因资源,已成为甘蔗抗逆育种的重要基因来源。有性杂交虽然也是一种有效的途径,而且,经过了十几年研究,目前也已培育出甘蔗与斑茅杂交的BC3和BC4后代。但是,在斑茅优异的抗逆基因资源的杂交利用与“高贵化”回交过程中,还面临较多的困难,如杂交后代花粉不育、计划杂交的组合花期不遇和优良目标性状的多基因聚合问题,同时,在杂交后代广泛变异群体中,具有优良目标性状聚合基因型单株的鉴定与选择的准确性和效率依然不高。因而,即便对于甘蔗品种间的杂交,一般认为在10万个杂交后代变异群体中,经过10年的鉴定与选择,有希望培育出1个优良栽培品种。基于上述考虑,利用综合性状好且具有斑茅血缘的甘蔗BC2材料,进行模拟干旱逆境胁迫,以期在解析甘蔗应答干旱逆境胁迫分子机理的同时,挖掘重要的抗逆基因和转录调控元件,为后续抗逆育种奠定物质基础、理论依据与技术储备。本研究以甘蔗与斑茅杂交选育的BC2无性系（S. complex）崖城05-179（YCE05-179）为实验材料,采用Illumina GA/HiSeq第二代测序平台进行RNA-Seq高通量测序,通过收集、比对与分析在模拟干旱胁迫条件下（25%PEG800,24h）的甘蔗根中的转录本数据,高通量的分离和筛选差异表达基因,并对部分PEG胁迫应答基因进行了功能验证。主要结果与结论如下：1.以抗旱斑茅蔗无性系YCE05-179为植物材料,基于Illumina/Solexa二代测序平台的RNA-Seq技术,成功获得YCE05-179的根中响应PEG胁迫的转录本序列信息,处理和对照2个样本的测序总量分别达到514,274,992个和556,342,815个总碱基对（Total base pairs）;其中,胁迫处理样本得到10,495,408个clean reads,对照样本得到11,353,935个clean reads。测序质量的多重评估分析结果表明,本研究中RNA-Seq测序质量良好,测序深度充分,测序结果已经基本覆盖了2组样本细胞中全部表达的基因。2.以NCBI的高粱基因组数据库以及高粱基因数据库数据为参考,对上述两组RNA-Seq数据进行比对和分析,共检测到23,550个基因。从两组样品中,共筛选到12,035个差异表达基因,其中上调表达的基因有6,480个,下调表达的基因有5,555个。表达显着差异（差异表达基因为FDR≤0.001且倍数差异不低于2倍）的基因共有597个（其中上调表达329个,下调表达268个）。本研究从上述差异表达基因中挑选出部分基因做进一步的功能验证,包括参与细胞次生代谢途径中木质素合成的dirigent蛋白基因、参与重金属绑定和细胞活性氧清除的金属硫蛋白基因,以及参与转录调控的R2R3-MYB转录因子家族基因。3. Dirigent和dirigent-like家族蛋白与植物细胞的木质素合成相关,参与了植物对病原体和非生物胁迫的应答。本研究在对RNA-Seq和甘蔗茎cDNA全长文库数据分析的基础上,分离克隆了1个dirigent-like基因,命名为ScDir （GenBank Accession number:JQ622282）。 ScDir的cDNA全长819bp,包含1个564bp的开放读码框,编码187个氨基酸。ScDir蛋白的氨基酸序列N端的第1到25个氨基酸残基和第7到26个氨基酸残基的位置分别包含一个信号肽和跨膜结构区。用His标签标记ScDir蛋白,并成功在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达了该重组蛋白（理论分子量大小为27.4kDa）.ScDir基因在大肠杆菌中的表达提高了宿主菌对PEG和NaCl的耐受能力。以GAPDH基因为内参基因的实时荧光定量PCR研究表明,ScDir基因在甘蔗的茎中高度特异表达,其在茎中的相对表达量分别是在根、叶和芽中的8.64±0.48倍,25,635.16±2,966.03倍和721.50±8.17倍。实时荧光定量PCR研究结果表明,H2O2、PEG和NaCl胁迫提高了ScDir基因在甘蔗组培苗中的表达水平,其中ScDir基因的表达受PEG胁迫的诱导而显着上调,在处理12h时间点其表达量最高,为对照的35倍以上。上述实验结果说明,ScDir基因是一种茎高度特异表达基因,该基因在大肠杆菌中的作用及其在甘蔗中的表达模式,揭示了该基因在甘蔗应答干旱、高盐和氧化等非生物胁迫方面起到积极的作用。4.金属硫蛋白基因是一类富含半胱氨酸的小分子量金属结合蛋白。前人的研究显示,植物金属硫蛋白具有可逆结合有毒离子和基本金属离子的能力,在解毒、维持金属离子代谢平衡和调节金属离子转运等方面起重要作用。本研究在对RNA-Seq和甘蔗茎cDNA全长文库数据分析的基础上,分离克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为ScMT2-1-3（GenBank Accession number:JQ627644）。ScMT2-1-3基因全长700bp,包含一个240bp的开放读码框,编码79个氨基酸。在大肠杆菌中成功表达了带His标签的ScMT2-1-3重组蛋白（分子量大小约为19.01kDa）,并通过MALDI-TOF-TOF MS验证了该重组蛋白。ScMT2-1-3基因在大肠杆菌中的表达提高了宿主菌对Cd2+、Cu2+、PEG和NaCl的耐受能力。实时荧光定量PCR研究表明,CuCl2、H2O2、PEG和NaCl胁迫均提高了ScMT2-1-3基因在甘蔗组培苗中的表达水平,而CdCl2胁迫抑制了ScMT2-1-3基因的表达水平；ScMT2-1-3基因在甘蔗芽和根中的相对表达量是在茎和叶中的14倍以上。ScMT2-1-3基因在大肠杆菌中的作用及其在甘蔗中的表达模式,提示了该基因在甘蔗应答干旱、高盐和氧化等非生物胁迫时,扮演着抗氧化的角色,并起积极的作用。此外,ScMT2-1-3基因还参与了铜离子在细胞中的解毒和富集过程,但其对甘蔗细胞中镉的解毒和富集过程的作用机理还需进一步研究。5.R2R3-MYB基因是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。本研究在RNA-Seq高通量测序的基础上,综合应用电子克隆、RT-PCR和RACE技术,分离克隆了3个甘蔗R2R3-Myb基因/亚家族Sc2RMyb1、 Sc2RMyb2和Sc2RMyb3s。这些基因的表达特性或功能验证实验结果如下：（1）Sc2RMyb1（GenBank Accession number:JQ823165）的基因组DNA全长1,807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1,284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌,经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kDa。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H202和NaCl抑制而明显下调；Sc2RMyb1基因对PEG的应答除了在处理12h时略有上调以外,在其余的6个理处时间点均明显下调。推测该基因作为负调节因子参与了NaCl等胁迫应答相关基因的调控过程。（2）Sc2RMyb2基因通过不同剪接方式,产生至少两种转录本,即Sc2RMyb1和Sc2RMyb2。其中Sc2RMyb2S1的cDNA全长为1,066bp,开放阅读框长度为687bp,共编码228个氨基酸；Sc2RMyb2S2无明显开放读码框,不编码功能蛋白。序列分析表明,串联内含子的结构特征是Sc2RMyb2剪接调控的结构基础。Sc2RMyb2转录基因子基因通过剪接调控,调节细胞中Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb2S2两种转录本的相对表达量,从而对PEG胁迫引起的生理生化变化进行应答。实时荧光定量PCR研究表明,Sc2RMyb2S1基因的表达受PEG胁迫的抑制而显着下调,该基因在烟草叶片中的瞬时表达导致叶片变黄,提示了该基因参与了PEG胁迫引起的细胞衰老的调控过程。（3）本研究还分离克隆了Sc2RMyb3s亚家族的7个成员基因（Sc2RMyb3-1～Sc2RMyb3-7）,并对Sc2RMyb3-1、Sc2RMyb3-2和Sc2RMyb3-3等3个基因进行了初步的功能验证。在烟草叶片中的瞬时表达实验表明,Sc2RMyb3-1和Sc2RMyb3-2基因没有引起烟草叶色等表型的明显变化,而Sc2RMyb3-3基因在烟草叶片中的瞬间表达导致了叶色明显变黄,这提示了Sc2RMyb3-3基因在细胞衰老等相关生理生化过程中发挥重要的调控作用；Sc2RMyb3s亚家族各成员基因在甘蔗响应环境因子的过程中执行不同的功能,体现了R2R3-Myb转录因子调控机制的复杂性。序列分析表明,氨基酸序列中的C端序列结构在决定甘蔗Sc2RMyb3s转录因子的功能上起到重要的作用。
甘仪梅,张树珍,曾凡云,冯翠莲,杨本鹏[9]（2013）在《甘蔗转基因育种研究进展》文中进行了进一步梳理由于复杂的遗传背景、较低的可育性和缺乏优异种质资源等因素给甘蔗品种改良带来了很大的困难,而通过转基因技术为甘蔗品种改良提供了有效的途径。甘蔗通过转基因,不仅在其抗虫性（螟虫和蚜虫）、抗病性（白条病、花叶病和黑穗病）、蔗糖改良（蔗糖产量、蔗糖纯度和色泽）、抗除草剂、抗旱性等方面已经取得了很大的进展,而且转基因甘蔗作为生物反应器生产重组蛋白（GM-CSF等）和生物塑料聚羟基丁酸酯（PHB）也取得了很好的成果。综述甘蔗主要性状遗传改良研究进展、转基因存在的问题以及转基因安全性研究状况,并对今后的甘蔗转基因育种前景和研究方向进行分析。
卢双楠,李粲,滕峥,刘开雨,刘芳,邱永福,梁朝旭,方位宽,何姗珊,刘晓静,李鸣,梁俊,李容柏[10]（2012）在《高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建》文中研究指明【目的】利用载体重组技术分别将高山离子芥冷诱导基因（Cbcor15a）和报告基因eGFP插入载体pCambia1300-bar,并引入玉米泛素基因启动子UBi-1代替载体本身启动子CaMV35s,重组为适合甘蔗转基因的二元植物表达载体pCambia1300-cbcor15a-bar。【方法】参照pCambia1300-bar载体多克隆位点和基因Cbcor15a、eGFP和启动子UBi-1的核苷酸序列设计引物,通过载体重组技术将基因和启动子分别插入相应的位点。利用基因枪分别将pCambia1300-bar载体和重组载体导入洋葱表皮细胞,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。【结果】与导入pCambia1300-bar载体的洋葱表皮细胞相比较,导入重组载体pCambia1300-cbcor15a-bar的洋葱表皮细胞内有强烈的绿色荧光信号。【结论】重组甘蔗转基因二元植物表达载体启动子Ubi-1能够调控下游冷诱导基因Cbcor15a和报告基因eGFP的正常高效表达,为外源基因Cbcor15a转化甘蔗提供保障。
二、海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究（论文提纲范文）
（1）分子改造提高融合酶特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 海藻糖的简介 |
| 1.1.1 海藻糖的结构 |
| 1.1.2 海藻糖的特性 |
| 1.1.3 海藻糖的合成方式 |
| 1.1.4 海藻糖的应用 |
| 1.2 海藻糖合酶的研究进展 |
| 1.2.1 海藻糖合酶的简介 |
| 1.2.2 海藻糖合酶的作用机理 |
| 1.2.3 海藻糖合酶基因工程研究进展 |
| 1.3 融合酶的研究进展 |
| 1.3.1 融合酶的简介 |
| 1.3.2 融合酶的连接方法 |
| 1.4 蛋白异源表达与纯化技术 |
| 1.4.1 蛋白异源表达与纯化的简介 |
| 1.4.2 蛋白异源表达体系分类 |
| 1.4.3 蛋白纯化流程简介 |
| 1.4.4 蛋白纯化技术的现状 |
| 1.5 圆二色光谱的研究进展与应用 |
| 1.5.1 圆二色光谱技术的简介 |
| 1.5.2 圆二色光谱技术在测定蛋白方面的应用 |
| 1.6 立题的背景和研究意义 |
| 第2章 β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶融合酶的构建与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 分子生物学试剂与酶 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 相关溶液与培养基的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒pET-28a-ba的构建 |
| 2.3.1.1 质粒pET-28a的提取 |
| 2.3.1.2 蜡样芽孢杆菌基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.3 表达引物的设计 |
| 2.3.1.4 大肠杆菌E.coli DH5α感受态的制备 |
| 2.3.1.5 β-淀粉酶基因的克隆与转化 |
| 2.3.2 β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶融合酶的构建 |
| 2.3.2.1 引物的设计 |
| 2.3.2.2 不同来源海藻糖合酶基因(ts)的扩增 |
| 2.3.2.3 重组质粒pET-28a-ba的提取 |
| 2.3.2.4 不同来源海藻糖合酶基因与质粒pET-28a-ba的连接与转化 |
| 2.3.2.5 阳性重组子的验证 |
| 2.3.3 融合酶的诱导表达与纯化以及融合蛋白浓度的测定(以重组菌株 E.coli BL21(pET-28a-bap3ts Ps)为例) |
| 2.3.3.1 融合酶的诱导表达及酶活验证 |
| 2.3.3.2 融合酶Ni-NTA亲和层析纯化及蛋白浓度的测定 |
| 2.3.4 重组菌株酶活性质的测定 |
| 2.3.4.1 融合酶最适温度的测定 |
| 2.3.4.2 融合酶最适pH的测定 |
| 2.3.4.3 不同金属离子对融合酶的影响 |
| 2.3.4.4 融合酶动力学参数的测定(BL21(pET-28a-bap3ts Ps)以及BL21(pET-28a-bap3 ts Tt)) |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 融合酶重组质粒的构建过程 |
| 2.4.2 空载pET-28a质粒的提取 |
| 2.4.3 β-淀粉酶基因(ba)的克隆 |
| 2.4.4 重组质粒pET-28a-ba阳性重组子的验证 |
| 2.4.5 PCR扩增不同来源的海藻糖合酶基因 |
| 2.4.6 重组融合酶的构建(以重组质粒pET-28a-bap3ts Ps为例) |
| 2.4.7 融合酶的表达与催化 |
| 2.4.8 融合酶酶活特性的测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 利用抗蛋白酶降解连接肽的融合酶的构建与表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 工程菌及质粒 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 分子生物学试剂与酶 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 培养基与相关溶液的配置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗蛋白酶降解的连接肽以及引物的设计 |
| 3.3.2 质粒pET-28a-bap3ts Ps和 pUC57-shishi-17 的提取 |
| 3.3.3 抗蛋白酶降解连接肽替换片段的连接 |
| 3.3.3.1 连接肽替换片段(SS17)的扩增 |
| 3.3.3.2 质粒pUC57-shishi-17与pET-28a-bap3ts Ps 的双酶切 |
| 3.3.3.3 目的片段与质粒pET-28a-bap3ts Ps的连接 |
| 3.3.4 阳性重组子的检测与验证 |
| 3.3.5 融合酶的诱导表达及酶活验证 |
| 3.3.6 重组融合酶BL21(pET-28a-bap4ts Ps)酶活特性的测定 |
| 3.3.6.1 重组融合酶最适温度的测定 |
| 3.3.6.2 重组融合酶最适pH的测定 |
| 3.3.6.3 不同金属离子对重组融合酶酶活的影响 |
| 3.3.6.4 圆二色光谱检测蛋白二级空间的变化(重组融合酶BL21(pET-28a-bap4tsPs)与原始融合酶BL21(pET-28a-bap3tsPs)以及单酶比较) |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 融合酶重组质粒的构建 |
| 3.4.2 连接肽替换片段(SS17)的扩增 |
| 3.4.3 质粒pUC57-shishi-17与pET-28a-bap3ts Ps的双酶切 |
| 3.4.4 重组质粒pET-28a-bap4ts Ps阳性重组子的验证 |
| 3.4.5 重组融合酶的诱导表达与酶活验证 |
| 3.4.6 重组融合酶酶活特性的检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 利用插入融合的方式构建融合酶 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 工程菌及质粒 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 分子生物学试剂与酶 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.2.5 培养基与相关溶液配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 插入位点以及插入融合主体与客体的选择 |
| 4.3.2 表达引物的设计 |
| 4.3.3 海藻糖合酶基因的扩增 |
| 4.3.4 重组质粒pET-28a-ba的线性化 |
| 4.3.5 重组质粒pET-28a-bats Ps的构建与转化 |
| 4.3.6 阳性重组子的检测与验证 |
| 4.3.7 重组菌株E. coli BL21(pET-28a-bats Ps)的异源表达与酶活验证 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PCR 扩增海藻糖合酶基因(tsPs) |
| 4.4.2 载体pET-28a-ba的线性化 |
| 4.4.3 阳性重组子的鉴定 |
| 4.4.4 重组融合酶BL21(pET-28a-bats Ps)的蛋白表达与酶活验证 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间主要研究成果 |
（2）海藻糖的生产及分析方法的国内研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 海藻糖的结构和功能 |
| 1.1 化学结构 |
| 1.2 生物学功能 |
| 2 海藻糖的生产方法 |
| 2.1 微生物提取法 |
| 2.2 微生物发酵法 |
| 2.3 基因工程法 |
| 2.4 酶转化法 |
| 3 海藻糖的分析方法 |
| 3.1 蒽酮比色法 |
| 3.2 纸层析法 |
| 3.3 薄层层析法 |
| 3.4 DNS比色法 |
| 3.5 高效液相色谱法 |
| 4 海藻糖的应用前景 |
| 5 展望 |
（3）甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（SoP5CS）的抗旱功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 1 前言 |
| 1.1 干旱胁迫与植物的生理生化基础 |
| 1.1.1 干旱胁迫与植物抗氧化系统 |
| 1.1.2 干旱胁迫与植物渗透调节物质 |
| 1.1.3 干旱胁迫与植物细胞膜系统 |
| 1.1.4 干旱胁迫与植物内源激素 |
| 1.2 干旱胁迫与植物基因 |
| 1.2.1 干旱胁迫与植物基因的调控 |
| 1.2.2 植物干旱响应基因的挖掘 |
| 1.2.3 植物抗旱基因的功能研究 |
| 1.3 植物P5CS基因研究进展 |
| 1.3.1 植物P5CS基因的克隆与表达特性研究 |
| 1.3.2 植物P5CS基因在抗逆基因工程中的应用 |
| 1.4 甘蔗转基因研究进展 |
| 1.4.1 甘蔗遗传转化方法 |
| 1.4.2 甘蔗抗逆转基因研究 |
| 1.5 本研究的立论依据、研究目的及意义 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 2 SoP5CS基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 甘蔗幼苗叶片总RNA的提取及检测 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.3 引物设计和PCR扩增 |
| 2.2.4 目的条带的胶回收纯化 |
| 2.2.5 SoP5CS片段的连接及测序验证 |
| 2.2.6 生物信息学分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 提取的总RNA质量检测 |
| 2.3.2 SoP5CS基因的扩增 |
| 2.3.3 SoP5CS基因的生物信息学相关分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 SoP5CS基因表达量分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料及处理 |
| 3.1.2 实验主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验主要方法 |
| 3.2.1 RNA的提取及检测 |
| 3.2.2 基因组DNA的去除及cDNA的合成 |
| 3.2.3 SoP5CS基因荧光定量PCR引物的设计 |
| 3.2.4 荧光定量PCR |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 RNA和cDNA质量的检测 |
| 3.3.2 SoP5CS的组织表达特性 |
| 3.3.3 SoP5CS在不同处理下的表达特性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 SoP5CS的原核表达、蛋白纯化及单克隆抗体制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 载体及菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pET-30a载体质粒的提取 |
| 4.2.2 目的基因与载体的双酶切 |
| 4.2.3 目的基因片段与原核表达载体的连接及转化 |
| 4.2.4 重组质粒pET30a-SoP5CS的提取及双酶切验证 |
| 4.2.5 重组质粒pET30a-SoP5CS转化BL21 |
| 4.2.6 融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.7 SDS-PAGE电泳 |
| 4.2.8 原核表达的SoP5CS蛋白的纯化 |
| 4.2.9 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 原核表达载体的构建及验证 |
| 4.3.2 原核表达 |
| 4.3.3 原核表达蛋白的纯化 |
| 4.3.4 单克隆抗体的制备 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 甘蔗过量表达SoP5CS基因的研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 甘蔗材料 |
| 5.1.2 农杆菌及植物表达载体 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 主要的仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 植物表达载体引物的设计 |
| 5.2.2 SoP5CS基因ORF的扩增及回收 |
| 5.2.3 PUBTB质粒的提取 |
| 5.2.4 目的基因片段和载体质粒的双酶切及纯化 |
| 5.2.5 SoP5CS与植物表达载体的连接及转化 |
| 5.2.6 重组质粒的提取及酶切验证 |
| 5.2.7 重组质粒转化EHA105农杆菌 |
| 5.2.8 甘蔗组培材料的抗性筛选 |
| 5.2.9 甘蔗的遗传转化 |
| 5.2.10 转基因甘蔗基因组DNA的提取 |
| 5.2.11 转基因甘蔗的PCR检测 |
| 5.2.12 转基因甘蔗的抗旱研究 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 植物表达载体的构建 |
| 5.3.2 PPT的抗性筛选 |
| 5.3.3 转基因甘蔗的获得 |
| 5.3.4 转基因甘蔗的PCR检测 |
| 5.3.5 转基因甘蔗的抗旱性鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 SoP5CS基因转化烟草的研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 烟草材料 |
| 6.1.2 菌种及载体 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 烟草无菌苗的培养及烟草的遗传转化 |
| 6.2.2 转基因烟草DNA的提取 |
| 6.2.3 转基因烟草的PCR检测 |
| 6.2.4 转基因烟草的基因拷贝数测定 |
| 6.2.5 转基因烟草的抗旱性检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 转基因烟草的获得 |
| 6.3.2 转基因烟草的检测 |
| 6.3.3 转基因烟草的基因拷贝数测定 |
| 6.3.4 转基因烟草的抗旱性检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）转SoDREB2烟草抗旱性及甘蔗转SoDREB2研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 甘蔗概况 |
| 1.1.1 甘蔗的起源以及生物学性质 |
| 1.1.2 甘蔗是重要的糖料作物 |
| 1.1.3 甘蔗是重要的能源作物 |
| 1.1.4 甘蔗副产品的利用 |
| 1.2 DREB转录因子的研究进展 |
| 1.2.1 DREB基因的结构与功能 |
| 1.2.2 DREB转录因子在植物抗逆基因工程中的应用 |
| 1.2.3 DREB转录因子与植物非生物胁迫的进展 |
| 1.3 甘蔗转基因研究进展 |
| 1.4 甘蔗转基因植株获得途径及影响因素 |
| 1.4.1 甘蔗转基因植株获得途径 |
| 1.5 甘蔗农杆菌介导遗传转化研究进展 |
| 1.5.1 甘蔗组织培养体系研究进展 |
| 1.5.2 甘蔗农杆菌介导体系研究进展 |
| 1.5.3 甘蔗转基因研究中存在问题 |
| 1.6 植物抗旱的生理机制 |
| 1.6.1 渗透调节物质与植物耐旱性的关系 |
| 1.6.2 植物细胞膜透性与植物耐旱性的关系 |
| 1.6.3 植株光合作用及叶绿素含量与植物耐旱性的关系 |
| 1.6.4 保护酶系统与植物耐旱性的关系 |
| 1.7 本课题研究的目的与意义 |
| 2 转甘蔗SoDREB2基因烟草遗传稳定性分析 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料和材料种植 |
| 2.1.2 转基因烟草T1代的PCR检测 |
| 2.1.3 抗旱性评价 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 T1转SoDREB2基因烟草形态观察 |
| 2.2.2 PCR检测结果 |
| 2.2.3 转SoDREB2基因烟草抗旱性评价 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 3 农杆菌介导甘蔗SoDREB2基因遗传转化甘蔗的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 植物材料及转化受体 |
| 3.1.2 目的基因、质粒和菌株 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 生化试剂配制 |
| 3.1.5 甘蔗组织培养外植体的选取与处理 |
| 3.1.6 不同培养基对甘蔗愈伤组织的诱导 |
| 3.1.7 农杆菌介导甘蔗遗传转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同培养基成分对甘蔗愈伤组织的诱导 |
| 3.2.2 菌液的PCR检测验证 |
| 3.2.3 根癌农杆菌介导法转化甘蔗的研究 |
| 3.2.4 抗性植株的PCR检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 甘蔗外植体的选择与灭菌 |
| 3.3.2 不同培养基培养差异 |
| 3.3.3 农杆菌洗脱用抗生素及转化植株筛选 |
| 4 全文结论与展望 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.1.1 转基因烟草SoDREB2 T1代抗旱性分析 |
| 4.1.2 SoDREB2基因在甘蔗中的遗传转化 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘蔗螟虫是甘蔗生产上最重要的害虫 |
| 1.1.1 甘蔗螟虫的发生及危害 |
| 1.1.2 甘蔗螟虫的防治 |
| 1.2 转基因育种是改良甘蔗的一条有效途径 |
| 1.2.1 甘蔗转基因研究远滞后于其他作物且未商业化种植 |
| 1.2.2 甘蔗转基因研究历程及主要进展 |
| 1.3 甘蔗抗虫转基因育种 |
| 1.3.1 Bt/cry等抗虫基因及利用情况 |
| 1.3.2 cry1Ac基因及转cry1Ac基因作物 |
| 1.3.3 转cry1Ac基因甘蔗研究现状 |
| 1.4 基因工程甘蔗的系统生物学研究 |
| 1.4.1 基因工程甘蔗的分子特征研究 |
| 1.4.2 组学技术研究基因工程甘蔗 |
| 1.5 立题依据与研究意义 |
| 1.6 主要研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 基于环介导等温扩增技术(LAMP)鉴定转cry1Ac基因甘蔗研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 2.1.2 阳性质粒1Ac0229制备与检测 |
| 2.1.3 cry1Ac基因和bar基因LAMP引物、PCR引物设计与合成 |
| 2.1.4 LAMP反应混合物 |
| 2.1.5 LAMP体系优化 |
| 2.1.6 LAMP产物检测 |
| 2.1.7 PCR反应 |
| 2.1.8 LAMP和常规PCR敏感性比较 |
| 2.1.9 LAMP特异性检测 |
| 2.1.10 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的鉴定 |
| 2.1.11 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的拷贝数鉴定和蛋白表达鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基于cry1Ac基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.2.2 基于bar基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 利用实时荧光定量PCR鉴定转基因甘蔗cry1Ac的拷贝数 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 3.1.2 内标准基因APRT、CYC和P4H的克隆 |
| 3.1.3 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.1.4 TaqMan实时荧光定量PCR |
| 3.1.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 内标准基因CYC、APRT和P4H的PCR克隆 |
| 3.2.2 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.2.3 标准曲线的绘制 |
| 3.2.4 转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac的拷贝数鉴定 |
| 3.2.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达与表型性状 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 工农艺性状和螟害情况调查 |
| 4.1.3 转cry1Ac基因甘蔗的拷贝数 |
| 4.1.4 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达 |
| 4.1.5 外源基因拷贝数和主要工农艺性状关联分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转cry1Ac基因甘蔗及对照的螟害情况 |
| 4.2.2 转cry1Ac基因甘蔗及对照的主要工农艺性状表现 |
| 4.2.3 转基因甘蔗及对照叶片中cry1Ac蛋白表达情况 |
| 4.2.4 灰色关联分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及根系土壤微生物群落研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达 |
| 5.1.2 转cry1Ac基因甘蔗部分株系的旁侧序列研究 |
| 5.1.3 根际土壤细菌16S rDNA和18S rDNA的DGGE分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达特性 |
| 5.2.2 旁侧序列和插入位点分析 |
| 5.2.3 根际土壤的PCR-DGGE及序列分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转录组学分析转cry1Ac基因甘蔗典型株系的非预期效应 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料及总RNA提取 |
| 6.1.2 mRNA的富集、cDNA文库构建和Illumina测序 |
| 6.1.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释 |
| 6.1.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析 |
| 6.1.5 外源cry1Ac基因和bar基因的表达分析 |
| 6.1.6 与抗虫性相关防御基因的差异表达分析 |
| 6.1.7 与产量性状相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.8 与蔗糖分积累相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.9 实时荧光定量PCR验征 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 甘蔗总RNA的检测 |
| 6.2.2 测序数据评估 |
| 6.2.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释结果 |
| 6.2.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析结果 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR验证 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 主要结论、创新点及后续工作 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ: 缩略词表 |
| 附录Ⅱ: RNA-seq表达谱差异表达基因筛选 |
| 附录Ⅲ: Trizol法提取总RNA |
| 附录Ⅳ:个人简介 |
| 致谢 |
（6）基因枪介导抗花叶病和黄叶病RNAi转化甘蔗及分子鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 甘蔗花叶病与黄叶病研究概况及RNA干扰的研究进展 |
| 1.1.1 甘蔗花叶病研究概况 |
| 1.1.2 甘蔗黄叶病研究概况 |
| 1.1.3 甘蔗花叶病与黄叶病RNA干扰的研究进展 |
| 1.2 甘蔗遗传转化的方法 |
| 1.2.1 基因枪转化法 |
| 1.2.2 农杆菌介导法 |
| 1.2.3 电穿孔法 |
| 1.2.4 聚乙二醇(PEG)介导法 |
| 1.3 转基因植物的检测方法 |
| 1.3.1 外源基因整合水平的检测 |
| 1.3.2 外源基因转录水平的检测 |
| 1.3.3 外源基因翻译水平的检测 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 1.5 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒载体及菌种 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验所使用的培养基 |
| 2.1.6 PCR检测引物及程序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNAi表达载体验证 |
| 2.2.2 双价RNAi表达载体转化扩繁 |
| 2.2.3 基因枪介导的RNAi表达载体的遗传转化 |
| 2.2.4 抗性再生植株分子鉴定 |
| 2.2.5 转基因阳性植株的分子鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNAi表达载体验证 |
| 3.1.1 质粒大小验证 |
| 3.1.2 PCR验证 |
| 3.1.3 表达载体酶切验证 |
| 3.2 双价RNAi表达载体转化扩繁 |
| 3.2.1 转化扩繁后菌液PCR及PCR产物测序 |
| 3.2.2 阳性菌株质粒验证 |
| 3.2.3 表达载体主要元件及筛选基因PCR验证 |
| 3.3 基因枪介导的RNAi表达载体的遗传转化 |
| 3.3.1 甘蔗愈伤诱导 |
| 3.3.2 受体材料G418筛选浓度测定 |
| 3.3.3 基因枪介导的遗传转化 |
| 3.4 抗性再生植株的分子鉴定 |
| 3.4.1 基因组DNA的制备与质量鉴定 |
| 3.4.2 双价抗病RNA干扰序列的PCR检测 |
| 3.4.3 转基因植株统计 |
| 3.5 转基因阳性植株的分子鉴定 |
| 3.5.1 转基因阳性植株拷贝数测定 |
| 3.5.2 转基因阳性植株转录水平鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNAi表达载体对甘蔗抗病性的作用 |
| 4.2 G418的筛选浓度 |
| 4.3 实时荧光定量PCR拷贝数和表达量分析 |
| 5 结论 |
| 6 展望 |
| 6.1 转基因植株的抗病性分析 |
| 6.2 转基因植株的遗传稳定性分析 |
| 6.3 转基因植株安全性评价 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 致谢 |
（7）干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 植物抗旱分子机理研究进展 |
| 1.1.1 渗透调节 |
| 1.1.1.1 脯氨酸 |
| 1.1.1.2 海藻糖 |
| 1.1.1.3 甜菜碱 |
| 1.1.2 Lea蛋白、AQP和DHNs |
| 1.1.2.1 Lea蛋白 |
| 1.1.2.2 AQP |
| 1.1.2.3 DHNs |
| 1.1.3 受ABA等内源激素调节基因 |
| 1.2 植物复水机制研究进展 |
| 1.3 基因差异表达研究方法技术原理及其应用 |
| 1.3.1 cDNA-AFLP差异显示分析技术原理、特点及其研究进展 |
| 1.3.2 cDNA-SCoT差异显示分析技术原理、特点及其研究进展 |
| 1.4 甘蔗抗旱分子机理研究进展 |
| 1.5 本研究的立项依据及意义 |
| 第2章 甘蔗伸长期对水分胁迫的生理响应 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料和材料种植 |
| 2.1.2 试验处理 |
| 2.1.3 试验测定的指标和方法 |
| 2.1.3.1 土壤相对含水量测定 |
| 2.1.3.2 脯氨酸(Pro)含量测定 |
| 2.1.3.3 △~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活性测定测定 |
| 2.1.3.4 脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性测定 |
| 2.1.3.5 过氧化物酶(POD)活性测定 |
| 2.1.3.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定 |
| 2.1.3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 |
| 2.1.3.8 超氧阴离子(O_2~-)含量测定 |
| 2.1.3.9 脱落酸(ABA)含量测定 |
| 2.1.3.10 丙二醛(MDA)含量测定 |
| 2.1.3.11 谷胱甘肽还原酶(GSH-R)活性测定 |
| 2.1.3.12 可溶性糖含量测定 |
| 2.1.3.13 可溶性蛋白质含量测定 |
| 2.1.3.14 多胺氧化酶(PAO)活性测定 |
| 2.1.4 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 土壤相对含水量 |
| 2.2.2 甘蔗叶片MDA含量变化 |
| 2.2.3 甘蔗叶片可溶性糖含量变化 |
| 2.2.4 甘蔗叶片可溶性蛋白质含量变化 |
| 2.2.5 甘蔗叶片O_2~-含量变化 |
| 2.2.6 甘蔗叶片POD活性变化 |
| 2.2.7 甘蔗叶片CAT活性变化 |
| 2.2.8 甘蔗叶片SOD活性变化 |
| 2.2.9 甘蔗叶片GSH-R活性变化 |
| 2.2.10 甘蔗叶片脯氨酸含量变化 |
| 2.2.11 甘蔗叶片P5CS活性变化 |
| 2.2.12 甘蔗叶片ProDH活性变化 |
| 2.2.13 甘蔗叶片ABA含量变化 |
| 2.2.14 甘蔗叶片PAO活性变化 |
| 2.3 小结 |
| 2.3.1 渗透调节物质 |
| 2.3.2 膜损伤及保护系统 |
| 2.3.3 内源激素及相关酶 |
| 第3章 甘蔗伸长期水分胁迫诱导相关基因差异表达分析 |
| 3.1 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-AFLP差异显示分析 |
| 3.1.1 材料种植和处理 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 总RNA的提取 |
| 3.1.2.2 cDNA第一链合成 |
| 3.1.2.3 cDNA第二链的合成 |
| 3.1.2.4 双链cDNA纯化 |
| 3.1.2.5 双链cDNA酶切反应 |
| 3.1.2.6 接头退火及连接 |
| 3.1.2.7 预扩增 |
| 3.1.2.8 选择性扩增 |
| 3.1.2.9 选择性扩增产物电泳检测 |
| 3.1.2.10 差异片段的回收、再扩增、再回收 |
| 3.1.2.11 反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.1.2.12 差异片段克隆 |
| 3.1.2.13 质粒抽提 |
| 3.1.2.14 测序 |
| 3.1.2.15 序列比较及基因功能分析 |
| 3.1.3 cDNA-AFLP分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析 |
| 3.1.3.1 总RNA提取和第一链cDNA合成 |
| 3.1.3.2 甘蔗叶片干旱和复水诱导基因表达分谱分析 |
| 3.1.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.1.3.4 部分验证为阳性TDFs的克隆及核苷酸序列分析 |
| 3.1.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能分析和功能类群 |
| 3.2 甘蔗干旱和干旱后复水基因cDNA-SCoT差异显示分析 |
| 3.2.1 材料种植和处理 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 总RNA的提取 |
| 3.2.2.2 cDNA第一链合成 |
| 3.2.2.3 SCoT引物设计及SCoT-PCR扩增反应体系、反应程序 |
| 3.2.2.4 电泳检测 |
| 3.2.2.5 差异片段的回收、再扩增、再回收 |
| 3.2.2.6 反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.2.2.7 差异片段克隆 |
| 3.2.2.8 质粒抽提 |
| 3.2.2.9 测序 |
| 3.2.2.10 序列比较及基因功能分析 |
| 3.2.3 cDNA-SCoT分离水分胁迫诱导表达基因结果与分析 |
| 3.2.3.1 总RNA提取和cDNA第一链合成 |
| 3.2.3.2 甘蔗叶片水分胁迫下基因差异表达谱分析 |
| 3.2.3.3 差异片段回收及反向Northern印迹杂交验证 |
| 3.2.3.4 部分验证为阳性差异片段的克隆、核苷酸序列分析和基因功能推测分析 |
| 3.2.3.5 受干旱和干旱后复水诱导表达基因功能类群 |
| 3.3 小结 |
| 3.3.1 cDNA-AFLP差异显示表达分析 |
| 3.3.2 cDNA-SCoT差异显示表达分析 |
| 第4章 水分胁迫诱导基因片段的半定量RT-PCR表达分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料种植和处理 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 总RNA提取 |
| 4.1.2.2 cDNA第一链合成 |
| 4.1.2.3 半定量RT-PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 甘蔗水分胁迫诱导表达基因全长CDNA克隆与结构分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料种植 |
| 5.1.2 甘蔗叶片总RNA提取 |
| 5.1.3 甘蔗cDNA第一链的合成 |
| 5.1.4 引物设计、合成 |
| 5.1.5 目的基因片段回收纯化 |
| 5.1.6 目的基因克隆 |
| 5.1.7 质粒抽提 |
| 5.1.8 测序 |
| 5.1.9 基因序列的生物学信息分析软件及网站 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成 |
| 5.2.2 甘蔗Sc-atpI基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.2.1 甘蔗Sc-atpI基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.2.2 甘蔗Sc-atpI基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.2.3 甘蔗Sc-atpI基因编码的氨基酸序列结构分析 |
| 5.2.2.4 甘蔗Sc-atpI基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.3 甘蔗Sc-SUT1基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.3.1 甘蔗Sc-SUT1基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.3.2 甘蔗Sc-SUT1基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.3.3 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.3.4 甘蔗Sc-SUT1基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.4.1 甘蔗Sc-SAMDC3基因的RT-PCR扩增 |
| 5.2.4.2 甘蔗Sc-SAMDC3基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.4.3 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.4.4 甘蔗Sc-SAMDC3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.5 甘蔗Sc-Tuba3基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.5.1 甘蔗Sc-Tuba3基因RT-PCR扩增 |
| 5.2.5.2 甘蔗Sc-Tuba3基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.5.3 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.5.4 甘蔗Sc-Tuba3基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.2.6 甘蔗Sc-HSP70基因克隆及其序列分析 |
| 5.2.6.1 甘蔗Sc-HSP70基因RT-PCR扩增 |
| 5.2.6.2 甘蔗Sc-HSP70基因核苷酸序列分析 |
| 5.2.6.3 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列保守区分析 |
| 5.2.6.4 甘蔗Sc-HSP70基因编码氨基酸序列同源比对以及系统进化树分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 讨论与结论 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 GT11对水分胁迫的生理响应机制 |
| 6.1.1.1 渗透调节物质 |
| 6.1.1.2 膜损伤及保护系统 |
| 6.1.1.3 内源激素及相关酶 |
| 6.1.2 水分胁迫诱导基因差异表达分析 |
| 6.1.2.1 cDNA-AFLP差异显示分析 |
| 6.1.2.2 cDNA-SCoT差异显示分析 |
| 6.1.2.3 两种差异表达方法比较 |
| 6.1.2.4 两种基因差异显示方法结果比较 |
| 6.1.2.5 甘蔗水分胁迫相关基因筛选和分离 |
| 6.1.3 基因Semi-QRT-PCR表达分析 |
| 6.1.3.1 抗旱类基因 |
| 6.1.3.2 恢复生长调节类基因 |
| 6.1.3.3 双重功能类基因 |
| 6.1.3.4 基因定量表达方法 |
| 6.1.4 基因克隆与结构分析 |
| 6.2 全文结论 |
| 6.3 论文创新点 |
| 6.4 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）PEG胁迫下的甘蔗RNA-Seq定量分析与差异表达基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 研究的实用价值与理论意义 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 筛选和克隆植物功能基因的方法 |
| 2.1.1 定位克隆 |
| 2.1.2 转座子标签法 |
| 2.1.3 同源克隆、RACE与电子克隆 |
| 2.1.4 酵母杂交系统 |
| 2.1.5 基于mRNA表达差异的筛选方法 |
| 2.1.6 基因芯片技术 |
| 2.1.7 二代测序 |
| 2.1.7.1 二代测序技术及测序平台 |
| 2.1.7.2 RNA-Seq |
| 2.1.7.3 数字基因表达谱 |
| 2.2 植物抗旱的机理与甘蔗抗旱相关基因的研究进展 |
| 2.2.1 渗透调节与相关甘蔗基因 |
| 2.2.1.1 脯氨酸 |
| 2.2.1.2 甜菜碱 |
| 2.2.1.3 海藻糖和果聚糖 |
| 2.2.1.4 糖醇 |
| 2.2.1.5 胚胎发育晚期丰富蛋白和水通道蛋白 |
| 2.2.2 活性氧清除系统与相关甘蔗基因 |
| 2.2.3 植物内源激素、蛋白激酶与相关甘蔗基因 |
| 2.2.4 转录因子与相关甘蔗基因 |
| 2.2.4.1 bZIP类转录因子 |
| 2.2.4.2 MYB类转录因子 |
| 2.2.4.3 AP2/EREBP类转录因子 |
| 2.2.4.4 WRKY类转录因子 |
| 2.2.4.5 NAC类转录因子 |
| 3 本研究的目的和所要解决的问题 |
| 第二章 甘蔗响应PEG胁迫的RNA-Seq定量分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验材料的处理 |
| 1.2.2 总RNA的提取 |
| 1.2.3 RNA-Seq |
| 1.2.4 数据处理与分析 |
| 1.2.4.1 标准信息分析流程图 |
| 1.2.4.2 去除杂质数据 |
| 1.2.4.3 与参考序列比对 |
| 1.2.4.4 测序评估 |
| 1.2.4.5 基因表达量统计 |
| 1.2.4.6 Gene Ontology功能显着性富集分析 |
| 1.2.4.7 Pathway显着性富集分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品总RNA电泳检测 |
| 2.2 RNA-Seq样品RNA的质量评估 |
| 2.3 表达谱测序结果与分析 |
| 2.3.1 测序原始数据的质量评估 |
| 2.3.2 数据比对统计 |
| 2.3.3 测序饱和度分析 |
| 2.3.4 测序随机性的统计分析 |
| 2.3.4.1 Reads在参考基因上的分布统计 |
| 2.3.4.2 Reads在参考基因组上的分布 |
| 2.3.5 基因表达量统计 |
| 2.3.5.1 基因覆盖度统计 |
| 2.3.5.2 基因表达量统计 |
| 2.3.6 差异表达基因筛选 |
| 2.3.7 Gene Ontology功能显着性富集分析 |
| 2.3.8 Pathway显着性富集分析 |
| 3 本章小结 |
| 第三章 甘蔗细胞壁木质素合成相关Dirigent基因的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料与处理 |
| 2.2 ScDir基因的克隆与序列分析 |
| 2.3 ScDir基因的原核表达载体构建 |
| 2.4 ScDir基因在原核系统中的诱导表达 |
| 2.5 ScDir基因的原核胁迫生长实验 |
| 2.6 ScDir基因的RT-qPCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 ScDir基因的克隆与序列分析 |
| 3.2 ScDir基因的原核表达载体构建与诱导表达 |
| 3.3 ScDir基因的原核胁迫生长实验 |
| 3.4 ScDir基因的组织表达特异性分析 |
| 3.5 ScDir基因对各种外源胁迫的应答反应 |
| 4 讨论 |
| 第4章 甘蔗金属硫蛋白基因ScMT2-1-3的克隆与功能分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料与处理 |
| 2.2 ScMT2-1-3基因的克隆与序列分析 |
| 2.3 ScMT2-1-3基因的原核表达载体构建 |
| 2.4 ScMT2-1-3基因的原核表达及产物的质谱验证 |
| 2.5 ScMT2-1-3基因的原核胁迫生长实验 |
| 2.6 ScMT2-1-3基因的RT-qPCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 ScMT2-1-3基因的克隆与序列分析 |
| 3.2 ScMT2-1-3基因的原核表达及产物的质谱验证 |
| 3.3 ScMT2-1-3基因的原核胁迫生长实验 |
| 3.4 ScMT2-1-3基因的组织表达特异性分析 |
| 3.5 ScMT2-1-3基因对各种外源胁迫的应答反应 |
| 4 讨论 |
| 第五章 甘蔗R2R3-Myb转录因子家族基因的克隆及功能验证 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料及处理 |
| 2.2 甘蔗Sc2Rmyb家族基因的获得和序列分析 |
| 2.2.1 Sc2RMyb1转录因子基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.2 Sc2RMyb2转录因子基因的克隆与序列分析 |
| 2.2.3 Sc2RMyb3转录因子基因(亚家族)的克隆与序列分析 |
| 2.3 Sc2RMyb1基因的原核胁迫验证 |
| 2.3.1 Sc2RMyb1基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 Sc2RMyb1基因的原核诱导表达 |
| 2.3.3 Sc2RMyb1基因的原核胁迫生长实验 |
| 2.4 Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb3亚家族基因的功能验证 |
| 2.4.1 Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb3基因双元表达载体的构建 |
| 2.4.2 Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb3亚家族基因转烟草的瞬时表达 |
| 2.5 Sc2RMyb1和Sc2RMyb2基因的实时荧光定量PCR检测 |
| 2.5.1 Sc2RMyb1基因的RT-qPCR检测 |
| 2.5.2 Sc2RMyb2基因的实时定量RT-qPCR检测 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 甘蔗Sc2Rmyb家族基因的获得和序列分析 |
| 3.1.1 甘蔗Sc2RMyb1转录因子基因的克隆与序列分析 |
| 3.1.2 甘蔗Sc2RMyb2基因的克隆与序列分析 |
| 3.1.3 甘蔗Sc2RMyb3亚家族基因的克隆与序列分析 |
| 3.2 Sc2RMyb1基因的原核表达载体构建及诱导表达 |
| 3.3 Sc2RMyb1基因的原核胁迫生长实验 |
| 3.4 Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb3亚家族基因的真核表达载体构建 |
| 3.5 Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb3亚家族基因在烟草中的瞬时表达 |
| 3.6 Sc2RMyb1基因对各种外源胁迫的应答反应 |
| 3.7 Sc2RMyb2基因对PEG胁迫的应答反应 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 缩写词(Abbreviation) |
| 附录Ⅱ PEG胁迫下甘蔗根中的显着差异表达基因 |
| 附录Ⅲ PEG胁迫下甘蔗根中的差异表达基因的Gene Ontology功能显着性富集分析 |
| 附录Ⅳ Sc2RMyb3s家族成员推导氨基酸序列的多序列比对分析 |
| 致谢 |
（10）高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 引物设计 |
| 1.3 植物表达载体构建 |
| 1.4 瞬时表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 目的基因T克隆 |
| 2.2 植物表达载体p Cambia1300-Cbcor15a-bar检测 |
| 2.3 报告基因e GFP的瞬时表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
四、海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究（论文参考文献）
- [1]分子改造提高融合酶特性的研究[D]. 谌芳. 齐鲁工业大学, 2020(02)
- [2]海藻糖的生产及分析方法的国内研究进展[J]. 邓丹丹,李美,凌婉阳. 甘蔗糖业, 2020(01)
- [3]甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（SoP5CS）的抗旱功能分析[D]. 李健. 广西大学, 2017(06)
- [4]转SoDREB2烟草抗旱性及甘蔗转SoDREB2研究[D]. 李春瑶. 广西大学, 2016(02)
- [5]转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究[D]. 周定港. 福建农林大学, 2016(05)
- [6]基因枪介导抗花叶病和黄叶病RNAi转化甘蔗及分子鉴定研究[D]. 陈忠伟. 福建农林大学, 2014(05)
- [7]干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究[D]. 吴凯朝. 广西大学, 2013(04)
- [8]PEG胁迫下的甘蔗RNA-Seq定量分析与差异表达基因鉴定[D]. 郭晋隆. 福建农林大学, 2013(05)
- [9]甘蔗转基因育种研究进展[J]. 甘仪梅,张树珍,曾凡云,冯翠莲,杨本鹏. 生物技术通报, 2013(03)
- [10]高山离子芥冷诱导基因转化甘蔗二元植物表达载体构建[J]. 卢双楠,李粲,滕峥,刘开雨,刘芳,邱永福,梁朝旭,方位宽,何姗珊,刘晓静,李鸣,梁俊,李容柏. 南方农业学报, 2012(09)