一、Page综合征一例（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中指出冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
于成东[2]（2021）在《内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立》文中认为猪圆环病毒4型（Porcine circovirus type 4,PCV4）作为一种新发现的猪圆环病毒,于2019年在我国湖南省的猪群中首次被检测到,由于发现时间较短,对其流行情况和致病性等相关信息还不明确。对收集的2016年至2018年内蒙古自治区51个猪场的1683份猪血清样本进行了 PCV4回溯性检测,PCR检测结果表明PCV4在猪群中总阳性率为1.6%（27/1683）,PCV4在猪场水平的阳性率为21.6%（11/51）。其中,2016年PCV4在猪群中总阳性率为0.2%（1/485）,2017年为1.7%（12/686）,2018年为2.7%（14/512）;2016年PCV4在猪场水平的阳性率为6.7%（1/15）,2017年为25%（5/20）,2018年为31.3%（5/16）,表明PCV4感染率呈现逐年上升趋势。此外,对PCV2、PCV3、PCV4的共感染情况进行了探究,结果表明PCV4感染与PCV2和PCV3感染并不相关。为明确PCV4的遗传变异和进化规律,本研究共获得了 3条PCV4全基因组序列,同源性分析表明,PCV4具有较高的遗传稳定性。同时,将目前NCBI所能下载到的8条PCV4序列与17种圆环病毒的23条完整基因组序列进行比对,通过核苷酸和推导的氨基酸序列同源性的分析表明,PCV4与水貂圆环病毒同源性最高。PCV4遗传多样性分析结果显示,Cap蛋白序列中存在7个氨基酸突变,Rep蛋白序列中存在6个氨基酸突变;ORF1基因中有19个核苷酸变异位点,ORF2基因中有17个核苷酸变异位点,但没有任何插入和缺失。分别对PCV4全基因组序列、Cap基因序列、Rep基因序列进行系统发育分析,结果显示,PCV4处于一个独立的分支中,与水貂圆环病毒具有最为密切的进化关系。以本实验室扩增的内蒙PCV4毒株的ORF2基因序列为参考,对其密码子进行优化并送往公司进行质粒合成,通过设计特异性引物,扩增出截短后的Cap蛋白基因。将目的基因克隆至pET-28a载体,构建pET28a-PCV4-Cap重组表达质粒。将重组质粒转化至表达宿主菌BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达,制备PCV4 Cap重组蛋白。通过优化表达的条件,经SDS-PAGE分析,Cap重组蛋白能够在沉淀中大量表达,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导6h条件下表达量最高,其大小约为27 kDa。经Western blot验证,条带单一,与预期结果相同。采用亲和层析的方法,通过镍柱对带有His标签的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白进行纯化,纯化后目的蛋白最高纯度可达95.16%。使用纯化、复性后的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白与弗氏佐剂按照1:1的比例,乳化后注射于4至6周龄的Balb/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,抗体效价可达1:300000以上。以纯化、复性后重组蛋白作为包被抗原,建立PCV4间接ELISA检测方法,通过对各反应条件进行优化,最终确定:抗原最佳包被浓度为1 μg/mL,4℃包被过夜;使用5%BSA,37℃封闭1 h为最佳封闭条件;待检血清最佳稀释倍数为1:400,37℃孵育1 h;酶标二抗最佳稀释浓度为1:5(000,37℃孵育15 min;底物最佳显色条件为室温显色1 5 min。本研究所建立间接ELISA检测方法批间与批内重复性试验变异系数均小于10%,且与PCV2、PRRSV、PRV、SVV阳性血清不产生血清学交叉反应,证明该方法重复性与特异性良好,为PCV4血清流行病学快速检测提供了新的途径。
曹琪[3]（2021）在《丝氨酸蛋白酶HTRA/DEGQ在猪呼吸道病原菌突破呼吸道黏膜上皮屏障中的作用及机制研究》文中研究表明猪呼吸系统疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex,PRDC）是一种由多种因素引起的综合症,给世界养猪业带来巨大的经济损失,其中涉及的主要病原因素包括细菌（如猪胸膜肺炎放线杆菌、猪支气管败血性波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪革拉瑟氏杆菌）、病毒（如猪甲型流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒和猪圆环病毒2型）和支原体（如猪支原体和猪肺炎支原体）。不同病原因素在PRDC发展中的作用和影响是复杂的,且病变的严重性是不同因素协同作用的结果。通常认为在PRDC发展过程中病毒性因素的致病机理主要是破坏呼吸道黏膜上皮纤毛结构和干扰肺泡巨噬细胞的功能,而细菌性因素的致病机理主要是刺激机体产生炎症反应。然而,目前对PRDC病原突破呼吸道屏障的分子机制尚不清楚。本研究以新生仔猪气管上皮细胞为体外模型,利用免疫印迹、免疫荧光、ECIS（Electric Cell-substrate Impedance Sensing）、Transwell等方法证明PRDC细菌性病原通过破坏气管上皮细胞屏障来促进自身的跨细胞迁移。同时,利用酪蛋白酶谱法和质谱鉴定了副猪革拉瑟氏杆菌（Glaesserella parasuis,GPS）中具有水解活性的蛋白酶。质谱结果结合氨基酸同源性分析表明PRDC细菌性病原中具有丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ,通过体外实验证实了丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ的生物学功能。最后,通过仔猪攻毒实验,揭示了丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ在PRDC细菌性病原突破宿主呼吸道上皮屏障和组织定殖中发挥着重要作用。论文的具体内容如下:1、PRDC病原菌在体内和体外破坏呼吸道上皮细胞屏障HE（Hematoxylin and Eosin）染色显示PRDC病原菌GPS能够破坏仔猪气管气管上皮层,表现为呼吸道纤毛丢失及上皮细胞。在体内,免疫荧光显示其可以破坏气管上皮的紧密连接蛋白ZO-1和黏附连接蛋白E-钙黏蛋白。在体外,通过免疫荧光和免疫印迹发现PRDC病原菌可以破坏NPTr细胞紧密连接和黏附连接蛋白,且能使E-钙黏蛋白胞外域释放到细胞上清中。同时,ECIS显示PRDC病原菌能够降低NPTr单层细胞的跨细胞电阻。2、E-钙黏蛋白维持上皮细胞屏障功能以及影响PRDC病原菌的跨细胞迁移利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在NPTr细胞中构建E-钙黏蛋白的缺失细胞系。PCR、免疫印迹和荧光定量PCR显示E-钙黏蛋白的成功敲除。通过ECIS检测发现E-钙黏蛋白能维持NPTr单层细胞的跨细胞电阻。通过PRDC病原菌对野生型或E-钙黏蛋白敲除型的NPTr细胞的黏附、侵入以及跨细胞迁移实验,我们发现E-钙黏蛋白影响PRDC病原菌的跨细胞迁移。通过核质分离实验和荧光定量PCR证实E-钙黏蛋白的敲除影响β-catenin在细胞核中的分布以及趋化因子的表达。3、E-钙黏蛋白的切割不依赖宿主基质金属蛋白酶为了分析在PRDC病原菌感染过程中E-钙黏蛋白胞外域释放到细胞上清中具体机制,我们用基质金属蛋白酶广谱抑制剂处理NPTr细胞后进行PRDC病原菌感染,免疫印迹检测发现E-钙黏蛋白全长蛋白的减少并未得到恢复。同时,我们用免疫印迹检测PRDC病原菌感染后基质金属蛋白酶MMP7和ADAM10的变化,免疫印迹显示在感染后MMP7蛋白水平下降,而ADAM10无变化。为排除ADAM10在感染中对E-钙黏蛋白的切割作用,我们用siRNA或者特异性抑制剂降低ADAM10蛋白水平后进行PRDC病原菌感染,通过免疫印迹发现ADAM10不参与PRDC病原感染过程中E-钙黏蛋白降低作用。与此同时,我们用明胶酶谱实验证实PRDC病原菌感染NPTr细胞并不能增强细胞的基质金属蛋白酶的活性。4、筛选PRDC病原菌中的潜在具有水解活性的蛋白酶为进一步探索PRDC病原菌参与E-钙黏蛋白的胞外域释放的因素,我们用酪蛋白酶谱结合质谱鉴定技术,筛选到GPS中具有水解活性的丝氨酸蛋白酶HtrA。多序列比对和结构预测表明,所有PRDC病原菌中均具有与HtrA蛋白同源的DegQ丝氨酸蛋白酶。为进一步探索HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶的活性,我们克隆和纯化PRDC病原菌的野生型或者活性中心的丝氨酸位点突变型（丝氨酸突变成丙氨酸）的HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶。酪蛋白酶谱表明野生型的HtrA/DegQ蛋白具有酪蛋白水解活性,而丝氨酸位点突变型却没有活性。免疫印迹显示HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶能够降解重组的猪源的E-钙黏蛋白的胞外域。通过HtrA多克隆抗体的制备,我们用免疫印迹证实GPS的丝氨酸蛋白酶HtrA可以分泌到胞外,并且可以切割NPTr细胞的E-钙黏蛋白。最终,ECIS显示PRDC病原菌的HtrA/DegQ丝氨酸蛋白酶影响NPTr单层细胞的跨细胞电阻。5、htrA基因缺失影响GPS在仔猪体内的定殖首先,通过自然转化的方法,我们在PRDC病原菌GPS中构建了htrA基因缺失菌株。PCR、免疫印迹和荧光定量PCR表明htrA基因成功缺失。在体外,免疫荧光、免疫印迹、黏附实验和Transwell实验证实htrA基因缺失影响GPS对E-钙黏蛋白的切割和跨细胞迁移。在体内,HE染色、组织分菌、免疫组化和免疫荧光显示htrA基因影响GPS对呼吸道组织的病理损伤、气管E-钙黏蛋白的破坏、跨呼吸道上皮细胞屏障的能力及在呼吸道以外的组织中定殖的能力。6、具有ATPase活性的蛋白酶ClpX调控HtrA的蛋白水平酪蛋白酶谱分析和质谱分析结果表明,蛋白酶ClpX直接或间接参与酪蛋白的水解。通过多序列比对和ATP水解实验,发现ClpX是一种具有ATPase活性的蛋白酶。为了更详细地了解ClpX活性,我们克隆并纯化了GPS的野生型（WT）ClpX,并通过在Walker B结构域中将谷氨酸突变为丙氨酸（EA）表达相应的无活性的突变体。ATP和酪蛋白水解实验表明ClpX蛋白不具有酪蛋白水解活性。通过构建clp X基因缺失菌株以及在htrA基因缺失菌株中表达ClpX蛋白,我们发现不是ClpX蛋白直接降解酪蛋白,而是clp X缺失影响总的和分泌的HtrA蛋白。同样地,我们用clp X基因缺失菌株感染NPTr细胞,免疫印迹结果显示clpX缺失后影响E-钙黏蛋白的切割。
乌东高娃[4]（2021）在《PRRSV GP2蛋白的单抗制备及Marc145-GP2细胞系的建立》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度接触性传染病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。PRRS在全球范围内广泛流行,尽管采取各项措施努力控制PRRSV的感染,但该病毒仍持续在全世界的养猪业中引起经济问题。本研究截短合成PRRSV ORF2序列,得到原核表达载体p ET-30a-ORF2,并进行诱导表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测,重组GP2蛋白成功表达。将纯化好的重组GP2蛋白免疫小鼠,进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。通过体内诱生法制备抗体并进行纯化,成功获得了重组GP2蛋白的单克隆抗体。为PRRSV GP2蛋白结构及功能的研究奠定了基础,也为今后PRRS的科学研究提供了技术储备。同时本研究以PRRSV全长感染性克隆pJXwn06为模板,利用PCR方法扩增ORF2基因序列,并克隆至慢病毒载体中,获得重组质粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。通过慢病毒包装系统转染获得重组的慢病毒颗粒,并将其转导至Marc145细胞。用含有嘌呤霉素的培养基进行筛选,初筛后的细胞采用有限稀释法进行克隆,最终获得细胞系。通过PCR、Western blot试验验证了细胞系中GP2蛋白的稳定表达。本研究成功建立了稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc145-GP2细胞系,为研究GP2蛋白免疫学特性和功能奠定了基础。
李江凡[5]（2021）在《高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究》文中研究表明冠状病毒传播速速快、感染后果严重,对人类生命健康构成持续的威胁。到目前为止,总共出现三次冠状病毒的暴发流行,其一是2003年由严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）引起的非典型肺炎,其二是2012年由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）引起的中东呼吸综合征,其三是2019年由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）。遗憾的是目前仅针对SARS-CoV-2有上市疫苗,对SARS-CoV和MERS-CoV既无可用疫苗也无特效药。中和抗体的应用是预防和控制传染病非常有效的手段之一。冠状病毒刺突蛋白上的受体结合域（RBD）能够强烈地诱导机体产生保护性抗体,是抗体甚至疫苗研发的重要靶点。目前,针对SARS-CoV和MERS-CoV的单克隆抗体研究较多,包括人源抗体、鼠源抗体和人源化抗体等。纳米抗体作为目前已知的可结合抗原的最小抗体,保留了较高的抗原亲和力和特异性,具有分子量低、易于制备、免疫原性低、组织渗透力强等优点,可以用于多种疾病的治疗,具有广泛的应用前景。对MERS-CoV纳米抗体的研究极少,对SARS-CoV纳米抗体的研究尚属空白。因此,本研究以SARS-CoV和MERS-CoV的受体结合域为靶点,展开了对SARS-CoV和MERS-CoV特异性纳米中和抗体的研究。1、抗MERS-CoV纳米中和抗体研究。为了筛选MERS-CoV纳米中和抗体,使用MERS-CoV S1和S蛋白分别对MERS-CoV RBD特异性纳米抗体库进行了四轮筛选,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定出三株亲和力较高的抗体。然后,通过竞争性ELISA、生物膜层干涉实验等鉴定出识别位点与Nb MS10（Nb MS10为此前筛选到的一株抗MERS-CoV纳米抗体）不同的一株抗体M34,并利用原核表达系统和真核表达系统制备了抗体蛋白。利用生物膜层干涉技术测定了M34与MERS-CoV S1蛋白的结合亲和力（Kd=222 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50=15.2 ng/m L)。通过竞争性ELISA证实M34与DPP4受体竞争性结合MERS-CoV RBD。进一步又通过流式细胞术试验和细胞-细胞融合实验探究出该抗体通过阻断RBD与DPP4的结合而发挥作用。最后通过同源建模和分子对接预测了M34与MERS-CoV RBD结合的空间结构,结果提示M34可能通过其残基G54与RBD上的残基Y523形成氢键而相互作用。2、抗MERS-CoV双表位中和抗体研究。为了减小单一抗体的应用导致病毒逃逸突变发生的可能性,将上一部分筛选到的抗体与此前实验室鉴定的抗MERS-CoV特异性抗体Nb MS10通过一个短肽进行连接,构建了抗MERS-CoV双表位抗体,通过真核表达系统表达了该抗体。然后通过ELISA测定了该抗体与MERS-CoV S1的亲和力,利用生物膜层干涉技术测定了该抗体与MERS-CoV S1蛋白的结合亲和力（Kd=36 p M）,通过假病毒中和试验鉴定了该抗体的中和活性(IC50=11.1 ng/m L)。结果证实改造后的双表位抗体,其亲和力、中和活性等生物学功能没有降低,并且对D539A/N突变的假病毒也具有了中和能力。3、抗SARS-CoV纳米中和抗体研究。为了筛选SARS-CoV纳米中和抗体,以SARS-CoV RBD免疫羊驼,免疫后利用其外周血单个核细胞建立了噬菌体展示的纳米抗体库。分别以SARS-CoV RBD和S1为抗原对抗体库进行了四轮筛选,通过ELISA鉴定出了四株高结合力抗体,选择了其中结合力最高的S14进行了进一步研究。利用生物膜层干涉技术测定了S14与SARS-CoV S1蛋白的亲和力（Kd=143 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50=10.7 ng/m L)。通过竞争性ELISA证实S14与ACE2受体竞争性结合SARS-CoV RBD。进一步又通过流式细胞术试验探究出该抗体通过阻断RBD与ACE2的结合而发挥作用。最后通过同源建模和分子对接预测了S14与SARS-CoV RBD结合的空间结构,结果提示S14可能通过其残基S33和P99与RBD上的残基R449形成氢键而相互作用。4、抗MERS-CoV和SARS-CoV双特异性中和抗体研究。为了实现抗体功能的多样性,将上一部分筛选到的抗SARS-CoV抗体S14与抗MERS-CoV特异性抗体Nb MS10通过一个短肽进行连接,构建了抗MERS-CoV和抗SARS-CoV的双特异性抗体,通过真核表达系统表达了该抗体。然后通过ELISA测定了该抗体与MERS-CoV S1和SARS-CoV S1蛋白的结合力,利用生物膜层干涉技术测定了该抗体与MERS-CoV S1和SARS-CoV S1蛋白的亲和力（Kd分别为116和155 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50分别为7.00和13.7 ng/m L)。结果证实改造后的双表位抗体,其亲和力、中和活性等生物学功能没有降低,具有同时抗MERS-CoV假病毒和SARS-CoV假病毒的能力。本研究以MERS-CoV和SARS-CoV的RBD为靶点,借助噬菌体展示技术,通过四轮筛选,针对两种病毒分别筛选到一株高亲和力的纳米抗体。随后通过ELISA、生物膜层干涉技术、假病毒中和试验评价了他们的生物学功能,通过竞争性ELISA、流式细胞术实验、细胞-细胞融合实验探究了它们的中和机制。然后通过基因工程的方法,将识别不同表位的抗MERS-CoV纳米抗体连接,将抗MERS-CoV纳米抗体和抗SARS-CoV纳米抗体进行连接,分别构建了抗MERS-CoV双表位抗体以及抗MERS-CoV和抗SARS-CoV双特异性抗体,并同样通过ELISA、生物膜层干涉技术、假病毒中和试验评价了他们的生物学功能,结果显示,经改造后的抗体分别保留着连接前各部分抗体的生物学功能,证实改造是可行的,为发展抗MERS-CoV和抗SARS-CoV治疗药物奠定了基础,为发展多功能抗体提供了一种策略。
齐金铭[6]（2021）在《基于β-葡聚糖与甘露聚糖修饰的寨卡病毒重组蛋白疫苗》文中指出寨卡病毒（ZIKV）是一种单股正链RNA病毒,因严重威胁全球公共卫生而受到广泛关注。寨卡病毒可造成先天性小头畸形,以及成人严重的神经系统疾病格林-巴利综合征等。由于寨卡病毒既通过蚊媒传播,又可通过非媒介传播途径传播,控制寨卡疾病的传播比较困难,且感染寨卡病毒后有较高的致病风险和严重的健康威胁。因此,研制安全有效的寨卡病毒疫苗显得极其重要和紧迫。重组蛋白疫苗是一种包含病毒抗原蛋白的新型疫苗,因其良好的安全性受到研究者们的广泛青睐。但由于病毒抗原本身的免疫原性较弱,需要添加佐剂以及选择合适的递送系统,使其可以诱导强大的体液免疫与细胞免疫。E蛋白作为寨卡病毒的关键结构蛋白,是研制寨卡疫苗的理想抗原。为增强E蛋白的免疫原性,需要在抗原中加入佐剂。β-葡聚糖作为一种多糖佐剂,可以激活巨噬细胞并触发细胞免疫反应,将E蛋白与β-葡聚糖共价偶联是一种提高E蛋白免疫原性的策略。然而,E蛋白的抗原表位和β-葡聚糖的免疫调节位点在偶联物中会被屏蔽,此外,偶联物也可能会引发对β-葡聚糖的非预期免疫反应。因此,将酸敏感的腙键和硫醇敏感的二硫键用作E蛋白和β-葡聚糖之间的连接键,得到偶联物E-PS-4。当偶联物进入免疫细胞后,在溶酶体中的低pH及细胞质中高水平谷胱甘肽的作用下,导致腙键水解和二硫键还原,使E蛋白与β-葡聚糖充分解离,克服了抗原表位和免疫调节位点被屏蔽的缺点。与不含腙键和/或二硫键的偶联物相比,E-PS-4刺激产生了高水平的E蛋白特异性IgG,是E蛋白组的27倍,且β-葡聚糖特异性IgG滴度降低了 8倍,并且可诱导分泌高水平的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-10。此外,E-PS-4可促进树突状细胞的活化,且对器官没有明显的毒副作用。药代动力学研究表明,E-PS-4在血清中的半衰期延长为E蛋白的3.3倍,清除速率降为1/5。因此,E蛋白通过腙键和二硫键与β-葡聚糖结合,可以刺激机体产生较强的细胞和体液免疫反应。EDⅢ蛋白是寨卡病毒E蛋白的第三结构域,包含了大部分中和抗体表位,且不会引起抗体依赖增强（ADE）效应。然而,EDⅢ蛋白必须与佐剂和抗原递送系统一起使用,以提高其免疫原性。血红蛋白（Hb）可以调节炎症和细胞因子水平,并激活巨噬细胞。甘露聚糖（Mannan）是组成真菌细胞壁的多糖,具有免疫调节活性。因此,我们将EDⅢ、血红蛋白和甘露聚糖共价结合,血红蛋白和甘露聚糖均作为佐剂,先进行共价结合,偶联物（HM）作为递送系统,以二硫键为连接键与EDⅢ偶联,得到偶联物HM-EDⅢ-2。通过细胞内高水平谷胱甘肽环境下二硫键的断裂,可以实现EDⅢ与HM在细胞内的有效分离。结构分析表明,与HM偶联后,可以基本维持EDⅢ的二级和三级结构。免疫学研究表明,与EDⅢ相比,HM-EDⅢ-2的EDⅢ特异性IgG滴度增长了 29倍,并可分泌高水平的IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10细胞因子,并且对器官没有明显的毒性。此外,药代动力学研究显示,HM-EDⅢ-2在血清中的半衰期延长为EDⅢ组的2倍,清除速率降为1/10。因此,HM-EDⅢ-2可以增强对EDⅢ的体液和细胞免疫应答。我们的研究有望为开发一种安全有效的寨卡病毒疫苗提供一种途径。
谢倩[7]（2021）在《基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析》文中研究表明胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor 1,IGF-1）是人体内一种多功能的稳态调控因子,具有促进机体生长发育、合成代谢等功能,在人体内发挥着重要的作用;IGF-1作为治疗原发性IGF-1缺乏综合征的唯一药物,我国的需求程度极高,在国外已有IGF-1相关的蛋白药物上市,而我国仍依赖于进口,给患者造成了极大的经济负担,从而导致生长发育迟缓的患者无法得到有效的治疗,因此开发进口替代药物具有十分重要的意义。本研究通过计算机模拟技术预测带有不同酶切位点的IGF-1融合蛋白结构来进行其与相应蛋白酶的分子对接,筛选出蛋白酶最适配的IGF-1融合蛋白,利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Origami B（DE3）,氨苄青霉素抗性筛选重组子,异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,菌体破菌上清经亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析得到目的蛋白,通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1活性进行测定。结果显示在大肠杆菌Origami B（DE3）表达菌株中,0.05 mM IPTG,25℃下诱导16 h,融合蛋白为可溶性表达;在酶切缓冲液为20 mM Tris-HCl+0.15 M NaCl+10 mM CaCl2+1 mM二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol,DTT）,25℃、摇床酶切16 h,可实现1 U凝血酶切割100μg融合蛋白;通过酶切前后两次亲和层析可获得纯度大于90%的目的蛋白;利用3T3细胞增殖法建立了IGF-1体外活性评价体系,该体系检测条件为铺板细胞密度1×104/mL,初始、铺板及维持培养基血清浓度分别为4%、2%与1%,IGF-1样品初始浓度1000 ng/mL,3倍梯度稀释,在该活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×105 U/mg,与市售标准品接近。本课题的研究可为IGF-1药物工业化生产提供实验依据。
白亚南[8]（2021）在《金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究》文中研究说明对虾白斑综合征（White spot syndrome,WSS）是目前对虾养殖业所面临的分布最广且危害最大的病害之一,该病的病原体为白斑综合征病毒（White spotsyndrome virus,WSSV）。目前没有有效的药物治疗WSS,而且WSSV的扩散速度很快,因此迫切需要一种简便、快捷的WSSV检测技术,以期及早发现WSSV的感染,及时净化养殖水体,预防WSS的爆发,降低经济损失。金纳米颗粒具有优异的等离子共振效应、优良的生物相容性、表面易修饰等特性。目前利用金纳米颗粒制备金纳米探针,并结合暗场显微镜成像技术对目标检测物的位置和数量进行监测的检测方法已广泛应用于分子成像、生物检测等方面。本论文构建了一种特异性标记WSSV的金纳米探针,结合暗场显微镜技术,用于简便快速地检测样本中的WSSV。本研究包括以下几部分:（1）WSSV的增殖纯化及实时荧光定量PCR检测WSSV方法的建立:感染WSSV的克氏原螯虾（小龙虾）组织冰浴研磨液通过蔗糖密度梯度离心分离获得纯化的病毒,透射电子显微镜（TEM）观察发现其纯度高,病毒囊膜多破裂,只剩下核衣壳结构。根据WSSV的保守基因序列设计特异性引物,构建含WSSV目的基因的质粒作为标准品,建立了 WSSV实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线中Ct值与质粒拷贝数（X）的关系为Ct=-3.7168X+42.291（X为质粒拷贝数的对数）,相关系数R2=0.9991,表明标准曲线线性关系良好。通过建立的实时荧光定量PCR技术对纯化的WSSV进行定量检测,测得WSSV的DNA浓度为7.12×107 copies/μL。（2）抗WSSV VP664多克隆抗体的制备与鉴定:本研究将WSSV的核衣壳蛋白VP664基因的一段高度保守序列克隆到pET-28a（+）表达载体上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了目的蛋白。随后将该重组蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,通过ELISA实验确定其血清效价为1:256000,血清纯化后经Western blot实验证明制备的多克隆抗体可以与WSSV特异性反应。（3）金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV方法的构建:1)金纳米探针的制备和表征:将制备的多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒（粒径为15 nm）共同孵育后纯化,制备成可特异性结合WSSV的金纳米探针。通过 SDS-PAGE、UV-Vis 吸收光谱、DLS（Dynamic light scattering）及 TEM 分析制备的探针,结果表明金纳米颗粒成功修饰上了抗体且单分散性良好,每个纳米颗粒表面可以结合约50个抗体分子。2)金纳米探针辅助暗场显微镜检测WSSV:用纯化的WSSV验证金纳米探针结合暗场显微镜的快检方法。金纳米探针与纯化的WSSV孵育后,在暗场显微镜下可以清晰的观察到明亮的金黄色椭圆型结构,而单独的金纳米探针和WSSV在暗场下不可见。TEM观察发现金黄色结构是由于上百个金纳米探针结合于WSSV的核衣壳表面形成的。该计数方法的结果与实时荧光定量PCR检测结果高度吻合,检测限约为5.7×101 copies/μL,灵敏度比荧光定量PCR方法高10倍。最后,我们也检测了感染WSSV的螯虾组织样本,结果表明本研究构建的金纳米探针结合暗场显微镜定量检测WSSV实际样本的结果与荧光定量PCR结果相近。因此,本研究构建的金纳米探针-暗场显微镜检测WSSV方法,制备探针简单,检测快速,灵敏度也比常用的荧光定量PCR技术高10倍。综上所述,本文建立的金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV技术具有操作简便、检测时间短（只需要将虾体组织匀浆上清与探针孵育30分钟后通过暗场拍照并用软件自动计数）和灵敏度高的优势,为WSSV的超灵敏快速检测提供了一种新的技术,有望服务于基层养殖单位。
陈彦宇[9]（2021）在《SAPHO综合征血清细胞外囊泡的蛋白组成和功能研究》文中研究指明研究背景滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨质增生和骨炎综合征（Synovitis,Acne,Pustulosis,Hyperosteogeny and Osteoarthritis Syndrome,SAPHO 综合征）是一种罕见的慢性炎症性疾病,具有常累及前胸壁和中轴骨的骨炎、滑膜炎、骨质疏松、骨质增生等骨关节表现,和掌跖脓疱病、痤疮等皮肤表现。骨关节表现是SAPHO综合征的特征,其造成的疼痛,活动受限及病程后期导致的关节僵硬,变型甚至塌陷严重影响患者的生活质量。SAPHO综合征病程迁延不愈,活动期与稳定期交替,发病机制尚不清楚。SAPHO综合征的慢性炎症表现和骨关节症状,提示免疫异常和骨代谢失衡在SAPHO综合征的发生发展中扮演重要角色。近年来,随着对细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）的研究越来越深入,其在调节免疫和骨代谢中的作用逐步展现。研究表明细胞外囊泡在生理和疾病状态下参与骨代谢的调节,同时也参与炎症过程,细胞外囊泡内的许多炎症相关细胞因子同时也是调节骨代谢的重要调节因子。包含各种蛋白成分又肩负细胞通讯功能的细胞外囊泡,可能作为免疫和骨代谢的“桥梁”在SAPHO综合征中发挥作用。而目前针对SAPHO综合征的血清来源细胞外囊泡（Serum-derived Extracellular Vesicles,SEVs）的研究尚属空白。研究方法本研究通过超速离心法分离SEVs,经电镜检测证明SEVs的成功分离后,采用定量蛋白质组学方法对SAPHO患者和健康志愿者的SEVs进行分析,明确SAPHO患者SEVs的蛋白表达谱和差异表达蛋白。通过生物信息学分析发现参与骨代谢的SAPHO患者SEVs差异表达蛋白和潜在的SAPHO疾病标志物。利用酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测患者和健康志愿者的血清和试剂法提取SEVs中潜在标志物的表达量,验证其辅助SAPHO诊断的能力。进一步用ELISA 比较SAPHO患者,风湿性关节炎（Rheumatic Arthritis,RA）患者和强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis,AS）患者的SEVs中潜在标志物含量,明确其能否用于鉴别诊断SAPHO综合征,RA和AS。为了验证SAPHO患者SEVs 对骨代谢的调节作用,通过试剂法提取SEVs,经免疫印迹实验（Western Blot,WB）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）证明SEVs的成功分离后,分别在人源和鼠源细胞进行SEVs刺激下的体外破骨细胞（Osteoclasts,OCs）生成和骨生成实验。对不同SEVs刺激下发生表型变化的细胞,进行定量蛋白质谱,结合生物信息学分析,寻找差异表达蛋白,即可能是形成表型差异的原因。研究结果结果表明SAPHO患者SEVs与健康人群SEVs蛋白表达谱有明显差异,其差异表达蛋白中有17个（35%）参与炎症和骨代谢。通过对54例SAPHO患者和84例健康志愿者的血清和试剂法提取SEVs进行ELISA检测,发现差异表达蛋白中血清淀粉样蛋白A-1（Serum Amyloid A-1,SAA1）,在SAPHO患者血清和SEVs中高表达,具有辅助SAPHO综合征诊断的潜力。但54例SAPHO患者,22例RA患者和29例AS患者SEVs中SAA1表达量无显着差异。骨生成实验表明,SAPHO患者SEVs对小鼠和健康志愿者来源细胞的成骨过程和破骨形成过程无显着影响。但在诱导36例SAPHO患者来源的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs）向破骨细胞分化的实验中,有24例其OCs分化过程被SAPHO患者SEVs抑制。统计分析提示,抑制的发生与患者处于活动期相关。进一步利用定量蛋白质组学检测健康志愿者及SAPHO患者SEVs刺激后生成的OCs蛋白组成的变化,发现SAPHO患者SEVs刺激下,患者破骨细胞中核仁素（Nucleolin,NCL）表达上调,并处于差异表达蛋白相互作用网络的关键节点。研究意义本研究首次报导了 SAPHO患者SEVs的蛋白表达谱和其中的差异表达蛋白。差异表达蛋白中,上调蛋白SAA1是一种有助于SAPHO综合征诊断的炎症标志物。SAPHO患者SEVs能够抑制活动期患者破骨细胞形成和功能,可能具有负调节免疫应答的作用。NCL是潜在的调控活动期SAPHO患者破骨细胞生成的关键调节因子。
陈勇[10]（2020）在《基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究》文中研究表明目的:探索针刺潜在的治疗病谱及针刺的网络调节作用规律,为针刺更好地应用于临床提供科学依据。方法:将10只Wistar大鼠右后足跖处注射弗氏佐剂0.1 ml,制备佐剂性关节炎疾病模型。采用随机数字法将造模成功的10只大鼠随机分为模型组和模型+电针组,每组5只。同样的方法将其余12只大鼠随机分为空白对照组和正常+电针组,每组6只。模型电针组和正常电针组大鼠予足三里穴、环跳穴电针刺激,刺激参数为:疏密波,频率2/10Hz,强度5/10/15（0.76/1.53/2.3m A）,各10min,共30min,隔日一次,第27天后各组大鼠取腹主动脉血,并离心提取血清。Exo Quick法提取血清外泌体,通过透射电镜、蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）、浓度粒径检测（NTA）等方法鉴定外泌体,应用非靶标（Label Free）定量蛋白组学技术测量血清外泌体所运载蛋白的种类和含量。筛选组间变化倍数大于1.5,p<0.05的针刺显着差异蛋白,将筛选出的263个正常针刺显着差异蛋白和61个炎症模型针刺显着差异蛋白作为源数据,在人类疾病数据库（MALACARD）查找与显着差异蛋白相关的疾病,通过Gephi软件构建正常针刺显着差异蛋白-疾病网和模型针刺显着差异蛋白-疾病网,将正常针刺显着差异蛋白相关疾病与模型针刺显着差异蛋白相关疾病列入Excel表格中,通过“突出显示单元格规则”下拉菜单中的“重复值”,找出正常针刺显着差异蛋白和模型针刺显着差异蛋白二者皆相关的疾病,并联合应用连入度（Degree）、加权入度（Weight Degree）、Page Rank等运行算法筛选与显着差异蛋白相关度高的疾病,剔除世界卫生组织（World Health Organization,WHO）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）及国内《现代针灸病谱》已推荐的针灸治疗病症,最终确定针刺可能的潜在治疗病症。将实验一中筛选的61个炎症模型针刺显着差异蛋白作为源数据,在Uniprot蛋白数据库、STRING数据库、GO功能数据库、KEGG数据库中查找显着差异蛋白相关的互相作用蛋白、分子功能、信号通路及显着差异蛋白来源的细胞和组织,通过Gephi软件构建显着差异蛋白-互相作用蛋白网、显着差异蛋白-信号通路网、显着差异蛋白-功能网及显着差异蛋白-分泌细胞组织网,联合应用Degree、Weight Degree、Page Rank等运行算法筛选关键的互作蛋白、信号通路、分子功能、分泌细胞组织,探究针刺镇痛抗炎网络调节的作用规律。结果:1.实验结合复杂网络分析挖掘的针刺潜在治疗病症结果显示,针刺在32种肿瘤、15种免疫系统疾病、15种循环系统疾病、6种传染病、5种泌尿生殖系统疾病、4种代谢性疾病、4种骨骼肌肉系统和结缔组织疾病、3种消化系统疾病、2种呼吸系统疾病、2种皮肤疾病、2种神经系统疾病、1种五官疾病以及11种其他疾病中可能存在潜在的治疗效应。2.针刺显着差异蛋白的下游互作蛋白与免疫调节、脂质代谢、糖代谢、信号传导等功能密切相关;针刺显着差异蛋白的分子功能多与生物活性物质的合成代谢、免疫调节、信号传导以及生物活性物质的运输相关;Fox O、Ras、补体和凝血级联、HIF-1、糖酵解/糖异生、PPAR等信号通路可能是针刺整体调节的关键信号通路,这些通路多与免疫调节、糖代谢、脂质代谢等相关;针刺显着差异蛋白可来源于消化、泌尿生殖、呼吸、内分泌、循环、免疫、运动、神经、泌尿、皮肤等各个系统。结论:1.针刺潜在适应病症广泛,涉及多系统疾病,其中免疫系统疾病、肿瘤、代谢性疾病等可能是针刺重要的潜在治疗病症。2.针刺镇痛抗炎作用具有网络调节的特点,可从器官、组织、细胞、蛋白、信号通路等多层次、多维度、多途径发挥整体作用。
二、Page综合征一例（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Page综合征一例（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 猪圆环病毒概述 |
| 2 病原学 |
| 2.1 病毒的分类及结构 |
| 2.2 PCV的理化性质 |
| 2.3 PCV细胞培养特性 |
| 3 PCV分子生物学特征 |
| 3.1 PCV1基因组结构及编码蛋白 |
| 3.2 PCV2基因组结构及编码蛋白 |
| 3.3 PCV3基因组结构及编码蛋白 |
| 3.4 PCV4基因组结构及编码蛋白 |
| 4 PCV引起的相关疾病研究 |
| 5 PCV实验室诊断方法 |
| 5.1 PCR及实时荧光定量PCR |
| 5.2 酶联免疫吸附试验 |
| 6 PCV流行情况 |
| 6.1 PCV2国内外流行现状 |
| 6.2 PCV3国内外流行现状 |
| 6.3 PCV4国内外流行现状 |
| 7 研究目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样本来源 |
| 1.2 载体与细胞 |
| 1.3 抗体与细胞培养液 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪圆环病毒4型分子流行病学调查 |
| 2.2 PCV4 Cap蛋白表达及纯化 |
| 2.3 PCV4间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 结果 |
| 1 内蒙古自治区PCV4分子流行病学调查 |
| 1.1 PCV4的流行情况 |
| 1.2 PCV4与PCV2、PCV3共感染 |
| 1.3 PCV4全基因组序列扩增结果 |
| 1.4 PCV4全基因组序列同源性分析 |
| 1.5 PCV4遗传变异特性 |
| 1.6 PCV4遗传进化分析 |
| 2 PCV4 Cap蛋白表达及纯化 |
| 2.1 PCV4 Cap基因扩增结果 |
| 2.2 pET28a-PCV4-Cap重组质粒鉴定结果 |
| 2.3 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白Western blot验证 |
| 2.4 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白表达条件优化 |
| 2.5 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白表达形式验证结果 |
| 2.6 pET28a-PCV4-Cap重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 PCV4 Cap蛋白真核表达及鼠源多克隆抗体鉴定 |
| 3 PCV4间接ELISA检测方法最佳反应条件建立 |
| 3.1 抗体阳性血清鉴定结果 |
| 3.2 抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数 |
| 3.3 抗原最佳包被条件确定 |
| 3.4 最佳封闭液种类及封闭时间结果 |
| 3.5 最佳血清孵育时间及二抗稀释倍数结果 |
| 3.6 酶标二抗孵育时间与底物显色时间最佳选择结果 |
| 3.7 阴阳性临界值确定 |
| 3.8 批内与批间重复性试验结果 |
| 3.9 特异性试验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B |
（3）丝氨酸蛋白酶HTRA/DEGQ在猪呼吸道病原菌突破呼吸道黏膜上皮屏障中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪呼吸系统疾病综合征 |
| 1.1.1 猪呼吸系统疾病综合征概述 |
| 1.1.2 影响猪呼吸系统疾病综合征的因素 |
| 1.1.3 细菌性病原在猪呼吸系统疾病综合征中的作用 |
| 1.2 引起猪呼吸系统疾病综合征的细菌性病原 |
| 1.2.1 副猪革拉瑟氏杆菌 |
| 1.2.2 猪胸膜肺炎放线杆菌 |
| 1.2.3 多杀性巴氏杆菌 |
| 1.2.4 猪支气管败血性波氏杆菌 |
| 1.3 呼吸道黏膜上皮屏障与呼吸道细菌性病原 |
| 1.3.1 呼吸系统屏障概述 |
| 1.3.2 呼吸道黏膜上皮层结构及屏障功能 |
| 1.3.3 细菌性病原跨越黏膜上皮细胞屏障 |
| 1.3.4 细菌性病原将上皮细胞间连接蛋白作为分子靶标 |
| 1.4 丝氨酸蛋白酶/伴侣蛋白 |
| 1.4.1 细菌丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ概述 |
| 1.4.2 丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ的结构及功能 |
| 1.4.3 细菌分泌丝氨酸蛋白酶HtrA/DegP的方式 |
| 1.4.4 致病菌HtrA蛋白与宿主细胞的作用形式 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 培养基及抗生素溶液的配制 |
| 3.1.4 主要溶液及其配制 |
| 3.1.5 主要实验器材 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.1.7 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株的复苏、传代培养和生长曲线测定 |
| 3.2.2 基因缺失重组质粒以及互补质粒的构建 |
| 3.2.3 基因缺失菌株和互补菌株的构建及PCR鉴定 |
| 3.2.4 htrA缺失菌株的荧光定量PCR的鉴定 |
| 3.2.5 HtrA/DegQ/ClpX蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.2.6 GpHtrA和GpClpX蛋白免疫血清的制备 |
| 3.2.7 htrA/clpX/clpP基因缺失菌株及互补菌株的Western Blot鉴定 |
| 3.2.8 HtrA蛋白的分泌实验 |
| 3.2.9 利用CRISPR-Cas9技术在NPTr细胞中构建基因缺失细胞系 |
| 3.2.10 细菌的对NPTr细胞的黏附、侵入和Transwell实验 |
| 3.2.11 E-钙黏蛋白胞外结构域(N-Terminal Fragment,NTF)的真核表达、纯化及体外切割实验 |
| 3.2.12 酪蛋白酶谱和明胶酶谱实验 |
| 3.2.13 GPS菌株酪蛋白酶谱区域的质谱分析实验 |
| 3.2.14 ECIS测定细胞的跨细胞电阻 |
| 3.2.15 siRNA干扰和抑制剂抑制实验 |
| 3.2.16 NPTr细胞核蛋白和细胞浆蛋白分离实验 |
| 3.2.17 序列比对和结构预测 |
| 3.2.18 动物实验 |
| 3.2.19 HE染色、免疫荧光染色、免疫组化和激光共聚焦 |
| 3.2.20 统计学分析 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 PRDC病原菌影响气管上皮细胞屏障功能 |
| 4.1.1 PRDC病原菌破坏气管上皮细胞与细胞之间的连接蛋白 |
| 4.1.2 PRDC病原菌降低气管上皮细胞的跨细胞电阻 |
| 4.2 PRDC病原菌黏附和侵入新生仔猪气管上皮细胞 |
| 4.3 利用CRISPR-Cas9技术成功构建E-钙黏蛋白缺失细胞系 |
| 4.4 E-钙黏蛋白维持上皮细胞屏障功能 |
| 4.5 E-钙黏蛋白的缺失能增加β-catenin的入核 |
| 4.6 宿主的基质金属蛋白酶蛋白不参与PRDC病原菌诱导E-钙黏蛋白的降低 |
| 4.6.1 PRDC病原菌对基质金属蛋白酶蛋白量的影响 |
| 4.6.2 E-钙黏蛋白的胞外域切割不依赖宿主MMPs活性和ADAM10 |
| 4.7 PRDC病原菌的酪蛋白酶谱分析 |
| 4.8 PRDC病原菌的HtrA/DegQ蛋白保守性分析 |
| 4.9 HtrA/DegQ蛋白的表达及纯化 |
| 4.9.1 pET28a-HtrA/DegQ质粒的构建 |
| 4.9.2 HtrA/DegQ野生型和突变型蛋白的表达 |
| 4.10 HtrA/DegQ蛋白的水解活性 |
| 4.10.1 HtrA/DegQ蛋白的酪蛋白水解活性 |
| 4.10.2 HtrA/DegQ蛋白对E-钙黏蛋白的水解作用 |
| 4.11 GpHtrA蛋白的分泌鉴定 |
| 4.11.1 GpHtrA蛋白的多克隆抗体制备 |
| 4.11.2 GpHtrA蛋白分泌到TSB培养基中 |
| 4.11.3 GpHtrA蛋白分泌到细菌与细胞共培养上清中 |
| 4.12 分泌的GpHtrA靶向E-钙黏蛋白的胞外域 |
| 4.12.1 重组的HtrA/DegQ蛋白对细胞E-钙黏蛋白的切割实验 |
| 4.12.2 E-钙黏蛋白胞外域切割不依赖宿主的HtrA1蛋白酶 |
| 4.12.3 GpHtrA蛋白在GPS菌株中的表达 |
| 4.12.4 野生型HtrA/DegQ蛋白降低NPTr细胞的跨细胞阻值 |
| 4.13 htrA基因缺失菌株的构建以及鉴定 |
| 4.13.1 pK18mobsacB-htrA-UKD自杀性质粒的构建 |
| 4.13.2 htrA基因缺失菌株的PCR鉴定 |
| 4.13.3 htrA基因缺失菌株的WB和荧光定量PCR鉴定 |
| 4.13.4 htrA基因缺失对酪蛋白酶活性的影响 |
| 4.14 htrA基因减少菌株的黏附和跨细胞迁移 |
| 4.14.1 htrA基因减少菌株对E-钙黏蛋白的切割 |
| 4.14.2 htrA基因缺失减少菌株对气管上皮细胞的黏附和跨细胞迁移 |
| 4.15 htrA基因缺失减少细菌在仔猪体内的定殖 |
| 4.15.1 htrA基因缺失减缓菌株对仔猪呼吸系统的病理损伤 |
| 4.15.2 htrA基因缺失减缓菌株对气管上皮E-钙黏蛋白的破坏 |
| 4.15.3 htrA基因缺失减少菌株在呼吸道和其它组织中的定殖 |
| 4.15.4 htrA基因缺失减少菌株的跨上皮细胞能力 |
| 4.16 AAA+ATPase ClpX蛋白酶调控 GpHtrA蛋白 |
| 4.16.1 ClpX的结构分析以及clpP-X基因共转录验证 |
| 4.16.2 GpClpX是具有ATPase活性的蛋白酶 |
| 4.16.3 clpP和clpX基因缺失对GPS的酪蛋白酶谱的影响 |
| 4.16.4 ClpX影响HtrA蛋白酶在GPS中的表达及生物学功能 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 PRDC细菌性病原与呼吸道黏膜屏障 |
| 5.1.2 PRDC细菌性病原中具有酪蛋白水解活性的蛋白酶 |
| 5.1.3 丝氨酸蛋白酶HtrA/DegQ的自我切割形式 |
| 5.1.4 病原菌的HtrA/DegQ蛋白酶的调控表达 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 附表1. GPS 的酪蛋白酶谱条带中蛋白的质谱鉴定 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）PRRSV GP2蛋白的单抗制备及Marc145-GP2细胞系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 PRRSV的基因组结构 |
| 1.2.3 PRRSV的非结构蛋白 |
| 1.2.4 PRRSV的结构蛋白 |
| 1.3 PRRS的发病机理 |
| 1.4 PRRSV的感染特征 |
| 1.5 PRRS的流行病学 |
| 1.6 PRRS的临床症状 |
| 1.7 PRRS的诊断及防控 |
| 1.7.1 PRRS的诊断 |
| 1.7.2 PRRS的防控 |
| 1.8 PRRSV抗体的研究进展 |
| 1.9 PRRSV细胞系的研究进展 |
| 1.10 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 血清、质粒、细胞及引物 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 溶液的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GP2 蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.2 pET-30a-ORF2 的酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.2.5 重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 重组蛋白的Western-Blot检测 |
| 2.2.8 杂交瘤细胞的制备及筛选 |
| 2.2.9 单克隆抗体腹水的制备及纯化 |
| 2.2.10 目的基因的扩增 |
| 2.2.11 重组慢病毒质粒的构建 |
| 2.2.12 慢病毒的包装 |
| 2.2.13 测定嘌呤霉素的杀灭曲线 |
| 2.2.14 慢病毒转导和细胞克隆 |
| 2.2.15 细胞系的PCR鉴定 |
| 2.2.16 细胞系的蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 GP2 蛋白生物信息学分析 |
| 3.2 原核表达载体双酶切鉴定结果 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达及SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4 重组蛋白的大量表达 |
| 3.5 重组蛋白的纯化结果 |
| 3.6 纯化后重组GP2 蛋白Western Blot结果 |
| 3.7 血清效价测定 |
| 3.8 杂交瘤细胞株的筛选及亚类鉴定 |
| 3.9 重组GP2 蛋白抗体的纯化 |
| 3.9.1 SDS-PAGE检测抗体纯度 |
| 3.9.2 用BCA法测定蛋白含量 |
| 3.10 ORF2 基因的扩增 |
| 3.11 重组慢病毒质粒的双酶切鉴定 |
| 3.12 重组慢病毒的包装 |
| 3.13 嘌呤霉素杀灭曲线的确定 |
| 3.14 慢病毒的转导及细胞系的筛选 |
| 3.15 细胞系的PCR鉴定 |
| 3.16 细胞系的Western blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、冠状病毒 |
| 二、中东呼吸综合征冠状病毒 |
| 三、严重急性呼吸综合征冠状病毒 |
| 四、纳米抗体 |
| 第一章 抗MERS-CoV纳米中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细菌、噬菌体和质粒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 蛋白质 |
| 1.1.4 主要试剂(盒) |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 MERS-CoV S1 蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 1.2.2 MERS-CoV S蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 1.2.3 抗MERS-CoV特异性纳米抗体的选取与制备 |
| 1.2.4 抗MERS-CoV特异性抗体的生物学功能评价 |
| 1.2.5 抗MERS-CoV特异性抗体的中和机制研究 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 抗MERS-CoV特异性纳米抗体的筛选和制备 |
| 1.3.2 MERS-CoV特异性抗体的生物学功能评价 |
| 1.3.3 MERS-CoV特异性抗体的中和机制研究 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 抗MERS-CoV双表位中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 蛋白质 |
| 2.1.3 主要试剂(盒) |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的构建与制备 |
| 2.2.2 MERS-CoV特异性双表位抗体的生物学功能评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的制备 |
| 2.3.2 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的生物学特征分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗SARS-CoV纳米中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细菌、噬菌体、质粒 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 蛋白 |
| 3.1.4 主要试剂(盒)与耗材 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SARS-CoV RBD-Fc蛋白特异性纳米抗体库的构建 |
| 3.2.2 SARS-CoV S1 蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 3.2.3 SARS-CoV RBD蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 3.2.4 SARS-CoV特异性纳米抗体的选取与制备 |
| 3.2.5 SARS-CoV特异性纳米抗体的生物学功能评价 |
| 3.2.6 SARS-CoV特异性纳米抗体的中和机制研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 SARS-CoV RBD特异性纳米抗体库的构建 |
| 3.3.2 SARS-CoV特异性纳米抗体的筛选及制备 |
| 3.3.3 SARS-CoV特异性纳米抗体的生物学特征分析 |
| 3.3.4 SARS-CoV特异性纳米抗体的中和机制研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体构建与鉴定 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 蛋白质 |
| 4.1.3 主要试剂(盒) |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的构建与制备 |
| 4.2.2 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的生物学功能评价 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的制备与鉴定 |
| 4.3.2 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的生物学功能评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 部分试剂及培养基配方 |
| 附录 B 用于序列比对的2012-2019年MERS-CoV流行株GenBank编号 |
| 在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（6）基于β-葡聚糖与甘露聚糖修饰的寨卡病毒重组蛋白疫苗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 寨卡病毒 |
| 1.1.1 传播背景 |
| 1.1.2 传播途径 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 病毒结构 |
| 1.2 寨卡病毒疫苗 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 减毒活疫苗 |
| 1.2.3 DNA疫苗 |
| 1.2.4 mRNA疫苗 |
| 1.2.5 腺病毒重组疫苗 |
| 1.2.6 病毒样颗粒(VLPs) |
| 1.2.7 重组蛋白疫苗 |
| 1.3 疫苗佐剂 |
| 1.3.1 铝盐佐剂 |
| 1.3.2 水油乳剂 |
| 1.3.3 脂质体颗粒 |
| 1.3.4 免疫刺激复合物(ISCOMs) |
| 1.3.5 TLR激动剂 |
| 1.3.6 联合佐剂 |
| 1.3.7 多糖佐剂 |
| 1.4 递送系统 |
| 1.4.1 免疫应答原理 |
| 1.4.2 微粒形成策略 |
| 1.5 论文立题依据及策略 |
| 1.5.1 立题背景 |
| 1.5.2 研究策略 |
| 第2章 寨卡病毒E蛋白与EDⅢ蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 构建重组质粒ZKsE-pET21a |
| 2.3.2 质粒ZKsE-pET21a鉴定 |
| 2.3.3 寨卡病毒E蛋白的诱导表达 |
| 2.3.4 寨卡病毒E蛋白表达菌株的包涵体复性 |
| 2.3.5 寨卡病毒E蛋白的分离纯化与分析鉴定 |
| 2.3.6 EDⅢ蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 质粒ZKsE-pET21a鉴定 |
| 2.4.2 E蛋白的诱导表达 |
| 2.4.3 E蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.4.4 EDⅢ蛋白的诱导与表达 |
| 2.4.5 EDⅢ蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于β-葡聚糖修饰的寨卡病毒E蛋白疫苗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 基于β-葡聚糖修饰的E蛋白疫苗的制备与纯化 |
| 3.3.2 尺寸排阻色谱分析 |
| 3.3.3 动态光散射分析 |
| 3.3.4 E-PS样品定量分析 |
| 3.3.5 圆二色光谱表征 |
| 3.3.6 荧光光谱表征 |
| 3.3.7 红外光谱表征 |
| 3.3.8 E-PS样品的裂解效率测定 |
| 3.3.9 免疫原性评价 |
| 3.3.10 脾细胞分泌细胞因子检测 |
| 3.3.11 体外评价E-PS样品对DC细胞成熟的影响 |
| 3.3.12 药代动力学评价 |
| 3.3.13 毒性评价 |
| 3.3.14 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 基于β-葡聚糖修饰的E蛋白疫苗的纯化与鉴定 |
| 3.4.2 尺寸排阻色谱分析 |
| 3.4.3 动态光散射分析 |
| 3.4.4 E-PS样品定量分析 |
| 3.4.5 远紫外圆二色光谱表征 |
| 3.4.6 荧光光谱表征 |
| 3.4.7 红外光谱表征 |
| 3.4.8 E-PS样品的裂解速率测定 |
| 3.4.9 免疫原性的评价 |
| 3.4.10 脾细胞分泌细胞因子检测 |
| 3.4.11 体外评价E-PS样品对DC细胞成熟的影响 |
| 3.4.12 药代动力学评价 |
| 3.4.13 毒性评价 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 基于血红蛋白与甘露聚糖修饰的寨卡病毒EDⅢ蛋白疫苗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 蛋白载体HM的制备与纯化 |
| 4.3.2 HM-EDⅢ样品的制备与纯化 |
| 4.3.3 尺寸排阻色谱分析 |
| 4.3.4 动态光散射分析 |
| 4.3.5 HM-EDⅢ样品定量分析 |
| 4.3.6 圆二色光谱表征 |
| 4.3.7 外源荧光光谱表征 |
| 4.3.8 红外光谱表征 |
| 4.3.9 免疫原性评价 |
| 4.3.10 脾细胞分泌细胞因子检测 |
| 4.3.11 药代动力学评价 |
| 4.3.12 毒性评价 |
| 4.3.13 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白载体HM的纯化与鉴定 |
| 4.4.2 HM-EDⅢ样品的纯化与鉴定 |
| 4.4.3 尺寸排阻色谱分析 |
| 4.4.4 动态光散射分析 |
| 4.4.5 HM-EDⅢ样品定量分析 |
| 4.4.6 圆二色光谱表征 |
| 4.4.7 外源荧光光谱表征 |
| 4.4.8 红外光谱表征 |
| 4.4.9 免疫原性的评价 |
| 4.4.10 脾细胞分泌细胞因子检测 |
| 4.4.11 药代动力学评价 |
| 4.4.12 毒性评价 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的研究结果 |
| 5.2 本论文创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 胰岛素样生长因子-1的研究进展 |
| 1.1.2 胰岛素样生长因子-1国内外生产现状 |
| 1.2 小结 |
| 1.3 本研究的主要内容、目标与方法 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 第2 章 融合蛋白与相应蛋白酶的虚拟筛选 |
| 2.1 预测服务器 |
| 2.2 预测方法 |
| 2.2.1 融合蛋白氨基酸序列的获取 |
| 2.2.2 融合蛋白二级结构预测 |
| 2.2.3 融合蛋白三级结构预测 |
| 2.2.4 融合蛋白与蛋白酶分子对接 |
| 2.3 预测结果 |
| 2.3.1 融合蛋白结构预测结果 |
| 2.3.2 融合蛋白与蛋白酶分子对接结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的载体构建 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 菌株、质粒 |
| 3.1.2 工具酶 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胰岛素样生长因子-1原核表达载体的构建及重组子的筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 3.3.2 抽提质粒结果 |
| 3.3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3.4 双酶切鉴定结果 |
| 3.3.5 胰岛素样生长因子-1序列测定及比对结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达及优化 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.2 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 表达菌株对蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 诱导温度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 诱导时间对蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 IPTG浓度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第5 章 胰岛素样生长因子-1的分离纯化及酶切优化 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 融合蛋白的分离纯化及酶切优化 |
| 5.2.2 反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯度鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 融合蛋白亲和层析结果 |
| 5.3.2 酶量及酶切方式对酶切结果的影响 |
| 5.3.3 温度及Ca~(2+)浓度对酶切结果的影响 |
| 5.3.4 酶切时间对酶切结果的影响 |
| 5.3.5 DTT对酶切结果的影响 |
| 5.3.6 酶切产物亲和层析结果 |
| 5.3.7 RP-HPLC纯度鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第6 章 利用3T3细胞检测胰岛素样生长因子-1的活性 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 培养液的配制 |
| 6.2.2 3T3细胞的冻存 |
| 6.2.3 3T3细胞的复苏 |
| 6.2.4 胰岛素样生长因子-1活性测定方法的建立 |
| 6.2.5 融合蛋白及胰岛素样生长因子-1样品活性检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 铺板细胞密度优化结果 |
| 6.3.2 胰岛素样生长因子-1作用时间优化结果 |
| 6.3.3 铺板及维持培养血清优化结果 |
| 6.3.4 初始培养血清优化结果 |
| 6.3.5 胰岛素样生长因子-1初始浓度及稀释倍数结果 |
| 6.3.6 胰岛素样生长因子-1样品及融合蛋白活性检测结果 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 |
（8）金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 对虾白斑综合征病毒的研究背景 |
| 1.1 对虾白斑综合征病毒的命名及分类地位 |
| 1.2 对虾白斑综合征病毒的形态结构 |
| 1.3 对虾白斑综合征的症状及病理变化 |
| 1.4 对虾白斑综合征病毒的主要结构蛋白 |
| 1.5 对虾白斑综合征病毒的检测方法 |
| 1.6 对虾白斑综合征的防治方法 |
| 2. 金纳米颗粒在生物检测中的应用 |
| 2.1 纳米材料概述 |
| 2.2 金纳米材料的性质 |
| 2.3 金纳米颗粒在生物检测方面的应用 |
| 3. 金纳米探针结合暗场显微镜技术检测病原体的应用 |
| 4. 论文研究内容及意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法的建立 |
| 1.材料 |
| 1.1 病毒毒株、质粒、菌株及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 WSSV的感染和增殖 |
| 2.2 PCR检测WSSV |
| 2.3 WSSV的纯化 |
| 2.4 透射电镜观察WSSV |
| 2.5 实时荧光定量PCR检测WSSV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR检测克氏原螯虾的WSSV感染情况 |
| 3.2 透射电镜观察WSSV |
| 3.3 实时荧光定量PCR定量检测WSSV |
| 4. 讨论 |
| 第二章 对虾白斑综合征病毒核衣壳蛋白VP664多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 质粒、菌株及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 重组蛋白VP664的制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 效价测定 |
| 2.4 抗体纯化 |
| 2.5 多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 重组菌的诱导表达 |
| 3.2 重组蛋白的纯化 |
| 3.3 血清的效价测定 |
| 3.4 多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.讨论 |
| 第三章 金纳米探针-暗场显微镜检测对虾白斑综合征病毒方法的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 金纳米探针的制备 |
| 2.2 在暗场下观察探针结合WSSV样品 |
| 2.3 WSSV实际样品的检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 金纳米探针的表征 |
| 3.2 暗场显微镜观察探针捕获WSSV |
| 3.3 透射电镜观察探针标记WSSV的特异性 |
| 3.4 探针结合暗场显微镜定量检测WSSV的灵敏度测定 |
| 3.5 WSSV实际样品的检测 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利目录 |
| 致谢 |
（9）SAPHO综合征血清细胞外囊泡的蛋白组成和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 SAPHO综合征的研究进展 |
| 1.1.1 SAPHO综合征的临床表现与流行病学 |
| 1.1.2 SAPHO综合征的病因与发病机制 |
| 1.1.3 SAPHO综合征的诊断与治疗 |
| 1.2 细胞外囊泡的研究进展 |
| 1.2.1 细胞外囊泡的定义 |
| 1.2.2 细胞外骨代谢的调节 |
| 1.2.3 细胞外囊泡在诊断与治疗方面的应用潜力 |
| 1.3 论文的主要研究目的 |
| 1.4 论文的研究方法和内容 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人体来源血清 |
| 2.1.2 抗体和ELISA试剂 |
| 2.1.3 细胞信息 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验耗材 |
| 2.5 试剂配制 |
| 2.6 实验方法 |
| 2.6.1 患者入组 |
| 2.6.2 血清标本收集 |
| 2.6.3 血清细胞外囊泡提取 |
| 2.6.4 血清细胞外囊泡电镜观察 |
| 2.6.5 血清细胞外囊泡浓度和粒径检测 |
| 2.6.6 血清细胞外囊泡的蛋白提取和定量 |
| 2.6.7 串联质谱标签标记 |
| 2.6.8 高效液相色谱 |
| 2.6.9 液相色谱-串联质谱分析 |
| 2.6.10 生物信息学分析 |
| 2.6.11 细胞培养 |
| 2.6.12 细胞裂解和蛋白定量 |
| 2.6.13 小鼠破骨细胞诱导和染色 |
| 2.6.14 人外周血单个核细胞的分离和诱导破骨分化 |
| 2.6.15 骨吸收实验和甲苯胺蓝染色 |
| 2.6.16 小鼠成骨细胞诱导和染色 |
| 2.6.17 人脂肪间充质干细胞提取和诱导成骨分化 |
| 2.6.18 凝胶电泳及考马斯亮蓝染色 |
| 2.6.19 免疫印迹实验 |
| 2.6.20 酶联免疫吸附实验 |
| 2.6.21 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 超速离心分离血清细胞外囊泡方法的确定 |
| 3.2 超速离心法和试剂法提取血清细胞外囊泡的有效性验证 |
| 3.3 SAPHO血清细胞外囊泡的定量蛋白质组学分析 |
| 3.4 SAA1是潜在的SAPHO诊断标志物 |
| 3.5 SAPHO血清细胞外囊泡抑制活动期患者破骨细胞分化和功能 |
| 3.6 SAPHO血清细胞外囊泡对骨细胞生成无显着影响 |
| 3.7 不同血清细胞外囊泡刺激下破骨细胞的定量蛋白质组学分析 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 第5章 综述 SAPHO综合征的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1. SAPHO患者基本信息 |
| 附表2. 健康志愿者信息 |
| 附表3. 类风湿关节炎和强直性脊柱炎患者信息 |
| 附表4. 伦理审查证明 |
| 附表5. SAPHO患者疼痛评分,分期,SAA1水平与对SEVs反应 |
| 附表6. SAPHO患者与健康志愿者SEVs差异蛋白 |
| 附表7. SAPHO患者与健康志愿者SEVs刺激后破骨细胞差异蛋白 |
| 附表8. 患者自评量表-骨痛评分 |
| 附表9. 发表文章列表 |
| 致谢 |
（10）基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容一 基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 研究内容二 基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺网络调节作用规律研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 计算生物学的研究进展 |
| 1 深度学习在生物医学中的应用 |
| 2 计算学在脑神经科学中的应用 |
| 3 计算学在组学研究中的应用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Page综合征一例（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]内蒙古PCV4分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的初步建立[D]. 于成东. 延边大学, 2021(02)
- [3]丝氨酸蛋白酶HTRA/DEGQ在猪呼吸道病原菌突破呼吸道黏膜上皮屏障中的作用及机制研究[D]. 曹琪. 华中农业大学, 2021(02)
- [4]PRRSV GP2蛋白的单抗制备及Marc145-GP2细胞系的建立[D]. 乌东高娃. 内蒙古农业大学, 2021
- [5]高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究[D]. 李江凡. 军事科学院, 2021(02)
- [6]基于β-葡聚糖与甘露聚糖修饰的寨卡病毒重组蛋白疫苗[D]. 齐金铭. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2021(01)
- [7]基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析[D]. 谢倩. 江汉大学, 2021(01)
- [8]金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究[D]. 白亚南. 扬州大学, 2021(02)
- [9]SAPHO综合征血清细胞外囊泡的蛋白组成和功能研究[D]. 陈彦宇. 北京协和医学院, 2021(02)
- [10]基于血清外泌体蛋白组联合复杂网络分析的针刺潜在治疗病谱及针刺网络调节作用规律的研究[D]. 陈勇. 天津中医药大学, 2020