一、615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装（论文文献综述）
尹良伟[1]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中提出自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
曹韪凡[2]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中提出近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
李晖[3]（2020）在《环形RNA circRNA000203调控miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴促进心肌肥厚的机制研究》文中认为心力衰竭是导致心血管疾病死亡率居首位的主要疾病之一。由高血压所致的心肌肥厚是导致心力衰竭甚至心源性猝死重要的独立危险因素。越来越多的研究结果表明环形RNA（circular RNAs,circRNAs）参与心肌肥厚的发生发展过程。因此,深入研究调控心肌肥厚过程的circRNAs及其分子机理,可为心力衰竭治疗提供新的靶点,具有非常重要的意义。我们前期工作证实circRNA000203在糖尿病心肌病模型中高表达,并具有促进心肌纤维化的作用。然而,circRNA000203在心肌肥厚中可能的作用和分子机制,目前仍不清楚。目的:本研究旨在阐明circRNA000203在心肌肥厚中的作用及其分子机制,明确其作用靶点及表达调控机制。方法:1、通过RT-qPCR检测Ang-Ⅱ诱导心肌肥厚的小鼠以及人心肌组织中（包括22例心力衰竭患者和20例器官捐赠健康志愿者）circRNA000203的表达水平;2、利用腺病毒介导在小鼠原代心肌细胞中过表达circRNA000203,并通过鬼笔环肽染色、RT-qPCR和Western Blot检测circRNA000203在体外对心肌细胞肥大表型的影响;3、利用心肌特异过表达circRNA000203转基因小鼠（Tg-circ203）,建立Ang-Ⅱ诱导的心肌肥厚模型,并通过超声心动图、麦胚凝集素（WGA）染色、RT-qPCR 和 Western Blot 检测过表达 circRNA000203 对心肌肥厚表型的影响;4、通过RT-qPCR、RNA反义纯化技术（RAP）、双萤光素酶报告基因实验和RNA pull-down实验验证circRNA000203与miR-26b-5p、miR-140-3p间的结合和调控作用;5、双萤光素酶报告基因实验、RT-qPCR和Western Blot实验验证miR-26b-5p、miR-140-3p与其共同靶基因Gata4之间的结合和调控作用;6、通过RT-qPCR和Western Blot实验确定circRNA000203与miR-26b-5p、miR-140-3p以及靶基因Gata4之间的调控作用和对心肌肥厚表型的影响;7、RT-qPCR和双萤光素酶报告基因实验验证NF-κB p65对circRNA000203的转录调控作用。结果:1、circRNA000203在肥厚的小鼠心肌和心力衰竭患者心肌组织中表达均明显升高;2、在原代小鼠心肌细胞中过表达circRNA000203,心肌细胞明显肥大、肥厚相关基因Myh7和Anp的表达显着增加;3、建立了 Ang-Ⅱ诱导Tg-circ203小鼠心肌肥厚模型,Tg-circ203小鼠心功能明显降低、心肌细胞明显肥大、Myh7和Anp水平显着增加;4、RAP、双萤光素酶报告基因实验和RNA pull-down 实验证实 circRNA000203 可与 miR-26b-5p、miR-140-3p 直接结合;在体内和体外心肌细胞中过表达circRNA000203后,miR-26b-5p和miR-140-3p表达水平显着降低;5、在心肌细胞过表达miR-26b-5p或miR-140-3p,Gata4表达明显降低;体内和体外心肌细胞中过表达circRNA000203,Gata4表达明显增高;miR-26b-5p、miR-140-3p 与 Gata43’-UTR 存在结合作用,且 circRNA000203可抑制它们之间的结合作用;6、过表达miR-26b-5p、miR-140-3p和敲低Gata4水平均可以抑制Ang-Ⅱ和circRNA000203的促心肌细胞肥大作用;7、NF-κB p65可结合circRNA000203宿主基因Myo9a启动子区,增加circRNA000203的转录表达。结论:1、circRNA000203在肥厚的小鼠心肌和心力衰竭患者心肌中表达均显着升高;2、circRNA000203具有促进心肌细胞肥大作用;3、circRNA000203通过调控miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴发挥促进心肌肥厚的作用;4、NF-κB信号介导心肌肥厚时circRNA000203表达增加。本文阐明了 circRNA000203 调控 miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴促进心肌肥厚的作用,并明确心肌肥厚时NF-κB p65调控circRNA000203高表达,circRNA000203可成为心力衰竭治疗研究的潜在干预靶点。
杨惠[4]（2020）在《绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究》文中指出绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,Env）可在体外诱导细胞转化、体内介导肿瘤形成。JSRVEnv如何打破宿主细胞平衡引起转化,需要从细胞稳态角度探讨致瘤机制。自噬（Autophagy）是维持细胞稳态的重要手段。截至目前,探讨JSRVEnv与自噬的研究仍是空白。因此,本研究旨在探讨JSRV Env转化细胞中自噬的相应变化,开展如下试验:1.针对自然感染OPA肺组织进行RNA-seq分析。结果显示:OPA肺组织中差异转录本与16个受细胞自噬调控的生物学功能模块相关,并与PI3K/Akt-mTOR、MAPK等调控自噬的信号转导通路高度关联。表明自噬可能参与OPA过程。2.JSRV env全基因序列同源重组入pCMV-dR8.91后包装、纯化。通过感染复数（multiplicity of infection,MOI）梯度试验,JSRV env慢病毒感染STCs最适MOI为5,感染NIH 3T3细胞最适MOI为30。表明JSRV env过表达慢病毒构建成功,并能感染STCs及NIH 3T3细胞。3.JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞72h后,细胞增殖、迁移、侵袭能力均显着增强（p<0.05）,10d即可在软琼脂中形成明显集落。转化细胞注入裸鼠皮下 28d 形成明显肿瘤（STCs:1.94±0.83 cm3;NIH3T3:3.24±0.47cm3）。表明JSRV env慢病毒感染的STCs及NIH 3T3细胞发生转化。4.针对OPA肺组织和JSRVEnv转化细胞进行自噬因子检测,Beclin-1、p62表达量均显着下调（p<0.05）,LC3表达量下调。JSRV Env转化细胞内自噬体数量显着降低（p<0.05）。JSRV Env与Beclin-1在OPA肺组织中共定位,JSRV Env与Beclin-1在转化细胞中共沉淀。表明JSRVEnv转化细胞的自噬稳态降低,自噬体数量减少,且JSRVEnv与Beclin-1互作。5.当使用PepstatinA抑制自噬体与溶酶体融合,JSRV Env转化细胞中LC3Ⅱ可在短时期内大量积累。p62伴随转染时间延长（0-72h）而大量降解。表明JSRV Env转化细胞中存在完整的自噬流通。6.针对裸鼠成瘤模型（STCs:1.17±0.06 cm3;NIH 3T3:1.23±0.01 cm3）连续给予 3-MA（2mg/kg/d）和 RAPA（1mg/kg/d）28d。与对照组相比,3-MA 组及RAPA组肿瘤体积及重量均显着下调（p<0.05）。在STCs形成的JSRVEnv肿瘤中,3-MA组E-cadherin阳性信号显着大于对照组（p<0.05）,Vimentin 阳性信号显着小于对照组（p<0.05）。RAPA组E-cadherin与Vimentin 阳性信号与对照组相比均无显着差异。表明RAPA作为自噬激活剂及mTOR抑制剂,其对肿瘤进展的影响不仅取决于自噬调控,还可能与mTOR信号转导抑制相关。而3-MA是通过降低细胞自噬稳态影响细胞转化来抑制肿瘤进展。本试验揭示的OPA病肺组织差异表达基因能为未来筛选OPA潜在生物学标志物提供研究基础。本研究构建的JSRVEnv过表达慢病毒、JSRVEnv转化细胞及JSRVEnv裸鼠皮下移植瘤模型均能为今后探讨JSRVEnv分子致病机制提供稳定、高效的基础研究工具。本试验探讨的自噬在JSRVEnv转化细胞中的相应变化及相关作用,可为今后OPA的预防控制提供新思路。
崔娟娟[5]（2020）在《IL-7重组痘病毒实验性治疗小鼠肠癌模型的研究》文中研究指明肿瘤微环境抑制因素导致抗肿瘤免疫的主力军——T淋巴细胞在肿瘤组织浸润减少、功能异常。痘病毒是一种溶瘤病毒,可以感染肿瘤细胞,诱导免疫原性细胞死亡,激活抗肿瘤免疫应答。细胞因子IL-7可以促进初始T细胞增殖和分化,增强效应性T细胞功能,延长记忆性T细胞存活时间,抑制Treg细胞功能,从而增强抗肿瘤免疫应答。采用IL-7基因改造痘病毒形成的重组病毒,可以激活并增强抗肿瘤免疫应答,促进效应性T细胞向肿瘤浸润并增强其功能。本课题拟采用小鼠IL-7基因编码序列修饰痘病毒,构建IL-7重组痘病毒,通过实验性治疗小鼠结直肠癌模型,探讨IL-7重组痘病毒的治疗效果,以期为肿瘤免疫治疗提供新思路。第一部分 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠结直肠癌细胞株并构建荷瘤小鼠模型目的:建立稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠结直肠癌基因转染细胞株,并采用此细胞株构建荷瘤小鼠模型。方法:以慢病毒为载体,采用脂质体转染法将含萤火虫荧光素酶基因的质粒pLVX-Puro-Luc2P导入MC38细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得基因转染细胞株。采用RT-PCR技术和化学发光法分别从基因水平和蛋白水平鉴定基因转染细胞株萤火虫荧光素酶的表达。采用基因转染细胞株构建小鼠荷瘤模型,检测基因转染细胞株成瘤能力,绘制成瘤曲线并观察小鼠体内基因转染细胞的生物发光强度。结果:RT-PCR技术确定基因转染细胞含有萤火虫荧光素酶mRNA。化学发光法确定基因转染细胞含有有活性的萤火虫荧光素酶。基因转染细胞株成瘤率达100%,小鼠活体成像技术可以检测到生物发光,确定基因转染细胞株小鼠肠癌模型构建成功,并将此细胞株命名为MC38-Luc。结论:成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的基因转染细胞株MC38-Luc,并采用该细胞株成功构建了小鼠肠癌模型。第二部分 IL-7重组痘病毒对小鼠结直肠癌模型治疗作用的研究目的:探讨IL-7重组痘病毒对小鼠结直肠癌模型的治疗作用。方法:扩增鼠IL-7基因编码序列,将目的基因和载体质粒pCMS1-IRES进行双酶切并连接,获得IL-7重组质粒。将IL-7重组质粒和痘病毒进行同源重组,获得IL-7重组痘病毒,并扩增和纯化。采用RT-PCR技术和ELISA法分别从基因水平和蛋白水平确定IL-7重组痘病毒IL-7的表达。检测IL-7重组痘病毒的增殖能力和杀伤能力。采用IL-7重组痘病毒治疗MC38-Luc荷瘤小鼠,绘制肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠生存曲线。对完全缓解的荷瘤小鼠,再接种MC38-Luc细胞和B16-F10细胞,观察小鼠肿瘤生长情况。结果:成功构建了 IL-7重组痘病毒,该病毒可以延缓荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,诱导特异性持久性的抗肿瘤免疫应答。结论:IL-7重组痘病毒可有效治疗小鼠肠癌模型。
杨鑫[6]（2019）在《家蚕杆状病毒表达的鸡干扰素的应用和该病毒用于A型血友病基因治疗的研究》文中研究说明杆状病毒作为一种具有高效表达能力的分子生物学工具,在昆虫细胞及虫体中用于重组蛋白质的生产已有超过三十年的历史,并且相关技术仍然在持续改进。此外,杆状病毒还可作为基因呈递载体,用于将外源基因呈递至哺乳动物细胞及体内。由于哺乳动物体内没有任何病毒复制或其他潜在风险,杆状病毒作为基因呈递载体也越来越受到重视。本文利用实验室构建的禽类干扰素杆状病毒生产平台,成功表达了高活性鸡α（chIFN-α）、γ（chIFN-γ）以及λ（chIFN-λ3）干扰素,并使用鸡成纤维细胞（CEF）对各类鸡干扰素在抗禽类疾病,如新城疫（ND）的实际应用效果进行了验证,发现在各类干扰素组合中chIFN-γ抗NDV的效果最好。通过利用转录组测序技术对试验样品的分析发现,干扰素处理后细胞中多种干扰素诱导基因（ISGs）及参与抗原呈递的各类基因都呈显着上调表达,同时细胞自身也开始分泌chIFN-γ,这为chIFN-γ抗NDV的良好效果提供了分子水平的解释,也为chIFN-γ作为新型抗病毒药物及疫苗佐剂的应用提供了理论依据。同时根据预实验及相关文献报道,进一步应用家蚕杆状病毒表达平台所获得的chIFN-α及chIFN-γ对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的互作效应进行了研究,并尝试在AA肉鸡生产实践过程中的使用方式及作用进行了试验探究,试验结果显示试验组肉鸡的体重相较对照组出现了高于4%的体重增长。在对细胞及动物试验样品的转录组学测序数据进行分析后,我们发现CEF试验中,大量的ISGs出现了上调表达,证明了干扰素的抗病毒活性。而在试验动物脂肪组织中发现了大量与肌肉生长发育相关的基因显着上调表达,同时肝脏中出现了ISGs的不同程度上调表达,这为试验中发现的动物体重增长现象提供了理论解释。我们也对杆状病毒作为一种潜在的优秀基因呈递病毒载体的应用进行了试验,选取人凝血因子Ⅷ（FⅧ）全长基因作为呈递对象,在人肾上皮细胞系HEK293T进行了该基因呈递可行性的初步研究。我们还利用A型血友病模型小鼠,通过口服及腹腔注射等手段,对家蚕杆状病毒作为基因呈递载体的呈递效果和可行的给药途径进行了检测,并对包括CMV、CAG、HLP在内的不同启动子在向基因缺陷小鼠体内呈递FⅧ时的效率进行比较分析。其中HLP的呈递的凝血因子Ⅷ达到了正常健康人水平的17%,足以达到治疗水平,并且在多轮试验后小鼠体内并未产生针对凝血因子Ⅷ的中和抗体,为长期治疗提供了可能。本文利用家蚕杆状病毒表达系统表达的鸡干扰素在禽类抗病及促生长功能的分子机理及应用前景进行了研究,并对口服给药的可能性进行了尝试,获得了较好的试验结果,为鸡干扰素在生产中的应用提供了有力的试验证据。同时我们首次利用家蚕杆状病毒进行了全长人凝血因子Ⅷ基因的基因呈递试验,并在动物试验阶段获得了成功,口服给药和腹腔注射给药就能达到治疗水平,为A型血友病的治疗提供了安全、高效、廉价的新方法。
刘美娟[7]（2019）在《新型脂肪细胞因子锌-α2-糖蛋白与肥胖关系的研究》文中研究指明第一部分 不同代谢状态的肥胖患者血清ZAG水平的变化[研究目的]肥胖作为一种常见疾病,已危害全球人类的健康。与代谢正常型肥胖（metabolically healthy obesity,MHO）相比,代谢异常型肥胖（metabolically abnormal obesity,MAO）患者通常并发症更多,预后更差。锌α2糖蛋白（zinc-alpha 2-glycoprotein,ZAG）是一种新型的脂肪细胞因子。我们前期的研究表明,与体重正常人相比,肥胖患者血清ZAG水平明显降低,并与体重、体重指数（bodymassindex,BMI）、腰围（waistcircumference,WC）、臀围、腰臀比等指标呈负相关。但关于不同代谢状态的肥胖患者中ZAG水平的变化,目前尚无相关文献报道。因此,本研究旨在比较代谢正常、代谢异常和代谢异常合并糖尿病的肥胖患者血清ZAG的水平,并进一步探讨血清ZAG在区别代谢正常和代谢异常肥胖患者中的效能。[研究方法]本研究纳入北京协和医院肥胖门诊肥胖患者193名以及体检中心的受试者32名。根据体重和代谢情况,将受试者分为4组:体重正常代谢正常组（metabolically healthynon-obese,MHNO,n=32）、MHO 组（n=40）、MAO 组（n=104）、代谢异常型肥胖合并 2 型糖尿病组（metabolically abnormal diabetic obese,MADO,n=49）。肥胖、代谢异常、2型糖尿病的定义分别采用中国成人BMI分类标准、美国国家胆固醇教育计划成人治疗小组第3次报告标准（The Adult Treatment Panel Ⅲ of the National Cholesterol Education Program,NCEP/ATPⅢ）、美国糖尿病协会（American Diabetes Association,AD A）的诊断标准。采用酶联免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清脂肪因子ZAG和脂联素的水平。用t检验进行两组间计量资料的比较,用方差分析进行多组间计量资料的比较,用卡方检验进行计数资料的比较。用Pearson相关分析ZAG和脂联素与每组患者各参数之间的相关性,用线性回归分析ZAG和脂联素的独立影响因素,用多元logistic回归分析代谢异常的风险因素,用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）判断ZAG和脂联素诊断代谢异常的敏感性和特异性。[研究结果]1、与MHNO组相比,MHO组患者血清ZAG水平代偿性升高（8.44±1.14μg/mL vs.8.02±0.98μg/mL,P<0.05）,而随着代谢异常情况的加重,MAO和MADO组血清ZAG的水平依次降低,与MHO组相比,分别降低了 5.81%和10.55%（P<0.05）。血清脂联素在MHNO组和MHO组无明显差异（19.82±6.88μg/mL vs.19.39±6.18μg/mL,P>0.05）。与MHO组相比,MAO组和MADO组脂联素水平分别降低了14.90%和 26.71%（P<0.05）。2、两变量相关分析显示,在所有受试者中,血清ZAG与胆固醇（total cholesterol,TC）呈正相关（r=0.145）,而与空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）（r=-0.206）,餐后2小时血糖（r=-0.209）,口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test,OGTT）0分钟血糖（r=-0.206）,OGTT 120分钟血糖（r=-0.209）,稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin,HOMA-IR）（r=-0.172）和脂联素稳态评估模型（homeostasis model assessment of adiponectin,HOMA-AD）（r=-0.191）呈负相关关系（P均<0.05）。在所有受试者中,血清脂联素与年龄（r=0.179）、性别（r=0.259）、高密度脂蛋白胆固醇（r=0.270）和胰岛素敏感性检测指数（quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI）（r=0.375）呈正相关,与 BMI（r=-0.233）、WC（r=-0.317）、收缩压（r=-0.163）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）（r=-0.221）、谷丙转氨酶（r=-0.250）、谷草转氨酶（r=-0.156）、TC（r=-0.164）、甘油三酯（r=-0.224）、低密度脂蛋白胆固醇（r=-0.149）、游离脂肪酸（r=-0.286）、肌酐（r=-0.156）、尿酸（uricacid,UA）（r=-0.314）、FBG（r=-0.162）、空腹胰岛素（r=-0.347）、OGTTO 分钟血糖（r=-0.162）、HOMA-IR（r=-0.351）、脂肪组织胰岛素抵抗（adipose tissue insulin resistance,Adipo-IR）（r=-0.333）和HOMA-AD（r=-0.558）呈负相关关系（P均<0.05）。逐步多元线性回归分析发现,TC（β=0.223）,餐后 2 小时血糖（β=-0.201）,HOMA-AD（β=-0.155）是血清ZAG水平的独立影响因素（P均<0.05）。年龄（β=0.094）、DBP（β=-0.115）、UA（β=-0.127）、HOMA-IR（β=1.119）、HOMA-AD（β=-1.375）和 QUICKI（β=0.242）是血清脂联素的独立影响因素（P均<0.05）。3、将所有受试者按血清ZAG水平进行三等分（低:<7.582μg/mL;中:7.582-8.283μg/mL;高:≥8.283μg/mL）,进一步采用多元logistic回归分析探讨血清ZAG水平与代谢异常风险之间的关系。结果表明,以高ZAG三分位数组为参照（reference=1.00）,低ZAG三分位数和中ZAG三分位数组人群代谢异常的发生风险明显增加,其OR值及95%置信区间分别为2.406（1.214-4.768）（P=0.012）和2.985（1.474-6.046）（P=0.002）,而且在校正年龄、性别、BMI、血压、血糖、血脂、UA等指标后,该趋势仍存在,表明血清ZAG水平降低是发生代谢异常的危险因素。另外,将所有受试者按血清脂联素水平进行三等分（低:<12.620μg/mL;中:12.620-19.300μg/mL;高:≥19.300μg/mL）,采用多元 logistic回归分析探讨血清脂联素水平与代谢异常风险之间的关系。结果表明,低脂联素水平的人群患代谢异常的风险是高脂联素水平人群的5.371倍（95%CI 2.452-11.761,P=0.000）;而且在校正年龄、性别、BMI、血压、血糖、血脂、UA等指标后,该趋势仍存在,表明血清脂联素水平降低也是发生代谢异常的危险因素。4、通过ROC曲线分析血清ZAG对代谢异常的诊断价值,其曲线下面积为0.622,95%置信区间为0.539-0.706,诊断的灵敏度为50%,特异性为73.2%。另外,用ROC曲线分析血清ZAG和脂联素联合诊断对代谢异常的诊断价值,其曲线下面积为0.703,95%置信区间为0.629-0.776,诊断的灵敏度为62.7%,特异性为73.6%。并且血清ZAG和脂联素联合诊断代谢异常的价值要高于ZAG单一指标的诊断价值（P<0.05）。[研究结论]1、血清ZAG水平在代谢正常型肥胖患者中会代偿性升高,而在代谢异常型肥胖患者中降低,在代谢异常合并2型糖尿病的肥胖患者中ZAG的水平更低,提示血清ZAG的水平与机体代谢状况密切相关。2、与高血清ZAG水平人群相比,血清ZAG水平降低的患者发生代谢异常的风险明显升高。3、血清ZAG具有一定的区分代谢正常和代谢异常肥胖患者的效能,联合血清脂联素水平区分代谢异常的效能会大一些。第二部分 ZAG过表达/敲减在小鼠肥胖发生过程中/肥胖形成后的作用及其机制的研究[研究目的]ZAG是一种新型的脂肪因子,与肥胖和糖脂代谢的调节密切相关。我们前期的研究结果发现ZAG过表达能明显降低高脂诱导肥胖小鼠的体重、脂肪含量,增加胰岛素的敏感性,但ZAG早期干预是否可以在高脂饮食喂养的小鼠预防肥胖的发生以及ZAG敲减对肥胖小鼠的作用及其机制目前尚不清楚。因此,本研究一方面在动物水平构建了 ZAG过表达和敲减的腺相关病毒8（adeno-associated virus 8,AAV8）载体,通过皮下脂肪组织定点注射,观察（1）ZAG过表达/敲减在小鼠肥胖发生过程中的作用及其可能的作用机制;（2）ZAG过表达/敲减对高脂饮食诱导肥胖小鼠的作用及其可能的作用机制。另一方面在细胞水平观察（1）稳定转染ZAG即ZAG内源性过表达在3T3L1脂肪细胞分化过程中对白色脂肪棕色化相关基因表达的影响;（2）外源性鼠/人ZAG纯品干预对诱导分化成熟的3T3L1脂肪细胞中白色脂肪棕色化相关基因表达的影响。[研究方法]包括动物实验和细胞实验两部分。动物实验主要分为以下4部分:1、ZAG-AAV8 和 ZAG-shRNA-AAV8 病毒载体的构建。首先在 3T3L1/Hepa1-6 细胞上对ZAG过表达质粒pcDNA3.1（-）-mZAG和靶向敲减ZAG的含有ZAG-shRNA序列的质粒进行体外表达验证;然后分别将验证后的过表达/敲减质粒提供给山东维真生物科技公司和上海和元生物科技公司,进行ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装。2、ZAG-AAV8干预（ZAG过表达）对高脂喂养小鼠体重等的影响。首先选取8周龄雄性C57BL6/J小鼠12只,随机分为对照组,尾静脉低剂量组、尾静脉中剂量组、尾静脉高剂量组、皮下脂肪低剂量组、皮下脂肪高剂量组,进行ZAG-AAV8注射部位和剂量的摸索。然后选取40只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为普通饮食对照组（1组,n=10）、高脂饮食对照组（2组,n=10）、高脂饮食ZAG过表达组（3组,n=10）、高脂饮食阳性药组（4组,n=10）。1组、2组双侧及3组小鼠左侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL（浓度为1*1012vg）对照病毒,3组小鼠右侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL（浓度为1*1012vg）ZAG-AAV8病毒,4组行恩格列净（10mg/kg/d）灌胃给药,从实验干预当天开始,1组给予脂肪含量10%的普通饲料;其余3组给予脂肪含量45%的高脂饲料。4周后,行腹腔注射葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）和腹腔注射胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT）,7 周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标;用HE染色观察小鼠皮下脂肪细胞的形态;用免疫组织化学染色观察小鼠皮下脂肪组织中ZAG和解偶联蛋白1（uncoupling protein 1,UCP1）表达情况;用RT-qPCR的方法检测小鼠附睾脂肪和肝脏中ZAG和糖脂代谢相关基因的表达;另外,采用转录组测序技术（RNA sequencing,RNA-seq）,寻找上述1-3组小鼠皮下脂肪组织中差异表达的基因,并利用生物信息学软件,对差异基因进行信号通路和生物学功能等的分析。3、ZAG-shRNA-AAV8干预（ZAG敲减）对高脂喂养小鼠体重等的影响。选取21只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为对照组（浓度为1*1011vg,n=5）、极低剂量组（浓度为5*109vg,n=4）、低剂量组（浓度为5*1010vg,n=4）、中剂量组（浓度为2.5*1011vg,n=5）、高剂量组（浓度为1*1012vg,n=3）。各组小鼠均进行双侧腹股沟皮下脂肪组织注射,从实验干预当天开始,给予脂肪含量45%的高脂饲料。6周后,行IPGTT和IPITT,7周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标;用免疫组织化学染色观察小鼠皮下脂肪组织中ZAG和UCP1表达情况;用RT-qPCR的方法检测小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肝脏组织中ZAG和糖脂代谢相关基因的表达;采用RNA-seq技术,寻找1组和4组小鼠皮下脂肪组织中差异表达的基因,并利用生物信息学软件,对差异基因进行信号通路和生物学功能等的分析。4、ZAG-AAV8 干预（ZAG 过表达）和 ZAG-shRNA-AAV8 干预（ZAG 敲减）对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响。选取53只8周龄的雄性C57BL6/J小鼠,随机分为普通饮食对照组（n=10）和高脂饮食对照组（n=43）。8周后高脂饮食喂养肥胖小鼠模型建立成功后,再将小鼠分为普通饮食过表达对照组（1组,n=4）;高脂饮食过表达对照组（2组,n=11）;高脂饮食ZAG过表达组（3组,n=10）;普通饮食敲减对照组（4组,n=6）;高脂饮食敲减对照组（5组,n=10）;高脂饮食ZAG敲减组（6组,n=12）。1组和2组双侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL过表达对照病毒（浓度为5*1011vg）,4组和5组双侧腹股沟皮下脂肪组织均注射100μL敲减对照病毒（浓度为2.5*1011vg）,3组小鼠双侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL（浓度为5*1011vg）ZAG-AAV8病毒,6组小鼠双侧腹股沟皮下脂肪组织注射100μL（浓度为2.5*1011vg）ZAG-shRNA-AAV8病毒。7周后,行IPGTT和IPITT,8周后处死小鼠,测量小鼠体重、体脂及血生化指标。细胞实验主要分为以下2部分:1、建立稳转pcDNA3.1-mZAG的3T3L1前脂肪细胞株,观察在脂肪细胞诱导分化过程中ZAG内源性过表达对白色脂肪细胞棕色化相关基因表达的影响。2、将3T3L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞后,用不同浓度的人/鼠ZAG纯品干预,24小时后,观察外源性ZAG干预对分化成熟的3T3L1脂肪细胞白色脂肪棕色化相关基因表达的影响。[研究结果]动物实验的研究结果如下:1、ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建。与转染对照质粒即pcDNA3.1（-）组相比,转染pcDNA3.1（-）-mZAG后,3T3L1细胞中ZAG基因的表达明显增加,可达对照组的18.75倍（P<0.05）。将验证后的pcDNA3.1（-）-mZAG质粒提供给山东维真生物科技有限公司,进行ZAG-AAV8过表达腺相关病毒载体的构建和包装,最终公司提供对照病毒的滴度为5.31x1013vg/mL,ZAG-AAV8病毒滴度为5.21x1013vg/mL。另外,上海和元生物科技有限公司设计并构建的靶向ZAG敲减的shRNA1、shRNA2和shRNA3三个载体中,转染含有shRNA3序列GCCAACAAGAAGCTAGCAT的质粒的细胞,与转染对照质粒的细胞相比,3T3L1和Hepa1-6细胞中ZAG基因的mRNA表达明显降低,仅为对照组的34.40%和59.05%（P均<0.05）。进一步蛋白水平的研究也发现,转染ZAG-shRNA3质粒后,3T3L1和Hepa1-6细胞中ZAG蛋白的表达明显降低,仅为对照组的9.78%和43.81%（P均<0.05）。进一步将ZAG-shRNA3序列提供给上海和元生物科技有限公司,进行ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装,最终公司提供对照病毒的滴度为 1.73x1013vg/mL,ZAG-shRNA-AAV8 病毒滴度为 1.44x1013vg/mL。2、ZAG-AAV8干预（ZAG过表达）对高脂喂养小鼠体重等的影响。与尾静脉注射相比,皮下脂肪注射AAV8的效果更好。ZAG过表达可以降低高脂喂养小鼠的体重,减少皮下、肾周和棕色脂肪组织的重量。对皮下脂肪组织进行HE染色发现,与普通饮食对照组（1组）相比,高脂饮食对照组（2组）小鼠的皮下脂肪细胞体积明显增加,而ZAG-AAV8注射后,与高脂饮食对照组（2组）小鼠,不仅注射处即右侧皮下脂肪细胞体积明显减小,左侧皮下脂肪细胞体积也明显减小。另外,ZAG过表达可以改善高脂喂养小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性。IPGTT结果显示,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠60分钟、90分钟血糖及60-90分钟曲线下而积均显着低于高脂对照组（P均<0.05）;IPITT结果显示,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠30分钟血糖及0-30分钟曲线下面积均显着低于高脂对照组（P均<0.05）。血清生化指标的结果发现,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠血清游离脂肪酸明显升高,UA水平明显降低（P均<0.05）。免疫组化结果显示,与高脂饮食对照组（2组）小鼠相比,ZAG-AAV8皮下脂肪组织注射后,不仅注射处即右侧皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达明显增加,左侧皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达也明显增加。ZAG过表达后,高脂喂养小鼠附睾脂肪组织中ZAG的表达明显升高,可达高脂饮食对照组的69.53倍（P<0.05）;UCP1的表达有增高的趋势;FAS的表达明显降低,降低到高脂饮食对照组的60.96%（P<0.05）。RNA-seq结果发现,小鼠皮下脂肪中共发现6588个差异表达的基因,这些差异表达的基因富集的信号通路有统计学差异的一共有35个,包括脂肪细胞中脂质分解相关的信号通路、PI3K-Akt信号通路和产热相关信号通路等。3、ZAG-shRNA-AAV8干预（ZAG敲减）对高脂喂养小鼠体重等的影响。ZAG敲减后,高脂喂养小鼠的体重、附睾、肾周和棕色脂肪组织的重量有增加的趋势。另外,ZAG敲减后可以加重高脂喂养小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。IPGTT和IPITT结果显示,ZAG敲减后,高脂喂养小鼠0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟的血糖均较高脂对照组有升高的趋势。免疫组化结果显示,与高脂饮食对照组小鼠相比,ZAG敲减后,小鼠皮下脂肪中ZAG和UCP1的表达明显减少。组织水平的研究发现,ZAG敲减后,高脂喂养小鼠皮下和附睾脂肪组织中ZAG的表达有降低的趋势,分别降低到高脂饮食对照组的40.15%和83.18%。RNA-seq结果发现,ZAG敲减后,小鼠皮下脂肪组织中共发现160个差异表达的基因,这些差异表达的基因富集的信号通路有统计学差异的一共有3个。4、ZAG-AAV8 干预（ZAG 过表达）和 ZAG-shRNA-AAV8 干预（ZAG 敲减）对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响。对高脂饮食喂养肥胖的小鼠,ZAG过表达可以降低高脂喂养小鼠的体重,而ZAG敲减后,肥胖小鼠的体重有增加的趋势。ZAG过表达后,肥胖小鼠皮下、附睾、肾周脂肪组织重量有降低的趋势;而ZAG敲减后,上述脂肪组织重量有增加的趋势。另外,ZAG过表达可以改善肥胖小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性。IPGTT结果显示,ZAG过表达后,肥胖小鼠30分钟血糖及0-30分钟、30-60分钟曲线下面积均显着低于高脂对照组;IPITT结果显示,ZAG过表达后,肥胖小鼠30分钟、60分钟血糖及30-60分钟曲线下面积均显着低于高脂对照组（P均<0.05）。而ZAG敲减后,可以加重肥胖小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。IPGTT结果显示,ZAG敲减后,肥胖小鼠60分钟血糖及30-60分钟曲线下面积均显着高于高脂对照组;IPITT结果显示,ZAG敲减后,肥胖小鼠0分钟、120分钟血糖及0-30分钟曲线下面积均显着高于高脂对照组（P均<0.05）。血清生化指标的结果发现,ZAG过表达后,肥胖小鼠血清FBG和UA有降低的趋势。而ZAG敲减后,肥胖小鼠血清谷丙转氨酶水平明显升高,游离脂肪酸水平明显降低（P均<0.05）。细胞实验的研究结果如下:1、稳转pcDNA3.1（-）-mZAG后,细胞中UCP1、成纤维细胞生长因子21（fibroblast growthfactor21,FGF21）和白色脂肪棕色化相关基因,如过氧化物酶体增殖激活受体辅激活因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGClα）、细胞死亡诱导的 DEFFA 样效应子 α（celldeath-inducing DFFA-like effector α,CIDEA）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator-activatedreceptorgamma2,PPARγ2）的表达都有增加的趋势,分别可达对照组的2.41 倍、2.40 倍、1.18 倍、1.25 倍和 2.83 倍。2、将3T3L1细胞诱导分化成熟,加入不同浓度0μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL 的小鼠 ZAG 纯品作用 24 小时后,RT-qPCR 和 western blot结果均表明,5μg/mL的小鼠ZAG纯品作用24小时可显着增加诱导分化成熟的3T3L1细胞中白色脂肪棕色化相关基因,如UCP1、CIDEA和FGF21的表达水平（P>均<0.05）。另外,l0μg/mL的人ZAG纯品作用24小时后,诱导分化成熟的3T3L1细胞中UCP1的表达有升高的趋势,但是没有达到统计学差异。[研究结论]1、与尾静脉注射相比,皮下脂肪组织定点注射腺相关病毒载体的效果更好。ZAG-AAV8干预（ZAG过表达）后,小鼠皮下脂肪组织中ZAG的表达显着升高;ZAG-shRNA-AAV8干预（ZAG敲减）后,小鼠皮下脂肪组织中ZAG的表达显着降低。2、在肥胖发生过程中,ZAG过表达可降低高脂喂养小鼠的体重,减少小鼠皮下、肾周和棕色脂肪组织重量,改善高脂喂养小鼠的糖耐量,增加胰岛素的敏感性;而ZAG敲减后,高脂喂养小鼠的体重、附睾、肾周和棕色脂肪组织的重量有增加的趋势。ZAG的上述作用可能是通过激活脂肪细胞中脂质分解、PI3K-Akt和产热相关信号通路来实现。此外,ZAG过表达后,高脂喂养小鼠皮下脂肪组织中UCP1的表达有增高的趋势。细胞水平的研究结果也发现,稳转pcDNA3.1（-）-mZAG质粒的3T3L1前脂肪细胞诱导分化成熟后,细胞中白色脂肪棕色化相关基因的表达明显增加,提示白色脂肪组织棕色化可能是ZAG在肥胖发生过程中发挥作用的重要机制,并且这一作用可能是直接作用。3、在肥胖模型诱导形成后,ZAG过表达可降低肥胖小鼠的体重,减少肥胖小鼠的脂肪含量,改善肥胖小鼠的糖耐量,增加肥胖小鼠的胰岛素敏感性;而ZAG敲减可加重肥胖小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗。细胞水平的研究结果发现,外源性ZAG纯品干预,可促进诱导分化成熟的3T3L1细胞中白色脂肪组织棕色化相关基因的表达,提示白色脂肪组织棕色化是ZAG重要的作用机制之一,并且这一作用是直接作用。
谢亮亮[8]（2017）在《慢病毒介导的TREM1及LBP基因沉默对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞基因表达分子调控机制初步研究》文中提出革兰氏阴性菌种类繁多,以大肠杆菌、痢疾杆菌、布氏杆菌等为代表,由此引发的家畜炎症疾病可导致败血症、乳腺炎、生殖系统感染等,给畜牧养殖业带来极大损失。内毒素又名脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要毒力因子,能激活细胞膜上多种受体如TLRs进行跨膜及胞内信号传导,释放炎性介质,诱发机体过度炎症损伤。髓系细胞触发受体-1（TREM1）是一种细胞膜模式识别受体,通过TREM1/DAP12信号通路放大LPS炎症反应。脂多糖结合蛋白（LBP）具有LPS高亲和力,属于TLR4信号通路上游关键蛋白。TREM1和LBP均能级联扩大炎症信号,对LPS信号传导至关重要。研究表明,沉默或敲除TREM1或LBP基因表达,可显着降低炎性介质表达并控制过度炎症,且TREM1与TLR4信号通路存在协同互作。为了深入了解水牛TREM1和LBP基因在LPS致炎反应中的作用及其致炎信号传导分子调控机制,本研究以水牛外周血单核巨噬细胞为材料,以慢病毒载体介导的RNA干扰和转录组学技术为主要手段,研究体外抑制TREM1或LBP基因表达对LPS诱导下相关基因表达的影响及其分子调控机制,为提高水牛抗病能力奠定理论基础。主要研究结果:1、原代水牛外周血单核巨噬细胞的分离培养为了获取生长状态良好的水牛原代单核巨噬细胞,首先对其进行分离纯化,比较自体血清浓度对细胞贴壁生长状况的影响,利用墨汁吞噬、流式及qRT-PCR方法对纯化后细胞进行鉴定。结果显示,细胞在含有2.5%自体血清培养液中贴壁能力高于5%、7.5%;纯化细胞特异性表达TREM1及CD14基因,且流式鉴定细胞表面抗原CD14和MHC-Ⅱ 阳性率达98.50%。2、抑制TREM1基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响为了探讨抑制TREM1基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响,首先对TREM1-shRNA294重组质粒进行慢病毒包装,摸索靶细胞感染适宜条件,之后qRT-PCR和ELISA方法进行检测。结果显示,在病毒滴度>4×108IU/mL、感染指数（MOI）为300、感染时间为7d的条件下,细胞感染效率超过50%。与LPS对照组相比,感染组TREM1基因表达量降低69%,DAP12、TLR4、MYD88、TNF-α、IL-1β等基因表达显着降低（P<0.05）。TREM1-shRNA 组的 TNF-α含量（418.23 pg/mL）显着低于对照组（604.92 pg/mL,P<0.05）,且 IL-1β含量（230.65 pg/mL）亦显着低于对照组（387.12pg/mL,P<0.05）。3、抑制LBP基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达的影响为了探讨抑制LBP基因表达对LPS诱导下炎症相关基因的表达,采用上述相同方法,另以TREM1-sh294和LBP-sh774慢病毒联合感染细胞。结果显示,纯化病毒滴度>5 × 108IU/mL;与LPS组相比,感染组LBP、CD14、TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-8等基因表达显着降低（P<0.05）。上清液TNF-α、IL-1β及可溶性LBP（sLBP）的蛋白分泌含量均显着低于LPS组（P<0.05）。不同比例病毒组TREM1和LBP shRNA共同抑制实验结果表明:与LPS组相比,各比例组中TNF-α、IL-1β基因表达及蛋白分泌水平均显着降低（P<0.05）;当2:1联合感染时,Bcl-2基因表达显着降低而Caspase-3显着升高（P<0.05）;。4、TREM1/LBP基因表达下调的水牛单核巨噬细胞转录组学分析为了更全面解析TREM1/LBP基因沉默对LPS致炎信号传导的分子调控机制,利用RNA-seq方法对TREM1-sh、LBP-sh和NC（LPS单独刺激）3个微量细胞样本测序,应用生物信息学方法对差异表达基因分析,并对其进行qRT-PCR验证。结果发现,与NC组比较,TREM1-sh和LBP-sh组的差异表达显着变化基因分别为1355和897个;与LBP-sh组相比,TREM1-sh有2536个（P<0.001）。GO及KEGG富集分析,差异基因主要在细胞免疫、免疫过程、抗原递呈等生物进程,NF-kB、细胞因子互作等代谢路径富集;TREM1-sh亦富集于JAK/STAT、抗原递呈等。3个组两两比较中共同差异表达基因182个,其中9个与炎症反应相关,即NFKBIB、TNFRSF13B、TNFRSF17、IL-26、C5AR1、HIF1A、IL2RA、IL-8、MMP-9,可能通过参与 HIF-1A/C5AR1/细胞因子互作、STAT/TNFSF/NF-kB/IL-8/MMP-9、LBP/TREM1互作等信号传导路径来发挥联合抑制作用。以上结果表明,抑制TREM1/LBP基因表达可以有效降低LPS诱导下单核巨噬细胞炎症相关基因的表达,调控LPS炎症反应,TREM1信号通路与LBP信号传导路径之间存在协同互作关系。
周超颖[9]（2016）在《MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究》文中进行了进一步梳理结核病和人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）感染是全球最致命的慢性感染疾病。结核是HIV感染者发病率和死亡率升高的主要原因,也更容易在HIV感染人群中进行播散。据WHO统计报告,2013年全球新增结核病人900万,其中110万（13%）共感染HIV；全球结核死亡人数150万,其中1/4为合并感染HIV致死。在宿主中,结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）和HIV彼此加强相互作用,加快免疫功能的弱化或丧失。结核潜伏感染者,一旦再感染HIV,会加速破坏机体免疫系统,主要使CD4+T淋巴细胞的功能下降和数量减少,激活原本受抑制的MTB,使之更容易发展成活动性结核。同时,MTB通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白1 （monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）促进HIV的转录,加速病毒增殖,促使病情恶化。目前,MTB/HIV双重感染者的治疗主要是异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗的结合,其疗程长,多种药物相互作用,药物重叠的毒副作用大,易产生耐药性,病人服药依从性差,对这两种疾病同时有效的药物稀缺,整合异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战,以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此,亟需开发针对MTB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗MTB/HIV共感染的主要免疫机制是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明,抗原特异性CD8+T细胞在控制MTB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+T细胞通过以下两种途径来发挥作用：1)发挥细胞毒作用,通过穿孔素和颗粒酶B （granzyme B, GrB）途径直接杀伤感染靶细胞；2)释放Thl型细胞因子,如干扰素-γ （interferon-γ, IFN-γ）、肿瘤坏死因子-a （tumor necrosis factor-a, TNF-a）,抑制病原体复制,促进巨噬细胞清除胞内病原体。然而,在MTB/HIV共感染者体内,其免疫功能明显紊乱,表现为T细胞增殖反应下降,效应CD8+T细胞数量和反应水平均很低,白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）和IFN-γ产生显着减少。因此,通过过继转移大量效应CD8+T细胞至MTB/HIV共感染者体内,可增强其抗MTB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗MTB和HIV感染中显示了巨大潜力。Kitsukawa等利用灭活的结核菌体外致敏PBL,将其回输给多药耐药肺结核患者,取得良好疗效。Lieberman等将患者自体HIV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）过继回输治疗6例HIV感染者,最初2周所有患者CD4计数增加,5名患者血浆病毒血症减少。24周后,2名患者的HIV病毒负载继续减少,另1名患者CD4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景,但这种方法的广泛应用却存在许多障碍。首先,我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞,因为此时CTL反应是不断消耗的；接受长期治疗的个体也是如此,因为随着病原体负载减少,针对病原体的CTL反应也减少。另外,从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的,很难扩增。即使可以扩增,回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体（T cell receptor, TCR）基因修饰初始T细胞,人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力,短期内获得大量效应T细胞,则可有效解决这一问题。我们已经利用结核分枝杆菌38KDa抗原体外刺激正常人外周血CD4+和CD8+T细胞,获得38KDa抗原特异TCR,转导初始T细胞,修饰的T细胞具有显着的体外抗结核抗原活性。HIV-1 gag特异性TCR基因修饰CD8+T细胞的体外和体内活性也有报道。但是,用MTB和HIV-1抗原双特异的TCR对T细胞进行基因修饰尚未见报道。有研究者提出,在人初始T细胞池中,不同特异性的TCR种类<108,而潜在外源肽>1015,因此,TCR的数量与大量潜在的外源肽-MHC复合物相比,是相形见绌的。适应性T细胞免疫要求每个T细胞都能识别大量与细胞异常相关的潜在抗原肽,这种现象可以由T细胞的交叉反应性来解释。最近报道的从I型糖尿病患者分离的1E6 TCR具有非常大的交叉反应性。表达1E6 TCR的T细胞除了识别前胰岛素原来源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽（ALWGPDPAAA）以外,还至少对130万个十肽产生反应,反应强度与PPI15-24一样强烈。在这些大量肽中,活化表达1E6 TCR的T细胞时,RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性强100倍以上,尽管它与PPI15-24在组成上有七个氨基酸不一致。因此,我们完全有理由相信可以找到一个单一TCR同时识别两种抗原肽。本文首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染患者的免疫治疗提供新的思路。利用分别负载MTB肽Ag85B199-207 （KLVANNTRL）和HIV-1肽Env120-128 （KLTPLCVTL）的树突状细胞（dendritic cell, DC）反复刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T细胞,通过互补决定区3 （complementarity determining region 3, CDR3）谱型分析,筛选出同时对Ag85B 199-207和Env120-128特异的单一TCR,通过逆转录病毒载体将双特异TCR基因转导至普通CD8+T细胞中使其表达。研究结果显示,双特异TCR基因修饰的CD8+T细胞既可针对Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、 TNF-α和GrB分泌及特异性杀伤,同时也可针对Env120-128产生显着的效应反应。本研究为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。方法1.筛选Ag85B199-207和Env120-128双特异TCR1)采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）;2) PBMC贴壁培养2h后,吸出悬浮细胞,往贴壁细胞中加入100ng/mL重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF）和100 ng/mL重组人白细胞介素-4 （recombinant human interleukin-4, rhIL-4）诱导DC；3)MTB肽Ag85B199-207 （50 μg/mL）和HIV-1肽Env120-128 （50μg/mL）分别冲击致敏DC；4)利用分别负载Ag85B199-207和Env120-128抗原肽的DC诱导抗原特异T细胞发生克隆扩增；5)经过两轮刺激后,磁珠分选CD8+T细胞,提取mRNA,逆转录为cDNA；6)CDR3谱型分析检测刺激前后CDR3谱型,找出刺激后均呈单克隆增生的Ag85B199-207和Env120-128双特异的TCRα、β基因家族。2.重组逆转录病毒载体构建与病毒滴度测定1)根据NCBI网站GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区（variable region, V）和下游恒定区（constant region, C）基因序列,设计TCR α和β链全长基因上、下游引物,扩增出Ag85B199-207和Env120-128双特异的α17和p15基因；2)根据文献报道的影响外源TCR基因表达和功能的C区9个关键氨基酸序列,分别设计α和β链C区突变位点上、下游引物,利用重组PCR方法将TCRα、β链C区9个关键氨基酸进行替换；3)利用重组PCR技术,将TCRα和p基因通过自剪切多肽P2A连接,测序鉴定正确后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；4)采用脂质体转染法,将重组逆转录病毒表达载体pMX-β 15-P2A-α 17-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞；5)收集转染后48 h病毒上清,低温超速离心浓缩纯化重组病毒,分装后保存于-80℃;6)重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测其感染性滴度,计算公式：病毒感染性滴度（GFU/mL）=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量（mL）。3.TCR基因修饰CD8+T细胞1)采用Ficoll密度梯度离心法,分离HLA-A*0201型健康人外周血PBMC;2)磁珠分选CD8+T细胞；3)联合使用抗CD3 （1μg/mL）、抗CD28 （1μg/mL）单抗和IL-2 （100U/mL）活化刺激分选出的CD8+T细胞；4)以最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）,,即MOI=13将重组逆转录病毒pMX-β15-P2A-α17-IRES-GFP感染CD8+T细胞；5)IL-2刺激感染后的CD8+T细胞；6)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的GFP表达阳性率；7)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的MHC dextramer阳性率；8)实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR, qRT-PCR）检测病毒感染后CD8+T细胞的β15-P2A-α17的基因水平。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性测定按已摸索好的效靶比（effector:target, E:T）,将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207或H1V-1肽Env120-128的DC共培养。实验组设置如下：① Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原肽的DC; ②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC;③NV+DC-HW：未转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC；⑤ Vector+DC-HIV:空载体转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Envi20-128的DC;⑥ Vector plus TCR+DC-CMV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载CMV肽pp65495-503的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-HIV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC。利用酶联免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、GrB的分泌水平；利用时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmuno assay, TRFIA）检测CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性；利用ELISA检测TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ分泌的剂量效应；利用胞内细胞因子染色法（intracellular cytokine staining, ICS）检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性测定按已摸索好的E：T,将TCR基因修饰CD8+T细胞与转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养。实验组设置如下：①Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原的DC;②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;③NV+DC-Env:未转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;⑤ Vector+DC-Env:空载体转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；⑥ Vector plus TCR+DC-OVA:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCI-OVA质粒的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-Env:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC。利用ELISA检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、 GrB的分泌水平;利用TRFIA检测CD8+T细胞对负载抗原DC的杀伤活性。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定接种不表达TCR的Jurkat T细胞系J.RT3-T3.5细胞,按MOI为0、1、5、10、20、50分别加入重组逆转录病毒浓缩液,测定最适MOI值。按最适MOI值加入病毒感染J.RT3-T3.5细胞,与负载不同浓度（0、0.01、0.1、1、10μg/mL）的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,标记APC-CD69抗体,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞的CD69表达。7.统计学分析采用Windows SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。所有计量资料用平均值±标准差（x±s）表示;采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较CD8+T细胞的细胞因子分泌水平和杀伤水平,方差不齐时采用Welch进行校正；多重比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Dunnett T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。结果1.分析抗原肽刺激前后CDR3谱型,筛选出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异TCR通过对CDR3谱型进行分析发现,抗原肽刺激前健康志愿者外周血T细胞各TCR Vα （α chain variable gene）、Vβ （β chain variable gene）基因家族CDR3谱型均呈8个或8个以上峰型的高斯分布,表现为多克隆性。而抗原肽刺激后,部分TCR基因家族的CDR3谱型发生改变,呈偏态分布甚至单峰分布,表明这些家族是因为抗原肽的持续刺激而引起的寡克隆或单克隆增生。通过比较刺激前、后的CDR3谱型,我们在CD8+T细胞中找到了刺激前为多克隆,刺激后呈单克隆扩增,针对MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128都特异的Vα17和Vβ15基因家族。2.构建重组逆转录病毒表达载体成功扩增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异的α17和β15全长基因片段,将其克隆至pGEM-T载体后测序鉴定,其V、C区DNA序列与GeneBank报道的序列完全一致。利用重组PCR技术,将人Cα、Cβ区9个关键位点的氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸,扩增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP载体,构建重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ5mCβ-P2 A-hVα17mCα-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将上述表达质粒与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,收集48 h病毒上清,经低温超速离心浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测NIH3T3细胞GFP表达阳性率,经计算,重组病毒滴度为1.08×l08GFU/mL。3.TCR基因修饰CD8+T细胞按MOI=13,将重组逆转录病毒颗粒感染CD8+T细胞,感染5天后,在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,利用流式细胞术检测CD8+T细胞的dextramer阳性率。结果显示,在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光,TCR基因修饰CD8+T细胞的MTB dextramer和HIV-1 dextramer双阳性率约为10%。收集感染5天后的CD8+T细胞,提取RNA,并逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TCR基因修饰CD8+T细胞的β15-P2A-a17的基因表达水平,结果显示,TCR载体转染组β15-P2A-α17的基因水平显着高于未转染组和空载体转染组。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-y分泌水平按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和负载HIV-1肽组（Vector plus TCR+DC-HIV组）的IFN-y分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=50668.981,P=0.000；F=4097.071,P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（598.530 ± 3.621 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-HIV组（323.584 ± 6.870 pg/mL）的IFN-y分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.001）。2)TCR基因修饰CD8+T细胞的TNF-α分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和负载HIV-1肽组（Vector plus TCR+DC-HIV组）的TNF-a分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=2173.051, P=0.000; F=393.708, P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（566.531±19.548 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-HIV组（354.622 ± 28.604 pg/mL）的TNF-a分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.01）。3)TCR基因修饰CD8+T细胞的GrB分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和负载HIV-1肽组（Vector plus TCR+DC-HIV组）的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=2757.830,P=0.000; F=3601.843,P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（413.818 ± 12.507 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-HIV组（375.823 ± 9.654 pg/mL）的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.01）。4)TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养4 h,TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性。结果显示,负载MTB肽组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和负载HIV-1肽组（Vector plus TCR+DC-HIV组）的杀伤水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=1708.411, P=0.000; F=114.198,P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（31.107±1.140%）和Vector plus TCR+DC-HIV组（21.280±2.862%）的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.05）。5)TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-y分泌的剂量效应按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载不同浓度的MTB肽Ag85B 199-207或HIV--1肽Env120-128的DC共培养18 h, ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,TCR载体转染组的IFN-γ分泌水平在MTB肽或HIV-1肽浓度为0.01 μg/mL时即可检测得到,并且随MTB肽或HIV-1肽浓度的增加而升高,呈现出明显的剂量效应；而未转染组和空载体转染组在每一个肽浓度均没有检测到显着的IFN-γ分泌。6)ICS检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128或CMV肽pp65495-503的DC共培养,利用ICS检测CD8+T细胞的胞内IFN-γ分泌。结果显示,在TCR载体转染组中,通过DC递呈MTB肽Ag85B199-207后,超过5%的TCR基因修饰CD8+T细胞为CD8和IFN-γ双阳性；通过DC递呈HIV-1肽Env120-128后,超过2%的TCR基因修饰CD8+T细胞共表达CD8和IFN-γ;通过DC递呈无关肽CMV pp65495-503后,只有很低水平的双阳性CD8+T细胞可检测到；而在未转染组和空载体转染组中,双阳性CD8+T细胞的水平均很低。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的IFN-γ分泌按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和转染pCAGGS-Env质粒组（Vector plus TCR+DC-Env组）的IFN-γ分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=1545.061,P=0.000; F=1611.016, P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（338.280 ± 13.919 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-Env组（236.875 ± 7.979 pg/mL）的IFN-γ分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.001）。2)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的TNF-a分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中TNF-a的分泌水平。结果显示,转染pViJ.ns-tPA-Ag85B质粒组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和转染pCAGGS-Env质粒组（Vector plus TCR+DC-Env组）的TNF-α分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=1648.189,P=0.000; F=341.302, P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（307.088 ± 6.695 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-Env组（187.847±11.278 pg/mL）的TNF-α分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.001）。3)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的GrB分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和转染pCAGGS-Env质粒组（Vector plus TCR+DC-Env组）的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=99.449,P=0.000；F=149.589,P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组（289.289 ± 53.946 pg/mL）和Vector plus TCR+DC-Env组（263.086 ± 39.756 pg/mL）的GrB分泌水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.05）。4)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养4h, TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原的DC的杀伤活性。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组（Vector plus TCR+DC-MTB组）和转染pCAGGS-Env质粒组（Vector plus TCR+DC-Env组）的杀伤水平组间差异均具有统计学意义（F值和P值分别为F=803.014, P=0.000; F=235.995, P=0.000）。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组 （25.663 ± 0.655%）和Vector plus TCR+DC-Env组（15.054±0.696%）的杀伤水平分别显着高于各自的四个对照组（P值均<0.001）。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定按不同MOI值,将重组逆转录病毒颗粒感染J.RT3-T3.5细胞,流式细胞术结果显示,MOI=5时,J.RT3-T3.5细胞的GFP阳性率最高,在感染后第3天达52.7%。将TCR基因修饰的J.RT3-T3.5细胞与负载不同浓度的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞CD69的表达。结果显示,通过对GFP阳性的细胞群进行分析,在TCR载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对MTB肽和HIV-1肽均有反应,其早期活化标志CD69的表达在肽浓度为0.01 μg/mL时即有明显升高,且随着肽浓度的增加而增加,表现出明显的剂量效应；但在空载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对每一个浓度的MTB肽和HIV-1肽均没有明显反应,其CD69表达均没有明显升高。结论本研究利用分别负载MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反复刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T细胞,通过CDR3谱型分析,获得针对这两种抗原肽共同特异的单个TCR。通过逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP介导,将该双特异TCR转导至初始CD8+T细胞,人为赋予其识别特异性抗原的能力。由于外源性TCRα、β链可能与内源性TCRα、β链发生错配,因此,为了减少错配机率,同时增加外源性TCR的表达和功能,我们对双特异TCR进行最小突变,即将人C区9个关键位点氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸。我们将最小突变的双特异TCR基因转导自体CD8+T细胞并检测其活性,结果表明该TCR基因修饰的CD8+T细胞具有双特异性,既可针对MTB肽Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌及杀伤活性,又可针对HIV-1肽Env120-128产生显着的效应反应。本研究首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗提供了新的思路,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。
龙雨清[10]（2015）在《mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究》文中认为黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤,占恶性肿瘤的1%3%,恶性程度高,转移早且发生广泛,对传统的治疗方法有较强的抗性,是临床治疗上一种颇为棘手的恶性肿瘤。由于黑色素瘤常发生在皮肤,易于观察,因此非常适用于基因治疗的研究。随着分子生物学、基因组学、免疫学、病理学以及相关学科的快速发展,以基因治疗为主线的治疗方法逐渐成为肿瘤学的研究热点。目前,腺病毒（Adenovirus,Ad）载体疗法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一,它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中,载体的构建和操作简单,宿主范围广,感染性强,可经不同途径进入不同组织,还能感染分化后的非分裂期细胞。本研究选择新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）的血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin neuraminidase,HN）基因作为黑色素瘤的治疗基因。大量研究结果表明,HN蛋白是NDV发挥抗肿瘤作用的主要成分,HN蛋白不仅具有介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起辅助病毒侵入肿瘤细胞的作用,还具有神经氨酸酶活性,能水解宿主细胞表面的唾液酸,暴露宿主细胞的生物识别位点,促进抗原递呈,引起肿瘤周围的细胞因子和化学因子生成增加,引发淋巴细胞、单核细胞浸润等。为了强化HN基因对黑色素瘤的治疗效果,研究中利用端粒酶启动子和酪氨酸酶双启动子来调控治疗基因HN的表达。端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是负责端粒酶催化活性最重要的组分。端粒酶活性的变化与细胞的衰老和肿瘤的发生息息相关。TERT表达于90%以上的肿瘤,大多数人类和小鼠的癌症或肿瘤衍生的细胞系中都有端粒酶活性的高表达,因而是广谱的肿瘤标志物。酪氨酸酶（Tyrosinase,Tyr）是黑色素瘤形成过程中的一种关键酶,其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量,该酶活性过高会导致色斑及黑色素瘤的形成。大量研究发现Tyr启动子只在黑色素瘤细胞中特异性表达,而在其他组织中不表达。因此,TERT和Tyr具有调控下游治疗基因HN的特性。本研究根据Gen Bank中mTERT基因序列（AF157502.1）、mTyr基因序列（D00439.1）和NDV HN cDNA序列（EF211815.1）,设计一对PCR扩增引物和两对RT-PCR扩增引物,分别从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和pShuttle-CMV-HN质粒中扩增出目的片段;将目的片段分别连接于pMD-19T载体,命名为pMD-mTERTp、pMD-mTyrp、pMD-HN;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切,用T4酶连接并构建重组穿梭载体;线性化重组穿梭载体与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,经鉴定正确后,将重组腺病毒质粒经脂质体转染HEK293细胞,包装出能表达HN基因的由双启动子调控的特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN;经RT-PCR、Western blotting鉴定及测序分析后,经CsCl密度梯度超速离心法大量纯化病毒颗粒,以TCID50方法测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的最终滴度分别为1011.25TCID50/mL、1012.52.5 TCID50/mL、1011.625 TCID50/m L、1011.875 TCID50/m L和1012.125 TCID50/mL,符合后续的抑瘤实验所需病毒要求;通过Hochest33342/PI染色实验证实构建的重组腺病毒能够感染B16细胞;MTT试验结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值,且抑制率显着大于其他对照组重组腺病毒,Western blotting检测到HN蛋白在B16细胞中的表达,经流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为28.03±0.45%、48.36±0.95%、39.12±0.78%、58.39±1.47%、19.05±0.89%。本研究的创新之处在于,首次结合端粒酶逆转录酶启动子与酪氨酸酶启动子的肿瘤特异性和组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性,成功构建出融合表达上述基因的Ad-mTERTp-Tyrp-HN,为下一步利用重组腺病毒在体外诱导肿瘤细胞凋亡及研制动物肿瘤性疾病的广谱疫苗奠定了理论和实验基础。
二、615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装（论文提纲范文）
（1）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（3）环形RNA circRNA000203调控miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴促进心肌肥厚的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 circRNA_000203在Ang-Ⅱ诱导的肥厚小鼠心肌中表达和鉴定 |
| 1.1 实验仪器和材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 circRNA_000203在心肌肥厚模型和心力衰竭患者心肌组织中的表达情况 |
| 1.3.2 circRNA_000203分子特性鉴定 |
| 1.3.3 circRNA_000203在心肌细胞内的分布特征 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 circRNA_000203对心肌肥厚表型的影响 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 过表达circRNA_000203对小鼠心肌细胞肥大的影响 |
| 2.3.2 心肌特异过表达circRNA_000203对小鼠心肌肥厚的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 circRNA_000203通过miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴促心肌肥厚的作用 |
| 3.1 实验仪器和材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 circRNA_000203对miR-26b-5p、miR-140-3p的特异结合作用 |
| 3.3.2 miR-26b-5p和miR-140-3p靶基因Gata4的鉴定 |
| 3.3.3 miR-26b-5p、miR-140-3p和Gata4介导circRNA_000203发挥促心肌肥厚作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 NF-κB信号通路介导circRNA_000203高表达 |
| 4.1 实验仪器和材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 NF-κB信号通路激活增加circRNA_000203表达水平 |
| 4.3.2 转录因子NF-κB p65介导circRNA_000203宿主基因Myo9a的转录激活 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 本文使用的PCR引物序列 |
| 2 缩略词 |
| 攻读博士学位期间的成果 |
| 致谢 |
（4）绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 OPA国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.2.1 OPA的分布 |
| 1.2.2 OPA人工感染模型及JSRV啮齿动物模型构建 |
| 1.2.3 OPA的预防和控制 |
| 1.3 JSRV国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.3.1 JSRV的复制 |
| 1.3.2 JSRV的致瘤机制 |
| 1.4 细胞自噬国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.4.1 细胞自噬的分类 |
| 1.4.2 细胞自噬形成过程与自噬相关基因(ATG)调控 |
| 1.4.3 病毒感染与细胞自噬 |
| 1.4.4 肿瘤与细胞自噬 |
| 1.4.5 自噬研究方法 |
| 1.4.6 调节自噬作用的相关药物 |
| 1.5 本研究拟解决的关键问题 |
| 1.6 本研究的意义 |
| 1.7 本试验技术路线 |
| 2 试验一 自然感染绵羊肺腺瘤肺组织的转录组测序分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验分析软件 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 自然感染OPA病理解剖学和组织病理学特征 |
| 2.2.2 自然感染OPA病例JSRV Env的表达检测 |
| 2.2.3 OPA和健康羊肺组织高质量测序数据的产生和筛选 |
| 2.2.4 自然感染OPA和健康对照之间的转录本比较概况 |
| 2.2.5 DEGs的GO富集分析 |
| 2.2.6 DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.2.7 自然感染OPA中上调和下调功能模块分析 |
| 2.2.8 通过RT-qPCR验证RNA-Seq结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 典型OPA病例筛选 |
| 2.3.2 转录组数据分析处理 |
| 2.3.3 差异表达基因筛选 |
| 2.3.4 DEGs富集的生物学功能 |
| 2.3.5 DEGs富集的信号转导通路 |
| 2.3.6 OPA分子致癌机制 |
| 2.4 小结 |
| 3 试验二 JSRV env慢病毒表达载体的构建及最佳转染效率测试 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞与载体 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 重组慢病毒载体构建 |
| 3.2.2 JSRV env重组慢病毒包装 |
| 3.2.3 纯化的重组慢病毒滴度测定 |
| 3.2.4 JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 OPA病原分离与复制 |
| 3.3.2 基因过表达基本方式 |
| 3.3.3 慢病毒载体与真核质粒的比较 |
| 3.3.4 JSRV env过表达载体优势 |
| 3.4 小结 |
| 4 试验三 慢病毒介导JSRV env过表达对细胞增殖及迁移侵袭的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 |
| 4.2.2 细胞划痕试验 |
| 4.2.3 Transwell侵袭试验 |
| 4.2.4 琼脂糖克隆形成试验 |
| 4.2.5 裸鼠成瘤试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 JSRV Env引起的细胞增殖作用 |
| 4.3.2 JSRV Env引起的细胞转化 |
| 4.3.3 JSRV Env引起的皮下肿瘤 |
| 4.4 小结 |
| 5 试验四 JSRV Env转化细胞相关自噬因子及自噬体检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验组织及细胞 |
| 5.1.2 抗体 |
| 5.1.3 试验耗材及仪器 |
| 5.1.4 试验试剂 |
| 5.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 5.1.6 试验方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 OPA肺组织自噬因子表达分布 |
| 5.2.2 OPA肺组织自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.3 JSRV Env过表达细胞自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.4 JSRV Env与Beclin-1互作 |
| 5.2.5 透射电镜观察JSRV Env转化细胞中的自噬体 |
| 5.2.6 CYTO-ID(?)自噬检测试剂盒检测自噬体 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 细胞自噬因子检测 |
| 5.3.2 自噬体的观察研究 |
| 5.3.3 细胞自噬与病毒感染 |
| 5.4 小结 |
| 6 试验五 JSRV Env转化细胞自噬流通状态检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验细胞 |
| 6.1.2 抗体 |
| 6.1.3 试验耗材及仪器 |
| 6.1.4 试验试剂 |
| 6.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 6.1.6 试验方法 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 P62降解试验 |
| 6.2.2 LC3 Ⅱ turnover试验 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 细胞自噬流的检测 |
| 6.3.2 自噬与细胞稳态 |
| 6.3.3 病毒感染与细胞自噬流变化 |
| 6.4 小结 |
| 7 试验六 雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤调控细胞自噬影响JSRV Env肿瘤形成 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验组织及细胞 |
| 7.1.2 抗体 |
| 7.1.3 试验耗材及仪器 |
| 7.1.4 试验试剂 |
| 7.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 7.1.6 试验方法 |
| 7.2 试验结果 |
| 7.2.1 JSRV Env皮下移植瘤模型构建 |
| 7.2.2 裸鼠腹腔给药试验 |
| 7.2.3 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤Western blotting检测 |
| 7.2.4 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤病理组织学观察 |
| 7.2.5 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤免疫组织化学观察 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 肿瘤的发生发展 |
| 7.3.2 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤生成 |
| 7.3.3 肿瘤与细胞自噬 |
| 7.3.4 细胞自噬在肿瘤治疗中的应用 |
| 7.4 小结 |
| 8 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）IL-7重组痘病毒实验性治疗小鼠肠癌模型的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 1.肿瘤微环境 |
| 2.溶瘤病毒 |
| 3.白细胞介素-7 |
| 4.本论文拟研究的科学问题 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠结直肠癌细胞株并构建荷瘤小鼠模型 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IL-7重组痘病毒对小鼠结直肠癌模型治疗作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结与展望 |
| 攻读硕士学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获得的基金资助 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（6）家蚕杆状病毒表达的鸡干扰素的应用和该病毒用于A型血友病基因治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽类干扰素的研究进展 |
| 1.1.1 干扰素的分类 |
| 1.1.2 禽类Ⅰ型干扰素 |
| 1.1.3 禽类Ⅱ型干扰素 |
| 1.1.4 禽类Ⅲ型干扰素 |
| 1.1.5 禽类干扰素抗病毒的分子机制 |
| 1.2 新城疫病毒 |
| 1.2.1 新城疫病毒 |
| 1.2.2 新城疫病毒对Ⅰ型干扰素的抑制作用 |
| 1.3 血友病及其治疗 |
| 1.3.1 血友病现状 |
| 1.3.2 血友病的治疗 |
| 1.4 杆状病毒与基因治疗 |
| 1.4.1 基因治疗 |
| 1.4.2 基因治疗使用的主要病毒载体 |
| 1.4.3 杆状病毒在基因治疗中的应用前景 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 第二章 鸡干扰素在CEF中抗NDV的分子机制探讨 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 不同组合鸡干扰素对NDV的抑制 |
| 2.2.2 不同试验组CEF的 Illumina RNA-Seq |
| 2.2.3 在干扰素抗NDV试验中不同组组别之间的差异表达基因 |
| 2.2.4 差异基因的GO富集和KEGG富集分析 |
| 2.2.5 在差异基因中相关抗病毒基因的蛋白互作网络 |
| 2.2.6 ch IFN-γ+NDV组与NDV组之间的比较分析 |
| 2.2.7 主要差异表达基因的qPCR验证 |
| 2.3 本章讨论 |
| 2.3.1 不同干扰素在CEF中对NDV抗性的差异 |
| 2.3.2 ch IFN-γ在 CEF中抗NDV的可能分子机制的探究 |
| 第三章 复合表达鸡干扰素的抗病毒活性及对肉鸡生长影响的分子机制探讨 |
| 3.1 材料及方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 AA肉鸡口服ch IFN-γ吸收情况检测 |
| 3.2.2 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素对AA肉鸡的体重及采食量的影响 |
| 3.2.3 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素处理CEF组与对照组之间的差异表达基因分析 |
| 3.2.4 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素AA肉鸡注射组与对照组之间的差异表达基因分析 |
| 3.2.5 ch IFN-α和 ch IFN-γ复合表达干扰素AA肉鸡口服组与对照组之间的差异表达基因分析 |
| 3.2.6 CEF组的差异基因GO富集和KEGG富集分析 |
| 3.2.7 AA肉鸡口服组及注射组差异基因GO富集与KEGG富集分析 |
| 3.2.8 主要差异表达基因的qPCR验证 |
| 3.3 本章讨论 |
| 3.3.1 干扰素在CEF及AA肉鸡中显示出的抗病毒活性分析 |
| 3.3.2 AA肉鸡在使用干扰素后体重及进食量变化的可能原因分析 |
| 第四章 家蚕杆状病毒在A型血友病基因治疗中的应用 |
| 4.1 材料及方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 基因呈递用重组杆状病质量检测 |
| 4.2.2 重组杆状病毒向HEK293T人肾上皮细胞系中呈递FⅧ |
| 4.2.3 重组杆状病毒向基因敲除小鼠体内呈递FⅧ |
| 4.2.4 小鼠血清中FⅧ抑制因子(中和抗体)检测 |
| 4.3 本章讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 小鼠基因型鉴定 |
| 附录B 试验中所用引物 |
| 附录C 试验中使用的 FⅧ序列 |
| 附录D 抗NDV试验 DEGs |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）新型脂肪细胞因子锌-α2-糖蛋白与肥胖关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 不同代谢状态的肥胖患者血清ZAG水平的变化 |
| 一、前言 |
| 二、技术路线图 |
| 三、对象与方法 |
| 一、研究对象 |
| 1. 纳入与排除标准 |
| 2. 研究分组 |
| 二、研究方法 |
| 1. 临床资料收集 |
| 2. 生化指标检测 |
| 3. 胰岛素抵抗的评估指标 |
| 4. 血清脂肪因子的测量 |
| 5. 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. 研究对象的基本特征 |
| 2. 研究对象的血清脂肪因子的水平 |
| 3. 血清脂肪因子与临床及血生化指标的相关性分析 |
| 4. 血清脂肪因子影响因素线性回归分析 |
| 5. 不同血清脂肪因子水平代谢异常的发生率 |
| 6. 血清脂肪因子对代谢正常和代谢异常区分的效能 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 ZAG过表达/敲减在小鼠肥胖发生/肥胖形成后的作用及其机制的研究 |
| 一、前言 |
| 二、技术路线图 |
| 三、材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 细胞系 |
| 2. 质粒 |
| 3. ZAG纯品 |
| 4. 实验动物及饲料 |
| 5. 主要试剂和耗材 |
| 6. 主要抗体和RT-qPCR反应引物 |
| 7. 主要仪器 |
| 8. 常用试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| (一) 动物实验 |
| 1. ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装 |
| 1.1 ZAG过表达质粒的构建和验证 |
| 1.2 ZAG敲减质粒的构建和验证 |
| 1.3 ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装 |
| 2. ZAG-AAV8干预(ZAG过表达)对高脂喂养小鼠体重等的影响 |
| 2.1 ZAG-AAV8注射部位和剂量的探索 |
| 2.2 ZAG-AAV8干预对高脂喂养小鼠体重等的影响的正式实验 |
| 3. ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对高脂喂养小鼠体重等的影响 |
| 4. ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8干预对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响 |
| 4.1 高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的建立 |
| 4.2 ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8干预对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响 |
| (二) 细胞实验 |
| 1. 内源性ZAG过表达对3T3-L1脂肪细胞棕色化相关基因表达的影响 |
| 1.1 3T3-L1稳定转染ZAG表达质粒细胞系的建立 |
| 1.2 诱导分化稳定转染ZAG表达质粒细胞系,观察棕色化相关基因的表达变化 |
| 2. 外源性ZAG干预对3T3-L1脂肪细胞白色脂肪棕色化相关基因表达的影响 |
| 2.1 不同浓度鼠ZAG纯品对诱导分化成熟的3T3L1细胞棕色化基因的影响 |
| 2.2 不同浓度人ZAG纯品对诱导分化成熟的3T3L1细胞棕色化基因的影响 |
| (三) 统计学分析 |
| 结果 |
| (一) 动物实验 |
| 1. ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装 |
| 1.1 过表达/敲减质粒在3T3L1/Hepa1-6细胞中验证结果 |
| 1.2 ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8病毒载体的构建和包装 |
| 2. ZAG-AAV8对高脂喂养小鼠体重等的影响 |
| 2.1 ZAG-AAV8注射部位和剂量的探索 |
| 2.2 ZAG-AAV8干预(ZAG过表达)对高脂喂养小鼠体重等的影响的正式实验 |
| 3. ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对高脂喂养小鼠体重等的影响 |
| 3.1 ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对小鼠体重的影响 |
| 3.2 ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对小鼠脂肪含量的影响 |
| 3.3 ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对小鼠胰岛素敏感性的影响 |
| 3.4 ZAG-shRNA-AAV8干预(ZAG敲减)对小鼠血清生化指标的影响 |
| 3.5 ZAG-shRNA-AAV8干预对小鼠脂肪组织中ZAG和UCP1表达的影响 |
| 3.6 ZAG-shRNA-AAV8干预对小鼠肝脏组织中脂代谢相关基因表达的影响 |
| 3.7 ZAG-shRNA-AAV8干预对小鼠腹股沟皮下脂肪组织mRNA表达谱的影响 |
| 4. ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8干预对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响 |
| 4.1 高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的建立 |
| 4.2 ZAG-AAV8和ZAG-shRNA-AAV8干预对高脂诱导肥胖小鼠体重等的影响 |
| (二) 细胞实验 |
| 1. 内源性ZAG过表达对3T3-L1脂肪细胞棕色化相关基因表达的影响 |
| 1.1 3T3-L1稳定转染ZAG表达质粒细胞系的建立 |
| 1.2 诱导分化稳定转染ZAG表达质粒细胞系,观察棕色化相关基因的变化 |
| 2. 外源性ZAG干预对3T3-L1脂肪细胞棕色化相关基因表达的影响 |
| 2.1 不同浓度鼠ZAG纯品对诱导分化成熟的3T3L1细胞棕色化基因的影响 |
| 2.2 不同浓度人ZAG纯品对诱导分化成熟的3T3L1细胞棕色化基因的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（8）慢病毒介导的TREM1及LBP基因沉默对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞基因表达分子调控机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 髓样细胞触发受体1的研究进展 |
| 1.1.1 TREM1的结构 |
| 1.1.2 TREM1相关信号通路 |
| 1.1.3 抑制TREM1实验研究 |
| 1.1.4 TREM1的功能 |
| 1.1.5 TREM1与炎症性疾病关系 |
| 1.2 脂多糖结合蛋白的研究现状 |
| 1.2.1 LBP的结构 |
| 1.2.2 LBP的信号通路 |
| 1.2.3 LBP的功能 |
| 1.2.4 LBP在感染及炎症中的作用 |
| 1.2.5 LBP多态性临床研究 |
| 1.3 慢病毒载体介导RNA干扰的应用及前景 |
| 1.3.1 该技术的发现 |
| 1.3.2 该技术分子机制 |
| 1.3.3该技术的应用 |
| 1.3.4 基于慢病毒载体的RNAi |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 原代水牛单核巨噬细胞的分离培养 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 原代PBMC细胞分离效果比较 |
| 2.2.2 不同血清浓度培养对细胞生长的影响 |
| 2.2.3 单核巨噬细胞的原代培养 |
| 2.2.4 水牛单核巨噬细胞鉴定 |
| 2.2.5 水牛单核巨噬细胞TREM1及CD14基因表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 抑制TREM1基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞炎症相关基因表达影响的研究 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 水牛TREM1-shRNA慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 LPS不同浓度及刺激时间对单核巨噬细胞的影响 |
| 3.2.3 TREM1-shRNA慢病毒感染单核巨噬细胞条件优化 |
| 3.2.4 基因沉默TREM1对单核巨噬细胞相关基因表达的影响 |
| 3.2.5 TREM1基因沉默对TNF-α及IL-1β细胞因子分泌水平的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 抑制LBP基因表达对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞相关基因表达影响的研究 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 LBP-shRNA慢病毒载体包装及滴度测定 |
| 4.2.2 LBP-shRNA慢病毒感染细胞最佳条件的摸索 |
| 4.2.3 LBP基因沉默对单核巨噬细胞LBP基因及相关基因表达的影响 |
| 4.2.4 ELISA检测相关基因的蛋白表达水平 |
| 4.2.5 TREM1和LBP双基因慢病毒联合感染对水牛单核巨噬细胞的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 TREM1/LBP基因表达下调的水牛单核巨噬细胞转录组学分析 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验仪器设备及试剂 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 微量样品处理及收集 |
| 5.1.4 测序基本流程 |
| 5.1.5 测序数据质量评估 |
| 5.1.6 基因表达数据分析 |
| 5.1.7 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 5.1.8 ELISA检测外源蛋白 |
| 5.1.9 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 总RNA质量检测 |
| 5.2.2 测序数据质量评估 |
| 5.2.3 参考序列比对分析 |
| 5.2.4 基因表达水平分析 |
| 5.2.5 RNA-seq相关性分析 |
| 5.2.6 基因差异表达分析 |
| 5.2.7 差异基因功能分析 |
| 5.2.8 qRT-PCR验证表达差异基因准确性 |
| 5.2.9 ELISA检测外源蛋白分泌情况 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（9）MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 筛选MTB肽Ag85B_(199-207)和HIV-1肽Env_(120-128)双特异TCR |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第二章 构建重组逆转录病毒表达载体 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 第三章 双特异TCR基因修饰CD8~+T细胞及其活性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 参与的科研项目和发表的相关论文 |
| 致谢 |
（10）mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 端粒酶逆转录酶启动子的研究进展 |
| 1.1 端粒酶逆转录酶基因的结构与功能 |
| 1.2 hTERT启动子与mTERT启动子区域的比对 |
| 1.3 TERT启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 2 酪氨酸酶启动子的研究进展 |
| 2.1 酪氨酸、酪氨酸酶基因的结构与功能 |
| 2.2 Tyrosinase启动子在肿瘤治疗中的应用 |
| 3 新城疫病毒HN蛋白的抑瘤机制及其研究进展 |
| 3.1 NDV的HN蛋白的结构和功能 |
| 3.2 HN蛋白的抑瘤活性及其机制 |
| 4 腺病毒载体在基因治疗中的研究进展 |
| 4.1 腺病毒载体的概述 |
| 4.2 重组腺病毒的构建思路 |
| 第二章 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 mTERTp基因、mTyrp基因和HN基因PCR/RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN双酶切鉴定结果 |
| 2.3 pMD-mTERTp、pMD-mTyrp和pMD-HN测序结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 双启动子调控HN基因的重组腺病毒的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN 和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的PCR结果 |
| 2.2 亚克隆穿梭质粒pShuttle-HN、pShuttle-m TERTp-HN，pShuttle-m Tyrp-HN和pShuttle-m TERTp-m Tyrp-HN的双酶切结果 |
| 2.3 重组腺病毒质粒的电泳图 |
| 2.4 重组腺病毒质粒的PCR鉴定结果 |
| 2.5 重组腺病毒质粒的PacⅠ单酶切结果 |
| 3 小结 |
| 第四章 重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞结果 |
| 2.2 重组腺病毒感染HEK293细胞后RT-PCR的检测结果 |
| 2.3 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.4 重组腺病毒的滴度测定结果 |
| 3 小结 |
| 第五章 重组腺病毒的体外抑瘤作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组腺病毒感染小鼠黑素瘤B16细胞系的荧光检测 |
| 2.2 重组腺病毒对B16细胞的细胞活力影响研究 |
| 2.3 RT-PCR重组腺病毒在B16细胞中的表达情况检测 |
| 2.4 Westernblotting检测HN蛋白的表达 |
| 2.5 荧光检测B16凋亡的情况 |
| 2.6 重组腺病毒对B16细胞的凋亡作用研究 |
| 3 小结 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 1 结论 |
| 2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、615小鼠MHC Ⅰ cDNA重组逆转录病毒基因治疗载体的构建和包装（论文参考文献）
- [1]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [3]环形RNA circRNA000203调控miR-26b-5p/miR-140-3p/Gata4轴促进心肌肥厚的机制研究[D]. 李晖. 南方医科大学, 2020
- [4]绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究[D]. 杨惠. 内蒙古农业大学, 2020
- [5]IL-7重组痘病毒实验性治疗小鼠肠癌模型的研究[D]. 崔娟娟. 苏州大学, 2020
- [6]家蚕杆状病毒表达的鸡干扰素的应用和该病毒用于A型血友病基因治疗的研究[D]. 杨鑫. 中国农业科学院, 2019
- [7]新型脂肪细胞因子锌-α2-糖蛋白与肥胖关系的研究[D]. 刘美娟. 北京协和医学院, 2019(02)
- [8]慢病毒介导的TREM1及LBP基因沉默对LPS诱导下水牛单核巨噬细胞基因表达分子调控机制初步研究[D]. 谢亮亮. 广西大学, 2017(06)
- [9]MTB Ag85B199-207和HIV-1 Env120-128双特异TCR基因修饰CD8+ T细胞及其活性研究[D]. 周超颖. 南方医科大学, 2016(02)
- [10]mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究[D]. 龙雨清. 天津农学院, 2015(01)