一、Activation/Inactivation of ion channels and pumps during apoptosis: a necessary role in the apoptotic volume decrease（论文文献综述）
江旋[1]（2021）在《靶向下调Cav3.1对喉癌细胞Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用》文中研究说明目的:探讨Cav3.1在喉鳞癌组织和细胞中的表达以及靶向下调Cav3.1在喉鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用免疫组织化学,实时PCR和Western blotting方法检测30例喉癌中Cav3.1的喉癌组织、正常切缘黏膜组织中的表达情况及差异;采用si RNA技术构建瞬转,构建靶向下调Cav3.1的Hep-2细胞系,应用CCK-8实验检测该喉癌细胞增殖的影响,采用Annexin V-PI染色技术检测下调组喉癌细胞凋亡的影响;Western Blot实验验证凋亡蛋白表达水平。结果:1.免疫组化染色显示,30例喉癌组织中主要Cav3.1在细胞质中呈弥漫性表达,少数细胞核中也有表达,呈现淡黄色、棕黄色或棕褐色,Cav3.1阳性表达27例,Cav3.1阳性表达率为90%;对应癌旁正常黏膜组织中Cav3.1阳性表达3例,Cav3.1阳性表达率10%。Cav3.1的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组织,差异有统计学意义（χ2=38.4,P<0.01）2.实时PCR结果显示,喉癌组织中Cav3.1的RNA表达水平（3.816±1.757）显着高于癌旁组织（1.131±0.843）,差异有统计学意义（t=7.550,P=0.000）;3.Western blotting显示,在30例喉癌样本和癌旁切缘组织中,喉癌组织中Cav3.1的蛋白表达水平（4.251±2.496）显着高于癌旁组织（1.445±1.143）,差异有统计学意义（t=5.755,P=0.0001）4.使用si-Cav3.1转染Hep-2细胞后,流式细胞技术提示转染效率92±2.31%,WB验证检测显示,si-Cav3.1组中的mi R-Cav3.1显着减少（si RNA-Cav3.1组0.4±0.08。mock0.96±0.45,NC组0.98±0.2,n=3）,si-Cav3.1组中的Cav3.1相对表达水平则显着下降（图3）,与空白对照组,mock组相比差异有统计学意义（F=18.109,P=0.0008）5.对凋亡的影响,检测24小时后凋亡率,正常组、mock组和si-Cav3.1组凋亡率分别为（1.26±0.31,2.62±0.42,25.11±2.56）,与正常组相比,si-Cav3.1组细胞凋亡率升高（F=514.5,P=0.0000）结论:1.Cav3.1在喉癌组织和喉癌细胞系中高表达。2.下调Cav3.1抑制喉癌细胞的增殖,促进凋亡。3.推测Cav3.1可能参与调节了喉鳞癌的发生发展。
陈霞[2]（2021）在《cGAS调控LRRC8/VRAC离子通道在天然免疫和肿瘤治疗中的功能与机制研究》文中提出LRRC8/VRAC（LRRC8 volume-regulated anion channel）是七年前才被发现的调控低渗反应和细胞体积的阴离子通道,广泛表达于多种哺乳动物组织中,由LRRC8A和它的同源亚基LRRC8B-E形成异源性六聚体行使功能。VRAC在细胞外环境渗透压降低时被迅速激活,介导Cl-外流来降低细胞内渗透压、防止细胞体积膨胀以维持细胞正常的生理功能。除了运输氯离子外,VRAC还能转运一些有机分子,包括天冬氨酸和谷氨酸、神经递质GABA和抗癌药物顺铂cisplatin,参与调节生长发育、胰岛素应答和中风等过程。前期我们发现LRRC8A/E VRAC可以转运STING的激动剂2’3’-cGAMP和3’3’-cGAMP,但它转运这些小分子物质的分子机制及其活性调控尚不清楚。cGAS（CyclicGMP–AMP synthase）主要识别胞内感染病原微生物以及肿瘤细胞释放的双链DNA,利用ATP和GTP催化合成第二信使2’3’-cGAMP。2’3’-cGAMP结合STING后促使其从内质网上解离并招募TBK1。TBK1激活后磷酸化IRF3,使其入核诱导干扰素和炎症因子表达,从而启动天然免疫反应。越来越多的研究证明除了识别ds DNA催化合成cGAMP外,cGAS在细胞内的功能仍需进一步拓展。我们前期的研究发现LRRC8A/E VRAC通过运输2’3’-cGAMP调节抗病毒免疫应答,在此基础上,我们致力于进一步阐述VRAC/LRRC8离子通道激活的机制。首先通过膜片钳电生理技术和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）发现阴离子通道LRRC8/VRAC可以将病毒感染细胞产生的cGAMP转运到非感染细胞中激活STNG信号和干扰素应答。然后我们发现VRAC转运cGAMP和cisplatin的活性受到血清和炎症因子TNF-α、IL-1β的调控。接下来,我们发现血清和炎症因子主要通过cGAS激活VRAC通道并且帮助其转运cGAMP进入细胞激活STING。从机制上,我们发现血清和炎症因子促进cGAS转位到细胞质膜上与磷酸肌醇PI（4,5）P2结合,使其锚定在细胞膜上促进VRAC转运cGAMP诱导I型干扰素表达或转运cisplatin杀死肿瘤细胞。最后我们揭示cGAS在肿瘤细胞中的表达影响LRRC8A/D VRAC活性和cisplatin治疗肿瘤的效果。我们的研究揭示了LRRC8/VRAC转运cGAMP和cisplatin的作用机制和生理功能,发现并细致阐述了cGAS调控LRRC8/VRAC通道活性的分子机制。为研发抗病毒疫苗、优化肿瘤治疗方案提供了新的思路和策略。
张树人[3]（2020）在《克服顺铂耐药性的铂（Ⅳ）抗肿瘤前药的理性设计及其作用机制研究》文中指出癌症是一种威胁人类健康的恶性疾病,化疗仍然是目前临床上用于治疗癌症的主流手段。铂类药物是使用最广且药效最好的化疗药物之一,被广泛用于治疗肺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种肿瘤,据估计至少有50%的肿瘤患者接受过铂类抗癌药物的化疗。尽管如此,铂类药物在临床使用中仍然存在许多亟待解决的问题,例如耐药性和毒副作用等,因此,开发能够克服耐药性以及降低毒副作用的新型铂类药物显得尤为紧迫。四价铂(PtⅣ)配合物作为新一代的铂类抗肿瘤前药,近年来引起国内外科研工作者的广泛关注。PtⅣ化合物具有八面体的配位构型,既增强了配合物的惰性,降低其在体内运输过程中的毒副反应,又为配合物的功能化修饰提供了便利。当PtⅣ配合物进入癌细胞后,基于癌细胞内乏氧以及高还原环境,会还原释放出活性的二价铂单元(PtII)和轴向配体。PtII物种与DNA结合,造成损伤;轴向配体发挥自身的生物活性,从而与PtII物种合力杀死癌细胞。PtⅣ前药的兴起为降低铂类药物的毒副作用、实现口服、克服顺铂耐药性等提供了新的思路。耐药性是限制铂类药物临床效果的一个主要障碍,有些肿瘤对铂药化疗存在先天耐药性,还有些肿瘤开始对铂类药物较为敏感,随着用药的时间以及剂量的累积,会产生获得性耐药性。因此,如何克服铂药耐药性一直是药物化学家们研究的热点问题。铂类药物的耐药机制非常复杂,涉及到肿瘤细胞中的多个信号通路,以顺铂为例,包括DNA损伤修复、凋亡逃逸、肿瘤代谢重编程等等,本论文以PtⅣ配合物为母体,通过在其轴向上修饰能够干预顺铂耐药途径的小分子,设计合成了一系列多功能的PtⅣ前药分子,期望高效地克服顺铂耐药性。顺铂结合核DNA会造成其单链的损伤,如果修复失败,会进一步造成双链损伤,而同源重组（HR）是修复DNA双链断裂的有效途径。BRCA是关键的HR基因或蛋白,因此,BRCA缺陷的肿瘤意味着HR能力的缺失,进而对铂类药物更为敏感,而BRCA完整的肿瘤对铂药化疗有着先天的耐药性。基于此,我们设计了两个PtⅣ-青蒿素琥酯复合物Pt-ART-Ⅰ和Pt-ART-Ⅱ,它们对BRCA完整的卵巢癌和乳腺癌细胞展现出显着高于顺铂的毒活性,达到了10倍以上,同时对正常的肾细胞表现出较低的毒性。机制研究表明,Pt-ART-Ⅰ和Pt-ART-Ⅱ能够有效进入肿瘤细胞,释放出PtII物种对核DNA造成严重损伤,释放出的ART下调HR关键执行蛋白RAD51的表达以及抑制其核焦点的形成,两者共同促进细胞发生显着凋亡。除DNA损伤修复之外,凋亡逃逸也是顺铂耐药的重要原因,单纯抑制DNA修复,肿瘤细胞还可以通过激活抗凋亡途径来抵抗顺铂的杀伤,因此同时干预这两个通路似乎能更有效的克服耐药性。据此,我们设计了两个噻吩衍生物修饰的PtⅣ配合物1和2,其中化合物2不仅能够抑制抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,同时还抑制HR介导的DNA双链断裂修复,这是同时干预DNA修复和凋亡的铂类化合物的首次报道。化合物2展现出对顺铂耐药的肺癌和卵巢癌细胞很高的毒活性,达到顺铂的32倍和61倍,耐药指数相较于顺铂也显着下降。活体研究表明,化合物1和2展现出显着的抗肿瘤活性以及较低的系统毒性。代谢重编程是恶性肿瘤的一个重要特征,肿瘤通过改变自身代谢方式来适应快速生长以及转移的需要。最近,研究者们发现顺铂的耐药性也与肿瘤的代谢异常有着密切的关系,因此,干预肿瘤代谢是克服顺铂耐药性的一个潜在方向。于是,我们设计了两例PtⅣ-依帕司他配合物Pt-E-Ⅰ和Pt-E-Ⅱ,它们能够有效抑制醛糖还原酶（AKR1B1）的活性,并干预葡萄糖的多元醇代谢旁路（Polyol pathway）以及脂质代谢通路（例如PGF2α、脂质过氧化等）,最终诱导肿瘤细胞发生多种模式的死亡,包括凋亡、坏死和铁死亡。Pt-E-Ⅰ和Pt-E-Ⅱ对多种肿瘤细胞都有较高的毒活性,尤其是顺铂耐药的A549/DDP细胞,Pt-E-Ⅰ对它的的IC50值降到顺铂的1/70。总之,本论文以克服顺铂耐药性为药物设计的目标,针对顺铂耐药机制的不同方面,采用PtⅣ前药的设计策略,合成了三类以顺铂为母体,轴向分别修饰了能够干预同源重组、凋亡逃逸、肿瘤代谢重编程的活性小分子的PtⅣ配合物,毒活实验表明它们都能够有效克服顺铂耐药性,并深入研究了其作用机制以及构效关系,为开发能够克服铂药耐药性的新型铂配合物提供理论依据和有益启发。
胡凌昊[4]（2020）在《新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究》文中认为本论文聚焦老药的二次研发,以上市抗真菌药物环吡酮胺和抗肿瘤药物quisinostat为先导化合物分别设计合成了一系列具有抗中风和抗疟疾活性的结构新颖的候选化合物,并系统研究了其活性、成药性和作用机制。此外,本论文还发现了基于姜黄素结构的极性荧光探针,可用于细胞成像以监测溶酶体内极性变化。论文由三部分组成:第一部分为N-羟基吡啶酮类抗脑卒中神经保护剂的设计合成与活性研究。缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）加剧了缺血性中风（ischemic stroke）患者的脑组织损伤,而在溶栓后应用神经保护剂类药物可以缓解缺血再灌注损伤,促进神经功能的恢复。前期研究发现的先导化合物抗真菌上市药物环吡酮（ciclopirox,CPX）的神经保护活性不佳,并且代谢稳定性较差。因此,在本工作中,我们以环吡酮为先导化合物开展老药二次研发,旨在通过结构改造提高活性并改善药代动力学性质。我们对环吡酮进行结构修饰得到了N-羟基吡啶酮类衍生物A1-A31,并通过SH-SY5Y细胞构建的OGD（氧糖剥夺,oxygen-glucose deprivation）模型评价了这些衍生物的神经保护活性、血脑屏障透过性和氧自由基清除能力。衍生物A10的神经保护效果优于环吡酮且起效浓度更低,同时具有更强的氧自由基清除能力,其乙醇胺盐A10-Ola的水溶性优于环吡酮胺（CPX olamine）,而其透血脑屏障能力与之相近,因此被确立为优选化合物。A10·Ola在神经细胞模型上具有缓解兴奋性毒性和氧自由基损伤以及抑制细胞凋亡的效果,并可以维持细胞结构完整。A10·Ola和环吡酮胺对hERG钾离子通道的抑制活性均较弱,然而两者具有相近的细胞毒性。在大鼠MCAO（脑中动脉栓塞,middle cerebral artery occlusion）模型上,0.3 mg/kg的A10·Ola减小梗死体积的药效与3 mg/kg的环吡酮胺相当,1 mg/kg 的 A10·Ola 对 mNSS（modified neurological severity scores,神经缺陷评分）评分的改善优于3 mg/kg的环吡酮胺的药效,而3 mg/kg是前期研究中确立的环吡酮胺的最优药效剂量。鉴于A10·Ola在动物实验中的药效剂量远低于环吡酮胺,且两者细胞毒性相近,A10·Ola具有相对更好的安全性。此外,A10·Ola的代谢稳定性优于环吡酮胺。我们设计合成了含有环吡酮结构的探针AP1-AP3用于靶标垂钓。其中,环吡酮的1位和3位直接连接linker-生物素片段得到的探针AP1和AP2无活性,而含有双吖丙啶和炔基的探针AP3具有较好的神经保护活性,有望通过光交联和click反应间接标记潜在的靶蛋白,但以AP3为探针的靶标垂钓实验没有成功。我们转而通过bSDTNBI（balanced substructure-drug-target network-based inference,平衡的基于化合物子结构-药物-靶点相互作用网络推理方法）和铁离子螯合实验研究发现A10和环吡酮可以通过铁离子螯合上调HIF-1α发挥神经保护活性,其氧自由基消除效果也有助于神经保护活性。在这部分工作中,我们设计合成了 31个N-羟基吡啶酮类衍生物,并系统研究了其体内外药效和成药性。从中发现了神经保护活性、抗氧化活性和代谢稳定性均优于环吡酮且血脑屏障透过性与之相当的优选化合物A10,其乙醇胺盐—A10·Ola在远低于环吡酮胺的剂量上就可以发挥更好的神经保护活性,鉴于两者细胞毒性相当,药效剂量更低的A10·Ola具有更好的安全性。本研究取得的成果有助于新型抗中风候选药物的开发。第二部分是酰肼类PfHDAC抑制剂的设计合成与活性研究。PfHDAC（P.falciparum histone deacetylase,恶性疟原虫组蛋白去乙酰化酶）抑制剂的作用机制与青蒿素不同,有望用于治疗青蒿素耐药疟疾。抗肿瘤HDAC抑制剂quisinostat具有很强的抗疟活性,但具有很强的细胞毒性和人源HDAC抑制活性,其结构可以分为嘧啶异羟肟酸（锌离子结合基团）、4-氨甲基哌啶（连接链）和N-甲基吲哚片段三部分。课题组前期研究维持异羟肟酸结构不变,对连接链和N-甲基吲哚片段进行了结构优化得到了一系列衍生物。虽然这些衍生物的细胞毒性大大降低,但是仍然有强烈的人源HDAC抑制活性、代谢稳定性差和口服生物利用度低等缺陷。鉴于PfHDAC和人源HDAC的活性中心（锌离子结合基团作用位点）之间存在结构差异,并且异羟肟酸中的羟基是主要的代谢位点,所以在本工作中,我们设计合成了一系列具有新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂B1-B64,以期提高选择性并优化药代动力学性质。其中,B1-B9的锌离子结合基团为N-酰基邻苯二胺或其类似物,但其抗疟活性较差或完全丧失。为此,我们进一步合成了以酰基肼为锌离子结合基团的衍生物B10-B18,其中衍生物B11（其锌离子结合基团为N2-丙基—N1—嘧啶甲酰基肼）不仅抗疟活性好,而且细胞毒性低。与quisinostat相比,B11对于人源HDAC多个亚型的抑制活性都大幅下降。因此,N2—丙基-N1-嘧啶甲酰基肼被确立为具有更高种属选择性的新型HDAC抑制剂的锌离子结合基团。在此基础上,我们对B11中的4-氨甲基哌啶连接链和N-甲基吲哚进行结构改造得到了衍生物B20-B64。其中变换连接链得到的衍生物B19-B23的活性和选择性较之B11大幅下降。于是,我们维持4-氨甲基哌啶连接链不变,将N-甲基吲哚替换成其他取代基得到了衍生物B24-B64。其中,B32、B35和B36的抗疟活性有所提高,活性最优衍生物B36对Pf3D7虫株的IC50值在25 nM左右。B36具有更低的细胞毒性,其选择性指数SI293T/Pf3D7为63,优于quisinostat和B11。此外,B36对人源HDAC的抑制活性与quisinostat相比下降了约70倍,并且其盐酸盐B36·HCl具有比异羟肟酸类衍生物更高的口服生物利用度。在这部分工作中,我们设计合成了 64个具新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂,并研究了其抗疟活性、细胞毒性、选择性和对于人源HDAC的抑制活性。其中的优选化合物B36的抗疟活性较好,细胞毒性低,对人源HDAC的抑制活性大幅下降,种属选择性大幅提高,并兼具更高的口服生物利用度,有望开发为新一代具有更高选择性且更加安全的口服抗疟药物。第三部分是基于姜黄素的比率型溶酶体极性荧光探针的发现和应用研究。多种生理和病理过程中都伴随着溶酶体极性变化,溶酶体靶向性极性敏感型荧光探针可以作为相关研究的有力工具。因此,在本工作中,我们以全新的结构设计策略开发了基于姜黄素的溶酶体靶向性比率型极性探针。虽然姜黄素类衍生物的发射波长较长,但姜黄素结构本身的水溶性差且易受所处环境干扰。为了克服这些缺点,我们对姜黄素进行结构改造得到了探针C1-C5。其中,含有二乙胺结构的探针C1和C2的极性敏感性优于含有半刚性结构（4-甲基哌嗪）或刚性结构（久洛尼定）的探针C4和C5,说明二乙胺片段可以提高极性敏感性。与C1和C2相比,不含糖的探针C3不溶于水且在混合溶剂中对于极性变化的响应也与前两者不同,说明半乳糖片段提高了水溶性并改变了极性响应模式。探针C1和C2的抗干扰能力强,pH和粘度的变化和常见的干扰物质对于两者荧光发射光谱的影响很小。探针C1和C2在两个波长之间的荧光强度比率（C1:I602/I554;C2:I606/I545）与极性参数△f（定向极化度）之间呈现良好的线性关系。两者光稳定性好,其光学性能可以对复杂环境中的极性变化进行特异性地精确地实时监测。我们以探针C2为例研究了这类探针的极性响应机制,通过对一维和二维核磁共振谱的解析发现探针C2在不同极性的溶剂中的两种互变异构体β-二酮式和酮-烯醇式的比例是不同,这可能是荧光随着极性变化的原因。探针C1的细胞毒性比探针C2更低,我们因此选择C1用于细胞成像实验。探针C1在不同的细胞中均具有较好的溶酶体靶向性,并可通过荧光成像中红通道和绿通道荧光强度的比值变化反映出不同细胞系的溶酶体极性差异,可用于检测多种细胞的溶酶体极性。在蔗糖模拟的溶酶体贮积症或二甲亚砜刺激造成的HepG2和293T细胞内溶酶体极性变化的过程中,探针C1的红通道和绿通道荧光强度的比值也发生了显着的变化,说明探针C1可以实时监测细胞内溶酶体极性变化。综上所述,溶酶体靶向性比率型极性荧光探针C1具有良好的极性敏感性、抗干扰能力、光稳定性、水溶性和生物相容性,有望用于研究与溶酶体极性变化相关的生物过程。
张凯[5]（2020）在《多西环素对慢性间歇缺氧导致的大鼠心房重构干预机制研究》文中提出目的:通过慢性间歇缺氧（chronic intermittent hypoxia,CIH）的方式建立雄性Sprague-Dawley大鼠心房重构房颤（atrial fibrillation,AF）模型,探究多西环素对CIH导致的大鼠心房重构的干预作用及其相关机制。方法:150只SD大鼠随机分为正常对照组（normal control group,Control group）、慢性间歇缺氧模型组（CIH-induced atrial remodeling group,CIH group）及多西环素干预组（CIH with doxycycline intervention group,CIH-D group）,每组50只（n=50）。模型组与干预组大鼠接受每日8小时的CIH,干预组大鼠在CIH的基础上经胃给予多西环素进行干预（30mg/kg）。模型建立周期为30天,之后对各组大鼠进行称重、气体麻醉,麻醉满意后对各组大鼠进行心脏彩超、血流动力学检测,之后留取各组大鼠心房组织,称重后按不同实验要求进行储存。各组中,10只大鼠用于病理学实验,5只用于体外心脏电生理学实验,5只用于实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）实验,5只用于蛋白印迹（Western Blotting）实验,20只用于全细胞膜片钳实验,5只用于共聚焦显微镜实验。HE染色用于观察各组大鼠心房组织一般结构变化,Masson染色用于分析比较各组大鼠心房组织中胶原纤维沉积程度,体外心脏电生理实验用于检测各组大鼠心房有效不应期、心房外膜传导速度、传导异质性及AF诱发率。免疫组织化学染色（IHC）及Western Blotting实验用于检测各组大鼠心房组织中心房重构相关蛋白PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、TGF-β1、CTGF、Nav1.5、Cav1.2、Kv4.2、Kv4.3、NCX1、Ry R2的表达水平,RT-q PCR实验用于检测各组大鼠心房组织中心房重构相关微小核糖核酸（micro RNAs,mi Rs）1、21、29b、30、133a、328及上述蛋白的m RNA表达水平。膜片钳实验用于检测各组大鼠心房肌细胞的动作电位（action potential,AP）、动作电位时程（action potential duration,APD）、INa、ICa,L、Ito的电流密度及通道动力学参数。共聚焦显微镜实验用于分析比较各组大鼠心房肌细胞内Ca2+瞬变情况。结果:与对照组大鼠相比,模型组的大鼠心脏重量、肺动脉平均压力、平均动脉压增加,心房组织纤维化程度明显增加,此外,心肌细胞间隙增加、走形紊乱。体外心脏电生理实验结果表明,模型组大鼠的心房外膜传导速度减慢、传导异质性增加,AF诱发率明显增加,心房组织中mi R-1、mi R-21、mi R-133a、mi R-328、TGF-β1、CTGF、Ry R2的表达水平明显升高,而PI3K、AKT、p-AKT、Nav1.5、Cav1.2、Kv4.2、Kv4.3的表达水平降低。细胞电生理实验表明,模型组大鼠心房肌细胞的APD延长,ICa,L、INa、Ito电流密度明显降低,心房肌细胞Ca2+瞬变增加,NCX1表达水平及离子通道动力学参数无明显改变。给予多西环素干预后,干预组大鼠较模型组相比,心房组织纤维化程度明显改善,AF诱发率有所降低,心房外膜传导速度增加、传导异质性降低,心房组织中mi R-21、mi R-133a、TGF-β1、CTGF、Ry R2的表达水平明显降低,而PI3K、AKT、p-AKT、Nav1.5、Cav1.2、Kv4.2、Kv4.3的表达水平升高,心房肌细胞的APD缩短,INa、Ito电流密度增加,离子通道动力学参数无明显改变。结论:1)CIH可导致雄性SD大鼠心房明显的结构重构和电重构,是研究AF心房重构机制的重要平台。2)心房组织胶原纤维沉积增加、心房外膜传导速度减慢、传导异质性增加、心房组织中mi R-1、mi R-21、mi R-133a、mi R-328、TGF-β1、CTGF、Ry R2表达水平的升高,PI3K、AKT、p-AKT、Nav1.5、Cav1.2、Kv4.2、Kv4.3表达水平的降低、心房肌细胞APD延长、INa、ICa-L、Ito电流密度减低、Ca2+瞬变增加是CIH促进AF的重要机制。3)多西环素可通过调节mi R-21/PTEN/PI3K/AKT通路、mi R-133a/TGF-β1/CTGF通路、Nav1.5、Kv4.2、Kv4.3、Ry R2、INa、Ito进而改善CIH导致的大鼠心房结构重构和电重构,是其干预AF重构的重要分子及离子机制。
郭蕊[6]（2019）在《醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究》文中认为目的:心血管疾病引起的死亡人数占全球人口死亡总数的三分之一,而罹患缺血性心脏病的死亡人数居心血管疾病死亡人数之首。冠状动脉梗阻是造成心肌缺血的主要原因,尽管心肌缺血后在最短的时间内恢复缺血心肌供血是目前临床首选的治疗方式,但是缺血心肌恢复血液灌注后,供血和供氧的恢复可能是促进心肌细胞炎症和凋亡反应增高的直接原因,造成再灌注后的心肌细胞损伤进一步加重;因此,寻找有效方式降低心肌缺血/再灌注后的心肌细胞损伤,改善心功能各项指标,将为临床提高冠状动脉介入手术的效果提供新的治疗策略。醉茄素A是从醉茄提取的主要生物活性成分,近年来研究发现醉茄素A具有抗炎、抗氧化作用,然而醉茄素A与缺血性心脏病的关系尚不明确。本文拟探讨醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用,结合在体动物模型、离体细胞培养及各项分子生物学技术,阐明醉茄素A心肌细胞保护作用中的分子调节机制,为心梗患者提高介入手术疗效提供实验依据。方法:1.利用实验动物模型模拟人体心梗后冠状动脉再通治疗:小鼠麻醉状态下进行心脏冠状动脉左前降支结扎术,30 min后打开结扎线恢复血液供应,复灌后3 h分离心脏左心室缺血/再灌注区心肌组织用于信号分析,复灌后24 h检测心功能、TUNEL凋亡分析及心肌梗死面积测定。2.实验动物分组伪手术组:除不结扎心脏冠状动脉左前降支外,其余操作同心梗/再灌注组;心梗/再灌注组:小鼠吸入麻醉状态下,行冠状动脉左前降支结扎/再通术;低浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射1 mg/kg醉茄素A;高浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射5 mg/kg醉茄素A。3.小鼠心功能测定超声测定心功能:小鼠吸入麻醉状态下,调节探头寻找两侧乳头肌短轴平面,M模式下连续记录三个收缩循环周期的左心室多普勒图像,并计算心功能指标。劲动脉插管测定左心室功能:小鼠吸入麻醉状态下,分离右侧颈总动脉,将带有导丝的探头从动脉微切口缓慢送入左心室,记录左心室压力、左心室舒张末期压力及心率等数值,计算心功能指标。4.心肌梗死面积测定:小鼠心肌缺血后再灌注24 h,使用Evans Blue-TTC染色法将心脏切片染色,计算风险面积百分比。5.TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡:小鼠缺血心肌再灌注24 h,福尔马林固定后制作石蜡切片,TUNEL染色并拍照记录染色结果,计算心肌细胞凋亡率。6.Real Time PCR法检测线粒体凋亡相关蛋白m RNA水平变化:小鼠缺血心肌再灌注3h,提取缺血区心肌组织总RNA,反转录后用Real time PCR法检测线粒体凋亡相关基因m RNA变化。7.Western Blot法检测蛋白表达:小鼠缺血心肌再灌注3 h,提取缺血区心肌组织蛋白,Western Blot法检测蛋白表达改变。结果:1.低浓度（1 mg/kg）醉茄素A显着改善心肌缺血/再灌注损伤1.1超声多普勒法检测小鼠心肌缺血/再灌注模型构建,通过超声图像和心电图结果判定心肌缺血/再灌注损伤模型的建成。1.2心肌缺血/再灌注（MI/R）组小鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）显着低于伪手术（Sham）组（P<0.001）,而1mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS较MI/R组显着增高（P<0.05）,5mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS与MI/R组无统计学差异。1.3血流动力学检测结果显示,MI/R组心室压最大上升速率（+d P/dt max）、心室压最大下降速率（-d P/dt max）显着低于Sham组（P<0.001）,而1mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max较MI/R组显着增高（P<0.05）,5 mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max与MI/R组无统计学差异。1.4 Evans Blue-TTC染色显示,1 mg/kg醉茄素A预处理组的心肌梗死面积较MI/R组显着降低,差异有统计学意义（P<0.001）,而5 mg/kg醉茄素A预处理组心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异。2.醉茄素A抑制线粒体凋亡降低心肌细胞缺血/再灌注损伤2.1 TUNEL染色显示1 mg/kg醉茄素A预处理组心肌细胞凋亡率显着低于MI/R组（P<0.001）,且醉茄素A组Cleaved caspase-3蛋白表达及caspase-3活性也显着低于MI/R组（P<0.001）,提示醉茄素A的心肌保护作用依赖醉茄素A抑制缺血/再灌注损伤的心肌细胞凋亡。2.2醉茄素A显着降低线粒体凋亡途径的标志Cleaved caspase-9蛋白表达（P<0.001）,而醉茄素A组外源性凋亡Cleaved caspase-8蛋白表达与MI/R组无统计学差异,提示线粒体凋亡是醉茄素A心肌保护作用的关键信号通路;醉茄素A通过促进Bcl-2活性增高,发挥其抑制凋亡作用。2.3醉茄素A抑制线粒体凋亡的作用中,AMPK是关键调节蛋白。3.醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用依赖AMPK活化利用AMPKα2心肌特异性失活小鼠构建心肌缺血/再灌注损伤模型,超声多普勒检测心功能结果显示醉茄素A组LVEF、LVFS与MI/R组相比无差异,而血流动力学检测及Evans Blue染色结果发现醉茄素A组+d P/dt max、-d P/dt max和心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异,提示WFA心肌保护作用依赖AMPKα2。4.醉茄素A促进自噬降解维持自噬平衡降低心肌缺血/再灌注损伤4.1与sham组相比MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,醉茄素A组较MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显着降低（P<0.001）,而醉茄素A组与MI/R组相比Lamp-2蛋白表达升高、p62蛋白表达降低（P<0.001）,提示醉茄素A通过促进自噬降解降低维持自噬平衡。4.2氯喹抑制溶酶体活性后,醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62蛋白表达均增高,心肌细胞凋亡水平增高。提示,自噬降解异常引起的自噬紊乱促进心肌细胞凋亡增高,而醉茄素A通过促进自噬降解、维持自噬平衡降低心肌细胞凋亡,缓解心肌缺血/再灌注损伤。4.3心肌AMPKα2失活,与MI/R组相比醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显着增高,提示AMPKα2是醉茄素A促进自噬降解的关键调节蛋白。结论:1.低浓度（1 mg/kg）醉茄素A可显着改善缺血/再灌注损伤后的心功能,缩小心肌坏死区域面积。2.醉茄素A活化Bcl-2抑制线粒体凋亡、降低心肌细胞凋亡率,发挥心脏保护作用。3.AMPK的活化在醉茄素A抑制缺血/再灌注心肌损伤心肌线粒体凋亡中,起重要调节作用。4.心肌缺血/再灌注损伤中,醉茄素A促进心肌细胞自噬降解,缓解MI/R引起的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,维持自噬平衡,降低心肌细胞凋亡。
李娇[7]（2019）在《超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的致死效应及分子机制研究》文中研究说明随着人们对新鲜、营养、安全食品需求的增加,非热杀菌技术在食品加工中的应用备受关注,超声作为一种有效的非热杀菌手段,能在保障食品安全的前提下最大限度地保留食品中的营养成分。大量研究表明超声空化效应是发挥杀菌效力的决定性因素,但是目前关于超声作用的途径和机制缺乏全面系统的研究,同时超声场胁迫下微生物的应激响应未见报道,微生物的应激响应机制会增加其对环境压力的耐受性,从而导致杀菌不彻底现象的出现,限制了超声杀菌技术在食品加工领域中的应用。本论文以食源性致病菌大肠杆菌O157:H7作为研究对象,运用分子生物学、转录组学、蛋白组学等技术手段,开展超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的致死效应和分子机制研究,通过解析超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7差异基因与蛋白表达情况,明确大肠杆菌O157:H7细胞生物学表型变化与差异表达基因的关系,阐释大肠杆菌O157:H7在超声场胁迫下的分子响应机制,为进一步优化超声杀菌工艺奠定理论基础,有助于食品加工过程中微生物的控制、确保食品生产安全。主要研究内容和结果如下:（1）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的致死效果根据不同的细菌活性评价标准（可培养性、膜完整性、酯酶活性、代谢能力）,采用平板计数法和流式细胞术分别考察超声对大肠杆菌O157:H7的作用效果,结果表明超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7具有显着的致死效应,随着处理时间和强度的增加,致死效果愈加显着;进一步采用流式细胞仪结合荧光双染色法,对不同强度超声场作用后大肠杆菌O157:H7细胞的异质性进行实时监测,探究亚致死损伤细菌以及活的不可培养状态细菌的存在情况,结果表明超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7的致死作用不是一个损伤逐渐累积的过程,而表现出“全有或全无（all-or-nothing）”效应的特征。（2）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的多靶点致死效应通过考察不同条件超声场作用对大肠杆菌O157:H7生物学特性的影响,阐释了超声机械效应的作用途径,并在细胞水平上明确了超声场作用的多靶点致死效应。由外向内的冲击波、微射流与由内向外的微声流共同作用,最终造成细胞的不可逆损伤。在细胞膜功能方面,超声空化效应产生的剪切力能改变大肠杆菌O157:H7细胞膜通透性,导致细胞膜上离子通道开放、钾离子发生外泄,从而出现膜电位超极化现象;在能量代谢方面,在高强度超声场作用下ATP产量下降,细菌的新陈代谢能力和正常生理功能受到影响;在DNA分子结构方面,超声场作用会逐渐损伤DNA分子的超螺旋和双螺旋结构,对细胞内DNA的一级结构并无明显的破坏作用。（3）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7细胞的程序性死亡机制通过考察超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7细胞膜上磷脂酰丝氨酸的分布以及细胞内凋亡蛋白酶的活性,发现超声场胁迫能诱导大肠杆菌O157:H7发生主动有序的程序性死亡,出现磷脂酰丝氨酸外翻、凋亡蛋白酶激活等细胞凋亡的生化特征,并初步阐明多功能调节子Rec A蛋白是执行细胞凋亡的关键因子;进一步分析超声空化产生的化学效应在大肠杆菌O157:H7细胞凋亡中所发挥的作用,结果表明自由基、过氧化氢能够通过多种途径提高胞内活性氧水平,与钙信号共同作用,参与凋亡蛋白酶的激活,触发部分受损细胞进入凋亡状态,体现了细菌“群体利益优先”的原则。（4）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的差异表达基因分析应用RNA-seq高通量测序技术,解析超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7基因转录水平的变化,并对显着富集通路的差异基因表达情况进行具体分析,结果表明,超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7编码磷酸转移酶系统和糖分解代谢的基因表达下调,涉及物质跨膜转运和呼吸链的相关基因大都下调表达,参与AI-2介导的群体感应系统的基因表达下调,但大肠杆菌O157:H7中与氨基酸合成代谢、核糖体合成和组装相关的基因表达呈上升趋势,说明在超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7基因的差异表达导致碳水化合物的转运和分解能力下降、细胞膜功能损伤、能量代谢下降、信号转导受到抑制,而对蛋白质的翻译过程产生积极影响。（5）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的应激响应机制采用i TRAQ联合HPLC-MS/MS技术对超声场作用后大肠杆菌O157:H7进行蛋白组定量分析,从通用压力应激途径、机械应激途径、DNA损伤应答、热休克应答、氧化应激反应等方面入手,揭示了大肠杆菌O157:H7在超声场胁迫下的分子响应机制:通过累积胁迫应答子Rpo S蛋白、激活机械性敏感离子通道蛋白、启动SOS应答系统修复损伤DNA,以应对超声场的胁迫作用;并推测自由基等可经由开放的机械敏感离子通道注入到细胞内,使胞内活性氧水平大幅升高,导致多种压力胁迫下大肠杆菌O157:H7的热休克应答和抗氧化防御体系遭到严重破坏,使细菌无法形成亚致死中间状态,从而出现all-or-nothing现象。
张盟[8]（2019）在《基于过氧化氢的功能纳米材料的设计合成与抗肿瘤研究》文中研究指明纳米科技的发展为治疗恶性肿瘤提供了新的机遇。纳米材料以其巨大的比表面积、丰富的物理化学性质、易于表面修饰与改性等特点,在抗癌药物的负载运输以及纳米前药的设计合成等方面具有天然的优势。许多纳米材料不仅具有较好的生物相容性,还能显着降低化疗过程中的药物毒副作用。H2O2作为一种强效的诱导细胞死亡的化学药物,其在肿瘤治疗领域具有极大的发展前景;然而,H2O2相对较差的化学稳定性制约了它的临床应用。通过纳米技术将H2O2纳米化,转变成更加稳定的纳米颗粒,同时保留其活性组分,并实现H202在特定部位的可控释放,这种策略将为H2O2分子在肿瘤治疗领域的发展和临床转化迎来新的活力。本论文以H2O2为研究对象,设计合成了多种基于H2O2的新型功能纳米材料,系统研究了它们的抗肿瘤性能,并以提高肿瘤治疗效率为目标,对基于H2O2的纳米材料进行结构优化和功能改进。主要研究内容如下:（1）基于肿瘤微环境响应的过氧化氢发生器用于肿瘤治疗。通过前期实验探索研究,成功筛选出一类能够稳定负载H2O2的纳米载体材料:层状双金属氢氧化物（LDH）。这类纳米载体材料通过强烈的化学配位作用而非物理静电吸附作用,实现了 H202的高效率负载,因此极大提高了 H2O2的化学稳定性。同时,在酸性条件下,材料又可以通过质子的配体交换作用来释放H2O2分子,从而实现肿瘤区域的H2O2可控释放。此时,由H2O2引起的肿瘤细胞氧化应激,不仅可以干扰细胞内的氧化还原信号,还能提高肿瘤细胞内的氧化能力,造成脂质过氧化,从而引发肿瘤细胞的增殖抑制,因此该策略具有可观的抗肿瘤效果。（2）基于过氧化钙纳米颗粒的抗肿瘤研究。为了进一步控制纳米体系尺寸并提高H202的化学稳定性我们提出将H2O2的活性组分通过化学键合结晶的策略,形成纳米前体药物。经过体系探索和制备工艺研究,在室温下通过湿化学法成功获得了尺寸可调的单相CaO2纳米晶。CaO2纳米晶是由H2O2分子与钙离子（Ca2+）在一定条件下反应结晶而成的不溶于水的纳米颗粒,因其在水溶液中无法溶解而表现出化学惰性;但在酸性环境下,可以逐渐分解释放Ca2+和H2O2。因此,它可以响应肿瘤的酸性微环境,以实现在肿瘤区域的H2O2快速释放。同时,系统研究了游离Ca2+在肿瘤细胞中的生物学效应及其与H202的协同抗肿瘤作用机理。CaO2纳米晶产生的H202,可以引起肿瘤细胞的氧化应激,进而干扰钙相关离子通道,使得分解产生的Ca2+无法及时储存或外排到肿瘤细胞外,导致细胞质内大量Ca2+异常滞留而引起钙超载这种钙超载可以将调控性的钙信号转变为凋亡信号,进而导致细胞死亡。此外,Ca2+的异常累积还能促进肿瘤钙化的发生发展,不但可用于CT影像监测,同时还可以进一步抑制肿瘤的增殖,最终导致肿瘤的死亡。我们把这类由外源钙引发钙超载导致的肿瘤死亡方式,命名为“肿瘤钙死亡疗法”。在这一工作中,我们开始注意到某些金属离子的生物学效应同样具有肿瘤辅助治疗作用,这类创新策略将有望为后续抗肿瘤纳米药物开发开辟新的道路。（3）基于放疗辅助的新型离子干扰疗法用于肿瘤治疗。受启发于上述过氧化物纳米体系的合成工艺以及金属离子潜在的肿瘤生物效应我们提出了一类基于放疗诱导的新型离子干扰疗法用于肿瘤治疗的新策略。采用改进工艺,成功制备出具有肿瘤放疗增敏功能的含有重金属元素的BaO2纳米材料,并在其表面修饰GLDA金属螯合剂,实现可控的钡元素的生物学功能转换。在正常组织中,Ba02纳米材料不具有化学活性,但在肿瘤区的X射线辐照下,钡作为高原子序数元素可以沉积更多的X射线能量,同时激发H2O2发生均裂转变成高活性的羟基自由基,用以提高放疗损伤作用。同时,高活性羟基自由基还可以破坏表面修饰的GLDA分子结构,使其失去螯合金属离子的能力,造成游离Ba2+的泄露。Ba2+作为高效的钾离子通道阻滞剂,在肿瘤细胞中可以进一步发挥其生物学功能,起到离子干扰作用,用于协同放疗抑制肿瘤的增殖生长。我们把这类利用肿瘤细胞内功能性离子干扰其正常增殖代谢的治疗策略,命名为“肿瘤离子干扰疗法”,它利用具有生物学效应的金属离子来干扰肿瘤细胞的增殖生长,以实现肿瘤协同治疗的效果。这类新型的肿瘤治疗策略将为其它功能性离子用于肿瘤协同治疗提供借鉴性思路,并为抗肿瘤纳米药物的研发开辟了新的途径。
程征[9]（2019）在《Mst1在血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心脏重塑中作用和机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:心脏重塑是一种全球范围内严重的致死性疾病,其给患者造成了沉重的经济负担。心肌重塑包括心肌肥厚、心肌纤维化、炎症细胞的浸润,炎症因子的释放、间质的沉积、线粒体损伤、心肌细胞自噬调节机制的紊乱以及心肌细胞的凋亡,以上因素引起了终末期心力衰竭。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张管-醛固酮系统的核心,其在心肌重塑中发挥了关键性的作用。血管紧张素Ⅱ引起心肌重塑的可能机制包括:血管紧张素Ⅱ通过引起血压升高引起心肌后负荷的增加、水钠潴留引起的心肌前负荷增加、机械牵拉刺激、血管紧张素Ⅱ引起各种促炎症因子以及炎症因子的释放、TGF-β1的表达过高和心肌间质的增殖与过度沉积。血管紧张素Ⅱ诱发的心脏重塑所带来高致病率以及高致死率促使人们研究改善心脏功能的各种药物,其中血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂在对抗血管紧张素Ⅱ引起的心脏重塑中发挥着重要的作用。然而,近年研究发现,在临床上尽管血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂逆转心脏重塑能够发挥有效的作用,它们的作用仍然是有限的,心脏重塑的全球发病率仍在不断上升。恼人的―醛固酮逃逸‖事件的发生也进一步限制了血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂在对抗心脏重塑上的功效。因此,通过探索新的可以对抗血管紧张素Ⅱ诱发心脏重塑的分子及其机制通路可能为血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂的治疗提供更多思路,给心脏重塑患者带来新的治疗策略。Mst1,又名丝苏氨酸蛋白激酶4,作为Hippo/YAP信号通路的重要成分,它可以调节肿瘤的发生、调控细胞的增殖以及死亡。我们课题组先前的研究发现Mst1分子有可能在调节心肌细胞的自噬以及凋亡方面发挥着重要的作用,Mst1的过表达可以加重糖尿病心肌病小鼠心功能的恶化。但是,目前对于心肌细胞特异性的Mst1敲除在血管紧张素Ⅱ诱导心脏重塑中施加的作用以及具体的分子机制尚不明确。因此,本论文旨在探讨:1)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重塑,包括是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心肌线粒体损伤。2)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除能够在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心肌纤维化以及高血压方面发挥作用。3)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以通过调节心肌细胞自噬流的途径来对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重塑,并且进一步的探讨其调控心肌细胞自噬流的机制。同时明确心肌细胞特异性的Mst1敲除通过调节心肌细胞自噬流来对抗血管紧张素Ⅱ诱导心脏重塑这一途径是否独立于血管紧张素Ⅱ受体而存在。4)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以改善血管紧张素Ⅱ导致的心肌细胞凋亡,并深入研究其机制,包括心肌细胞特异性的Mst1敲除是否通过对抗ROS介导的JNK通路来缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,而这一过程是否通过心肌细胞特异性Mst1敲除逆转血管紧张素Ⅱ诱导的Trx从ASK1分子上的分离,继而阻断血管紧张素Ⅱ诱导的ASK1-JNK促凋亡信号通路的激活来实现的。第一部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除鼠的产生研究目的:通过构建Mst1flox/flox小鼠和αMHC-Mer Cre Mer工具小鼠,最终在全球首次获得心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠:Mst1Δ/Δ小鼠（予以他莫昔芬诱导的αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠）。研究方法:我们通过标准的Cre-Lox P方案来获取心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠。实施的步骤大致分为:成功构建心肌细胞特异性Mst1敲除的打靶载体（Lox P位点是A12242 to T12275 and A6695 to T6728;外显子是G13681 to A13724,T13561to T13620,C7270 to G7320 and G4350 to G4478）。随后,我们通过电穿孔将其递呈给ES细胞（C57BL/6背景）。接下来,我们对其进行了药物筛选,Polymerase Chain Reaction（PCR）鉴定和Southern blotting杂交鉴定。利用囊胚显微注射法以及随后的嵌合体生产,一定数量的克隆被筛选出来。然后,通过与苏州赛业公司提供的野生型小鼠进行杂交,―亚当与夏娃小鼠‖通过这种种系传递的方式取得。接下来,去NEO的杂合子突变小鼠（Mst1flox/+,3只雄性小鼠和4只雌性小鼠）被确定下来。通过F1代小鼠的交配,我们获得了F2代小鼠,并且通过PCR从F2代小鼠中鉴定出Mst1flox/flox小鼠。进一步,将Mst1flox/flox小鼠与来自于美国Jackson实验室的αMHC-Mer Cre Mer工具小鼠进行交配,F3代小鼠（αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/+mice）诞生了。通过将F3代小鼠（αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/+mice）与Mst1flox/flox小鼠进行回交,F4代小鼠诞生出来。接下来,通过PCR法筛选出F4代的Mst1flox/flox小鼠,并最终从F4代的Mst1flox/flox小鼠中鉴定出αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠,αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠的PCR鉴定产物是413bp的单一扩增条带。接下来,我们给6周龄以上的雄性αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠腹腔注射他莫昔芬（40 mg/kg）,连续注射5天。考虑到他莫昔芬诱导Cre表达本身有诱发小鼠瞬间心肌病的风险,我们在建立动物模型前给予小鼠以7周的恢复期。因为他莫昔芬诱导Cre表达所导致的瞬间心肌病在5周后自然消失。最后,在动物模型建立前我们通过PCR和Western blotting的方法确定成年鼠心肌组织中Cre酶表达的效率以及心肌细胞特异性的Mst1敲除效果。并且通过心脏超声评估小鼠基线的心功能情况。研究结果与研究结论:全球首例心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠被成功构建。第二部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心功能障碍以及线粒体损伤的影响研究目的:明确心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌失功能以及线粒体损伤的影响研究方法:Mini-osmotic微泵埋植在小鼠肩胛骨之间的皮下。该泵灌满通过无菌生理盐水配置的血管紧张素Ⅱ溶液（1000ng/kg per/min）,持续灌注达46天（按照灌注总体积以及流速流量换算的最大灌注时间是48天）。对照组灌注等体积的生理盐水。通过电脑生成随机数的方式将Mst1fl/fl和Mst1Δ/Δ小鼠以随机分配的方式分配给对照组以及血管紧张素Ⅱ干预组。各种在基线水平上具有相似的血压、血流动力学相关指标以及心脏的结构形态学参数。小鼠的分组方法如下:（1）Mst1fl/fl;（2）Mst1Δ/Δ;（3）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl;（4）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ（每组有9只小鼠）。7周后,这些小鼠被处死。在处死小鼠前,小鼠的各项无创的心脏超声指标（LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD）以及各项有创的心功能指标（LVSP、LVEDP、d P/dtmax、negative d P/dtmax）被再次评估,接下来,我们评估了这些小鼠的心脏形态学指标。在离体,我们通过JC-1来评估原代心肌细胞的线粒体膜电位,通过TEM和FCM来评估原代心肌细胞的线粒体肿胀程度,通过增强型ATP生物发光分析试剂盒来评估各组小鼠心肌中线粒体ATP的含量水平,继而评价各组小鼠心肌中线粒体的功能。研究结果:1.在Ang Ⅱ微泵灌注的小鼠中,改善的LVEF和LVFS以及回收的LVESD反映心肌细胞特异性的Mst1敲除缓解Ang Ⅱ诱导的心脏失功能。2.Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组的LVSP和positive dp/dtmax指标比Mst1fl/fl组更高。这反映出Ang Ⅱ模型小鼠出现代偿性的心肌收缩能力增加,以此来对抗Ang Ⅱ引起的心脏压力负荷的增加。3.Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组的LVEDP和negative dp/dtmax参数较Mst1fl/fl组下降。这反映出Ang Ⅱ引起小鼠心脏舒张功能的降低。Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组的LVEDP和negative dp/dtmax参数较Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组回升,反映出心肌细胞特异性的Mst1敲除能够改善Ang Ⅱ引起小鼠心脏舒张功能的降低。4.在Ang Ⅱ干预的环境下,转染以AD-sh-Mst1的原代乳鼠心肌细胞呈现出更多的JC-1红色荧光和更少的JC-1绿色荧光。5.TEM显示Ang Ⅱ干预可以诱发明显的线粒体超微结构的损害,Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组的线粒体超微结构损伤较Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组明显减轻。6.反映线粒体肿胀程度的流式FSC/SSC显示Mst1Δ/Δ能够有效减轻Ang Ⅱ引起的心肌线粒体的肿胀。7.在慢性Ang Ⅱ微泵灌注组中,Mst1Δ/Δ能够有效增加线粒体ATP的含量。研究结论:1.心肌细胞特异性的Mst1敲除能够有效的缓解Ang Ⅱ诱导的心脏失功能。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除也能够减轻Ang Ⅱ引起的心肌线粒体损害。第三部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心肌纤维化以及高血压的影响研究目的:明确心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌向心性代偿性肥厚、不良的心肌离心性肥厚、心肌纤维化以及高血压的影响。研究方法:小鼠被处死后,迅速清洗心脏,去除血液和水分后统计HW/BW and HW/TL指标。然后将每个样本的左心室横截面切片予以固定高度和位置,进行H&E染色。通过3DHISTECH软件来评估H&E染色的左心室切片LVWT和IVST指标。心肌细胞长轴、心肌细胞短轴和心肌细胞横截面积通过软件Image-Pro Plus 6.0,采用H&E染色和WGA染色进行评估。考虑到Ang Ⅱ干预还可导致左心室出现适应不良的离心性肥厚,对外不但呈现出心肌细胞延伸,还可以表现出心肌细胞的凋亡加重。因此,每个左心室标本也被连续切成6μm厚的切面,每个切片都予以TUNEL染色来评价心肌细胞的凋亡率。RT-PCR和Western blotting用来评价ANF和β-MHC的m RNA表达水平和蛋白质表达水平。接下来,我们采用马松三色法以及天狼星红染色来评价各组左心室心肌纤维化程度。马松切片通过扫描仪扫描后采用pannoramic viewer软件进行评估左心纤维化程度。造模型期间,我们采用鼠尾无创血压检测系统来评估各组小鼠的舒张压,收缩压以及心率情况。各只小鼠的血压以及心率每两天检测一次。研究结果:1.虽然慢性Ang Ⅱ微泵灌注引起小鼠HW/BW和HW/TL以及LVWT和IVST指标的升高,Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组的上述指标并未看到显着差异。无论是通过H&E染色,还是通过WGA染色来评估心肌细胞长轴、心肌细胞短轴和心肌细胞横截面积,也都体现出同HW/BW、HW/TL、LVWT和IVST等指标相一致的趋势。2.无论是在体实验还是离体实验,ANF和β-MHC的各项RT-PCR和Western blotting结果均提示心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够明显改善Ang Ⅱ诱导的左室心肌代偿性的向心性肥厚。3.心肌细胞特异性的Mst1敲除能够改善Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,减轻Ang Ⅱ诱导的左室心腔扩张（LVESD的减少）,反映心肌细胞特异性的Mst1敲除有可能改善Ang Ⅱ诱导的不良的左室心肌离心性肥厚。4.马松以及天狼星红染色结果提示:Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组的左室纤维化程度没有明显区别。5.无创压力血压检测系统提示:各组小鼠的心率、舒张压以及收缩压在慢性Ang Ⅱ微泵灌注实验开始时没有显着差异;46天后,Ang Ⅱ微泵组小鼠的心率、舒张压以及收缩压均显着高于其相应的对照组。然而,心率、舒张压以及收缩压在Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组之间没有显着的差异。研究结论:1.心肌细胞特异性的Mst1敲除不但能够通过缓解心肌细胞凋亡、改善心脏舒张功能、减轻左室心腔扩张来对抗Ang Ⅱ诱导的不良类型左心离心性肥厚,减轻Ang Ⅱ诱导的左心容量超负荷的不良影响;而且心肌细胞特异性的Mst1敲除并不减弱Ang Ⅱ诱导的左心代偿性向心性肥厚,而左心室代偿性的向心性肥厚有助于在一定程度上帮助维系Ang Ⅱ微泵灌注小鼠的心功能以对抗Ang Ⅱ诱导的压力超负荷（左心室代偿性的向心性肥厚维系小鼠的心功能以对抗Ang Ⅱ诱导的压力超负荷是通过拉普拉斯法则来实现的）。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除对于Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化和高血压的影响是微乎其微的。第四部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ干预的小鼠心肌细胞自噬流的影响及其机制研究研究目的:探讨是否心肌细胞特异性的Mst1敲除能够通过改善血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞自噬流来减轻血管紧张素Ⅱ引发的心肌重塑,并进一步探究其深层机制。明确该作用是否能够独立于血管紧张素Ⅱ的1型受体和2型受体。研究方法:在体实验以及离体实验中,采用Western blotting方法检测LC3-Ⅱ/LC3-I、P62/GAPDH、Beclin1/GAPDH、p-JNK、JNK、p-Erk1/2、Erk1/2、Cleaved caspase-3/caspase-3和Bax/GAPDH的表达水平。在体实验中,我们也通过IF和IHC法来检测心肌组织中LC3的表达水平。对于离体细胞实验,我们采用酶解法从1到3日龄的乳鼠左心室中获取原代心肌细胞,原代心肌细胞的培养基为含10%胎牛血清的细胞培养基,其中加入1%的青链霉素双抗。将含有红色和绿色荧光标签的双标荧光蛋白（GFP-m RFP-LC3）转入原代乳鼠心室肌细胞后24小时,再将Mst1 sh RNA（AD-sh-Mst1）腺病毒和Mst1 sh RNA的对照空载体（Ad-Lac Z）腺病毒转入原代心室肌细胞中,注意感染腺病毒4小时后及时换液。36小时后,我们采用Ang Ⅱ（10μmol/l）或者等体积的PBS干预乳鼠原代心室肌细胞达24小时。采用激光共聚焦显微镜观察黄点（代表自噬体）以及红点（代表自噬溶酶体）的表达水平。分离获得原代乳鼠心室肌细胞后按照如下方法进行分组:（i）Control;（ii）Control+Ad-Lac Z;（iii）Control+Ad-sh-Mst1;（iv）Ang Ⅱ;（v）Ang Ⅱ+Ad-Lac Z;（vi）Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1。进一步,我们采用AO染料染原代心室肌细胞,AO染料的红点可以视为反映自噬溶酶体表达水平的一个初步指标;并且采用激光共聚焦显微成像系统观察P62的表达程度。为了进一步明确由心肌细胞特异性Mst1敲除所引发的心肌细胞自噬流增加是否在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌重塑中发挥有益的保护性作用以及为了进一步明确是否心肌细胞特异性Mst1敲除诱导心肌细胞自噬流增加这一效应独立于血管紧张素Ⅱ受体,我们将剩余的小鼠进行重新造模,并且分别予以自噬抑制剂3-MA以及血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞剂络沙坦干预。一部分小鼠予以腹腔注射自噬抑制剂3-MA（每天10 mg/kg）达14天。小鼠分组如下:（1）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl+3-MA;（3）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ+3-MA（每组含有5只小鼠）。各组在实验开始前具有相近的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。7周后,每只小鼠分别采用心脏超声评估LVEF,LVFS,LVESD和LVEDD这些指标。另一部分小鼠采用饮用水中加入血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞剂络沙坦（0.8g/L）的方式来予以干预。我们将这些小鼠按照如下方式进行分组:（1）Mst1fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl;（3）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl+losartan;（5）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ+losartan（每组含有5只小鼠）。各组同样在基线水平上具有相近的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。离体水平上,我们采用针对AT1a受体基因的RNA干扰质粒（p AT1a）以及血管紧张素Ⅱ的2型受体抑制剂PD123319来分别干预原代乳鼠心室肌细胞,并进行相关研究。研究结果:1.无论是在体实验、离体实验,还是Western blotting实验均发现:与对照组相比,血管紧张素Ⅱ微泵干预组具有轻度上调的LC3-Ⅱ/LC3-I和Beclin1表达水平以及轻度下调的P62表达水平。IF以及IHC实验也揭示出血管紧张素Ⅱ干预引起心肌组织中LC3表达水平的轻度上升。在离体的原代乳鼠心室肌细胞中,同其相应的对照组相比,我们观察到血管紧张素Ⅱ干预组具备较轻幅度增加的AO红点以及较小幅度降低的P62红点。相似的,在转染AD-GFP-m RFP-LC3的原代心肌细胞中,血管紧张素Ⅱ干预引发心肌细胞内自噬体以及自噬溶酶体数目的较轻幅度增加。在体实验,在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,自噬抑制剂3-MA进一步加重了血管紧张素Ⅱ引发的心肌重塑,因为我们在Ang Ⅱ+Mst1fl/fl+3-MA组小鼠中观察到LVEF和LVFS值较Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组进一步降低以及cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平较Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组进一步升高。2.无论是在体实验还是离体实验,Mst1Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组都具备相近的LC3-Ⅱ/LC3-I,P62以及Beclin1的表达水平。IHC以及IF实验同样揭示出Mst1Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ组的心肌组织中具有相似的LC3表达水平。进一步,我们发现,在转染AD-GFP-m RFP-LC3的乳鼠原代心室肌细胞中,Ad-sh-Mst1组和Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1组具有相似的自噬体以及自噬溶酶体数目。3.在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除显着增加LC3-Ⅱ和Beclin1的表达水平,显着降低P62,cleaved caspase-3/caspase-3和Bax的表达水平。同时,透射电镜也揭示出在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除组呈现出更多的自噬体数目以及更轻的心肌线粒体损伤。4.在离体实验中,抑制Mst1基因的表达进一步促进血管紧张素Ⅱ干预的原代心室肌细胞内自噬流的增加,因为我们观察到胞浆内更多的GFP-m RFP-LC3点以及显着增加的AO红点伴随有明显降低的P62红点。采用RNA干扰质粒（p AT1a）抑制血管紧张素Ⅱ的1型受体表达的条件下,抑制Mst1基因仍然可以显着促进原代心室肌细胞内自噬流的增加。予以自噬下游阻断剂氯喹干预的情况下,抑制Mst1基因同样可以进一步增加血管紧张素Ⅱ干预的原代心室肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-I的表达水平,进一步降低其P62的表达水平。5.在自噬抑制剂3-MA干预的情况下,心肌细胞特异性的Mst1敲除改善血管紧张素Ⅱ诱导的心功能减退以及降低血管紧张素Ⅱ诱导心肌凋亡的效果消失。6.IF实验揭示出络沙坦降低心肌组织中LC3的表达,但是即使在用络沙坦阻滞血管紧张素Ⅱ的1型受体功能的条件下,心肌细胞特异性的Mst1敲除仍然能够显着增加小鼠心肌组织中LC3的表达。TUNEL实验也揭示出虽然络沙坦可以一定程度的降低血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,相比于Ang Ⅱ+losartan+Mst1fl/fl组,Ang Ⅱ+losartan+Mst1Δ/Δ组小鼠左室心肌组织中的心肌细胞凋亡率仍然能够进一步降低。Western Blotting的实验结果与TUNEL和IF实验的结论一致。在用络沙坦阻滞血管紧张素Ⅱ 1型受体功能的条件下,心肌细胞特异性的Mst1敲除不但可以继续显着增加Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-I的表达水平,显着降低P62的表达水平,还能够继续明显减弱心肌组织中血管紧张素Ⅱ诱发的caspase-3以及Bax的激活。7.在离体实验中,我们发现抑制Mst1基因表达能够逆转血管紧张素Ⅱ诱导的JNK磷酸化,即使采用针对AT1a受体基因的RNA干扰质粒（p AT1a）显着抑制血管紧张素Ⅱ的1型受体表达的情况下,抑制Mst1基因表达仍然能够有效逆转JNK的磷酸化。另一方面,抑制Mst1基因表达却无法降低血管紧张素Ⅱ诱发ERK1/2的磷酸化,而此信号通路是血管紧张素Ⅱ受体下游通路的重要组成部分。研究结论:1.血管紧张素Ⅱ干预所引发的心肌细胞轻度自噬流上调效应是心肌细胞胞内的一种有效的自我代偿性保护机制,在这种条件下,上调的自噬流可以通过清除受损的细胞器、加速受损蛋白质的清除以及再循环来减轻损伤、保护心肌,从而对抗血管紧张素Ⅱ引起的心脏重塑。更加重要的是,血管紧张素Ⅱ干预所引发的心肌细胞自我代偿性保护效应依赖于对Mst1分子的抑制。因为在心肌细胞特异性Mst1敲除的状态下,血管紧张素Ⅱ干预无法再进一步增加心肌细胞的自噬流。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除通过增强心肌细胞胞内自噬流来缓解血管紧张素Ⅱ诱发的心肌重塑,而且该效应独立于血管紧张素Ⅱ受体而存在。3.尽管血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂在临床上广为使用且可以一定程度的改善血管紧张素Ⅱ诱导心肌重塑,本研究发现血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂却抑制了心肌细胞胞内的自噬流,而自噬流是心肌细胞对抗心肌重塑的重要代偿保护性机制。这有可能暗示着血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂在临床治疗上具有其局限性,也能够解释为何临床上有部分患者在规范服用血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂后仍然出现心肌重塑。4.心肌细胞特异性Mst1敲除增强心肌细胞自噬流对抗血管紧张素Ⅱ诱发心肌重塑的分子机制是通过上调Beclin1的表达水平和抑制JNK的磷酸化来实现的。5.即使在阻滞血管紧张素Ⅱ 1型受体的功能或者下调血管紧张素Ⅱ 1型受体表达的条件下,心肌细胞特异性Mst1敲除仍然可以抑制JNK的磷酸化和上调Beclin1的表达水平。第五部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于缓解血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞凋亡的机制研究研究目的:进一步探讨心肌细胞特异性的Mst1敲除缓解血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞凋亡的具体机制。研究方法:常规的小鼠分组方式如前。进一步,为了消除心肌组织ROS的影响,我们采用ROS清除剂NAC（每天50mg/kg）腹腔注射小鼠。Mst1fl/fl小鼠与Mst1Δ/Δ小鼠被随机分入Ang Ⅱ组或者Ang Ⅱ+NAC组。分组方式如下:（1）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1fl/fl+NAC;（3）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ+NAC（n=6只小鼠每组）。各组在实验开始前具有相似的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。46天后,我们通过心脏超声来评估各只小鼠的LVEF,LVFS,LVESD和LVEDD。接下来,将小鼠处死,进行H&E染色、IHC实验、TUNEL实验和IF实验。p-JNK的IHC采用石蜡包埋切片后微波抗原修复法。然后测定心肌组织内超氧化物的含量,我们将小鼠的部分左心室组织采用OCT包埋剂迅速冰冻并且采用冰冻切片机切成8μm厚的冰冻切片,注意尽量保持各只小鼠左心室横截面高度位置的一致性。每只小鼠左心室选取3个截面。采用DHE荧光探针（5mmo/l）37度环境下避光孵育组织切片达30分钟,接下来用激光共聚焦显微镜评估DHE荧光探针的荧光强度。在体实验中,获取心脏组织TUNEL切片后采用数字扫描仪对整张切片进行扫描,获取整张切片的扫描图后利用Pannormamic viewer软件对凋亡的心肌细胞进行统计分析。为了检测Trx与ASK1在小鼠心肌组织中的共定位情况,我们采用序贯的免疫荧光双染法。为进一步明确Trx与ASK1在小鼠心肌组织中的结合情况,我们实施了COIP法。在离体研究中,乳鼠原代心室肌细胞从1-3天的C57BL/6小鼠的左心室中采用酶解法获取。Ad-sh-Mst1和Ad-Lac Z被成功构建以及分选出来。腺病毒的滴度是1.26*1010 PFU/ml.实验采用的病毒重复感染率是100:1,其sh RNA序列是CCCGTTTGTTAAGAGTGCCAAAGGA。在转染Ad-sh-Mst1（adenoviruses harbouring Mst1 sh RNA）以及Ad-Lac Z（control vectors for Mst1 sh RNA）36小时后,乳鼠原代心室肌细胞被施加以Ang Ⅱ（10μmol/l）干预或者等量的PBS干预24小时,同时,予以抗氧化剂NAC（1mmo/l）干预部分乳鼠原代心室肌细胞。进一步,采用DCFH-DA荧光标签来评估接种在激光共聚焦皿中的乳鼠原代心室肌细胞胞浆内ROS水平。离体实验中,我们采用激光共聚焦显微镜观察JNK核转位情况,因为JNK的核转位可以反映JNK的活化情况。为了统计各组原代心室肌细胞的坏死情况与凋亡情况,我们在离体实验中采用AO/EB双染的免疫荧光法。最后,采用商业化的试剂盒来检测各组的胞内MDA、SOD、T-AOC以及线粒体ATP含量。研究结果:1.TUNEL实验揭示出相比于Ang Ⅱ+Mst1fl/fl组,心肌细胞特异性的Mst1敲除组可以有效的降低血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。Western blotting实验也表明血管紧张素Ⅱ干预引起cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平的升高,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以有效减弱血管紧张素Ⅱ诱发的cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平的升高。2.血管紧张素Ⅱ干预可以有道心肌组织内p47phox表达量的增加,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以阻止这一过程的发生。3.血管紧张素Ⅱ干预使得心肌组织中DHE荧光强度显着增加,这一效果被心肌细胞特异性的Mst1敲除所抑制。IHC实验表明:血管紧张素Ⅱ干预诱发小鼠心肌组织内JNK的磷酸化,而心肌细胞特异性的Mst1敲除阻断这一过程的发生。Western blotting实验也表明血管紧张素Ⅱ干预增加了心肌组织内JNK和ERK1/2的磷酸化水平,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以抑制血管紧张素Ⅱ诱发的JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）的激活,但是心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够抑制血管紧张素Ⅱ诱发ERK1/2的活化。4.在血管紧张素Ⅱ微泵灌注的小鼠中,给予NAC干预可以有效抑制血管紧张素Ⅱ诱发的心肌细胞胞内ROS生成,缓解线粒体损伤,这通过DHE荧光密度的下降、MDA水平的下降以及SOD以及T-AOC水平的升高反映出来。在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能进一步抑制活性氧自由基的生成。在血管紧张素Ⅱ微泵灌注的小鼠中,予以NAC治疗可以有效降低JNK磷酸化水平。然而,在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能进一步降低心肌组织JNK磷酸化水平。相似地,在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,TUNEL实验以及H&E染色实验结果提示NAC治疗可以缓解血管紧张素Ⅱ引发的心肌病理改变和降低血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞凋亡。但是,我们在Ang Ⅱ+Mst1fl/fl+NAC组与Ang Ⅱ+Mst1Δ/Δ+NAC组之间没有观察到显着的心肌病理结构改变以及心肌细胞凋亡的差异。5.在离体实验中,抑制Mst1表达有效缓解血管紧张素Ⅱ诱导的原代心室肌细胞的凋亡,这通过Mst1抑制显着缓解了血管紧张素Ⅱ引发的原代心肌细胞胞浆内cleaved caspase-3和Bax表达水平升高来体现出来。此外,我们还发现:血管紧张素Ⅱ干预引起乳鼠原代心肌细胞凋亡率以及坏死率的增加,抑制Mst1表达可以有效缓解血管紧张素Ⅱ干预引起的乳鼠原代心肌细胞凋亡率以及坏死率增加,这通过AO和EB双染实验体现出来。离体实验中TUNEL实验结论同AO/EB双染实验结果相一致。6.在原代乳鼠心室肌细胞中,NAC处理或者Mst1抑制都可以缓解血管紧张素Ⅱ诱发的胞浆内ROS生成,可是在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠心室肌细胞中,再予以Mst1抑制不能进一步降低胞浆内ROS的生成。同样地,血管紧张素Ⅱ促进乳鼠原代心室肌细胞JNK的核转位,该效应可被NAC处理或者Mst1抑制所阻止,可是在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠心室肌细胞中,继续予以Mst1抑制不能再进一步阻止乳鼠原代心室肌细胞JNK的核转位。Western blotting提示血管紧张素Ⅱ干预引起JNK的磷酸化（Thr183/Tyr185）以及ERK1/2的磷酸化,给予NAC处理可以有效缓解血管紧张素Ⅱ诱发的JNK和ERK1/2的激活。抑制Mst1表达可以有效的逆转血管紧张素Ⅱ诱发的JNK磷酸化,但是抑制Mst1表达对于血管紧张素Ⅱ干预引发的ERK1/2的磷酸化没有造成显着影响,这个结论与之前我们在在体实验中得到的结论相符合。在血管紧张素Ⅱ干预同时给予NAC处理的乳鼠原代心室肌细胞,继续抑制Mst1的表达不能够再进一步的逆转JNK磷酸化。7.在离体实验中,抑制Mst1表达能够减弱血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠原代心室肌细胞胞浆内ROS水平的升高,改善心肌细胞线粒体功能,依据在于Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1组可以观察到胞浆内显着的DCFH-DA荧光密度降低,降低的MDA水平以及增加的SOD以及T-AOC水平。然而,在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠原代心室肌细胞中,抑制Mst1表达并不能进一步促进胞浆内DCFH-DA荧光降低,也不能进一步改善SOD和T-AOC水平,无法进一步降低MDA水平。8.COIP实验提示:血管紧张素Ⅱ干预引起心肌细胞中Trx与ASK1的结合力丧失,心肌细胞特异性的Mst1敲除有效逆转了血管紧张素Ⅱ干预引起的心肌细胞胞浆内Trx与ASK1结合力的丧失。心肌细胞特异性的Mst1敲除由此抑制了ASK1的活化,抑制了其下游的促凋亡通路（ASK1-JNK通路）。相比于Ang Ⅱ+Mstfl/fl小鼠,Ang Ⅱ+MstΔ/Δ小鼠心肌组织中呈现出更低的JNK磷酸化水平（Thr183/Tyr185）以及更低的ASK1和p47phox表达水平。Trx与ASK1贯序免疫荧光双标实验也揭示出:同Ang Ⅱ+Mstfl/fl小鼠相比,Ang Ⅱ+MstΔ/Δ小鼠心肌组织中Trx与ASK1呈现出明显的共定位现象,这也暗示心肌细胞特异性的Mst1敲除能够促进了Trx与ASK1的结合,以此对抗Ang Ⅱ诱发的Trx从ASK1中解离的效应。研究结论:1.血管紧张素Ⅱ干预引起心肌细胞胞浆内ROS的生成以及心肌细胞的凋亡,该效应可以被ROS清除剂NAC或者被心肌细胞特异性的Mst1敲除所阻断,其机制是通过抑制JNK的磷酸化和其下游信号通路的激活来实现的。但是,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够缓解血管紧张素Ⅱ引起Erk1/2的磷酸化,这说明心肌细胞特异性的Mst1敲除具有对MAPKs（mitogen-activated protein kinases）信号传导通路的特异性。2.心肌细胞特异性Mst1敲除缓解血管紧张素Ⅱ诱发心肌细胞凋亡的效应依赖于对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞胞浆内ROS生成的抑制。3.心肌细胞特异性Mst1敲除通过降低血管紧张素Ⅱ诱发的氧化应激来缓解血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞线粒体功能丧失。4.心肌细胞特异性Mst1敲除通过促进Trx与ASK1分子的结合来抑制血管紧张素Ⅱ诱发的ASK1分子活化,从而阻滞了血管紧张素Ⅱ诱导的ASK1-JNK促凋亡信号通路的激活,由此缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。
刘伟[10]（2019）在《SIRT1信号通路介导丹酚酸B抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究》文中指出目的:1.评估丹酚酸B（Salvianolic acid B,Sal B）预处理抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用和量效关系;2.评估Sal B预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中炎症反应、细胞凋亡的影响;3.探讨Sal B在大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌保护中对心肌SIRT1表达,及由SIRT1介导的相关蛋白表达的影响;4.在心肌细胞糖氧剥夺再灌（oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGDR）模型下,探讨Sal B心肌保护作用与SIRT1蛋白表达、炎症反应、细胞凋亡间的关系。方法:A.动物实验部分:本研究采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型,SD大鼠随机入组,组别分别为:SHAM组,缺血再灌注模型（Ischemia/Reperfusion,I/R）组,Sal B LD 组（LD:30mg/kg）,SalB HD 组（HD:60mg/kg）,SalB HD+EX527 组（EX527:2mg/kg）;每组 N=16。给药4天后,除SHAM组行假手术外,其余各组均结扎冠脉左前降支（left anterior descdending coronary,LAD）0.5h,复灌24h,后进行下一步骤:1.所有大鼠行心脏超声,检测大鼠心功能;2.后腹主动脉取血,离心后取上清-20℃冻存,以备Elisa用;3.取心脏组织,随机从各组中取3只大鼠心脏多聚甲醛固定,制作石蜡切片,以备 TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）/IHC（immunohistochemistry）用;另各组中随机取3只大鼠行TTC染色;剩余大鼠心脏取出后剪取梗死边缘区2mm心脏组织提取蛋白,以备western blot用;具体观察指标如下:1.心脏功能和大小:心脏超声①左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）、每搏输出量（stroke volume,SV）左室收缩末内径（left ventricular end systolic diameter,LVESD）、左室舒张末内径（left ventricular end diastolic diameter,LVEDD）等;2.心肌损伤标志物及炎症指标:Elisa法测LDH/CK-MB/TNF-α/IL-1β/IL-18/HMGB1;3.心脏梗死面积检测:TTC染色;4.心肌梗死缺血再灌注心脏组织凋亡观察:TUNEL染色;5.组织蛋白免疫组化检测:SIRT1/ac-HMGBl/TLR4;6.心肌梗死缺血再灌注损伤信号通路作用靶点检测:western blot:SIRT1、ac-HMGB1、c-HMGB1、N-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bcl-2、Bax;B.细胞实验部分:采用H9C2细胞,探索建立细胞OGDR细胞模型条件、SIRT1抑制剂EX527最小有效浓度以及SalB细胞毒性测定,确定SalB干预浓度;分组如下:Control组,Sal B组,Model 组,Sal B LD 组,Sal B HD 组,SalB HD+EX527 组;实验步骤如下:第一阶段,将密度为2*104个/ml的心肌细胞均匀种于96孔板中孵育24h。OGDR组分别用无糖培养基在低氧（1%O2）环境下培养,后更换正常培养基,常规培养箱培养,探索OGDR模型建立条件;6孔板孵育H9C2,control组不做任何处理,EX527组分别用50 μM,25μM,12.5 μM三个浓度,westernblot测定SIRT1表达水平,确定EX527最小有效浓度;SalB组毒性试验:MTT法,分别用200 μM,100μ M,50μ M,0μ M测定Sal B最高安全浓度;第二阶段,分别对 control 组,SalB 组,Model 组,Sal B LD 组,Sal B HD 组,SalB HD+EX527组予药物处理,培养24h后,建立OGDR模型,之后检测下列指标:1.MTT检测:在OGDR模型下,不同浓度SalB预处理后H9C2细胞的活性;2.细胞损伤标志物及炎症指标检测:Elisa法检测培养基LDH/CK-MB/TNF-α/HMGB1;3.细胞内损伤信号通路相关蛋白检测:western blot检测SIRT1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B;Bcl-2,Bax。结果:A.动物实验:1.心脏功能评价:I/R 组大鼠 EF、FS、SV 低于正常组（P<0.05）;Sal B LD 组、Sal B HD 组 EF 与I/R 组比较,EF 均高于 I/R 组（P<0.05）;Sal B HD 组 EF 高于 Sal B LD 组（P<0.05）;Sal B HD+EX527 组 EF、FS、SV 低于 Sal B HD 组（P<0.05）。I/R 组心率高于正常组,Sal B LD 组、Sal B HD 组、Sal B HD+EX527 组与 I/R 无差异（P>0.05）。2.心肌损伤标志物评价I/R组大鼠心肌LDH、CK-MB水平高于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,LDH、CK-MB水平均低于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组LDH、CK-MB水平低于 Sal B LD 组P<0.05);与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 LDH、CK-MB水平上升（P<0.05）。3.解剖学评价:I/R组大鼠心肌梗死面积显着高于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,梗死面积占左室面积的百分比均低于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组心肌梗死面积低于Sal B LD组（P<0.05）;与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527组梗死面积升高（P<0.05）;4.病理学评价:Tunel染色:I/R组大鼠细胞凋亡率高于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,细胞凋亡率均低于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组细胞凋亡率低于Sal B LD 组（P<0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组率升高（P<0.05）。5.组织蛋白表达评价:Western blot:I/R 组大鼠心肌 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表达低于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,心肌SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1表达均高于I/R 组（P<0.05）;Sal B HD 组 SIRT1 Bcl-2、N-HMGB1 表达高于 Sal B LD 组（P<0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 SIRT1、Bcl-2、N-HMGB1 表达降低（P<0.05）。与之相反的是,I/R组SD大鼠心肌C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B表达高于正常组（K0.05）;Sal B LD 组、Sal B HD 组与 I/R 组比较,C-HMGB1、ac-HMGB1、Bax、TLR4、NF-κ B 表达均低于 I/R 组（P<0.05）;Sal B HD 组 C-HMGB1、ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 表达低于 Sal B LD 组（K0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527组C-HMGB1、ac-HMGBl、TLR4、NF-κ B、Bax 表达升高（P<0.05）。免疫组化:I/R组大鼠心肌SIRT1表达低于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,SIRT1均高于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组SIRT1表达高于Sal B LD 组（P<0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 SIRT1 降低（P<0.05）。与之相反的是,I/R组SD大鼠ac-HMGB1、TLR4表达高于正常组（P<0.05）;Sal B LD组、Sal B HD组与I/R组比较,ac-HMGB1、TLR4表达均低于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组ac-HMGB1、TLR4表达低于Sal B LD组,有显着性差异（P<0.05）;与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527 组 ac-HMGB1、TLR4 表达升高（P<0.05）。6.炎症相关因子评价I/R 组大鼠 TNF-α、HMGB1 水平高于正常组（P<0.05）;Sal B LD 组、Sal B HD组与I/R组比较TNF-α、HMGB1水平均低于I/R组（P<0.05）;Sal B HD组TNF-α、HMGB1 水平低于 Sal B LD 组（P<0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 LDH、CK-MB水平显上升（P<0.05）。B.细胞实验:1.OGDR细胞模型的建立:在缺氧24h,复氧2h时细胞活率到达63.8%,复氧4h细胞活性上升至80.1%。据此,确定OGDR模型建立时间为:缺氧24h,复氧2h。2.Sal B对H9C2心肌细胞的毒性评估:结果显示100 μ M、200 μ M细胞活性下降至76.7%和47.1%;50μM则与0μM无统计学差异（P>0.05）。因此,确定Sal B最高给药浓度为50 μM（设为细胞模型中:Sal B HD组）,另设置25 μM为低剂量组（Sal B LD组）;3.在OGDR模型下,Sal B预处理对细胞活性的评价:在OGDR条件下,Sal B 25μ M、50μM分别提高细胞活性至75.2%和86.6%,且Sal B 25 μM与Sal B 50 μM间细胞活性比较,差异有统计学意义（P<0.05）,改善细胞活性呈浓度依赖性;EX527逆转了 Sal B的这种作用。4.蛋白表达评价:Model 组 SIRT1 表达低于 control 组（P<0.05）;与 Model 组比较,Sal B LD 组、Sal B HD 组 SIRT1、Bcl-2 表达均升高（P<0.05）,而 ac-HMGB1、TLR4、NF-κB、Bax表达下降（P<0.05）;Sal B HD组SIRT1、Bcl-2表达高于Sal B LD组（P<0.05）,ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax低于Sal BLD组（P<0.05）;与Sal B HD组相比,Sal B HD+EX527组 SIRT1、Bcl-2 表达降低（P<0.05）,同时 ac-HMGB1、TLR4、NF-κ B、Bax 增高（P<0.05）。5.炎症相关因子评价I/R 组 TNF-α、HMGB1 水平高于正常组（P<0.05）;Sal B LD 组、Sal B HD 组与I/R 组比较 TNF-α、HMGB1 水平均低于 I/R 组（P<0.05）;Sal B HD 组 TNF-α、HMGB1水平低于 Sal B LD 组（P<0.05）;与 Sal B HD 组相比,Sal B HD+EX527 组 TNF-α、HMGB1水平上升（P<0.05）。结论:1.Sal B能够有效改善心肌缺血再灌注损伤,呈剂量依赖性;2.Sal B减轻心肌缺血再灌注损伤的机制可能是通过上调心肌SIRT1的表达从而抑制了 HMGB1的核移位与分泌,通过SIRT1介导的HMGB1/TLR4/NF-κ B信号通路,与改善大鼠心肌炎症水平、细胞凋亡有关;3.Sal B减轻了心肌细胞的炎症水平,起到了“凉血消痈”的作用,我们因此推断“热毒”可能是心肌缺血再灌注损伤的中医症候本质之一;SIRT1可能是丹参凉血消痈作用的靶点。
二、Activation/Inactivation of ion channels and pumps during apoptosis: a necessary role in the apoptotic volume decrease（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Activation/Inactivation of ion channels and pumps during apoptosis: a necessary role in the apoptotic volume decrease（论文提纲范文）
（1）靶向下调Cav3.1对喉癌细胞Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要溶液配制 |
| 3.方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 瞬时转染 |
| 3.3 细胞增殖实验 |
| 3.4 细胞凋亡流式实验 |
| 3.5 免疫组织化学检测Cav3.1 的表达 |
| 3.6 实时定量PCR |
| 3.7 Western Blot方法检测Cav3.1 蛋白的表达 |
| 3.8 数据分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 Cav3.1 在喉癌组织中高表达 |
| 4.2 喉癌Cav3.1 表达和基因干预 |
| 4.3 Cav3.1 抑制喉癌细胞的增殖能力 |
| 4.4 si-Cav3.1 对细胞凋亡的影响 |
| 4.5 .si-Cav3.1 Hep-2 细胞凋亡蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 T型钙离子通道Cav3与肿瘤相关的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）cGAS调控LRRC8/VRAC离子通道在天然免疫和肿瘤治疗中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 LRRC8/VRAC阴离子通道 |
| 1.1.1 LRRC8 家族基因的发现 |
| 1.1.2 LRRC8 家族蛋白结构与分布 |
| 1.1.3 体积调节阴离子通道(Volume-regulated anion channels,VRAC) |
| 1.1.4 LRRC8/VRAC阴离子通道的发现 |
| 1.1.5 LRRC8A/VARC 在免疫系统中的作用 |
| 1.1.6 LRRC8/VRAC调控营养代谢 |
| 1.1.7 LRRC8/VRAC参与物质运输 |
| 1.1.8 LRRC8/VRAC在肿瘤治疗的作用 |
| 1.2 cGAS-STING信号通路诱导的天然免疫反应 |
| 1.2.1 DNA 模式识别受体 |
| 1.2.2 cGAS-STING通路与I型干扰素 |
| 1.2.3 cGAS的分子结构 |
| 1.2.4 cGAS的定位与功能 |
| 1.2.4.1 cGAS识别胞质DNA |
| 1 2.4.2 cGAS定位在细胞核内 |
| 1.2.4.3 cGAS定位在细胞膜上 |
| 1.3 cGAS-STING信号通路在抗肿瘤免疫中的作用 |
| 1.3.1 肿瘤微环境中的cGAS-STING的激活 |
| 1.3.2 cGAMP与肿瘤治疗 |
| 1.4 cGAMP跨细胞运输通道 |
| 1.4.1 间隙连接蛋白(GAP-junctions)在相邻细胞间传递cGAMP |
| 1.4.2 叶酸转运蛋白SLC19A1对cGAMP的转运 |
| 1.4.3 体积调节的阴离子通道LRRC8/VRAC 对cGAMP的运输 |
| 第二章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验小鼠 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 病毒毒株 |
| 2.1.4 质粒 |
| 2.1.5 抗体与化学试剂 |
| 2.1.6 商品试剂盒 |
| 2.1.7 缓冲液配制 |
| 2.1.8 实验仪器 |
| 2.1.9 引物列表 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系传代与培养 |
| 2.2.2 小鼠原代细胞的分离和培养 |
| 2.2.2.1 Tamoxifen诱导Lrrc8a敲除 |
| 2.2.2.2 骨髓来源巨噬细胞 |
| 2.2.2.3 鼠肺成纤维细胞 |
| 2.2.2.4 胚胎成纤维细胞 |
| 2.2.3 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blotting) |
| 2.2.5 蛋白质免疫共沉淀(CO-IP) |
| 2.2.6 免疫荧光染色与分析 |
| 2.2.7 低渗条件激活VRAC |
| 2.2.8 液相质谱-色谱联用定量cGAMP试验 |
| 2.2.9 Transwell Assay检测cGAMP转移 |
| 2.2.10 CRISPR-Cas9 构建基因敲除细胞系 |
| 2.2.11 基因克隆与构建稳转细胞株 |
| 2.2.12 病毒感染实验 |
| 2.2.12.1 HSV-1 病毒扩增 |
| 2.2.12.2 HSV-1 体内感染模型 |
| 2.2.12.3 ds DNA病毒感染细胞 |
| 2.2.12.4 HSV-1 病毒滴度测定 |
| 2.2.13 RNA抽提及荧光定量PCR |
| 2.2.14 细胞凋亡与检测 |
| 2.2.14.1 SYTOX Green染色 |
| 2.2.14.2 流式细胞术 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 VRAC通道LRRC8A/E亚型跨细胞膜运输cGAMP调控抗病毒免疫 |
| 3.1.1 LRRC8 家族中亚基 A与亚基 E调控HSV-1 诱导的I型干扰素反应 |
| 3.1.2 VRAC 通道亚基 LRRC8A/E 缺失妨碍胞外 cGAMP 进入细胞 |
| 3.1.3 HSV-1感染后LRRC8A/E VRAC通过转运cGAMP进入到非感染细胞激活 STING通路 |
| 3.1.4 LRRC8A/E VRAC调控HSV-1 病毒诱导的免疫反应 |
| 3.2 血清蛋白增强LRRC8A/E VRAC通道转运cGAMP |
| 3.3 细胞因子增强LRRC8A/VRAC通道转运cGAMP |
| 3.4 血清蛋白及细胞因子增强LRRC8A/VRAC通道转运cGAMP依赖cGAS |
| 3.5 cGAS调控LRRC8A/VRAC通道活性和cGAMP转运 |
| 3.6 LRRC8A/E VRAC通道激活依赖于定位在细胞膜上的cGAS |
| 3.6.1 cGAS在细胞膜上与VRAC相互作用 |
| 3.6.2 cGAS细胞膜位点突变抑制了LRRC8A/E VRAC通道活性 |
| 3.7 PIP2 通过促进cGAS膜定位增强与VRAC的相互作用 |
| 3.7.1 PIP2 增强cGAS与 LRRC8A的相互作用 |
| 3.7.2 PBP10-cGAS上调VRAC介导的胞外cGAMP诱导的IFN反应 |
| 3.8 cGAS和 LRRC8/VRAC转运抗癌药物Cisplatin参与肿瘤治疗 |
| 3.8.1 LRRC8/VRAC运输Cisplatin依赖于cGAS |
| 3.8.2 cGAS参与调控Cisplatin诱导的肿瘤细胞死亡 |
| 3.8.3 cGAS细胞膜位点突变阻碍了VRAC转运Cisplatin |
| 3.8.4 血清和细胞因子通过cGAS增强VRAC介导的抗肿瘤效应 |
| 3.8.5 cGAS 缺失抑制体内 Cisplatin 抗肿瘤效应 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 LRRC8A/E VRAC离子通道与免疫反应 |
| 4.2 LRRC8A/E VRAC离子通道与肿瘤治疗 |
| 4.3 LRRC8/VRAC离子通道的研究展望 |
| 4.4 cGAS对 LRRC8/VRAC离子通道活性的调控 |
| 4.5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）克服顺铂耐药性的铂（Ⅳ）抗肿瘤前药的理性设计及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 前言 |
| 2 铂类抗肿瘤药物的临床发展及作用机制 |
| 2.1 临床发展 |
| 2.2 作用机制 |
| 2.2.1 细胞摄取 |
| 2.2.2 水解活化 |
| 2.2.3 与核DNA的结合 |
| 2.2.4 核DNA的损伤以及诱导细胞死亡 |
| 2.2.5 非DNA的作用机理 |
| 3 铂类药物的毒副作用 |
| 3.1 机制 |
| 3.2 评估 |
| 3.3 药物剂量和监控 |
| 3.4 毒性类型 |
| 3.4.1 肾毒性 |
| 3.4.2 耳毒性 |
| 3.4.3 神经毒性 |
| 3.4.4 心脏毒性 |
| 3.4.5 血液毒性 |
| 3.4.6 肝毒性 |
| 3.4.7 胃肠毒性 |
| 4 铂类药物的耐药性 |
| 4.1 Pt结合DNA之前阶段 |
| 4.2 Pt结合DNA阶段 |
| 4.3 Pt结合DNA之后阶段 |
| 4.4 非DNA相关机制 |
| 5 非经典的铂类抗肿瘤配合物 |
| 5.1 反式铂配合物 |
| 5.2 单功能铂配合物 |
| 5.3 多核铂配合物 |
| 5.4 四价铂(Pt~(Ⅳ))前药 |
| 5.4.1 结构特点 |
| 5.4.2 还原性质 |
| 5.4.3 进入临床试验的Pt~(Ⅳ)前药 |
| 5.4.4 克服顺铂耐药性的Pt~(Ⅳ)配合物 |
| 5.4.5 低毒性的Pt~(Ⅳ)配合物 |
| 5.4.6 靶向肿瘤微环境的Pt~(Ⅳ)配合物 |
| 6 设计思想及研究目标 |
| 7 参考文献 |
| 第二章 靶向核酸修复蛋白RAD51的Pt~(Ⅳ)配合物的设计及作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 合成与表征 |
| 2.2.1 Pt-ART-Ⅰ |
| 2.2.2 Pt-ART-Ⅱ |
| 2.3 油水分配系数的测定 |
| 2.4 氧化还原电位的测定 |
| 2.5 稳定性测试 |
| 2.6 细胞毒活性测定 |
| 2.7 细胞摄取的测定 |
| 2.8 化合物对DNA构象影响研究 |
| 2.9 细胞内DNA铂化的测定 |
| 2.10 细胞周期分布的测定 |
| 2.11 免疫印迹 |
| 2.12 RT-PCR分析 |
| 2.13 免疫荧光 |
| 2.14 细胞内ROS的测定 |
| 2.15 线粒体膜电位(MMP)的检测 |
| 2.16 细胞凋亡的测定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 化合物的表征 |
| 3.1.1 Pt-ART-Ⅰ |
| 3.1.2 Pt-ART-Ⅱ |
| 3.2 脂溶性分析 |
| 3.3 氧化还原电位分析 |
| 3.4 稳定性分析 |
| 3.5 细胞毒活性分析 |
| 3.6 细胞内药物摄取分析 |
| 3.7 化合物对DNA构象影响的CD光谱分析 |
| 3.8 细胞内DNA铂化分析 |
| 3.9 化合物对细胞内DNA损伤分析 |
| 3.10 细胞周期阻滞分析 |
| 3.11 RAD51 蛋白表达情况分析 |
| 3.12 RAD51 RNA转录水平分析 |
| 3.13 RAD51 核焦点的形成 |
| 3.14 肿瘤细胞中ROS分析 |
| 3.15 线粒体膜电位(MMP)的分析 |
| 3.16 凋亡标志蛋白的表达分析 |
| 3.17 细胞凋亡的流式分析 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 同时干预同源重组修复和凋亡逃逸的Pt~(Ⅳ)配合物的设计及机理研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 合成与表征 |
| 2.3 油水分配系数的测定 |
| 2.4 氧化还原电位的测定 |
| 2.5 稳定性测试 |
| 2.6 还原过程性测试 |
| 2.7 细胞毒活性测定 |
| 2.8 细胞摄取的测定 |
| 2.9 细胞内DNA铂化的测定 |
| 2.10 细胞周期分布的测定 |
| 2.11 免疫印迹 |
| 2.12 细胞色素c的释放 |
| 2.13 细胞凋亡的测定 |
| 2.14 免疫荧光 |
| 2.15 急性毒性 |
| 2.16 H&E染色 |
| 2.17 活体抑瘤测试 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 核磁以及元素分析 |
| 3.2 HPLC表征 |
| 3.3 脂溶性分析 |
| 3.4 氧化还原电位分析 |
| 3.5 稳定性分析 |
| 3.6 还原过程分析 |
| 3.7 细胞毒活性分析 |
| 3.8 细胞内药物摄取分析 |
| 3.9 细胞内DNA铂化以及损伤分析 |
| 3.10 细胞周期阻滞分析 |
| 3.11 细胞中Mcl-1 以及凋亡相关蛋白的表达分析 |
| 3.12 细胞凋亡的流式分析 |
| 3.13 细胞中同源重组蛋白RAD51和BRCA2 的表达分析 |
| 3.14 RAD51 核焦点的形成 |
| 3.15 急性毒性和活体抗肿瘤活性评价 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 靶向醛糖还原酶AKR1B1的Pt~(Ⅳ)配合物的设计及机理研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 合成与表征 |
| 2.3 油水分配系数的测定 |
| 2.4 氧化还原电位的测定 |
| 2.5 还原过程性测试 |
| 2.6 细胞毒活性测定 |
| 2.7 细胞凋亡的测定 |
| 2.8 药物细胞摄取测定 |
| 2.9 细胞内DNA铂化的测定 |
| 2.10 免疫印迹 |
| 2.11 细胞周期分布的测定 |
| 2.12 细胞内AKR1B1 的活性测试 |
| 2.13 细胞内山梨醇(sorbitol)含量的测试 |
| 2.14 细胞内PGF2α的测试 |
| 2.15 细胞内脂质过氧化物(lipid ROS)的测试 |
| 2.16 细胞形态的电镜分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 化合物的核磁表征 |
| 3.2 油水分配系数的测定 |
| 3.3 氧化还原电位的测定 |
| 3.4 还原过程测试 |
| 3.5 细胞毒活性分析 |
| 3.6 细胞凋亡的流式分析 |
| 3.7 细胞内药物摄取分析 |
| 3.8 细胞内DNA铂化以及损伤分析 |
| 3.9 细胞周期阻滞情况分析 |
| 3.10 细胞内AKR1B1 的活性以及表达分析 |
| 3.11 细胞内山梨醇含量分析 |
| 3.12 化合物对细胞花生四烯酸代谢以及炎症通路的干预分析 |
| 3.13 细胞内脂质过氧化物以及诱导细胞死亡方式的分析 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 N-羟基吡啶酮类抗脑卒中神经保护剂的设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 脑卒中防治的重要性和紧迫性 |
| 1.2 抗脑卒中药物研发现状 |
| 1.2.1 现有脑卒中治疗药物 |
| 1.2.2 缺血再灌注导致神经细胞死亡的分子机制以及潜在的药物靶标 |
| 1.2.3 处于临床研究阶段的抗脑卒中候选药物 |
| 1.3 先导化合物环吡酮的发现——表型筛选和老药二次研发 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 第2章 衍生物A1-A31的设计合成与优选化合物A10·Ola的发现 |
| 2.1 设计思路和合成路线 |
| 2.2 N-羟基吡啶酮类衍生物的神经保护活性评价以及构效关系 |
| 2.2.1 A1-A31对于SH-SY5Y细胞氧糖剥夺损伤的神经保护作用 |
| 2.2.2 衍生物的氧自由基清除能力和血脑屏障透过性评价 |
| 2.2.3 构效关系总结 |
| 2.2.4 A10及其乙醇胺盐A10·Ola的水溶性 |
| 2.2.5 A10-Ola对于OGD损伤引起的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 2.2.6 A10·Ola可以缓解氧自由基和兴奋性毒性造成的神经细胞损伤 |
| 2.3 A10·Ola的动物药效评价 |
| 2.4 A10-Ola的安全性和肝微粒代谢稳定性的评价 |
| 2.5 A10·Ola和环吡酮胺的体内代谢性质的初步评价 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 N-羟基吡啶酮类衍生物抗中风作用机制探究 |
| 3.1 靶标确证在药物研究中的重要意义和小分子药物靶标确证的方法 |
| 3.2 探针AP1-AP3的设计与合成 |
| 3.3 bSDTNBI预测结果和铁离子螯合实验 |
| 第4章 第一部分总结 |
| 第5章 实验部分 |
| 5.1 衍生物A1-A31、探针AP1-AP3的合成方法与表征数据 |
| 5.2 细胞培养条件、细胞活力以及细胞毒性测试方法 |
| 5.2.1 SH-SY5Y、HT22和MRC-5细胞培养条件 |
| 5.2.2 细胞活力以及细胞毒测试方法 |
| 5.3 OGD损伤、双氧水和谷氨酸损伤实验方法 |
| 5.4 PAMPA-BBB实验方法 |
| 5.5 ORAC-FL实验方法 |
| 5.6 细胞凋亡检测实验方法 |
| 5.7 水溶性测试方法 |
| 5.8 大鼠MCAO模型实验方法 |
| 5.9 hERG钾离子通道膜片钳实验方法 |
| 5.10 小鼠肝微粒体代谢稳定性实验 |
| 5.11 大鼠体内代谢实验方法 |
| 5.12 bSDTNBI预测原理和铁离子螯合实验方法 |
| 5.13 统计分析 |
| 第二部分 酰肼类PfHDAC抑制剂的设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 疟疾现有疗法和青蒿素抗性的出现 |
| 1.2 处于临床研究阶段的小分子抗疟疾候选药物 |
| 1.3 组蛋白去乙酰化酶作为治疗疟疾的潜在靶标 |
| 第2章 前期研究基础、立题依据和研究目标 |
| 2.1 前期研究基础 |
| 2.2 立题依据和研究目标 |
| 第3章 衍生物B1-B18的设计与合成以及苗头化合物B11的发现 |
| 3.1 HDAC抑制剂中的锌离子结合基团 |
| 3.2 N-酰基邻苯二胺类衍生物B1-B9的设计与合成及其抗疟活性的评价 |
| 3.3 酰肼类衍生物B10-B18的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 3.4 引入酰肼锌离子结合基团降低了人源HDAC的抑制活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 酰肼类衍生物B19-B64的设计合成与活性研究 |
| 4.1 衍生物B19-B23的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 4.2 衍生物B24-B64的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 4.3 B11、B35和B36对恶性疟原虫临床株的抑制活性的评价 |
| 4.4 Quisinostat、B11、B35和B36的抗疟活性、细胞毒性和人源HDAC抑制活性的比较 |
| 4.5 构效关系总结 |
| 4.6 衍生物B36的药代动力学性质研究 |
| 第5章 第二部分总结 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 衍生物B1-B64的合成方法与表征数据 |
| 6.2 体外疟原虫抑制活性测试 |
| 6.3 细胞毒性测试 |
| 6.4 人源HDAC抑制活性测试 |
| 6.5 小鼠体内代谢实验方法 |
| 第三部分 基于姜黄素的比率型溶酶体极性荧光探针的发现和应用研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 检测溶酶体极性的重要意义 |
| 1.2 溶酶体靶向极性荧光探针的研究现状 |
| 1.3 姜黄素的光学性质 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 第2章 探针C1-C5的设计与合成 |
| 2.1 探针C1-C5结构设计思路 |
| 2.2 探针C1-C5的合成 |
| 第3章 探针C1-C5的光学性质与其发光机制的研究 |
| 3.1 探针C1、C2、C4和C5在不同溶剂中吸收和发射光谱 |
| 3.2 探针C1和C2的抗干扰能力和光稳定性的评价 |
| 3.3 探针C3和C-M2的光学性质 |
| 3.4 探针C1-C5的极性响应机制研究 |
| 第4章 探针C1的细胞成像应用 |
| 4.1 探针C1和C2的生物相容性的评价 |
| 4.2 探针C1的亚细胞定位研究 |
| 4.3 探针C1对HepG2、HL-7702和293T的细胞成像 |
| 4.4 探针C1监测细胞内溶酶体极性变化 |
| 第5章 第三部分总结 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 探针C1-C5的合成方法与表征数据 |
| 6.2 光谱测试方法 |
| 6.3 细胞培养条件和细胞荧光成像实验方法 |
| 6.4 细胞毒实验测试方法 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英对照表 |
| 发表文章 |
| 专利 |
| 致谢 |
（5）多西环素对慢性间歇缺氧导致的大鼠心房重构干预机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验对象、分组及模型建立 |
| 1.2 主要试验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 基础参数采集 |
| 1.5 病理学实验 |
| 1.6 体外心脏电生理学实验 |
| 1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验 |
| 1.8 蛋白印迹(Western Blotting)实验 |
| 1.9 膜片钳实验 |
| 1.10 心房肌细胞钙瞬变实验 |
| 1.11 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠基础参数比较 |
| 2.2 病理学实验结果 |
| 2.3 体外心脏电生理学实验结果 |
| 2.4 RT-q PCR实验结果 |
| 2.5 蛋白印迹(Western Blotting)实验结果 |
| 2.6 膜片钳实验结果 |
| 2.7 心房肌细胞内 Ca~(2+)瞬变比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 CIH促进大鼠心房结构重构与电重构 |
| 3.2 多西环素通过干预miR-21/PTEN/PI3K/AKT信号通路改善大鼠心房重构 |
| 3.3 多西环素通过干预miR-133a/TGF-β1/CTGF信号通路改善大鼠心房重构 |
| 3.4 多西环素通过干预INa改善大鼠心房重构 |
| 3.5 CIH/多西环素对大鼠心房肌细胞ICa,L 的影响 |
| 3.6 多西环素通过干预Ito改善大鼠心房重构 |
| 3.7 CIH/多西环素对大鼠心房肌细胞AP的影响 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 心房颤动中心房电重构的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验步骤及方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度醉茄素A显着改善心肌缺血/再灌注损伤后心功能 |
| 2.2 醉茄素A抑制线粒体凋亡降低心肌细胞缺血/再灌注损伤 |
| 2.3 醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用依赖AMPK活化 |
| 2.4 醉茄素A促进自噬降解维持自噬平衡降低心肌缺血/再灌注损伤 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验步骤及方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 尼古丁组ApoE小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块形成显着增多 |
| 2.2 尼古丁致尼古丁受体与Cav-1 相互作用失衡 |
| 2.3 Cav-1 是尼古丁引起内皮细胞炎症反应的上游调控因子 |
| 2.4 雄激素受体(Androgen receptor, AR)可能是尼古丁损伤内皮细胞中,Cav-1的下游调控因子 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 个人简历 |
（7）超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的致死效应及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 超声及其作用效应概述 |
| 1.1.1 超声的空化效应 |
| 1.1.2 超声的其他效应 |
| 1.2 超声杀菌效果概述 |
| 1.2.1 处理参数对超声杀菌效果的影响 |
| 1.2.2 微生物种类对超声杀菌效果的影响 |
| 1.2.3 介质性质对超声杀菌效果的影响 |
| 1.2.4 环境因素对超声杀菌效果的影响 |
| 1.3 超声杀菌机制概述 |
| 1.3.1 空化效应的作用方式和途径 |
| 1.3.2 超声场胁迫下微生物的致死过程 |
| 1.4 超声场胁迫下微生物的应激响应 |
| 1.5 本论文的立题背景、研究意义、研究内容和技术路线 |
| 1.5.1 立题背景和研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第二章 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的致死效果 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的可培养性 |
| 2.3.2 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的细胞膜完整性 |
| 2.3.3 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的胞内酯酶活性 |
| 2.3.4 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的代谢能力 |
| 2.3.5 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的细胞异质性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的多靶点致死效应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要材料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7 形态特征的影响 |
| 3.3.2 超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7 细胞膜功能的影响 |
| 3.3.3 超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7 ATP水平的影响 |
| 3.3.4 超声场胁迫对大肠杆菌O157:H7 DNA结构的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 细胞程序性死亡机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 细胞凋亡的生化特征 |
| 4.3.1.1 磷脂酰丝氨酸外翻 |
| 4.3.1.2 凋亡蛋白酶激活 |
| 4.3.2 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 细胞凋亡的诱导因素 |
| 4.3.2.1 溶液中过氧化氢含量上升 |
| 4.3.2.2 胞内活性氧含量上升 |
| 4.3.2.3 胞内钙离子含量上升 |
| 4.3.3 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 细胞凋亡的可能机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的差异表达基因分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 碳水化合物的转运与代谢 |
| 5.3.2 氨基酸的合成代谢 |
| 5.3.3 转录与翻译功能相关 |
| 5.3.4 细胞壁细胞膜相关 |
| 5.3.5 氧化呼吸链 |
| 5.3.6 群体感应 |
| 5.3.7 实时荧光定量PCR法验证 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7 的应激响应机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器与设备 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 胁迫应答子Rpo S的调控 |
| 6.3.2 机械敏感性离子通道的开放 |
| 6.3.3 DNA损伤应答 |
| 6.3.4 热休克应答 |
| 6.3.5 氧化应激反应 |
| 6.3.6 PRM质谱验证结果 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）基于过氧化氢的功能纳米材料的设计合成与抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 过氧化氢分子对细胞的作用 |
| 1.2.1 过氧化氢的产生、代谢与生物分布 |
| 1.2.2 过氧化氢对细胞的生理作用 |
| 1.2.3 过氧化氢与肿瘤细胞的关系 |
| 1.3 基于内源性过氧化氢的肿瘤治疗策略研究 |
| 1.3.1 改善乏氧 |
| 1.3.2 促进芬顿反应发生 |
| 1.3.3 响应性功能激活 |
| 1.4 提高肿瘤细胞内过氧化氢含量的治疗策略 |
| 1.4.1 酶/基因工程调控过氧化氢水平 |
| 1.4.2 外源性物质提高过氧化氢水平 |
| 1.5 金属离子对细胞的生物学效应 |
| 1.6 论文的选题与意义 |
| 第2章 肿瘤微环境响应的过氧化氢发生器用于肿瘤治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 实验表征手段 |
| 2.2.3 Mg-Al LDH纳米片的制备 |
| 2.2.4 LDH纳米片对H_2O_2的负载 |
| 2.2.5 H_2O_2负载率的计算 |
| 2.2.6 酸性环境下释放H_2O_2的研究 |
| 2.2.7 细胞吞噬研究 |
| 2.2.8 细胞毒性研究 |
| 2.2.9 细胞内活性氧水平和线粒体活性研究 |
| 2.2.10 生物透射电镜观察细胞器的形态 |
| 2.2.11 活体内肿瘤治疗效果评价 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 LDH和HLDH纳米材料的合成与表征 |
| 2.3.2 HLDH中H_2O_2负载率的研究 |
| 2.3.3 酸性环境下H_2O_2释放的研究 |
| 2.3.4 细胞吞噬研究 |
| 2.3.5 细胞内活性氧产生和线粒体活性研究 |
| 2.3.6 细胞生物毒性研究 |
| 2.3.7 活体肿瘤的治疗效果评估 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于过氧化钙纳米颗粒的抗肿瘤研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验原料 |
| 3.2.2 实验表征手段 |
| 3.2.3 SH-CaO_2纳米颗粒的制备 |
| 3.2.4 不同pH缓冲液中Ca~(2+)与H_2O_2的释放研究 |
| 3.2.5 细胞毒性研究 |
| 3.2.6 细胞内Ca~(2+)和H_2O_2释放的研究 |
| 3.2.7 实时观察细胞内Ca~(2+)释放和活性氧水平的变化 |
| 3.2.8 细胞线粒体活性研究及细胞分泌物的收集 |
| 3.2.9 生物透射电镜观察细胞器的形态 |
| 3.2.10 细胞钙化研究 |
| 3.2.11 体内生物安全性研究 |
| 3.2.12 CT影像研究肿瘤区域钙化结节的产生 |
| 3.2.13 活体内肿瘤治疗效果评价 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 SH-CaO_2纳米颗粒的合成与表征 |
| 3.3.2 酸性环境下的分解行为研究 |
| 3.3.3 细胞毒性机理研究 |
| 3.3.4 细胞内游离Ca~(2+)与活性氧的产生研究 |
| 3.3.5 SH-CaO_2纳米颗粒的生物矿化能力的研究 |
| 3.3.6 SH-CaO_2纳米颗粒的活体生物安全性评估 |
| 3.3.7 SH-CaO_2纳米颗粒对活体肿瘤的治疗效果评估 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 放疗辅助的离子干扰肿瘤治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验原料 |
| 4.2.2 实验表征手段 |
| 4.2.3 BaO_2纳米材料的制备 |
| 4.2.4 BaO_2纳米材料的表面修饰 |
| 4.2.5 GL-BaO_2纳米材料的稳定性研究 |
| 4.2.6 电子顺磁共振检测羟基自由基的产生 |
| 4.2.7 水溶液中的羟基自由基产率研究 |
| 4.2.8 羟基自由基破坏GLDA化学结构研究 |
| 4.2.9 GL-BaO_2纳米材料的体外细胞毒性研究 |
| 4.2.10 细胞内活性氧与羟基自由基的产生研究 |
| 4.2.11 克隆形成实验研究 |
| 4.2.12 彗星实验研究 |
| 4.2.13 体外的细胞凋亡评估实验 |
| 4.2.14 细胞膜电位的检测实验 |
| 4.2.15 体内生物安全性研究 |
| 4.2.16 体内血液半衰期评估 |
| 4.2.17 体内抗肿瘤治疗实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 GL-BaO_2纳米材料的合成与表征 |
| 4.3.2 GL-BaO_2纳米材料的稳定性研究 |
| 4.3.3 X射线照射下的羟基自由基产率研究 |
| 4.3.4 羟基自由基破坏GLDA分子结构研究 |
| 4.3.5 细胞毒性研究 |
| 4.3.6 细胞内活性氧的产生与细胞凋亡研究 |
| 4.3.7 细胞克隆形成实验与彗星实验评估 |
| 4.3.8 游离Ba~(2+)对细胞的生物学效应研究 |
| 4.3.9 GL-BaO_2纳米材料的活体生物安全性评估 |
| 4.3.10 GL-BaO_2纳米材料对活体肿瘤的治疗效果评估 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）Mst1在血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心脏重塑中作用和机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 心肌细胞特异性的MST1敲除鼠的产生 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验使用的主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验用到的主要仪器与设备 |
| 1.3 实验动物伦理学声明 |
| 2 方法 |
| 2.1 为Mst1条件性敲除设计打靶载体与选择合适的ES细胞 |
| 2.2 心肌细胞特异性Mst1敲除鼠的产生 |
| 3 结果与讨论 |
| 第二部分 心肌细胞特异性的MST1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心功能障碍以及线粒体损伤的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验使用的主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验用到的主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 Alzet Osmotic Pump的配置 |
| 2.2 建立慢性血管紧张素Ⅱ微泵模型 |
| 2.3 高分辨率小动物超声检测小鼠心脏功能 |
| 2.4 左心导管评估小鼠左心功能 |
| 2.5 采用透射电子显微镜观察小鼠心肌组织线粒体状态 |
| 2.6 采用流式细胞仪评估小鼠心肌组织线粒体肿胀情况 |
| 2.7 评估小鼠心肌组织线粒体ATP含量 |
| 2.8 小鼠的乳鼠原代心室肌细胞分离以及培养 |
| 2.9 Mst1ShRNA腺病毒的构建与转染 |
| 2.10 JC-1法检测小鼠乳鼠原代心室肌细胞线粒体膜电位 |
| 2.11 实验采用的统计学方法 |
| 2.12 本课题的在体实验以及离体实验流程图 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞特异性的Mst1敲除缓解Ang Ⅱ诱导的心脏功能减退 |
| 3.2 心肌细胞特异性的Mst1敲除改善Ang Ⅱ诱导的心肌线粒体损伤 |
| 3.3 抑制Mst1能够缓解Ang Ⅱ诱导的原代心肌细胞线粒体膜电位下降 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 心肌细胞特异性的MST1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心肌纤维化以及高血压的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验使用的主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验用到的主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 鼠尾无创血压的检测 |
| 2.2 石蜡切片 |
| 2.3 心肌组织H&E染色 |
| 2.4 心肌组织的Masson染色 |
| 2.5 心肌组织天狼星红染色 |
| 2.6 心肌组织WGA染色 |
| 2.7 RT-PCR |
| 2.8 Western Blotting |
| 2.9 原代心肌细胞的α-SMA染色 |
| 2.10 实验采用的统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞特异性的Mst1敲除不能缓解Ang Ⅱ诱导的心肌向心性肥厚 |
| 3.2 Mst1~(△/△)不能改善Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚相关分子的蛋白表达 |
| 3.3 Mst1~(△/△)不能改善Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚相关分子的mRNA表达 |
| 3.4 心肌细胞特异性的Mst1敲除不能缓解Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化 |
| 3.5 心肌细胞特异性的Mst1敲除不能改变心肌组织的胶原纤维成分 |
| 3.6 心肌细胞特异性的Mst1敲除不能改善Ang Ⅱ诱导的血压升高 |
| 3.7 Mst1抑制不能降低Ang Ⅱ诱导的原代心肌细胞肥厚相关分子的蛋白表达 |
| 3.8 Mst1抑制不能逆转Ang Ⅱ诱导的α-SMA表达升高 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 心肌细胞特异性的MST1敲除对于血管紧张素Ⅱ干预的小鼠心肌细胞自噬流的影响及其机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验使用的主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验用到的主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 心肌组织LC3免疫组化染色 |
| 2.2 心肌组织LC3免疫荧光染色 |
| 2.3 心肌组织TUNEL染色 |
| 2.4 采用自噬抑制剂3-MA干预Mst1~(fl/fl)小鼠和Mst1~(Δ/Δ)小鼠 |
| 2.5 采用Ang Ⅱ的1型受体阻滞剂络沙坦干预Mst1~(fl/fl)小鼠和Mst1~(Δ/Δ)小鼠 |
| 2.6 原代心室肌细胞P62表达水平的免疫荧光检测 |
| 2.7 采用吖啶橙(AO)染色检测原代心室肌细胞酸性囊泡数目 |
| 2.8 采用GFP-mRFP-LC3双标腺病毒评估原代心肌细胞自噬流 |
| 2.9 敲除或拮抗AT1R和AT2R后对原代心肌细胞自噬、凋亡和下游信号通路的评估 |
| 2.10 Western blotting |
| 2.11 实验采用的统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞特异性的Mst1敲除增强血管紧张素Ⅱ干预小鼠心肌的自噬 |
| 3.2 抑制Mst1增强血管紧张素Ⅱ干预的原代心肌细胞自噬水平 |
| 3.3 抑制Mst1增强血管紧张素Ⅱ干预的原代心肌细胞自噬流 |
| 3.4 Mst1~(△/△)增强心肌细胞自噬流发挥保护性的作用以对抗Ang Ⅱ诱发的心肌重塑 |
| 3.5 Mst1~(△/△)通过增强心肌细胞自噬流来缓解心脏重塑这一效应独立于血管紧张素Ⅱ受体 |
| 3.6 Mst1~(△/△)增强心肌细胞自噬流来缓解心脏重塑不依赖于血管紧张素Ⅱ受体的分子机制研究 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 心肌细胞特异性的MST1敲除对于缓解血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞凋亡的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验使用的主要试剂与耗材 |
| 1.2 实验用到的主要仪器和设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 DHE荧光探针检测心肌组织ROS水平 |
| 2.2 JNK核转位的检测 |
| 2.3 AO/EB法评估原代心肌细胞坏死与凋亡 |
| 2.4 Trx与ASK1的免疫共沉淀 |
| 2.5 DCFH-DA荧光探针检测原代心肌细胞胞内ROS水平 |
| 2.6 予以NAC干预后小鼠的分组情况 |
| 2.7 Western blotting |
| 2.8 序贯的免疫荧光双标法(ASK1与Trx) |
| 2.9 实验采用的统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞特异性的Mst1敲除抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡 |
| 3.2 心肌细胞特异性的Mst1敲除抑制Ang Ⅱ诱导的ROS产生和JNK磷酸化 |
| 3.3 Mst1~(Δ/Δ)通过抑制ROS介导的JNK磷酸化来改善Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡 |
| 3.4 抑制Mst1改善Ang Ⅱ诱导的原代心肌细胞凋亡 |
| 3.5 抑制Mst1通过逆转ROS介导的JNK磷酸化来缓解Ang Ⅱ诱导的原代心肌细胞凋亡 |
| 3.6 Mst1~(Δ/Δ)通过增强Trx与ASK1的结合来逆转Ang Ⅱ诱导的ASK1-JNK促凋亡通路激活,从而缓解心肌细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）SIRT1信号通路介导丹酚酸B抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 Sal B的药理学作用 |
| 1.1 心血管药理学 |
| 1.1.1 抗氧化作用 |
| 1.1.2 抗血小板聚集 |
| 1.1.3 促进心脏血管生成 |
| 1.1.4 抑制细胞衰老和凋亡 |
| 1.1.5 抗缺血再灌注损伤 |
| 1.1.6 改善血液流变学 |
| 1.1.7 调节离子通道功能 |
| 1.1.8 抗炎作用 |
| 1.1.9 抗动脉粥样硬化 |
| 1.1.10 抑制左心室重构 |
| 1.1.11 抗心律失常 |
| 1.2 Sal B的其他药理学作用 |
| 1.2.1 抗肿瘤作用 |
| 1.2.2 改善放疗引起的骨髓抑制 |
| 1.2.3 治疗皮肤及肺纤维化 |
| 1.2.4 治疗类风湿性关节炎 |
| 1.2.5 抗抑郁治疗 |
| 1.2.6 改善认知功能 |
| 1.2.7 保护肾脏 |
| 1.3 讨论和展望 |
| 第二章 心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 2.1 MIRI概述 |
| 2.2 MIRI中细胞损伤和死亡的机制 |
| 2.2.1 钙离子超载 |
| 2.2.2 氧化/硝化应激 |
| 2.2.3 线粒体应激 |
| 2.2.4 炎症反应 |
| 2.2.5 细胞死亡 |
| 2.2.6 自噬 |
| 2.2.7 细胞坏死 |
| 2.3 结语 |
| 第三章 SIRT1信号通路介导Sal B抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要使用的抗体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要的实验仪器 |
| 3.1.4 实验动物来源 |
| 3.1.5 实验动物分组 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.2 统计分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 Sal B对SD大鼠心肌缺血再灌注后心功能的影响 |
| 3.3.2 Sal B对SD大鼠I/R心肌梗死面积的影响 |
| 3.3.3 Sal B对SD大鼠I/R后心肌细胞凋亡的影响 |
| 3.3.4 Sal B对SD大鼠I/R后SIRI1介导信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 Sal B对SD大鼠I/R后血清或组织中LDH、CK-MB、HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-18含量的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SIRT1信号通路介导Sal B抗H9C2糖氧剥夺复灌损伤的机制研究 |
| 4.1 材料及方法 |
| 4.1.1 主要的试剂 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.1.3 细胞培养、传代及种板(皿) |
| 4.1.4 药物及试剂配制 |
| 4.1.5 糖氧剥夺再复模型建立(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGDR) |
| 4.1.6 MTT比色法判定OGDR模型的建立 |
| 4.1.7 Sal B对H9C2心肌细胞的毒性试验 |
| 4.1.8 实验分组及给药 |
| 4.1.9 Sal B预处理对OGDR模型心肌细胞活性的测定 |
| 4.1.10 心肌细胞损伤--L-LDH、CK-MB的测定 |
| 4.1.11 心肌细胞促炎症因子检测 |
| 4.1.12 Western Blot检测心肌细胞相关蛋白表达 |
| 4.2 统计方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 OGDR模型的建立 |
| 4.3.2 EX527对H9C2心肌细胞SIRT1表达的影响 |
| 4.3.4 不同浓度Sal B对H9C2心肌细胞活性的影响 |
| 4.3.5 Sal B对H9C2心肌细胞在OGDR模型下SIRT1表达的影响 |
| 4.3.6 Sal B对H9C2心肌细胞OGDR模型下L-LDH、CK-MB、HMGB1、TNF-α的影响 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、Activation/Inactivation of ion channels and pumps during apoptosis: a necessary role in the apoptotic volume decrease（论文参考文献）
- [1]靶向下调Cav3.1对喉癌细胞Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用[D]. 江旋. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]cGAS调控LRRC8/VRAC离子通道在天然免疫和肿瘤治疗中的功能与机制研究[D]. 陈霞. 兰州大学, 2021(09)
- [3]克服顺铂耐药性的铂（Ⅳ）抗肿瘤前药的理性设计及其作用机制研究[D]. 张树人. 南京大学, 2020(09)
- [4]新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究[D]. 胡凌昊. 华东理工大学, 2020(01)
- [5]多西环素对慢性间歇缺氧导致的大鼠心房重构干预机制研究[D]. 张凯. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究[D]. 郭蕊. 山西医科大学, 2019(12)
- [7]超声场胁迫下大肠杆菌O157:H7的致死效应及分子机制研究[D]. 李娇. 浙江大学, 2019(01)
- [8]基于过氧化氢的功能纳米材料的设计合成与抗肿瘤研究[D]. 张盟. 中国科学院大学(中国科学院上海硅酸盐研究所), 2019(03)
- [9]Mst1在血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心脏重塑中作用和机制的研究[D]. 程征. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [10]SIRT1信号通路介导丹酚酸B抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 刘伟. 广州中医药大学, 2019(03)
标签：血管紧张素论文; 特异性论文; 心肌细胞论文; 血管紧张素转化酶抑制剂论文; 心肌损伤论文;