一、动物发育过程中参与Wnt信号传导的因子及调节的研究进展（论文文献综述）
国嵩[1]（2021）在《辛开苦降法治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效评价及基于转录组学的作用机制研究》文中认为1、目的:1.1探究辛开苦降法代表方半夏泻心汤对于慢性萎缩性胃炎（CAG）患者胃功能血清学指标、中医症状、焦虑抑郁状态、睡眠质量、炎症因子的临床疗效;观察半夏泻心汤对于CAG患者应用的安全性。1.2通过高通量转录组学测序技术,筛选半夏泻心汤治疗CAG过程的差异表达基因,探究潜在的靶点与信号通路,揭示其作用的分子机制。2.方法:2.1半夏泻心汤治疗CAG的临床研究采用前瞻性、随机、安慰剂对照临床试验设计,制定纳入、排除标准,将116例CAG患者随机分为2组,对所有患者均进行CAG健康教育。试验组、对照组分别同时接受半夏泻心汤与安慰剂治疗,疗程为8周。以胃功能血清学指标（PGⅠ、PGⅡ、PGR、G-17）、中医症状（胃脘痛、胃脘痞满、胃中嘈杂、神疲乏力、食少纳呆）、焦虑状态（SAS）、抑郁状态（SDS）、睡眠质量（PSQI）、炎症因子（IL-6、IL-17、TNF-α）以及安全性指标为评价指标,评价辛开苦降法代表方半夏泻心汤治疗CAG的临床疗效与安全性,为该方的临床应用提供新的循证医学证据。2.2基于转录组学半夏泻心汤治疗CAG的作用机制研究采集本研究临床部分半夏泻心汤组15例用药前后空腹血以及8例健康志愿者的空腹血,使用TRIzo来提取血液的总RNA。利用Illuminanovaseq 6000平台进行高通量非链特异性RNA测序。测序数据进行预处理和组装后,进行了差异基因表达的生物信息学分析,使用DEGse软件分析各样本之间的差异表达基因。针对半夏泻心汤组治疗前后显着变化的基因使用了 Cytoscape软件中进行基因相互作用分析,并进行相关基因距离富集并可视化。使用Metacore软件进行差异基因表达的通路富集分析和GO生物过程聚类分析,绘制差异表达基因功能GO生物过程和通路的聚类图,构建蛋白质相互作用网络。3、结果:3.1半夏泻心汤治疗CAG的临床研究所有患者均完成8周的治疗,剔除3例病例,脱落13例,最终纳入统计分析的样本量为113例。对照患者女性略多于男性,试验组患者平均年龄（54.93±7.85）岁,平均病程（49.00±48.16）月;对照组患者平均年龄（56.15±8.78）平均病程（46.29±55.04）月。两组年性别、年龄、病程、胃癌家族史、萎缩情况、肠化生情况、中医证型、BMI指数等方面无统计学差异,基础病情特征均具有可比性。胃功能血清学指标状态治疗后改善情况比较,经秩和检验,半夏泻心汤在改善胃蛋白酶原I（PGI）、胃泌素-17（G-17）状态方面均优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。中医症状评分组间比较,经秩和检验,半夏泻心汤在改善胃脘痛、胃脘痞满、神疲乏力、食少纳呆症状方面均优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。改善中医证候有效率比较,半夏泻心汤组总有效率达到84.48%,对照组总有效率达到29.09%,经秩和检验,差异有显着统计学意义（P<0.05）。焦虑抑郁状态比较,经独立样本t检验,半夏泻心汤在改善SAS评分、SDS评分方面均优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。睡眠质量比较,经独立样本t检验,辛开苦降法在改善PSQI评分方面均优于对照剂治疗,差异有显着统计学意义（P<0.01）。经秩和检验,半夏泻心汤在改善炎症因子（IL-6、IL-17、TNF-α）方面均优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。在2月治疗过程中,对照组出现3例不良事件（头痛、腹泻、肝功异常）。其他患者未出现其他不适症状,在研究过程中也无严重不良事件发生。3.2基于转录组学半夏泻心汤治疗CAG的作用机制研究CAG模型组（治疗前试验组）与健康对照组相比有228个基因发生高表达,而半夏泻心汤可以逆转其中66个基因的异常表达;同时,CAG模型组与健康对照组相比有554个基因发生低表达,而半夏泻心汤可以逆转其中34个基因的异常表达。根据差异表达基因GO富集分析的结果半夏泻心汤治疗CAG的主要涉及免疫调节、炎症反应、神经调控等方面。根据差异表达基因通路富集分析的结果,辛开苦降法治疗CAG差异表达基因主要集中在5条信号通路,分别是MEK/ERK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、WNT/Beta-catenin 信号通路、NF-κB信号通路及JAK-STAT信号通路,以发挥多通路、多靶点发挥作用。4、结论:4.1半夏泻心汤治疗CAG的临床研究连续8周治疗后,半夏泻组心汤较安慰剂组显着改善CAG患者血清学胃功能（PGI、G-17）状态,减轻CAG患者胃脘痛、胃中痞满、神疲乏力、食少纳呆等临床症状,提高CAG患者的生活质量,缓解焦虑抑郁状态,改善睡眠质量,降低炎症因子水平,无不良反应发生,因此半夏泻心汤是治疗CAG安全有效的中药复方,值得临床推广应用。本研究为经典名方半夏泻心汤治疗CAG提供了新的循证医学证据。4.2基于转录组学半夏泻心汤治疗CAG的作用机制研究通过转录组学的研究,利用差异基因的表达比较、GO功能富集、通路富集、PPI网络的技术,发现半夏泻心汤治疗CAG的机制涉及多靶点、多过程、多通路,可能与免疫调节、炎症反应、抗肿瘤、神经调控等生物学过程有关,与调控MEK/ERK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路、WNT/Beta-catenin 信号通路、NF-κB信号通路及JAK-STAT信号通路等有关。
王晓玲[2]（2021）在《β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究》文中进行了进一步梳理肝纤维化是肝脏组织急性或慢性细胞损伤引起的可逆性伤口愈合反应,反映了肝脏修复和瘢痕形成之间的平衡[1]。目前肝脏慢性纤维化疾病的总负担不断增长,全世界每年约有200万人因此死亡[2,3]。然而,尽管对纤维化病理生理机制取得了实质性进展,但在确定抗纤维化靶点并转化为有效治疗方面仍为空白[3,4],因此,减轻或逆转肝纤维化的研究具有直接的临床意义[5]。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）作为肝纤维化发病机制的主要调节因子,旁分泌或自分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）,调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、沉积、降解[4,6,7]。近期研究表明,TGF-β/SMAD信号通路中,SMADs需要与其它DNA结合转录因子相互作用,即β-catenin与T细胞因子（T cell factor,TCF）、叉形头转录因子O1（Forkhead box O1,FOXO1）和乏氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）相互作用,调控TGF-β/SMAD信号通路,其相对活性取决于结合β-catenin的“转录伴侣”[8]。当β-catenin与TCF结合时,促进细胞增殖和纤维化[9],然而在与FOXO1结合后,发挥抗增殖、促凋亡、促进细胞在氧化应激下的存活[10,11]。在人类结肠癌细胞中发现FOXO1与TCF竞争结合β-catenin[12],在肾脏纤维化的研究中发现[8],β-catenin/FOXO1转录复合物形成可以促进TGF-β诱导的调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）foxp3的表达[8,13],发挥抗炎作用,然而β-catenin不同“转录伴侣”在HSCs及其肝脏纤维化中的作用仍不清楚。因此,本研究从细胞、动物、人体多水平,正向、反向多角度探讨TGF-β信号通路转录因子β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控HSCs增殖活化的作用机制,并在体内实验中探讨转录因子复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1对HSCs增殖活化、细胞外基质沉积、肝脏组织免疫调节的作用及其机制,发现转录因子复合物TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,可以调节TGF-β促纤维化生物学效应开关,导致不同的生物事件结局,为精准靶向抑制肝脏纤维化的临床研究提供基础及思路。目的:1.结合细胞水平和动物水平实验,阐明肝脏纤维化过程中,TGF-β信号通路中β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录因子复合物在肝纤维化病程中的作用机制;研究通过调控HSCsβ-catenin转录因子复合物,启动TGF-β多重生物学效应开关,导向不同生物学事件结局的思路在改善肝脏纤维化中的应用。2.在人体肝纤维化组织中分析β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与纤维化进展之间的关系,丰富肝纤维化疾病进展的病理生理基础,为肝纤维化的治疗提供了新的思路和策略,为进一步探索其在肝脏以及其它器官纤维化治疗中的临床应用提供支撑。方法:1.体外实验:人肝星状细胞LX2体外培养,分对照组、TGF-β诱导分化组、TGF-β诱导分化+ICG-001干预组、TGF-β诱导分化+ICG-001+AS1842856组通过Western Blotting、RT-q PCR检测各组细胞外基质α-SMA和COL-I水平以及HSCs细胞周期、氧化应激功能,应用Western Blotting、Co IP、PLA方法分析HSCs活化后,各组β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平变化。2.体内实验:根据肝纤维化的不同病因,构建四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎（BDL）两种肝纤维化小鼠模型,观察小鼠肝脏外观,速率法检测丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶,同时对肝纤维化不同时期进行肝脏组织切片、染色,提取RNA及逆转录、RT-q PCR,分析肝纤维化小鼠模型不同时期的纤维化以及炎症因子水平,判断不同模型的干预时间;采用邻位连接技术（PLA）分析肝纤维化不同时期β-catenin转录复合物变化规律。3.在以上实验的基础上,对两种肝纤维化小鼠模型应用β-catenin/TCF抑制剂ICG-001进行干预,分别设立对照组、模型组、ICG-001干预组,观察小鼠肝脏外观,计算肝重、体重比,应用小鼠肝酶血清学水平检测、组织学染色、免疫组化、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原蛋白（COL-1）RNA表达水平检测相结合的方法,评价ICG-001干预后是否抑制小鼠肝脏纤维化,并应用ELISA方法检测了BDL各组肝脏组织炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6水平。4.为正反两个角度进一步探索TGF-β信号通路转录因子复合物在抑制肝脏纤维化中的作用机制,BDL小鼠肝纤维化动物模型中增加TGF-β组、FOXO1抑制剂干预组,采用免疫组化、Western blotting、RT-q PCR、Co IP、PLA实验,分析以β-catenin为核心的转录复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1之间的转换关系;应用组织免疫荧光共定位、组织HSCs特异细胞PLA实验分析体内TGF-β信号通路转录因子复合物对HSCs细胞的作用,并应用RT-q PCR检测了foxp3、TNF-α、P27kip1表达水平。5.最后在胆道闭锁患者不同肝纤维化分期的肝脏组织中开展免疫组化、RTq PCR、PLA实验,分析人体肝脏组织中TGF-β水平、细胞增殖水平、IL-10、β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与肝纤维化分期是否相关,为重新定向TGF-β信号通路转录因子复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF治疗肝纤维化的临床策略提供依据。结果:1.体外实验:β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1参与肝星状细胞的增殖活化1.1β-catenin/TCF抑制剂ICG-001干预活化的LX2细胞,WB结果显示,ICG-001组LX2细胞α-SMA蛋白表达水平与TGF-β组相比显着下降;ICG-001+AS1842856组与ICG-001组比较,α-SMA蛋白表达水平显着高于ICG-001组;而ICG-001组与对照组相比,α-SMA蛋白表达水平差异不具有统计学意义,ICG-001+AS1842856组与TGF-β组相比,α-SMA表达水平差异不具有统计学意义。说明ICG-001可以抑制活化的HSCs转分化为肌成纤维细胞。1.2 Mn SOD、p27kip1 RT-q PCR结果显示,ICG-001组LX2细胞Mn SOD、p27kip1表达水平的变化趋势与α-SMA、COL-I WB结果相反。说明ICG-001干预活化的HSCs使HSCs细胞周期阻滞,抗氧化应激水平增强。1.3以β-catenin作为Co IP抗体的免疫共沉淀结果显示,ICG-001组与TGF-β组相比,β-catenin结合的TCF水平显着下降,FOXO1水平显着升高。β-catenin、TCF、FOXO1 PLA结果显示,ICG-001组LX2细胞β-catenin/TCF互作与TGF-β组相比显着下降,β-catenin/FOXO1结果与β-catenin/TCF相反。综合与β-catenin结合的TCF、FOXO1水平,应用TF ratio（β-catenin/TCF versusβ-catenin/FOXO1）指标分析各组之间转录因子水平的差异,结果显示TF ratio水平变化趋势与LX2细胞活化的特异性标记物α-SMA表达水平一致,LX2细胞的活化与TF ratio水平升高密切相关。以上结果说明β-catenin/TCF可以促进TGF-β诱导的HSCs增殖、活化。2.体内实验;小鼠肝纤维化动物模型以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与肝纤维化病程关系初探2.1 CCl4肝纤维化小鼠模型在造模4w时,ALT、AST水平达到最高,随着造模时间延长,6w、8w时点ALT、AST水平呈现下降趋势;小鼠肝脏组织HE染色、网状纤维染色结果显示,在造模4w时纤维组织增生逐渐显着,网状纤维增粗、断裂,纤维间隔初步形成,随着造模时间延长,纤维间隔显着;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,随着CCl4注射时间延长至4w,α-SMA表达水平与对照组相比显着升高。小鼠肝脏组织IL-6、TNF-αm RNA表达水平在模型4w时达到高峰,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,6w时达到高峰,8w时下降。2.2 BDL肝纤维化小鼠模型BDL术后1w,ALT、AST与Sham相比显着升高,术后2w时达到顶峰,术后3w、4w呈现下降趋势;小鼠肝组织HE染色、网状纤维染色、Masson染色、亮绿-天狼星红染色分别从炎症细胞浸润、网状纤维、胶原纤维增生不同维度检测结果显示,BDL术后1周可见毛细胆管增生,汇管区增大,肝细胞轻度水肿变性,少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,随着术后时间延长,可见局灶性坏死,毛细胆管数量增多,肝细胞空泡样变加重;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,BDL术后1w汇管区α-SMA表达水平与对照组相比显着增加,随着BDL术后胆总管结扎时间延长,α-SMA表达水平持续升高,。小鼠肝脏组织TNF-αm RNA表达水平在模型1w、2w、3w时逐步上升,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,2w、3w时显着升高。以上结果说明CCL4、BDL两种不同机制导致的小鼠肝纤维化模型分别在造模4w、1w时即出现炎症细胞浸润,纤维组织增生。2.3 CCL4、BDL模型不同时期对小鼠肝脏石蜡组织切片进行原位PLA实验,检测β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物在病程不同阶段的变化,结果显示β-catenin/TCF水平在CCl4造模4w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,在CCl4造模4w时显着下降;β-catenin/TCF水平在BDL手术造模1w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,术后1w时下降。说明在两种模型中β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平与肝纤维化病程相关。3.抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化3.1 CCl4、BDL肝纤维化小鼠模型分别应用ICG-001干预1w、2w,对肝脏外观、肝重/体重比、肝酶、组织学、α-SMA、COL-I m RNA及蛋白水平进行了比较,结果显示,CCl4、BDL模型中ICG-001干预1w时,肝重体重比较模型组无显着差异,干预2w时,肝重体重比与模型组相比显着下降。两种模型1w、2w干预组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）与模型组相比均显着下降。CCl4模型肝脏组织HE染色、网染结果显示,ICG-001组与同期CCL4模型组相比,炎性细胞浸润减少,纤维间隔包绕肝细胞团与同期模型组相比减少。BDL模型肝脏组织HE、Masson、网状纤维、天狼星红染色结果显示,ICG-001组与同期BDL模型组相比,毛细胆管增生及纤维化减少,炎性细胞浸润减轻,I型胶原、III型胶原数量显着降低,网状纤维断裂、肝细胞板增厚程度减轻;BDL模型天狼星红染色半定量结果显示,ICG-001组胶原沉积显着低于同期模型组。RT-q PCR结果显示两种模型ICG-001组2w时COL-I、α-SMA阳性比例与同期模型组相比显着下降。免疫组化结果显示CCl4模型ICG-001组COL-I水平显着低于同期模型组,干预2w COL-I水平与干预1w时相比显着下降;BDL模型ICG-001组α-SMA水平显着低于同期模型组,干预2w时α-SMA水平与干预1w相比显着下降。以上结果说明抑制β-catenin/TCF 1w或2w,均可改善肝纤维化。3.2 CCl4、BDL模型在ICG-001干预后foxp3水平与模型组相比显着升高,p27kip1水平与模型组相比显着升高。3.3 BDL模型,ICG-001干预2w时,IL-6水平与同期模型组相比显着下降;TNF-α、IL-17变化趋势与IL-6一致,IL-10则显着增加。4.BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控肝纤维化的分子机制4.1 BDL模型中,腹腔注射AS1842856抑制FOXO1后,免疫组化、WB检测小鼠肝脏组织α-SMA水平,结果显示,应用AS1842856干预后,α-SMA水平显着增加,肝脏纤维化加重;当在ICG-001基础上应用AS1842856干预时,α-SMA阳性细胞数与ICG-001组相比显着增加。α-SMA和COL-I WB及半定量分析结果显示:术后给予ICG-001,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与BDL组相比显着下降,在此基础上应用AS1842856,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与ICG-001组相比显着增加。4.2各组小鼠肝脏组织核蛋白IP实验结果显示BDL组与Sham组相比,β-catenin/TCF升高、β-catenin/FOXO1降低,ICG-001干预后,与Sham组趋于一致,在此基础上应用AS1842856,β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与Sham组相比均显着下降。各组小鼠肝脏组织石蜡切片进行PLA实验,结果显示各组TCF、FOXO1与β-catenin互作的变化趋势与肝脏核蛋白Co IP实验结果基本一致,BDL术后以及TGF-β的作用下,β-catenin、TCF互作呈现增长趋势,而β-catenin、FOXO1互作显示下降,与肝脏纤维化进展相关。ICG-001干预后β-catenin、TCF结合减弱,β-catenin、FOXO1结合增强,而在ICG-001+AS1842856组,β-catenin与TCF、FOXO1的互作关系均减弱,与肝脏核蛋白Co IP实验结果一致。4.3组织免疫荧光结果显示BDL模型组HSCs增殖活化水平显着高于Sham组,ICG-001组显着低于模型组,TGF-β组HSCs数量及活化较BDL模型组增强,ICG-001干预TGF-β组HSCs增殖活化水平显着下降,与ICG-001组相比无显着差异。BDL模型组HSCs细胞β-catenin/TCF ligation与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组β-catenin/TCF与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/TCF ligation较TGF-β组显着下降。β-catenin/FOXO1ligation BDL组显着低于Sham组,ICG-001干预后与BDL组比较显着升高;TGF-β组β-catenin/FOXO1与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/FOXO1 ligation较TGF-β组显着升高。TF ratio作为β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1的比值,可以综合评价与β-catenin竞争结合的TCF、FOXO1之间的动态变化,BDL模型组HSCs细胞中TF Ratio与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组与BDL组相比无显着差异,ICG-001干预TGF-β组,TF Ratio较TGF-β组显着下降,与ICG-001组无差异。结合本部分2.1结果显示TF ratio下降,肝纤维化程度减轻,反之则加重。4.4 BDL模型组小鼠肝脏组织RT-q PCR结果显示TNF-α、foxp3表达水平与Sham组比较显着升高,ICG-001干预后TNF-α显着下降,foxp3进一步增加,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,TNF-α水平显着升高,foxp3表达下降。4.5 ICG-001干预后p27kip1水平与BDL模型组相比显着升高,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,p27kip1水平发生显着下降。5.人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物与纤维化进展的关系5.1经过彩色多普勒超声初诊,腹腔镜胆囊插管造影确诊的16例胆道闭锁以及其它患者,依据HE、Masson、天狼星红染色结果进行纤维化程度的Ishak评分分期,其中0期3例,1期4例,2期、3期、4期各3例。5.2不同分期患者肝脏组织Masson染色、IL-10、Ki67半定量分析结果显示,肝脏组织纤维化程度逐渐加重,IL-10水平S0-S2期显着升高,细胞增殖S2-S4期显着增强,这些指标均与TGF-β表达水平逐渐升高相关。5.3患者肝脏组织石蜡切片PLA结果显示,S0、S1、S2、S3期β-catenin/TCF ligation S0-S2期逐渐增多;β-catenin/FOXO1 S0期最高,S0-S2期逐渐下降;TF ratio与患者肝脏纤维化程度变化趋势一致。结论:1.体外人肝星状细胞LX2实验中,TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,形成不同转录因子复合物,调控TGF-β诱导的LX2转分化及细胞周期、氧化应激水平。2.体内动物实验中,TGF-β通路下游转录因子TCF、FOXO1同样存在竞争结合β-catenin;β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1作为TGF-β通路不同生物学效应的开关导致促纤维化和抗炎、细胞抑制--不同的生物学事件结局。体内通过调控HSCs TF ratio,可以抑制HSCs细胞的增殖活化,减少细胞外基质沉积,同时调节肝脏组织免疫反应,减轻组织慢性损伤,改善肝纤维化。3.β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1相对水平即TF Ratio水平升高与BA患者肝脏纤维化病程早期进展相关。
许琳[3]（2021）在《基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制》文中研究说明研究背景溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种慢性、复发性疾病,是炎症性肠病的常见亚型之一。UC以反复发作的腹泻、腹痛,黏液脓血便为主要临床特点,近10年来我国UC发病率迅速上升。UC的发病机制复杂,其中肠黏膜屏障损伤是UC发病的重要病理生理基础,黏膜愈合是UC治疗的关键终点指标,但维持肠黏膜屏障完整,促进肠上皮损伤后修复的调控机制尚未阐明。巨噬细胞作为固有免疫系统中的主要效应细胞,在UC炎症损伤和上皮修复过程中发挥关键作用。巨噬细胞失调是UC黏膜免疫紊乱的突出特征,同时是达到黏膜愈合和体内稳态的关键靶点。目前UC的治疗方案仍存在停药后难以长期维持临床缓解及部分患者无应答的问题,严重影响了患者的生活质量并导致了高昂的医疗负担。鉴于巨噬细胞强大的可塑性及其在肠道稳态中的调控作用,近年来巨噬细胞成为UC治疗的焦点。最近的研究表明β-catenin/FOSL2/ARID5A或为调控巨噬细胞极化的关键通路,但其在UC发生发展中的作用尚需进一步明确。越来越多的研究证据支持中医药治疗UC具有良好的临床效果,能有效缓解患者临床症状,改善预后,但具体的作用机制尚需进一步明确。清热利湿复方加味葛根芩连汤是导师唐旭东教授在对UC基本病机理解的基础上,结合多年临床经验制定的经验方。前期动物实验结果表明加味葛根芩连汤能够减轻葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎症状,改善结肠黏膜超微结构,但其作用机制尚待进一步阐明。由此,我们思考加味葛根芩连汤改善UC症状,减轻肠黏膜损伤的机制是什么,是否与调控肠巨噬细胞极化有关,其调控巨噬细胞极化、促进肠上皮修复的通路和靶点是什么,是否与β-catenin/FOSL2/ARID5A通路相关,这值得我们进一步探讨。第一部分UC患者巨噬细胞极化状态的临床研究研究目的明确UC患者结肠巨噬细胞极化状态及β-catenin/FOSL2/ARID5A蛋白表达情况。研究方法1 采用多因子检测方法,对UC患者及健康受试者血清中炎症因子（IP-10、IL-12p70、TNF-α、IL-1β、IL-12p40、IL-23、IL-6、IL-4、IL-10、Arginase、TARC、IL-1RA）含量进行检测。2采用免疫组化检测UC患者及健康受试者结肠活检组织的巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2、ARID5A的表达情况。3采用免疫荧光检测UC患者及健康受试者肠黏膜巨噬细胞极化相关蛋白CD68、CD163、iNOS,肠黏膜屏障关键蛋白 ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin的表达情况。研究结果1与健康受试者相比,UC患者促炎因子IP-10表达水平显着升高（p<0.01）,抑炎因子 IL-10（p<0.05）、IL-4（p<0.05）、Arginase（p<0.001）、IL-1RA（p<0.01）表达水平显着降低。2与健康受试者相比,UC患者结肠组织中肠黏膜屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin 表达水平显着降低（p<0.05）。3与健康受试者相比,UC患者结肠组织中M1巨噬细胞标志蛋白iNOS表达水平显着上升（p<0.05）,M2标志蛋白CD163表达水平显着下降（p<0.05）。与健康对照组相比,UC患者结肠组织中巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2表达水平显着下降（p<0.05）,ARID5A表达水平显着上升（p<0.05）。研究结论一1 UC患者存在炎症因子失衡,具体表现为促炎因子IP-10上调,抑炎因子IL-10、IL-4、Arginase、IL-1RA 下调。2 UC患者存在肠黏膜屏障损伤,肠黏膜屏障关键蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin表达水平降低。3 UC患者存在巨噬细胞极化异常及巨噬细胞极化相关通路β-catenin/FOSL2/ARID5A表达异常,表现为M1巨噬细胞增多,M2巨噬细胞减少,β-catenin、FOSL2表达水平下降,ARID5A表达水平上升。4 β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路的异常可能导致了巨噬细胞极化失调,继而导致炎症因子失衡及肠黏膜屏障的损伤。第二部分加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的效应机制研究在体实验加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤干预DSS诱导急性结肠炎模型小鼠的疗效,以巨噬细胞极化为切入点,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用机制。研究方法1以DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型为载体,将小鼠随机分为正常组、模型组、加味葛根芩连汤低剂量组、加味葛根芩连汤中剂量组、加味葛根芩连汤高剂量组,以小鼠体重,疾病活动指数,脾重,结肠长度,结肠组织病理学评分,电镜为指标评估加味葛根芩连汤的干预效果。2观察加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响:检测小鼠肠黏膜通透性,结肠组织髓化过氧化物酶含量,丙二醛含量,采用免疫组化检测结肠BrdU表达水平评估上皮增殖状况;采用免疫组化检测结肠E-Cadherin,β-catenin,Occludin,ZO-1表达,评估肠黏膜屏障损伤情况。3观察加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的影响:采用流式细胞术检测小鼠脾脏及结肠组织中M1/M2巨噬细胞亚型的含量;采用免疫荧光检测小鼠结肠组织F4/80、CD206 含量;采用 Elisa 检测结肠组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量。4基于β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路,研究加味葛根芩连汤调控巨噬细胞极化的分子机制:采用Western blot检测结肠组织β-catenin、FOSL2、ARID5A 蛋白水平表达情况,采用 Realtime PCR 检测 β-catenin、FOSL2、ARID5A mRNA水平表达情况。研究结果1小鼠一般情况:与正常组相比,模型组小鼠出现弓背、毛发竖起,活动减少,体重降低,腹泻,便血的状况,结肠长度明显缩短,脾重明显增加,组织病理学评分明显升高。与模型组相比,加味葛根芩连汤各给药组小鼠体重显着上升（p<0.001）,加味葛根芩连汤高剂量组DAI评分显着降低（p<0.001）,各给药组结肠缩短状况明显改善（p<0.05）,脾重明显降低（p<0.05）,各给药组组织病理学评分均降低（p<0.05）。结肠电镜结果显示:正常组小鼠的微绒毛发达。细胞充满了线粒体和囊泡。可在细胞与细胞接触的腔侧见到细胞间连接复合体。与正常组相比,模型组小鼠的结肠中,多数紧密连接的结构紊乱,融合点较少见,并且细胞间间隙增宽。加味葛根芩连汤干预组介于正常组与模型组之间。2肠黏膜屏障评估:与正常组相比,模型组肠黏膜通透性明显升高（p<0.05）,MPO含量明显升高（p<0.05）,MDA含量明显升高（p<0.05）,BrdU表达降低（p<0.05）;与模型组相比,各给药组肠黏膜通透性均降低（p<0.05）,各给药组MPO含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组MDA含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组BrdU表达显着上升（p<0.05）。免疫组化检测结果显示,与正常组相比,模型组E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达量下降（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量组E-Cadherin、Occludin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、高剂量组β-catenin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ZO-1表达均显着上升（p<0.05）。4结肠炎症因子检测结果显示与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠黏膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高（p>0.05）,IL-10含量降低（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤各剂量组IL-1β、IL-6含量降低（p<0.05）;。5流式细胞术检测结果:脾脏流式结果显示,与正常组相比,模型组脾脏中M2巨噬细胞比例下调（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤高剂量组白细胞比例下调（p<0.05）,低剂量和中剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）,低剂量组M2比例上调（p<0.05）。结肠流式结果显示,与正常组相比,模型组结肠组织中巨噬细胞比例上调（p<0.05）,M1巨噬细胞比例显着上调（p<0.05）,M2巨噬细胞比例下调（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量和高剂量组Ml比例下调（p<0.05）,高剂量组M2比例上调（p<0.05）,高剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）。免疫荧光结果显示与正常组相比,模型组F4/80表达量显着上升（p<0.05）。6β-catenin/FOSL2/ARID5A表达情况:Western blot检测结果显示:与正常组相比,模型组β-catenin表达降低（p>0.05）,FOSL2表达显着降低（p<0.05）,ARID5A表达升高（p<0.05）。与模型组相比,加味葛根芩连汤各组β-catenin表达均显着升高（p<0.05）,加味葛根芩连汤各组FOSL2表达均显着升高（p<0.05）;加味葛根芩连汤中剂量组、高剂量组ARID5A表达降低（p<0.05）。Real Time PCR检测结果显示,与正常组相比,模型组小鼠结肠组织中β-catenin mRNA、FOSL2mRNA表达水平明显降低（p<0.05）,ARID5AmRNA表达水平明显升高（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组β-cateninmRNA、FOSL2 mRNA水平明显升高（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ARID5A mRNA表达水平显着升高（p<0.05）。研究结论二1加味葛根芩连汤可有效减轻DSS诱导的结肠炎症状,改善体重减轻,结肠缩短,下调MPO、MDA水平,改善肠黏膜超微结构,降低DSS导致的结肠黏膜通透性增加,下调结肠组织促炎因子IL-1β、IL-6表达水平,促进肠上皮增殖,诱导E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达上调,维持肠黏膜屏障完整。2加味葛根芩连汤可调控结肠炎小鼠巨噬细胞极化状态,抑制M1巨噬细胞极化,促进M2巨噬细胞极化,上调β-catenin、FOSL2表达,下调ARID5A表达。离体实验加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤体外干预M1巨噬细胞极化模型的作用,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用靶点。研究方法1构建M1巨噬细胞极化模型:采用PMA叠加LPS/IFN-γ刺激THP-1细胞建立M1巨噬细胞极化模型,镜下观察THP-1细胞形态变化,应用流式细胞术检测细胞表面CD11b阳性表达率。2观察加味葛根芩连汤含药血清对M1巨噬细胞炎症因子的影响.:将细胞随机分为6组,分别是正常组（Con）,模型组（Model）,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（GL）,加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（GM）,加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（GH）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（LW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（MW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（HW）,检测各组细胞上清促炎因子IL-1β的含量变化。研究结果1 以100ng/ml PMA 叠加 LPS（100ng/ml）/IFN-y（20ng/ml）构建 THP-1 M1巨噬细胞极化模型,采用CCK8检测不同浓度含药血清孵育细胞24h后对细胞活力的影响,结果显示血清浓度增高影响细胞活力,且10%加味葛根芩连汤中剂量、高剂量含药血清血清细胞活力显着高于20%血清细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2细胞上清IL-1β检测结果:与正常组相比,各组IL-1β含量均显着高于正常组（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-1β含量均显着低于模型组（p<0.05）;添加抑制剂后,各含药血清组IL-1β含量均显着高于未加抑制剂组（p<0.05）。研究结论三1 CCK8结果提示血清浓度增高影响细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2加味葛根芩连汤含药血清可直接作用于巨噬细胞,抑制LPS/IFN-γ诱导的THP-1巨噬细胞M1方向极化,降低促炎因子IL-1β的释放。添加IWR-1抑制剂后,这一抑制作用减弱,提示β-catenin可能为加味葛根芩连汤的作用靶点,加味葛根芩连汤可通能过β-catenin/FOSL2/ARID5A通路抑制M1巨噬细胞的极化。研究结论加味葛根芩连汤可能通过调控β-catenin/FOSL2/ARID5A通路蛋白表达抑制M1巨噬细胞的极化,促进炎症因子的平衡及肠上皮损伤后修复,维持肠黏膜屏障完整,缓解结肠炎症状。
于海帆[4]（2021）在《YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制》文中研究说明蜕膜化是子宫基质细胞增殖并分化为蜕膜细胞的过程,是子宫对正在发生着床的胚胎的响应,也是胚胎发育和成功妊娠的关键过程。蜕膜化缺陷可能导致一系列妊娠疾病,包括反复自然流产和早期妊娠失败。尽管许多转录因子、细胞因子和信号通路已被证实参与胚胎着床和蜕膜化过程,但其潜在的调控机制目前尚不完全清楚。大量研究表明,Yes-相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）参与调控器官大小、干细胞功能、器官再生和肿瘤发展等过程。基因敲除鼠相关研究已证实,YAP/TAZ在哺乳动物胚胎发育过程中发挥重要作用。YAP缺失的胚胎具有致死性,而TAZ缺失的小鼠能够存活,但表现出肾脏发育缺陷。然而,关于YAP/TAZ在子宫蜕膜化过程中的作用及调控机制的研究很少。本课题旨在研究YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机理,为进一步明确哺乳动物胚胎着床及蜕膜化的机制提供依据。在本研究中我们观察到,在小鼠子宫蜕膜化过程中YAP的表达量逐渐升高,并且证实YAP失活会影响子宫基质细胞的增殖和分化,并伴有细胞周期的阻滞。在子宫基质细胞中,Bmp2可通过Bmp I型受体Alk2促进YAP的表达并诱导YAP的核积累,从而增强细胞核内YAP-TEAD转录活性。通过si RNA或添加抑制剂导致YAP失活后可阻碍Bmp2对基质细胞分化的促进作用。使用荧光素酶报告基因分析发现,迁移到细胞核中的YAP可直接结合到Rrm2启动子区域的TEAD序列,并调节Rrm2在基质细胞中的功能。通过检测8-OHd G含量发现,过表达Rrm2可改善YAP失活引起的基质细胞DNA损伤,同时恢复基质细胞分化。进一步分析发现,YAP介导Bmp2对Rrm2表达的调控,而添加Rrm2抑制剂Triapine处理会阻碍Bmp2对基质细胞分化的诱导作用。YAP抑制后显着下调了GR和GPX的活性,进一步导致GSH含量下降,但上述指标在Rrm2过表达组呈现出相反的趋势。通过检测基质细胞内ROS含量、ATP水平、线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位以及线粒体膜通透性转运孔的开放程度,我们发现YAP失活会引起基质细胞发生氧化应激,并进一步导致线粒体功能发生紊乱。同时,YAP的失活通过促进Caspase-3和Bax的表达并抑制Bcl-2的表达从而诱发基质细胞凋亡。然而,GSH可有效的清除升高的ROS水平,并防止YAP失活引起的氧化应激、线粒体功能发生紊乱和细胞凋亡。本研究结果表明,TAZ定位于蜕膜组织中,能够通过靶向Ccnd3和Cdk4以加速细胞周期G1/S的过渡从而促进基质细胞的增殖,同时TAZ可促进基质细胞分化的标志分子Prl8a2和Prl3c1的表达,提高ALP的活性,表明TAZ对蜕膜化的发生至关重要。沉默TAZ会阻碍HB-EGF诱导的基质细胞的增殖和分化。在氧化应激状态下,TAZ通过减少细胞内ROS水平,并通过依赖于Nrf2/ARE/Foxo1的信号通路来增强基质细胞的抗氧化能力,进而保护基质细胞分化免受氧化损伤。TAZ能够增强Nrf2的转录活性,而Nrf2可直接与Foxo1启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）结合。此外,TAZ沉默后可导致NOX活性升高从而引起细胞内ROS的积累,而一旦NOX的活性被APO抑制后,基质细胞分化所受的损伤可明显获得挽救。进一步研究表明,ATP水平升高、mt DNA拷贝数增加、线粒体膜电位升高和线粒体超氧化物水平下降共同提示,TAZ可明显恢复基质细胞的线粒体功能。同时,TAZ能够调节线粒体呼吸链复合物I和III的活性,而通过ROT和AA分别抑制其活性后,均可导致TAZ对基质细胞分化的保护作用丧失。另外,在氧化应激过程中,TAZ还可通过上调Bcl-2的表达并抑制Caspase-3的活性及Bax的表达来防止基质细胞发生凋亡。综上所述,本研究表明,YAP/TAZ在小鼠蜕膜化过程中发挥重要作用。我们的结果证实YAP可作为Bmp2的下游调控蛋白,通过TEAD/Rrm2/GSH/ROS信号通路调节子宫蜕膜化过程。TAZ可能通过靶向Ccnd3介导HB-EGF在子宫蜕膜化中的作用,并通过Nrf2/ARE/Foxo1信号通路减轻氧化应激介导的基质细胞分化损伤。
浦延鹏[5]（2021）在《基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制》文中指出目的:探索眼针对MCAO/R大鼠神经功能缺损的保护作用机制。观察眼针干预后,对MCAO/R大鼠脑组织尼氏体和血管新生的影响,探究眼针能否通过促进尼氏体恢复,促进血管新生,增加Wnt3a、β-catenin、LEF1及HIF-1α因子的表达,以减轻脑损伤,加快神经功能的恢复,希望能够通过此研究为临床眼针治疗缺血性脑卒中提供可靠的研究依据。材料与方法:1动物及分组选用SPF级健康雄性成年SD大鼠,采用随机数字表法将大鼠分为空白组（blank）、假手术组（sham）、模型组（model）、眼针组（eye acupuncture）、针刺组（acupuncture）,每组12只,遵照《关于善待实验动物的指导性意见》（科技部2006年颁布）中动物的使用及伦理学规定。2模型制备方法采用改良线栓法制备大鼠MCAO/R模型,具体方法见正文。3干预方法空白组,不进行干预;假手术组,在行手术后,不再做其他干预措施;模型组,造模成功后,不再做其他干预措施。针刺组,造模成功后,用13mm的毫针,分别取大鼠的百会穴和曲鬓穴,平刺,进针大约3mm,透过真皮达皮下组织,然后开始计时,在10min时和20min时,各刮针柄5下,共留针20min;眼针组,在造模成功后,选取双侧上焦区、下焦区、肝区和肾区进行眼针针刺治疗,主要采用平刺法,深度透过真皮,留针20min。两组针刺皆在脑缺血再灌注一小时后开始,每隔8h针刺一次,在各时间节点前30min,行最后一次针刺治疗,对3h,24h及72h三个时间节点进行评测,取材检测。4指标检测及方法造模前、后及治疗前、后,观察大鼠的一般情况,应用Longa评分法、Bederson评分法及前肢踩空试验三种方法,对大鼠的神经功能进行评测,应用TTC染色法观察大鼠脑梗死的情况,采用尼氏体染色的方法观察大鼠脑组织神经元的变化情况;通过免疫组织化学观察缺血区大脑皮层CD34+的阳性表达变化,另采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达变化;应用免疫组织化学法和Western blot两种方法,检测大鼠脑组织缺血半暗带区域中HIF-1α因子,及Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路相关因子的表达水平。5统计学分析采用SPSS25.0进行统计分析,以均数加减标准差为统计量（x±s）,采用单因素方差分析（One-Way-Anova）进行总体比较,有差异的采用最小显着差异法（LSD）进行两两比较,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 TTC染色法评价大鼠脑梗死结果显示,空白和假手术组的脑组织呈红色,无明显梗死灶,而模型组则有明显的苍白色梗死灶。2大鼠神经功能障碍评分Longa评分和Bederson评分结果显示,与空白和假手术组比较,模型组大鼠的评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而空白与假手术组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3大鼠前肢踩空试验评分变化在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分改变不明显（P>0.05）,差异无统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。4大鼠尼氏体染色结果尼氏体染色结果显示,在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组尼氏体增加较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而空白和假手术组,眼针组和针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5免疫组织化学法检测大鼠脑组织CD34+的表达在3h时,各组之间CD34+的表达无明显差异（P>0.05）;而在24h和72h时,与空白和假手术组比较,模型组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组,眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠血清VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,且在24h时,眼针组与针刺组比较,眼针组的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组比较,3h和72h时眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7 Western blot法检测大鼠脑组织缺血半暗带区域相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,β-catenin,LEF1的表达明显较多,Wnt3a的表达较低（P<0.05）,而HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,Wnt3a,β-catenin的表达明显较多（P<0.05）,而LEF1和HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在72h时,Wnt3a,HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin和LEF1的表达无明显差异（P>0.05）。8免疫组织化学法检测大鼠脑组织相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠脑组织Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,Wnt3a,β-catenin,LEF1及HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,β-catenin及HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,Wnt3a及LEF1的表达差异无统计学意义（P>0.05）;在72h时,Wnt3a的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin,LEF1和HIF-1α的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.眼针可以改善MCAO/R大鼠的神经功能缺损,其机制可能是通过改善神经元的损伤,从而促进神经功能的恢复,且疗效好于针刺组。2.眼针可以促进MCAO/R大鼠血清VEGFA的增多,从而促进血管新生,改善脑损伤。3.眼针可以增加MCAO/R大鼠HIF-1α因子及经典Wnt信号传导通路中Wnt3a,β-catenin,LEF1的表达,从而促进血管新生,减轻神经元损伤,促进神经功能的恢复,这可能是眼针治疗缺血性脑卒中的作用机制之一。
崔爽[6]（2021）在《肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究》文中研究指明超级增强子（Super-enhancer,SE）是由连续排列的增强子串联形成的增强子簇,能够促进关键基因的表达,这些关键基因在机体发育和疾病发生过程中定义了细胞的身份。与增强子相比,超级增强子在基因组上跨度范围更广、转录因子结合密度更大以及诱导转录的能力更强。大量研究表明超级增强子在多种肿瘤中被异常激活,调控癌症中的关键癌基因,促进肿瘤的发生与发展。本文通过生物信息学方法,识别了一个在10种不同肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞中的超级增强子,EphA2-SE。本研究首次揭示了EphA2-SE在肿瘤中的功能以及对靶基因EphA2的转录调控机制。本研究首先在超级增强子数据库内识别了一个新的超级增强子并进行了实验验证。以本实验室前期开发的SEA超级增强子数据库为基础,结合其它三个超级增强子数据库,以组蛋白H3K27ac为识别标志在十种不同肿瘤细胞中识别出了一个超级增强子,EphA2-SE。ChIP实验结果表明活性组蛋白修饰H3K27ac富集在超级增强子的三个组分增强子上。染色质互作关系网站分析结果显示EphA2-SE的靶基因为邻近的上下游基因ARHGEF19和EphA2。BRD4抑制剂JQ1能够抑制超级增强子驱动基因的表达,实验结果表明JQ1能够以浓度依赖性和时间依赖性的方式降低EphA2-SE靶基因EphA2的表达。生物信息学分析发现EphA2在宫颈癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胸腺癌和胃癌中的表达高于正常组织,并且高表达的EphA2与结直肠癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌肿瘤患者的不良预后密切相关。以上结果表明,EphA2-SE在10种不同肿瘤细胞中均具有活性,主靶基因为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的生存期降低相关。本研究进一步解析了EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2的调控机制,明确了EphA2-SE的核心成分及主转录因子。通过双荧光素酶报告系统确认了EphA2-SE的组分增强子活性,在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞中E1组分增强子活性远高于另外两个组分增强子并且是最小的核心活性单元。结合生物信息学分析与siRNA实验明确了结合在EphA2-SE上的转录因子,FOSL2和TCF7L2结合在E1组分增强子的不同位置共同促进E1组分增强子的活性。FOSL2和TCF7L2在E1增强子上结合位点的缺失导致E1增强子活性的显着下调。siRNA介导的FOSL2的TCF7L2的表达下调导致EphA2表达的降低。这些结果表明E1组分增强子通过招募FOSL2和TCF7L2转录因子发挥增强子活性并将转录因子募集到EphA2启动子处促进EphA2的强烈转录。本研究最后明确了EphA2-SE在肿瘤细胞中的功能。通过RNA-seq高通量测序以及体内外细胞生物学特性分析发现EphA2-SE通过促进EphA2的表达推动肿瘤的发展进程。利用Crispr/Cas9技术在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞建立了EphA2-SE敲除细胞系。在三种细胞中EphA2-SE缺失后EphA2的表达均明显下调,表明在三种细胞中EphA2-SE的靶基因为EphA2。KEGG和GO分析显示EphA2-SE参与肿瘤细胞的生长和迁移。EphA2-SE的缺失阻断了PI3K/AKT和WNT信号通路进而影响细胞的生物学特性。EphA2-SE缺失导致肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的降低,细胞周期进程的改变。但EphA2的回复能够挽救EphA2-SE缺失带来的影响。裸鼠体内成瘤实验结果表明EphA2-SE的缺失导致EphA2的表达降低,并在体内影响肿瘤的生长与血管形成。以上结果表明EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。综上所述,EphA2-SE是一个位于人类1号染色体并且在10种肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞的超级增强子,靶基因之一为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的不良预后相关。阐明了EphA2-SE的核心成分E1增强子通过招募转录因子FOSL2和TCF7L2驱动靶基因EphA2表达的分子机制。EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响HeLa、HCT-116和MCF-7细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,并且在体内影响肿瘤生长与瘤内新生血管的形成。这些结果表明EphA2-SE在今后有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。
岳静伟[7]（2021）在《大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析》文中研究指明胚胎期猪骨骼肌的发育受转录机制的精确调控,转录机制取决于染色质可及性。然而,关于染色质可及性如何在猪胚胎期骨骼肌发育过程中起调节作用的研究却鲜有报道。本研究利用ATAC-Seq（Transposase-accessible chromatin with high-through sequencing）和RNA-Seq技术对大白猪（Large White,LW）和民猪（Min pigs,M）妊娠期45天、70天和100天的胚胎期骨骼肌组织中的染色质可及性和转录变化进行鉴定,同时利用加权共表达网络分析（Weighted correlation network analysis,WGCNA）推测与猪胚胎期骨骼肌发育相关的共表达基因,然后对这些基因进行差异分析,推测导致不同品种猪的骨骼肌发育差异的候选基因;并进一步与GWAS结果相结合,推测影响肌纤维直径和肌纤维密度的候选基因。分别在大白猪妊娠期45天、70天和100天的胚胎中检测到21638、35447和60181个染色质可及性区域（Accessible chromatin regions,ACRs）;其中有13%-29%ACRs被注释到基因近端启动子区。45、70和100 dpc（day post-coitus）分别检测到722、989和5688个阶段特异性ACRs注释基因,这些基因均能显着富集到肌肉发育相关通路中。MYOG在45 dpc时显着富集,MEF2A、MEF2C和MEF2D在100 dpc时显着富集;在70 dpc时,检测到一个潜在的转录抑制因子,即E2F6;在LW70 vs LW45、LW100 vs LW70和LW100 vs LW45中,分别发现3、20和113个在ATAC-seq中下调但是在RNA-seq中呈上调趋势的基因,以及0、5和12个在ATAC-seq中上调但是在RNA-seq中呈下调趋势的基因。分别在民猪妊娠期45天、70天和100天的胚胎中检测到35088、61676和58264个ACRs;分别在M70 vs M45、M100 vs M70和M100 vs M45中得到5587、13355和18795个显着差异ACRs以及831、1497和2671个显着差异基因。差异ACRs和差异基因的联合分析发现,分别在M70 vs M45、M100 vs M70和M100 vs M45中得到340、1498和2815个差异ACRs,分别对应183、613和1167个差异基因。这些基因均能够显着富集到与肌肉发育相关的生物学进程中。这些通路中的ALPK2、NMRK2、PDLIM3、CD9、CSRP3、FGF9和FOS等基因可能在民猪骨骼肌发育过程中具有重要作用。对不同品种间的差异ACRs分析,分别在LW45 vs M45、LW70 vs M70和LW100 vs M100中得到794、1959和2779个差异ACRs。利用WGCNA分析共检测到6个与胚龄相关的候选模块,对这6个模块内的基因进行GO富集分析发现,45 dpc相关模块基因显着富集到与细胞增殖、细胞周期和骨骼肌发育的生物学进程;70 dpc相关模块基因显着富集到许多与骨骼肌组织发育的生物学进程;100 dpc相关模块基因显着富集到与蛋白质修饰有关的生物学进程。对45 dpc和70 dpc相关模块基因进行差异分析发现,分别在45 dpc和70 dpc中得到1576和205个差异基因。其中DLK2、TNFAIP1、SVEP1、VCAM1、FGFRL1、PARQ7和TUFT1等基因的差异表达可能导致大白猪和民猪骨骼肌发育差异。本研究揭示了猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性的动态变化,丰富了猪中关于染色质可及性的研究,增加了人们对猪染色质可及性的认识,为研究哺乳动物肌肉发育的机制提供参考。
富昱[8]（2021）在《基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究》文中研究表明目的:本实验以膝关节制动法制备KOA动物模型,观察针刺结筋病灶点对膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）大鼠股四头肌结构功能以及与股四头肌再生修复相关的生肌分子标志物的影响,进而探索再生修复相关通路（Wnt/β-catenin）介导的针刺结筋病灶点促进KOA大鼠股四头肌再生修复的作用机制,为临床应用经筋疗法治疗膝骨性关节炎提供实验依据。材料与方法:将44只SPF级雄性SD大鼠（6周龄、体重180-220g）随机分为正常对照组（简称:正常组）、KOA模型组（简称:模型组）、针刺结筋病灶点组（简称:病灶点组）、针刺经穴组（简称:经穴组）,每组11只（1只用于检验模型是否成立,10只用于指标检测）。模型组、病灶点组、经穴组采用膝关节制动造模方法制备KOA模型。造模完成后,将正常组和模型组两组大鼠每日用固定器固定20min,连续进行14天;将病灶点组大鼠每日固定于固定器,类比《中国经筋学》中膝周结筋病灶点定位,视循膝关节经筋触诊结果,在大鼠右后肢股前侧的股直肌肌腱抵止处,腹股沟部的股直肌肌腱抵止处,以及臀后侧半腱肌和股二头肌长头之间当坐骨结节处软组织的拘挛、结节处标记结筋病灶点,并且对以上3个结筋病灶点进行针刺干预,一次20min,连续干预14天;将经穴组大鼠每日固定于固定器,针刺右后肢犊鼻穴、足三里穴、阳陵泉穴,一次20min,连续干预14天。在形态学方面,测量各组大鼠右后肢的大腿围度、股四头肌质量,采用HE染色法观察各组大鼠右后肢股四头肌的形态结构;在行为学方面,测量各组大鼠右后肢膝关节被动活动度和改良Lequesne MG膝关节功能指数,采用步态分析技术测量各组大鼠爪印面积、最大接触面积、最大压强、摆动速度以及站立时间等步态参数;在分子生物学方面,采用免疫组织化学法观察各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1蛋白表达;采用RT-PCR法检测各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1mRNA表达;采用Western blot法检测各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达以及GSK3β、β-catenin蛋白磷酸化水平;采用RT-PCR法检测各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达。实验相关数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差（（?）±s）表示,组间数据比较采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）比较各组差异,以P<0.05表示具有统计学差异。结果:1.各组大鼠右后肢大腿围度变化:膝关节制动法制备KOA大鼠腿围显着降低（P<0.05）;针刺干预后,与模型组比较,病灶点组以及经穴组大鼠大腿围度显着升高（P<0.05）。2.各组大鼠右后肢股四头肌质量比较:与正常组比较,模型组绝对湿重显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组绝对湿重显着升高（P<0.05）,病灶点组显着高于经穴组（P<0.05）。与正常组比较,模型组肌湿重维持率显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组肌湿重维持率显着升高（P<0.05）。与正常组比较,模型组股四头肌肌湿重体重比值显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组肌湿重体重比值显着升高（P<0.05）。3.各组大鼠右后肢步态参数变化情况比较（1）爪印面积变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠爪印面积显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组爪印面积显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组爪印面积显着增加（P<0.05）。（2）最大接触面积变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠最大接触面积显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组最大接触面积显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组最大接触面积显着增加（P<0.05）。（3）最大压强变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠最大压强显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组最大压强显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组最大压强显着升高（P<0.05）,病灶点组升高程度显着高于经穴组（P<0.05）。（4）摆动速度变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠摆动速度显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组摆动速度显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组摆动速度显着升高（P<0.05）,病灶点组升高程度显着高于经穴组（P<0.05）。（5）站立时间变化情况比较:膝关节制动法制备KOA大鼠站立时间显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组站立时间显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组站立时间均显着升高（P<0.05）。4.各组大鼠右后肢膝关节被动活动度比较:膝关节制动法制备KOA大鼠膝关节被动活动度显着降低（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组膝关节被动活动度显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组膝关节被动活动度显着增加（P<0.05）,病灶点组增加幅度显着高于经穴组（P<0.05）。5.各组大鼠改良Lequesne MG膝关节功能指数比较:膝关节制动法制备KOA大鼠改良Lequesne MG指数显着升高（P<0.05）。针刺干预后,与正常组比较,模型组改良Lequesne MG指数显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组改良Lequesne MG指数显着降低（P<0.05）。6.各组大鼠右后肢股四头肌HE染色结果分析:正常组肌纤维结构完整,排列整齐;模型组肌纤维形态改变,结构破坏;病灶点组肌纤维结构较完整,可见再生的肌纤维;经穴组肌纤维结构有所恢复,但肌纤维之间间隙较大。7.各组大鼠右后肢股四头肌生肌分子标志物免疫组化结果:7.1形态学结果显示:各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1的免疫反应阳性染色结果均呈棕黄色,其中Pax7、MyoD和MyoG在各组大鼠股四头肌中的免疫阳性反应表达在肌纤维的细胞核上,MyHC1免疫阳性反应表达在肌纤维的胞浆中。7.2积分光密度值比较结果:（1）Pax7积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度明显高于经穴组（P<0.05）。（2）MyoD积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度明显高于经穴组（P<0.05）。（3）MyoG积分光密度值比较:与正常组比较,模型组积分光密度值显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组与经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）。（4）MyHC1积分光密度值比较:与正常组相比,模型组积分光密度值显着降低（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组积分光密度值显着升高（P<0.05）。8.各组大鼠右后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1 mRNA的表达情况:（1）Pax7 mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组表达显着升高（P<0.05）。（2）MyoD mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度显着高于经穴组（P<0.05）。（3）MyoG mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组以及经穴组表达均显着升高（P<0.05）。（4）MyHC1 mRNA表达水平比较:与正常组比较,模型组表达显着降低（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组以及经穴组表达显着升高（P<0.05）。9.各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1 mRNA表达水平:（1）Wnt mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（2）GSK3βmRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着降低（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着降低（P<0.05）,病灶点组下降幅度更加显着（P<0.05）。（3）β-catenin mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（4）Cyclin D1 mRNA表达水平比较:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。10.各组大鼠右后肢股四头肌Wnt、GSK3β、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对含量以及GSK3β、β-catenin蛋白磷酸化水平:（1）Wnt/β-actin:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更加显着（P<0.05）。（2）p-GSK3β/GSK3β:与正常组比较,模型组显着升高（P<0.05）;与模型组比较,病灶点组显着升高（P<0.05）。（3）p-β-catenin/β-catenin:与正常组相比,模型组显着下降（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组均显着下降（P<0.05）,病灶点组下降幅度更显着（P<0.05）。（4）Cyclin D1/β-actin:与正常组相比,模型组表达显着升高（P<0.05）;与模型组相比,病灶点组和经穴组表达显着升高（P<0.05）,病灶点组升高幅度更显着（P<0.05）。结论:1.针刺结筋病灶点可以重塑肌纤维的形态结构,增加KOA大鼠患侧后肢腿围以及肌肉质量,从而改善KOA大鼠股四头肌的病理形态。2.针刺结筋病灶点可以有效增加KOA大鼠患侧膝关节的被动活动度、纠正患侧后肢的异常步态以及降低KOA膝关节功能指数,从而改善KOA大鼠膝关节活动受限等功能异常。3.针刺结筋病灶点能显着提高KOA大鼠患侧后肢股四头肌Pax7、MyoD、MyoG、MyHC1等生肌分子标志物的表达,促进骨骼肌干细胞增殖分化以实现对受损骨骼肌的再生修复。4.针刺结筋病灶点能够调节Wnt/β-catenin通路相关基因蛋白的表达,Wnt/β-catenin通路介导的骨骼肌干细胞再生修复可能是经筋刺法改善KOA大鼠股四头肌形态结构及功能的作用途径之一。
魏素芬[9]（2021）在《新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究》文中研究说明目的:Hedgehog（Hh）信号通路的异常活化在多种恶性肿瘤的发生及发展中起关键作用,尤其是髓母细胞瘤（Medulloblastoma,MB）。MB是最常见的儿童恶性脑肿瘤之一,其中,Shh亚型MB占所有病例的约30%。目前,MB的治疗仍以手术、全脑全脊髓放疗以及化疗为主。然而,治疗伴随的认知障碍等长期严重不良反应使得人们将目光转移到分子靶向治疗。Smoothened（SMO）是Hh通路上游的关键调控元件,因此SMO已成为Hh通路驱动的MB的新治疗靶点。目前,已有多种SMO抑制剂进入MB临床试验,并在治疗初期取得了良好疗效。然而,由于SMO或下游元件基因突变导致耐药性的出现及肿瘤复发,极大地限制了 SMO抑制剂的临床应用。因此,研发新型、可有效逆转耐药的Hh通路抑制剂显得尤为迫切。土荆皮乙酸（Pseudolaric acid B,PAB）是一种广谱抗肿瘤天然小分子化合物,然而目前关于PAB作用于Hh信号通路或用于治疗MB的相关研究未见报道。因此,本课题旨在探索PAB在体外及体内通过作用Hh信号通路抑制MB生长的抗肿瘤活性及其潜在分子机制。方法:在体外实验中,首先,我们通过MTT法从26个天然抗肿瘤小分子化合物中筛选出对人髓母细胞瘤细胞（DAOY）活性抑制效果最强的药物——PAB;接着,我们选用DAOY细胞、人肺腺癌细胞系（A549、H1299）、人胃腺癌细胞系（BGC-823、SGC-7901、AGS）、人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）、人宫颈癌细胞系（Hela）以及人肝癌细胞系（SMMC-7721、MHCC-97H）共十个肿瘤细胞系,western blotting 法检测细胞 Glil蛋白表达,给予指定浓度PAB处理后,MTT法检测细胞活力。然后,我们将DAOY细胞、原代颗粒神经元前体细胞（Granule Cell Progenitors,GNPs）、提取自Ptch1--自发MB小鼠的原代MB细胞以及3T3/GLI-luc细胞作为研究对象;给予指定浓度的PAB或SMO激动剂SAG处理,部分实验采用SMO抑制剂cyclopamine或vismodegib作为阳性对照;MTT法检测细胞活力,克隆形成实验或EdU掺入实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,western blotting法检测凋亡相关蛋白、Glil、cyclin Dl、N-myc以及SMO蛋白表达,肿瘤球形成实验检测细胞成球能力,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测GLI转录活性,qRT-PCR法检测Hh通路靶基因表达,siRNA敲低SMO后采用MTT法检测细胞活力,western blotting法检测细胞Glil、cyclin Dl、N-myc及SMO蛋白表达。此外,我们构建了过表达SMO-GFP的NIH3T3细胞、过表达SMO-WT的293T细胞以及分别过表达SMO-WT、SMO-D477G、SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞,给予指定浓度PAB或SAG处理,部分实验采用vismodegib作阳性对照。此外,我们采用分子对接预测PAB与SMO的结合潜力,BODIPY-cyclopamine竞争结合实验检测PAB竞争结合SMO,CETSA实验检测PAB对SMO稳定性的影响,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测Hh通路转录因子GLI转录活性,纤毛发生及SMO纤毛定位实验检测纤毛形成和SMO纤毛定位,western blotting检测Gli1蛋白表达。在体内实验中,我们采用提取自Ptch1+-自发MB小鼠的原代MB细胞,构建MB异位移植瘤BALB/c裸鼠模型;肿瘤体积达100 mm3时随机分为4组:溶剂空白对照组、PAB低剂量组（50 mg/kg）、PAB高剂量组（100 mg/kg）、vismodegib组（20 mg/kg）;隔日测量肿瘤体积及小鼠体重,持续给药18天后,取材留取肿瘤组织样本;称量肿瘤质量,western blotting检测凋亡和增殖相关蛋白以及Gli1蛋白,qRT-PCR检测Hh通路靶基因表达,免疫组化法检测Ki-67表达水平,H&E染色观察组织病理形态。结果:在体外实验中,PAB对DAOY细胞表现出极显着的细胞毒效应,而且与其他肿瘤细胞系相比,PAB以极低的浓度特异性杀伤Hh通路高度活化的DAOY细胞（IC50为0.83μM）,同时抑制其克隆形成,并上调其凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3及PARP cleavage水平,诱导细胞凋亡;与之相一致的是,PAB同样可抑制原代MB细胞的细胞活性,显着减少EdU 阳性细胞比例,并抑制其肿瘤球形成;然而,当我们采用siRNA敲低SMO后,DAOY细胞增殖能力降低,而且PAB无法有效抑制其增殖能力。在通路活性抑制效应方面,PAB可消除由SAG诱导的GLI荧光素酶报告基因以及Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录活化;与此同时,PAB可下调DAOY细胞在SAG诱导前后的Gli1蛋白水平,并抑制其Gli1、cyclin D1的转录活性;同样地,PAB可抑制原代MB细胞Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录水平;与之相一致的是,PAB可下调DAOY细胞及原代MB细胞Hh通路效应蛋白cyclin D1及N-myc的表达水平;而采用siRNA敲低原代MB细胞SMO后,PAB对其Gli1、SMO、cyclin D1及N-my蛋白的下调效应几乎消失。在通路靶点验证方面,虽然PAB对DAOY细胞总SMO蛋白水平并无影响,但是分子对接预测出PAB与SMO结合的两个位点,其中一个位点位于SMO跨膜区域（Transmembrane domain,TMD）的细胞外入口处,另一个则位于TMD的细胞内环区（Intracellular loops,ICLs）中;BODIPY-cyclopamine 竞争结合实验结果表明PAB可与BODIPY-cyclopamine竞争结合SMO TMD中的疏水口袋,而CETSA实验亦证实PAB干预可提高SMO蛋白稳定性;PAB还可抑制细胞纤毛形成,但对SMO纤毛定位并无影响。在逆转耐药方面,PAB对过表达SMO-WT、SMO-D477G及SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞GLI转录活性呈现出相似的抑制效应,同时能下调其Glil蛋白水平;此外,PAB对不同浓度梯度SAG处理下3T3/GLI-luc细胞的GLI转录活性的抑制效应几乎一致。在体内实验中,PAB显着抑制MB异位移植瘤的生长,且对小鼠体重无影响,同时上调其PARP cleavage、cleaved-casepase-3蛋白水平,肿瘤组织H&E染色片中亦观察到核凝集现象;此外,PAB还可下调肿瘤组织中PCNA及Ki-67表达水平;与体外实验相一致的是,PAB可下调肿瘤组织中Glil蛋白水平,并下调其Gli1、cyclin D1、N-myc的 mRNA 水平。结论:本课题探讨了天然小分子化合物土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的潜在分子机制。我们发现PAB可通过抑制Hh通路活性,在体外及体内抑制MB的生长。此外,PAB还可克服由SMO突变引起的SMO抑制剂耐药。通过机制研究,我们发现PAB可同时结合SMO上的两个位点,并抑制纤毛形成,提示PAB可通过多个机制抑制Hh通路的活性。因此,PAB是治疗Hh通路驱动的MB的有效药物,尤其是对SMO抑制剂产生耐药的MB,为新型Hh靶向药物的研发提供了新方向。
何倩[10]（2021）在《ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响》文中研究指明Wnt信号通路是存在于脊椎和无脊椎动物中高度保守的信号通路,可分为两种,分别为依赖β-catenin的经典途径和不依赖β-catenin的非经典途径。Wnt信号通路在胚胎发育、组织稳态、细胞分化和细胞增殖等过程中发挥重要作用,该通路的异常活化与肿瘤的发生发展密切相关。目前关于Wnt信号通路与疾病相互作用的研究多集中在人类以及小鼠疾病,与动物疫病相关性研究较少。J亚群禽白血病（ALV-J）是家禽常见的肿瘤疾病之一,由于目前暂时没有疫苗及药物进行防控,净化鸡群是主要的防控手段。关于禽白血病致瘤和免疫抑制机制的研究甚少,本研究主要关注病毒编码蛋白对Wnt信号通路的影响,进而探究是否参与通路的调控从而影响细胞生长周期及肿瘤的形成。目前关于其他病毒编码蛋白与Wnt信号通路的相互作用已有相关研究。丙型肝炎病毒（HCV）1b基因核心蛋白通过激活Wnt信号通路,抑制细胞的凋亡,促进肝癌形成;乙型肝炎病毒X蛋白诱导Wnt信号通路异常活化,促进细胞增殖,从而参与肝癌形成。本研究通过双荧光素酶报告检测技术、荧光定量PCR技术、流式细胞技术等,研究ALV-J编码蛋白对信号通路的影响,并且通过在细胞中过表达β-catenin,激活信号通路的情况下,研究病毒编码蛋白对信号通路的影响,为进一步探究ALV-J感染引起的家禽肿瘤疾病与Wnt信号通路之间的相互作用机制奠定基础。1.ALV-J编码蛋白对Wnt信号通路的影响为研究病毒编码蛋白与信号通路的相互关系,首先用全病毒感染CEF细胞,通过双荧光素酶和荧光定量PCR检测Top flash活性和信号通路下游相关基因表达水平,从而反映病毒感染细胞中信号通路的活化水平。实验结果显示与低滴度MOI=0.1的实验组相比,MOI=1.0组Top flash活性明显增强,并且信号通路下游基因LEF-1、TCF-4、AXIN、β-catenin、c-myc、cyclinD1 表达量高于低滴度组,说明 ALV-J 全病毒MOI=1.0感染CEF细胞可激活信号通路。CEF细胞中过表达病毒编码蛋白检测信号通路下游相关基因的表达水平,结果显示P27可引起通路下游重要转录因子β-catenin的升高,提示P27蛋白可能激活信号通路,P2、P12、P15、Gp37下调β-catenin的表达,提示可能抑制信号通路的活化。流式检测病毒编码蛋白对细胞周期的影响,结果显示病毒编码蛋白P2、P10、P12、P15、P27、P68、Gp37、Gp85可使S期和G2期的细胞比例增多,以上实验结果提示P27可能通过激活信号通路从而使S期和G2期的细胞比例升高,从而加快病毒复制。2.过表达β-catenin细胞中病毒编码蛋白对信号通路的影响为进一步探究病毒编码蛋白是否可以促进Wnt信号通路的活化,首先构建pCAGGS-β-catenin真核表达质粒转染CEF细胞,利用Top flash活性检测,证实过表达β-catenin能够激活信号通路。然后将β-catenin与病毒编码蛋白共转染至CEF细胞中,荧光定量PCR检测通路下游相关基因的表达情况。结果显示信号通路下游相关基因β-catenin、LEF-1、TCF-4、AXIN、c-myc的表达量都有不同程度的上升,细胞周期相关基因CCND1、CCNE1、CDK2、CDK6表达量上升,提示在过表达β-catenin细胞中,ALV-J编码的10个蛋白均可促进信号通路的活化。3.核衣壳蛋白P27慢病毒载体的构建及其在LMH细胞中的表达前两部分研究内容结果显示病毒编码蛋白P27可上调β-catenin的表达,使S期细胞比例增多,利于病毒的复制。因此,为了进一步研究P27在信号通路中的生物学功能,构建了表达衣壳蛋白P27慢病毒载体,并且将293T细胞包装上清感染禽源LMH细胞,在基因和蛋白水平成功检测到P27的表达。实验结果表明表达P27的慢病毒载体构建成功,并且组装成功的慢病毒可以感染禽源LMH细胞,这一结果为进一步深入研究P27生物学功能提供技术工具。
二、动物发育过程中参与Wnt信号传导的因子及调节的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、动物发育过程中参与Wnt信号传导的因子及调节的研究进展（论文提纲范文）
（1）辛开苦降法治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效评价及基于转录组学的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献研究 |
| 综述一 慢性萎缩性胃炎的现代医学研究进展 |
| 1. CAG与胃癌前疾病的定义 |
| 2. CAG的临床研究进展 |
| 3. CAG的基础研究进展 |
| 4. 小结 |
| 综述二 慢性萎缩性胃炎的中医学研究进展 |
| 1. 辨证治疗 |
| 2. 成方治疗 |
| 3. 自拟方治疗 |
| 4. 中西医药联合治疗 |
| 5. 中成药治疗 |
| 6. 外治法 |
| 综述三 转录组学技术及其在中医学中的研究进展 |
| 1. 转录组学研究的相关技术 |
| 2. 转录组学在中医药学研究中的应用 |
| 3. 展望 |
| 综述四 魏玮教授治疗CAG相关学术思想及临证经验 |
| 1. 辛开苦降,善用经方 |
| 2. 益气活血,消症化瘕 |
| 3. 调畅情志,和解少阳 |
| 4. 调枢通胃,总揽全局 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 半夏泻心汤治疗CAG的临床研究 |
| 1、研究目的 |
| 2、研究方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 样本量估算与数据管理 |
| 2.3 研究对象 |
| 2.4 干预措施 |
| 2.5 疗效评价指标 |
| 2.6 安全性指标 |
| 2.7 统计方法 |
| 2.8 技术路线图 |
| 3 、研究结果 |
| 3.1 一般资料分析 |
| 3.2 疗效结果分析 |
| 3.3 安全性评价 |
| 4、讨论 |
| 4.1 半夏泻心汤可以减轻CAG患者中医症状 |
| 4.2 半夏泻心汤可以调节CAG患者胃功能血清学水平 |
| 4.3 半夏泻心汤可以改善CAG患者焦虑抑郁状态 |
| 4.4 半夏泻心汤可以提高CAG患者睡眠质量 |
| 4.5 半夏泻心汤可以降低CAG患者炎症因子水平 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于转录组学半夏泻心汤治疗CAG的作用机制研究 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 研究来源 |
| 1.2 受试者与血样采集 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 软件及数据库 |
| 1.5 样本准备 |
| 1.6 生物信息学分析 |
| 2、结果 |
| 2.1 测序基本情况 |
| 2.2 差异表达筛选结果 |
| 2.3 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4 差异表达基因通路富集分析 |
| 2.5 PPI网络分析 |
| 3、讨论 |
| 3.1 半夏泻心汤治疗CAG与抑制炎症 |
| 3.2 半夏泻心汤治疗CAG与免疫调节 |
| 3.3 半夏泻心汤治疗CAG与抗肿瘤 |
| 3.4 半夏泻心汤治疗CAG与神经调控 |
| 4、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 总结与展望 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 创新点 |
| 3. 存在问题与不足 |
| 4. 展望 |
| 致谢 |
| 附件 中国中医科学院望京医院医学伦理委员会审查批件 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（2）β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 参与肝星状细胞的增殖活化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 LX2 细胞培养及细胞传代 |
| 1.4 rhTGF-β诱导LX2 细胞活化增殖 |
| 1.5 ICG-001、AS1842856 干预活化的LX2 细胞 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 增殖活化表型 |
| 2.2 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 细胞增殖活化的作用机制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化动物模型构建以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 与肝纤维化病程关系初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCl_4、BDL模型不同时点的小鼠一般状况 |
| 2.2 CCl_4、BDL模型不同时点的肝脏外观改变 |
| 2.3 CCl_4、BDL模型不同时点的肝功能变化 |
| 2.4 CCl_4、BDL模型不同时点的组织学改变 |
| 2.5 CCl_4、BDL模型不同时点α-SMA免疫组织化学结果 |
| 2.6 CCl_4、BDL模型不同时点炎症因子表达水平 |
| 2.7 CCl_4、BDL模型不同时点β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF转录复合物变化. |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时小鼠一般状况 |
| 2.2 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时肝脏外观及肝重体重比 |
| 2.3 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时血清肝功能水平 |
| 2.4 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 wS时肝脏组织学变化 |
| 2.5 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时 COL-I、α-SMA水平 |
| 2.6 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF2 w促进FOXO1 靶基因foxp3、p27~(kip1)表达 |
| 2.7 抑制BDL模型β-catenin/TCF时肝脏组织炎症因子水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控肝纤维化的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、FOXO1 共同调控肝纤维化进展 |
| 2.2 肝脏核蛋白中TCF、FOXO1与β-catenin竞争结合形成不同转录复合物 |
| 2.3 体内HSCs中 TCF、FOXO1与β-catenin形成不同转录复合物调控肝纤维化进展 |
| 2.4 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织炎症因子水平 |
| 2.5 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织细胞周期抑制蛋白p27~(kip1) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五部分 探讨人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 转录复合物与纤维化进展的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 临床组织标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆道闭锁导致胆汁淤积性肝纤维化患者基本信息统计 |
| 2.2 患者肝脏组织石蜡切片HE、Masson、天狼星红染色结果及纤维化分期 |
| 2.3 不同分期患者肝脏组织TGF-β、IL-10、Ki67 水平 |
| 2.4 不同分期患者肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点与不足之处 |
| 1.本研究的特色与创新点 |
| 2.本研究不足之处及进一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生长因子-β信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 巨噬细胞极化与肠黏膜屏障的相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 UC患者巨噬细胞亚群变化的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 UC患者巨噬细胞极化特点 |
| 2 巨噬细胞极化对炎症因子的影响 |
| 3 巨噬细胞极化对肠黏膜屏障损伤的影响 |
| 4 β-catenin/ FOSL2/ARID5A通路对巨噬细胞极化的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制研究 |
| 前言 |
| 第一章 在体实验研究 |
| 第一节 加味葛根芩连汤干预DSS诱导结肠炎模型的疗效观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 DSS诱导结肠炎疾病模型的构建与特点 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠道炎症状态的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对肠黏膜通透性的影响 |
| 4 加味葛根芩连汤的组方思路与特色 |
| 小结 |
| 第二节 加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的调控 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对β-catenin/FOSL2/ARID5A通路的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 离体实验研究 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 体外巨噬细胞极化模型的构建 |
| 2 加味葛根芩连汤含药血清对细胞活力的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1细胞IL-1β分泌的影响 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（4）YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 哺乳动物胚胎着床和蜕膜化的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎着床 |
| 1.2 子宫内膜蜕膜化 |
| 1.3 胚胎着床和蜕膜化的调控机制 |
| 1.3.1 类固醇激素及其受体 |
| 1.3.2 细胞因子 |
| 1.3.3 转录因子 |
| 1.3.4 骨形态发生蛋白 |
| 1.3.5 Notch信号通路 |
| 1.3.6 其他因子 |
| 1.3.7 氧化应激 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Hippo信号通路的研究进展 |
| 2.1 Hippo信号通路简介 |
| 2.2 YAP/TAZ的生物学功能 |
| 2.2.1 YAP/TAZ在发育过程中的作用 |
| 2.2.2 YAP/TAZ在再生过程中的作用 |
| 2.2.3 YAP/TAZ与癌症发生 |
| 2.3 Hippo-YAP/TAZ的调节机制 |
| 2.3.1 细胞间接触与细胞形状 |
| 2.3.2 细胞极性与细胞粘附 |
| 2.3.3 Wnt/β-Catenin信号通路 |
| 2.3.4 代谢 |
| 2.3.5 G蛋白偶联受体 |
| 2.4 YAP/TAZ与哺乳动物生殖 |
| 2.5 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 YAP在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 动物模型的建立 |
| 1.1.4 原位杂交 |
| 1.1.5 小鼠子宫蜕膜细胞与基质细胞的分离培养 |
| 1.1.6 免疫荧光染色 |
| 1.1.7 免疫蛋白印迹(Western blot) |
| 1.1.8 荧光定量PCR |
| 1.1.9 基因过表达与沉默 |
| 1.1.10 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.1.11 细胞转染 |
| 1.1.12 细胞增殖 |
| 1.1.13 细胞周期 |
| 1.1.14 细胞凋亡 |
| 1.1.15 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性 |
| 1.1.16 ROS含量检测 |
| 1.1.17 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量检测 |
| 1.1.18 8-OHd G含量检测 |
| 1.1.19 抗氧化系统及Caspase-3 活性检测 |
| 1.1.20 线粒体膜电位和通透性转换孔的检测 |
| 1.1.21 ATP含量检测 |
| 1.1.22 数据统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 YAP m RNA在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 1.2.2 YAP在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 1.2.3 YAP在蜕膜化过程中的作用 |
| 1.2.4 Bmp2 诱导基质细胞中YAP核迁移并增强YAP功能 |
| 1.2.5 YAP通过Rrm2 调控基质细胞的分化 |
| 1.2.6 Bmp2 通过YAP调控Rrm2 的表达 |
| 1.2.7 YAP失活导致基质细胞GSH产生下降并诱导ROS含量升高 |
| 1.2.8 YAP失活导致基质细胞线粒体功能紊乱并抑制蜕膜化 |
| 1.2.9 YAP失活诱导基质细胞凋亡 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TAZ在小鼠早期妊娠子宫中的表达 |
| 2.2.2 TAZ在体内和体外人工诱导蜕膜化模型中的表达 |
| 2.2.3 TAZ在蜕膜化过程中的作用 |
| 2.2.4 TAZ介导HB-EGF对蜕膜化的调节 |
| 2.2.5 TAZ保护基质细胞分化免受氧化损伤 |
| 2.2.6 TAZ通过增强基质细胞的抗氧化能力来抵抗氧化应激对基质细胞分化的损伤 |
| 2.2.7 氧化应激状态下TAZ可保护基质细胞线粒体功能 |
| 2.2.8 TAZ可抑制H_2O_2诱导的基质细胞凋亡 |
| 2.2.9 氧化应激状态下TAZ通过Nrf2/ARE/Foxo1 途径增强基质细胞抗氧化能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1 基因引物序列 |
| 附表2 siRNA序列 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 眼针对MCAO/R大鼠神经功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 眼针对MCAO/R大鼠缺血侧脑组织血管新生的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 眼针对MCAO/R大鼠脑组织缺血半暗带区域HIF-1α和Wnt3a/β-catenin/LEF1 信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 针刺治疗缺血性脑卒中研究进展 |
| 二 血管新生相关因子及信号传导通路在缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（6）肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题的研究背景及意义 |
| 1.2 增强子的研究进展 |
| 1.2.1 增强子概述及其鉴定 |
| 1.2.2 增强子类型及作用方式 |
| 1.3 超级增强子研究进展简介 |
| 1.3.1 超级增强子概述 |
| 1.3.2 超级增强子的鉴定 |
| 1.3.3 超级增强子与3D基因组结构 |
| 1.3.4 超级增强子相关数据库 |
| 1.4 超级增强子与疾病的关系 |
| 1.4.1 超级增强子与肿瘤的关系 |
| 1.4.2 超级增强子在治疗中的应用 |
| 1.5 Eph/ephrin及 EphA2 的研究进展 |
| 1.5.1 Eph/ephrin的研究概况 |
| 1.5.2 EphA2 的研究进展 |
| 1.5.3 EphA2 与恶性肿瘤的研究进展 |
| 1.6 本文的主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 文章的主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.1.3 常用网站和软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核酸的提取 |
| 2.2.2 实时定量PCR |
| 2.2.3 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.2.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.5 双荧光素酶载体的构建与检测 |
| 2.2.6 敲除细胞系的建立 |
| 2.2.7 MTT增殖与克隆形成 |
| 2.2.8 细胞周期 |
| 2.2.9 细胞划痕 |
| 2.2.10 细胞侵袭和迁移 |
| 2.2.11 小鼠皮下成瘤 |
| 2.2.12 H&E染色与组织免疫荧光 |
| 2.2.13 ChIP-seq 数据与RNA-seq 数据 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 2.2.15 实验室质量控制 |
| 第3章 EphA2-SE的识别与鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 超级增强子的生物信息学分析 |
| 3.2.1 超级增强子的识别 |
| 3.2.2 组分增强子的划分及活性检测 |
| 3.3 超级增强子靶基因的预测 |
| 3.4 EphA2 在肿瘤中的表达以及与预后关系的研究 |
| 3.4.1 EphA2在TCGA数据库肿瘤样本中的表达分析 |
| 3.4.2 EphA2 表达与预后相关 |
| 3.5 EphA2对BRD4 抑制敏感 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2 的转录调控机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 EphA2-SE核心组分的识别 |
| 4.3 EphA2-SE对 EphA2 调控机制的探究 |
| 4.3.1 结合E1 组分增强子的转录因子识别 |
| 4.3.2 E1 组分增强子上FOSL2和TCF7L2 转录因子结合位点分析 |
| 4.3.3 FOSL2和TCF7L2 调控E1 增强子活性及EphA2 表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 RNA-seq高通量测序分析EphA2-SE的功能 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 EphA2-SE缺失细胞系的建立 |
| 5.2.1 敲除靶点有效性的检测 |
| 5.2.2 稳转细胞系的建立 |
| 5.3 HeLa、HCT-116和MCF-7 细胞中差异表达基因分析 |
| 5.4 三种肿瘤细胞中共差异表达基因分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 EphA2-SE影响肿瘤细胞基本生物学功能的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 EphA2-SE对肿瘤细胞生物学特性的影响 |
| 6.2.1 EphA2-SE影响肿瘤细胞的增殖与克隆形成 |
| 6.2.2 EphA2-SE对肿瘤细胞侵袭与迁移的能力的影响 |
| 6.2.3 EphA2-SE信号通路分析 |
| 6.3 EphA2-SE对裸鼠体内成瘤的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 附录 Ⅳ |
| 附录 Ⅴ |
| 附录 Ⅵ |
| 攻读博士学位期间取得创新性成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪胚胎期骨骼肌发育概述 |
| 1.1.1 骨骼肌发育过程 |
| 1.1.2 参与骨骼肌发育调控的关键基因及信号通路概述 |
| 1.2 不同品种猪骨骼肌转录组研究进展 |
| 1.3 染色质可及性概述 |
| 1.4 染色质可及性的研究方法 |
| 1.4.1 DNase-seq |
| 1.4.2 ATAC-seq |
| 1.4.3 MNase-seq |
| 1.4.4 NOMe-seq |
| 1.5 基于 ATAC-seq 技术探索染色质可及性的研究进展 |
| 1.5.1 基于ATAC-seq技术探索人类染色质可及性的研究进展 |
| 1.5.2 基于ATAC-seq技术探索其他物种染色质可及性的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 ATAC-seq文库测序 |
| 2.2.2 ATAC-seq测序数据的分析 |
| 2.2.3 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.4 ATAC-seq与 RNA-seq的联合分析 |
| 2.2.5 大白猪和民猪的染色质可及性和转录组差异分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的高通量文库和测序数据质量检测 |
| 3.1.1 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的 ATAC-seq 文库和测序数据质量检测 |
| 3.1.2 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的 RNA 质量和 RNA-seq 数据质量检测 |
| 3.2 大白猪胚胎期骨骼肌发育过程中全基因组染色质可及性 |
| 3.2.1 大白猪ATAC-seq文库概述 |
| 3.2.2 大白猪中染色质可及性检测 |
| 3.2.3 大白猪中ACRs在基因组上的分布规律 |
| 3.2.4 大白猪中ACRs与基因表达水平的关系 |
| 3.2.5 大白猪中阶段特异性ACRs和阶段共有ACRs鉴定 |
| 3.2.6 大白猪ACRs注释基因功能富集分析 |
| 3.2.7 大白猪ATAC-seq和 RNA-seq联合分析 |
| 3.3 民猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性研究 |
| 3.3.1 民猪胚胎期骨骼肌组织的染色质可及性检测 |
| 3.3.2 民猪ACRs在基因组上的分布规律 |
| 3.3.3 民猪中ACRs与基因表达水平的关系 |
| 3.3.4 民猪ACRs在胚胎期骨骼肌发育不同阶段间的差异分析 |
| 3.3.5 差异ACRs与差异基因的联合分析 |
| 3.4 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的染色质可及性和转录组的差异分析 |
| 3.4.1 大白猪和民猪染色质可及性的时序性分析 |
| 3.4.2 大白猪和民猪在同一阶段的染色质可及性差异分析 |
| 3.4.3 大白猪和民猪在同一阶段的基因差异分析 |
| 3.4.4 大白猪和民猪差异ACRs与差异基因、GWAS的联合分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 ATAC-seq 测序应用局限性 |
| 4.2 ATAC-seq 文库和测序数据质量检测讨论 |
| 4.3 大白猪胚胎期骨骼肌发育过程中全基因组染色质可及性讨论 |
| 4.3.1 大白猪ACRs在基因组的分布规律 |
| 4.3.2 大白猪阶段特异性ACRs和阶段共有ACRs对基因表达的调控 |
| 4.3.3 大白猪ATAC-seq和 RNA-seq的联合分析 |
| 4.4 民猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性研究 |
| 4.4.1 民猪差异ACRs注释基因功能富集分析 |
| 4.4.2 民猪ATAC-seq与 RNA-seq的联合分析 |
| 4.5 大白猪和民猪全基因组染色质可及性和转录组的差异分析讨论 |
| 4.5.1 不同品种胚胎期骨骼肌发育进程差异 |
| 4.5.2 大白猪和民猪差异ACRs分析 |
| 4.5.3 大白猪和民猪差异基因分析 |
| 4.5.4 大白猪和民猪差异ACRs与差异基因、GWAS的联合分析 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 |
| 5.3 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌形态结构和功能的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌再生修复分子标志物表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 经筋刺法对KOA大鼠股四头肌Wnt/β-catenin信号通路的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 KOA的骨骼肌损伤机制以及经筋疗法治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 Hedgehog信号通路研究综述 |
| 一、Hedgehog信号通路传导途径 |
| 二、初级纤毛与Hedgehog信号传导 |
| 三、Hedgehog信号通路与肿瘤发生 |
| 四、Hedgehog通路抑制剂 |
| 第二节 髓母细胞瘤研究综述 |
| 一、髓母细胞瘤流行病学概况 |
| 二、髓母细胞瘤的分子分型 |
| 三、髓母细胞瘤靶向治疗瓶颈 |
| 第三节 中医药治疗脑肿瘤研究综述 |
| 一、脑肿瘤的病因病机 |
| 二、中医药治疗脑肿瘤研究进展 |
| 三、“辛味通络”法治疗脑肿瘤 |
| 第四节 中医药靶向Hh通路研究综述 |
| 一、中医药抑制Hh通路研究进展 |
| 二、土荆皮乙酸抗肿瘤研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验仪器 |
| 二、实验试剂 |
| 三、细胞系 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、药物配制 |
| 二、小鼠原代神经元的提取 |
| 三、细胞系培养 |
| 四、原代MB细胞肿瘤球培养 |
| 五、细胞活力检测 |
| 六、克隆形成实验 |
| 七、总蛋白提取 |
| 八、免疫印迹法(Western blotting) |
| 九、流式细胞术 |
| 十、EdU细胞增殖检测 |
| 十一、小分子干扰RNA (siRNA)敲低SMO |
| 十二、GLI-荧光素酶报告基因活性测定 |
| 十三、总RNA提取 |
| 十四、cDNA合成 |
| 十五、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) |
| 十六、分子对接 |
| 十七、质粒载体构建 |
| 十八、慢病毒包装及转染 |
| 十九、细胞热转变分析(Cellular thermal shift assay,CETSA) |
| 二十、BODIPY-cyclopamine竞争结合实验 |
| 二十一、纤毛形成及SMO纤毛定位实验 |
| 二十二、小鼠基因鉴定 |
| 二十三、MB异位移植瘤造模 |
| 二十四、免疫组织化学法 |
| 二十五、免疫荧光 |
| 二十六、H&E染色 |
| 二十七、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、抗MB细胞生长药物筛选 |
| 二、PAB抑制由Hh信号通路驱动的MB细胞增殖 |
| 三、PAB抑制MB细胞中Hh信号通路活性 |
| 四、PAB直接靶向结合SMO |
| 五、PAB抑制纤毛形成 |
| 六、PAB逆转由SMO突变引起的耐药 |
| 七、PAB在体内抑制Hh信号通路驱动的MB生长 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 符号说明(续) |
| 文献综述 |
| 1 Wnt基因的简介 |
| 1.1 经典的Wnt信号通路 |
| 1.2 非经典的Wnt信号通路 |
| 2 Wnt信号通路与人类疾病 |
| 2.1 造血系统疾病 |
| 2.2 骨病 |
| 2.3 结直肠癌 |
| 2.4 心血管疾病 |
| 2.5 肺部疾病 |
| 2.6 肾脏疾病 |
| 2.7 肝脏疾病 |
| 3 Wnt信号通路与动物疫病 |
| 3.1 牛副流感病毒 |
| 3.2 新城疫病毒 |
| 3.3 猪圆环病毒样病毒 |
| 3.4 牛痘病毒 |
| 3.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒 |
| 3.6 禽流感病毒 |
| 本研究目的与意义 |
| 研究内容一: ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备与培养 |
| 2.2 GY03病毒扩增培养 |
| 2.3 GY03病毒滴度的测定 |
| 2.4 ALV-J全病毒对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 2.5 ALV-J感染CEF细胞后对通路的影响 |
| 2.6 ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路影响 |
| 2.7 ALV-J编码蛋白对细胞周期的影响 |
| 2.8 结果统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同滴度病毒感染CEF细胞后Top flash活性情况 |
| 3.2 不同滴度病毒感染CEF细胞后信号通路下游相关基因表达水平 |
| 3.3 感染病毒后加通路激活剂Top flash活性情况 |
| 3.4 感染病毒后加通路激活剂通路下游相关基因表达情况 |
| 3.5 PCR扩增目的基因 |
| 3.6 酶切鉴定结果 |
| 3.7 间接免疫荧光鉴定病毒编码蛋白的表达 |
| 3.8 免疫蛋白印迹验证病毒编码蛋白的表达 |
| 3.9 荧光定量PCR检测对信号通路有影响的病毒编码蛋白 |
| 3.10 荧光定量PCR检测编码蛋白对细胞周期的影响 |
| 3.11 流式检测编码蛋白对细胞周期的影响 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二: 过表达β-catenin细胞中ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pCAGGS-β-catenin表达载体构建及鉴定 |
| 2.2 双荧光素酶报告实验检测过表达β-catenin对信号通路的活化情况 |
| 2.3 荧光定量PCR检测过表达β-catenin细胞中病毒编码蛋白对信号通路的活化情况 |
| 2.4 ALV-J病毒编码蛋白对过表达β-catenin的CEF细胞周期影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pCAGGS-β-catenin真核载体的构建 |
| 3.2 间接免疫荧光检测β-catenin的表达 |
| 3.3 Western blot检测β-catenin的表达 |
| 3.4 双荧光素酶报告实验 |
| 3.5 GY03编码蛋白在过表达β-catenin的CEF细胞中激活信号通路 |
| 3.6 ALV-J编码蛋白上调过表达β-catenin的CEF细胞周期相关基因 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三: 表达P27慢病毒载体的构建及其在LMH细胞中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 慢病毒质粒构建 |
| 2.2 慢病毒的包装 |
| 2.3 病毒滴度测定 |
| 2.4 慢病毒上清感染293T细胞中P27的表达情况 |
| 2.5 慢病毒上清感染LMH细胞中P27的表达情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 慢病毒质粒构建 |
| 3.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.3 慢病毒感染293T细胞中P27表达情况 |
| 3.4 慢病毒感染LMH细胞中P27表达情况 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、动物发育过程中参与Wnt信号传导的因子及调节的研究进展（论文参考文献）
- [1]辛开苦降法治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效评价及基于转录组学的作用机制研究[D]. 国嵩. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究[D]. 王晓玲. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制[D]. 许琳. 中国中医科学院, 2021(02)
- [4]YAP/TAZ在小鼠子宫蜕膜化过程中的作用及调节机制[D]. 于海帆. 吉林大学, 2021
- [5]基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制[D]. 浦延鹏. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [6]肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究[D]. 崔爽. 哈尔滨工业大学, 2021(02)
- [7]大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析[D]. 岳静伟. 中国农业科学院, 2021(01)
- [8]基于Wnt通路探讨经筋针刺调控KOA大鼠股四头肌再生修复的机制研究[D]. 富昱. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [9]新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究[D]. 魏素芬. 广州中医药大学, 2021(02)
- [10]ALV-J编码蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的影响[D]. 何倩. 扬州大学, 2021
标签：β-catenin论文; wnt信号通路论文; 动物细胞论文; 巨噬细胞论文; 健康论文;