一、Th1/Th2对HBV特异性抗原HBcAg和HBeAg应答的研究（论文文献综述）
卢婷[1]（2020）在《基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究》文中认为慢性乙肝的治愈之路充满挑战。与传统的抗病毒疗法相比,疫苗疗法是慢性乙肝预防和治疗的重要潜力途径。但是如何使疫苗获得有效的细胞免疫效果满足治疗性需求,具有更好的保护效果,是当前面临的重要挑战。本课题提出生物相容性好的聚乳酸（PLA）微球合理装载抗原和免疫刺激剂,实现按需递送的功能,作为治疗性乙肝疫苗,同时以PLA微球为佐剂探索免疫针次减少的疫苗制剂。课题具体研究内容如下:1)针对免疫刺激剂5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）在特定细胞位置发挥作用的需求,成功制备了按需释放抗原的DP微球及抗原/刺激剂的DP-D微球,并验证了其在细胞水平的效果。通过向PLA微球中引入阳离子脂双十八烷基二甲基溴化铵（DDAB）,微球可以温和高效携载乙肝表面抗原（HBsAg,吸附率85%以上）;并且借助质子海绵效应,促进溶酶体逃逸,使DMXAA释放到胞质中,与其受体结合,激活下游通路。在分子水平上,DP-D与抗原组相比,其STING通路的IRF-7和IFN-β表达分别提高了 12和8.2倍。同时微球携载HBsAg后易于被树突状细胞（DCs）摄取及引起溶酶体逃逸,提高DCs表面共刺激分子及MHC分子的表达,促进细胞因子分泌,在高效促进DCs活化的同时诱导后续免疫应答。2)评价了 PLA微球佐剂在健康鼠上的体液和细胞免疫效果,探索了其应用于疫苗时的作用机制。微球疫苗制剂诱导了注射部位IL-1β和CXCL-10等炎症因子和趋化因子的表达,同时招募DCs及巨噬等免疫细胞到注射部位,经APCs转运至淋巴结后,促进了淋巴结内DCs、B及滤泡辅助T细胞（Tfh细胞）的活化。在免疫健康鼠后,诱导产生了高水平的HBsAg特异性抗体IgG,提高IgG2a/IgG1比例、Th1细胞数量及IFN-γ等细胞因子的分泌,实现了体液和细胞免疫的双重提升。3)成功构建了慢性乙肝（CHB）模型鼠,并基于该评价模型开展了微球疫苗制剂的免疫及治疗评价。采用尾静脉注射重组乙肝腺病毒的方式构建CHB模型鼠。结果表明,DP、DP-D组诱导产生高水平的HBsAg特异性抗体IgG,可促进脾细胞增殖活化与Th1型细胞因子的分泌,提升了 HBsAg特异性CTL反应,产生免疫记忆起到保护效果。两组模型鼠血清中HBsAg转阴率均达到50%,显着降低了肝脏中HBcAg的表达,取得了良好的治疗效果。4)验证了以PLA微球为佐剂,用两针代替三针铝佐剂疫苗的长效免疫保护效果。微球疫苗制剂两针免疫后产生与铝佐剂相当的抗体水平,且抗体半年内维持较高水平,在HBsAg再次入侵时可快速产生抗体。优化了该疫苗制剂的冻干保护剂种类及相应浓度,考察了冻干制剂在室温下的稳定性。总体结果明确了微球疫苗佐剂具有减少免疫针次及可冻干的特性,具备临床转化的潜力。综上,本课题设计的PLA微球疫苗制剂应用于乙肝疫苗有较大潜力。
张卫云[2]（2018）在《献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析》文中指出背景和目的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染（OBI）在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例（含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例）,HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例（含疫苗免疫组33例,正常对照组23例）,合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原（HBsAg）检测,核酸检测法（NAT）检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞（PBMCs）,采用T细胞增殖试验（CFSE）检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色（ICS）检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验（CBA）检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显着（P=0.403）,但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组（74.0%,78.1%vs.82.1%）;在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显着（P<0.001）,其中OBI组和CHB组的增殖率显着高于正常对照组（3.0%,3.3%vs.1.7%）,差异显着（3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001）。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显着（P=0.004）。在三种重组蛋白（HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw）和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显着（P<0.05）。OBI组（160 SFC/106 PBMCs）对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组（95 SFC/106 PBMCs）,低于CHB-HBeAg-组（208 SFC/106 PBMCs）。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组（25 SFC/106 PBMCs）和CHB-HBeAg-组（25 SFC/106 PBMCs）的应答强度均高于正常对照组（5 SFC/106 PBMCs）。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显着高于HBV Pol多肽库（44.6%vs.16.1%）,HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组（64.0%）最高,其次是HBV感染康复组（53.2%）,显着高于正常对照组（21.7%）。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组（P<0.05）,而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组（P<0.05）。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组（P<0.05）;而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显着低于其他组（P<0.05）,而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显着低于其他组（P<0.05）。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）;在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显着低于CHB患者（P<0.001）,而与正常对照组差异不显着（P=0.860）;G-MDSCs水平在五组人群中无差别（P=0.914）。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性（P>0.05）。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显着高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显着的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显着增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。
孙晓雷[3]（2015）在《LSD1在乙型肝炎病毒感染中的作用及机制研究》文中指出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）简称乙肝病毒,属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae）,是一种逆转录DNA病毒。HBV不仅引起急性肝炎（Acute hepatitis B, AHB）和慢性肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）,还可导致肝硬化,并与肝癌的发生密切相关,严重危害人类健康。约有5%的HBV急性感染者不能有效清除HBV,导致病毒的持续感染,甚至最终发展为肝硬化或肝癌。HBV感染的致病机制涉及病毒和机体两方面——乙型肝炎病毒在感染肝细胞内的复制增殖所致细胞损伤有限,而宿主的细胞免疫应答引起的免疫病理变化是导致肝细胞损伤的主要因素。在乙肝病毒所致的急性和慢性感染时,机体免疫状态不同。急性乙肝患者体内辅助性T细胞1类细胞（Helper T cell 1, Thl）应答模式占优势,上升的Thl类细胞因子促进细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T cell, CTL）参与乙肝病毒的清除；而慢性乙肝患者体内存在明显的Thl/辅助性T细胞2 （Helper T cell 2, Th2）平衡漂移,表现为Thl类细胞因子减少,Th2类细胞因子增加。组蛋白赖氨酸去甲基化酶1 （Lysine specific demethylase 1, LSD1）是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinμlcleotide, FAD）依赖性单胺氧化酶,LSD1定位于细胞核内,可特异性脱去单甲基化和二甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸（Histone 3 lysine 4, H3K4）和H3第9位赖氨酸（Histone 3 lysine 9, H3K9）位点上的甲基基团,动态调节组蛋白的甲基化状态,影响组蛋白和其他功能蛋白的相互作用,进而调控基因转录的激活和抑制。本课题从CHB患者和动物模型两方面探讨LSD1与Th1/Th2平衡漂移,进而影响HBV清除的关系,研究LSD1在乙肝病毒感染中的作用及机制。为进一步阐明CHB发病机制及免疫治疗靶点提供理论和实验依据。第一部分LSD1在HBV感染中的作用及机制研究目的：本部分实验旨在了解CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平与Th1/Th2平衡漂移的关系,探讨LSD1介导的组蛋白修饰对CHB患者CD4+Th细胞分化的作用,观察LSD1抑制剂反苯环丙胺（Tranylcypromine, TCP）对CD4+Th细胞Th1/Th2分化的影响,探讨TCP在调控Thl/Th2分化平衡中的作用及机制。方法：248名2011年1月至2014年6月在南通大学附属医院住院CHB患者和206名健康体检者作为对照进行实验。观察CHB患者的外周血CD4+Th细胞中LSD1表达水平、血清中IFN-γ和IL-4水平；TCP干预后Th1、Th2细胞频率和Thl型转录调控因子T-bet、调控因子磷酸化信号转导和转录活化因子1 （Phosphorylated signal transducers and activators of transcription, pSTATl）以及二甲基组蛋白H3赖氨酸4 （Dimethylation of histone 3 lysine 4, H3K4me2）表达状况。1.根据入院时的肝功能、HBV两对半及HBV-DNA定量的检验结果,将248例CHB患者分为四组：（1）乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen, HBsAg）高水平组（HBsAg>250 IU/ml）与低水平组（HBsAg≤,250 IU/ml）; （2）乙型肝炎e抗原（Hepatitis B e antigen, HBeAg）阳性组与阴性组；（3）丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase, ALT）高水平组（ALT>3*检测上限）与低水平组（ALT<3*检测上限）；（4） HBV-DNA高载量组（HBV-DNA>105 copy/ml）与低载量组（HBV-DNA<105 copy/ml）。采用微粒子化学发光法检测血清HBsAg和HBeAg含量；全自动生化仪检测ALT；实时定量PCR （RT-PCR）法检测血清HBV-DNA载量。2.采用密度梯度离心法分离CHB患者和对照组外周血淋巴细胞,免疫磁珠法分选CD4+Th细胞和流式细胞仪检测CD4+Th细胞的纯度。提取CHB患者和对照组CD4+Th细胞总蛋白,蛋白质免疫印迹法（Western blot, WB）检测LSD1表达。采用ELISA法检测CHB患者和对照组血清中IFN-γ和IL-4含量。3.采用密度梯度离心法分离正常人外周血淋巴细胞,免疫磁珠抗CD3单抗和抗CD28单抗刺激分选的CD4+Th细胞,活化后加入不同浓度的LSD1抑制剂TCP （10,30,50,80,100 μM）作用24h, CD4-PerCP-Cy5.5/IFN-γ-FITC/IL-4-PE三色流式细胞术检测Th1、Th2细胞频率；（3）WB检测Thl型调控因子T-bet、STAT1和pSTAT1蛋白表达。（4）WB检测H3K4me2和LSD1的表达。结果：1.对照组CD4+Th细胞纯度为（96.9±2.3）%,CHB患者组CD4+Th细胞纯度为（96.5±2.5）%,两组差异无统计学意义（P>0.05）。（1） CHB组外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平高于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。CHB患者各组外周血CD4+Th细胞LSD1表达：HBsAg高水平组>低水平组（P<0.05）; HBeAg阳性组>阴性组（P<0.01）; ALT高水平组<低水平组（P<0.05）; HBV-DNA高载量组>HBV-DNA低载量组（P<0.05）,差异均有统计学意义。（2）与对照组相比,CHB患者血清IFN-γ显着降低（P<0.01）；IL-4水平无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）; IFN-γ/IL-4比值明显降低（P<0.01）。CHB患者各组血清IFN-γ及IFN-y/IL-4:HBsAg高水平组<低水平组（P<0.01）;HBeAg阳性组<阴性组（P<0.01）；ALT高水平组>低水平组（P<0.01）; HBV-DNA高载量组<低载量组（P<0.01）,差异均有统计学意义。血清IL-4水平在HBsAg高水平组与低水平组,HBeAg阳性组与阴性组,ALT高水平组与低水平组和HBV-DNA高载量组与低载量组间比较均无统计学差异（P>0.05）。（3） CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达量与血清IFN-γ水平呈负相关（P<0.01）；与血清IL-4水平无相关（P>0.05）；与IFN-γ/IL-4呈负相关（P<0.01）。2.在不同浓度TCP干预下：（1）随着TCP浓度增加,不同实验组IFN-γ阳性细胞频率均明显高于对照组；IL-4阳性细胞频率无显着差异（P>0.05）。（2）与对照组相比,TCP干预组CD4+Th细胞Thl型特异转录因子T-bet表达明显增加（P<0.01）,上游调控因子STAT1磷酸化（Phosphorylated STAT1, pSTAT1）程度显着增加（P<0.01）,STAT1总蛋白的表达无明显变化（P>0.05） （3） H3K4me2表达增加（P<0.01）。结论：1.CHB患者外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平高于对照组,且实验组中代表HBV感染程度的HBsAg, HBeAg、HBV-DNA载量高水平组,其LSD1表达水平高于各指标的低水平组。在显示肝组织损伤程度的ALT低水平组,LSD1表达量高于ALT高水平组,提示LSD1的低表达有利于Thl细胞分化并能上调细胞免疫应答,产生效应性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）,导致大量被HBV感染的肝细胞损伤,释放过量ALT至外周血。2.CHB患者外周血中Thl型细胞因子IFN-γ表达水平低于对照组,与外周血CD4+Th细胞LSD1表达水平呈负相关,实验组中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA载量高水平组,IFN-γ均低于各指标低水平组；Th2型细胞因子IL-4则均无明显变化。以上结果提示LSD1可通过影响Thl分化,导致CHB患者Th1/Th2平衡漂移。3.TCP干预后,IFN-γ阳性细胞频率明显高于对照组,Thl型特异转录因子T-bet表达明显增加,上游调控因子STAT1磷酸化（pSTAT1）水平显着增加,提示其通过T-bet/STAT1信号转导通路抑制LSD1的活性；LSD1的底物H3K4me2表达水平上升,进一步证实TCP是良好的LSD1活性抑制剂。综上所述,本研究结果表明LSD1高表达是CHB患者体内Thl分化水平下降、Th1/Th2分化失衡并导致对HBV清除或抑制HBV复制能力减弱的原因之一。提示LSD1高表达参与了慢性HBV感染的致病过程,调节LSD1表达可成为针对HBV感染的潜在治疗靶点。第二部分下调LSD1对HBV感染小鼠模型的作用及机制研究目的：通过小鼠尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒建立HBV小鼠模型。使用TCP和LSD1siRNA下调HBV小鼠模型体内LSD1的表达,通过观察HBV小鼠模型体内HBV抗原和DNA的变化及组织病理学检测的改变,判断下调LSD1对HBV模型小鼠清除HBV的影响。通过观察HBV模型小鼠与TCP和LSD1 siRNA处理小鼠脾脏来源的淋巴细胞中LSD1的表达变化,及体外转染骨髓来源的树突状细胞（Dendritic cells, DC）细胞中LSD1的表达情况和表型的改变,探讨其作用机制。检测外周血和脾脏CD4+Th细胞IFN-γ和IL-4的表达,观察小鼠脾细胞Thl相关的转录调控因子T-bet和pSTAT1以及LSD1、H3K4me2的表达水平的变化；探讨LSD1酶活性改变与HBV感染小鼠免疫细胞Th1/Th2平衡漂移的关系以及抑制LSD1酶活性对HBV感染病毒清除的影响及机制。方法：1.将100μg重组的HBV1.3倍长重组质粒经尾静脉高压注射BALB/C小鼠,建立HBV小鼠感染模型。（1）4d后ELISA法检测小鼠血清HBsAg;（2）实时定量PCR检测HBV-DNA载量；（3）HE染色观察肝细胞变化；（4）免疫组化检测肝组织HBsAg、HBcAg和HBeAg分布,确定HBV感染小鼠模型的建立。2.将BALB/C小鼠随机分成4组,每组20只：对照组（仅尾静脉注射1 ml生理盐水）；模型组（尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积生理盐水）；LSD1siRNA组（尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积溶解50 μg LSD1 siRNA的生理盐水）；TCP组（尾静脉注射HBV1.3倍长重组质粒与等体积溶解TCP终浓度为60μM的生理盐水）。对各组小鼠（1）采用全自动微粒子化学发光法检测外周血第0d、4 d、8 d和12 d HBsAg的表达情况；（2）实时定量PCR检测HBV-DNA载量；（3）免疫组化检测肝组织HBsAg表达水平；（4）分离各组小鼠的脾淋巴细胞,提取全细胞蛋白,WB检测脾脏来源的淋巴细胞LSD1的表达情况；（5）将体外诱导各组小鼠骨髓来源的DC,提取细胞总蛋白,WB检测LSD1的表达水平；采用流式细胞术检测各组小鼠骨髓来源的DC表面MHC-Ⅱ、D11c、CD80和CD86分子的表达变化；（6）用ELISA检测小鼠外周血中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达；通过免疫磁珠分选试剂盒获取小鼠脾脏中CD4+Th细胞,部分通过胞内细胞因子染色,经流式细胞术分别检测Thl和Th2细胞特异性细胞因子IFN-γ和IL-4的表达,部分用于提取细胞蛋白,WB检测CD4+Th细胞中LSD1、H3K4me2、STAT1和T-bet的表达。结果：1.尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒小鼠4天后,检测发现（1）外周血HBsAg阳性；（2） HBV-DNA载量达到最高峰；（3）肝细胞无明显病理改变；（4）肝组织中HBsAg广泛存在,HBcAg和HBeAg未见分布,说明HBV感染模型构建成功。2.LSD1 siRNA和TCP组小鼠与模型组小鼠相比（1）各时间点血清HBsAg表达较后者显着降低（P<0.01）；（2）血清HBV-DNA载量明显低于后者组（P<0.01）；（3）肝脏HBsAg显着减少（P<0.01）；（4）脾脏来源的淋巴细胞中LSD1的表达较后者显着降低（P<0.05）；（5）骨髓来源的DC LSD1表达水平较后者明显下降（P<0.01）,表型分析结果显示,LSD1 siRNA组较后者DC表面分子MHC-Ⅱ、 CD11c、CD80和CD86分子表达上调（P<0.01）；（6）外周血中IFN-γ的表达高于模型对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,而各处理组IL-4的表达无统计学差异（P>0.05）; IFN-γ阳性细胞频率高于模型对照组（P<0.05）,而各组IL-4阳性细胞频率无明显差异（P>0.05）; TCP组和LSD1 siRNA组Thl相关的转录调控因子pSTAT1和T-bet的表达均高于对照组（P<0.05）；模型对照组和TCP组LSD1的表达高于LSD1 siRNA组（P<0.05）,而模型对照组H3K4me2的表达低于TCP组和LSD1siRNA组（P<0.05）。结论：1.用尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒可简便有效的构建HBV感染的小鼠模型,为研究HBV感染创造条件。2.通过TCP或LSD1siRNA干预,感染小鼠DC表面与抗原提呈相关分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达水平增高,表明两种干预方法均可增强小鼠DC的抗原提呈功能,进而促进HBV清除。3.通过TCP或LSD1siRNA干预：感染小鼠外周血IFN-γ和IFN-γ阳性细胞频率均出现明显增高,提示促进小鼠脾脏Thl/Th2分化平衡向Th1细胞偏移；Th1型特异转录因子T-bet表达明显增加,上游调控因子STAT1磷酸化（pSTAT1）程度显着增加,亦显示其可调控CD4+Th细胞分化向Th1型漂移,机制是通过对T-bet/STAT1信号转导通路产生影响进而抑制了LSD1的活性。4.结果显示模型对照组和TCP组LSD1的表达高于LSD1siRNA组,而模型对照组H3K4me2的表达低于TCP组和LSD1siRNA组。表明TCP干预降低了LSD1的酶活性,使得H3K4me2蛋白的表达增加,但并未抑制LSD1的表达。综上所述,本研究应用尾静脉高压注射HBV1.3倍长重组质粒构建HBV感染的小鼠模型,用TCP或LSD1 siRNA干预后,小鼠DC表面与抗原提呈相关分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表达水平增高,表明两种干预方法均可增强DC的抗原提呈功能,进而促进HBV清除。在感染小鼠体内应用TCP或LSD1 siRNA干预后,促进了脾脏Th1/Th2分化平衡向Th1细胞偏移,能加快体内HBV的清除。上述结果为表观遗传学调控参与HBV感染的发生和发展提供了理论和实验依据。
袁松松,邬小萍[4]（2014）在《乙型肝炎e抗原在HBV感染过程中的研究进展》文中提出乙型肝炎e抗原（HBeAg）是由HBV-C基因区编码的一种非颗粒性的分泌型核壳蛋白,目前已证实HBeAg具有耐受原与免疫原双重作用,不参与乙型肝炎病毒（HBV）的复制、感染细胞及装配,但在慢性乙型肝炎宿主的免疫反应中发挥重要作用,其具体功能至今尚未完全明确。文章综述了HBeAg的生物学特征、免疫调节功能及其可能的作用机制和一般临床意义。
李映菊[5]（2013）在《Th17型细胞在乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的作用及其分化机制》文中进行了进一步梳理研究背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，具有严格的宿主和组织特异性，是全球感染性肝脏疾病的主要病因，据报道全球约每年100万的患者死于HBV感染导致的各种疾病，如肝功能衰竭、肝硬化和肝癌，严重威胁人类的健康。HBV本身不引起肝细胞病变，肝脏的病理变化主要取决于机体免疫应答，尤其细胞免疫应答。HBV导致的免疫损伤十分复杂，加之缺乏有效的动物疾病模型，故目前乙型肝炎发生发展的免疫病理机制尚不十分清楚。Th17型细胞是一种辅助性CD4+T细胞，能够分泌产生IL-17A（即IL-17）、IL-17F、IL-22、IL-6等细胞因子，孤独核受体γt （Orphan nuclear receptor gammat, RORγt）是调节Th17型细胞分化的关键转录因子。Th17型细胞可促进炎症的发生发展，与许多免疫性疾病的致病机制密切相关。现发现Th17型细胞及其相关的细胞因子在HBV相关的肝脏疾病中明显升高。但有关HBV抗原诱导的Th17型细胞在肝脏免疫病理损伤的作用，以及影响其分化的机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，本研究首先用HBV抗原定向诱导初始CD4+T细胞向Th17型细胞分化，并过继转移到能表达HBsAg和HBcAg的小鼠模型，以研究Th17型细胞在HBV感染中的致病作用；并进一步研究HBV抗原对Th17型细胞分化的影响及机制。第一部分HBV重组腺病毒的构建目的构建HBV重组腺病毒方法利用分子克隆技术将1.3倍HBV全基因组（ayw亚型）真核表达质粒与穿梭质粒pAdTrack连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-HBV。测序验证序列正确后，将重组穿梭质粒pAdTrack-HBV线性化转染到含有pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183中构建HBV重组腺病毒质粒pAd-GFP/HBV1.3。测序验证后，将重组穿梭质粒pAd-GFP/HBV1.3线性化，用脂质体2000转染到HEK293AD细胞进行包装，并进一步扩增HBV重组腺病毒，用氯化铯梯度离心纯化HBV重组腺病毒，最后用HBV DNAFQ-PCR定量检测HBV重组腺病毒浓度。结果pAdTrack-HBV质粒和pAd-GFP/HBV质粒分别经酶切，在1%琼脂糖凝胶电泳，均可得到4.1Kb大小的酶切片段，大小与1.3倍HBV基因全长相符合。转染pAd-GFP/HBV质粒的HEK293AD细胞在24小时后开始表达GFP荧光蛋白，1周后出现细胞病理效应。扩增后的HBV重组腺病毒的HBV DNA含量为1.31×1010copies/ml，经氯化铯梯度离心纯化后病毒指数为7.89×1012copies/ml。结论成功构建HBV重组腺病毒（Ad-HBV）。第二部分HBV感染小鼠模型的建立及小鼠对HBV的免疫应答反应目的建立急性HBV感染小鼠模型，研究HBV感染早期小鼠的免疫反应及其肝组织学改变。方法尾静脉注射HBV重组腺病毒感染C57BL/6小鼠，在注射病毒后的第1、2、3、5、7天收集小鼠血液、脾脏和肝脏。分离小鼠血清，用改良赖氏法检测血清谷丙转氨酶；时间分辨免疫荧光分析方法（IFMA）定量检测血清HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe和抗HBc；HBV FQ-PCR定量检测血清HBV DNA。分离肝脏细胞，用HBsAg和HBcAg作用肝脏细胞后，ELISA检测细胞因子INF-γ、IL-4和IL-17；Real-time PCR检测肝脏组织HBV cccDNA；荧光显微镜观察肝脏组织GFP蛋白表达；HE染色切片检测小鼠肝脏组织病理学检查，免疫组化检测肝脏HBsAg和HBcAg表达。结果Ad-HBV组与Ad组C57BL/6小鼠在注射初期（1d、2d）均出现血清谷丙转氨酶轻度升高和肝脏组织轻度炎症反应，两组之间无统计学差异，第3天血清谷丙转氨酶和肝脏组织学改变基本恢复正常。小鼠感染Ad-HBV后的第1天血清检测到HBsAg和HBV DNA，肝脏组织也出现HBsAg、HBcAg的表达和HBV cccDNA，第3天最明显。感染后第5天检测到抗-HBs，第7天检测到抗-HBc，而抗-HBe一直为阴性；HBsAg和HBcAg作用后不影响肝脏细胞的INF-γ、IL-4和IL-17细胞因子分泌水平。结论尾静脉注射Ad-HBV能够构建急性HBV感染小鼠模型；Ad-HBV感染C57BL/6小鼠早期不产生特异性免疫反应与肝脏损伤作用。第三部分HBV抗原诱导的Th17型细胞对感染Ad-HBV小鼠的作用研究目的定向诱导HBV抗原特异性Th17型细胞，并研究其对感染Ad-HBV小鼠的作用。方法1．诱导HBV抗原特异性CD4+T细胞经C57BL/6小鼠鼻腔接种200μl含5×106copies HBV重组腺病毒的病毒悬液，4周后加强一次，再经1周后取小鼠脾脏单个核细胞，将细胞分三组：HBV抗原+细胞因子组，HBV抗原组和PBS组。HBV抗原+细胞因子组，用细胞因子（TGF-β1ng/mL、IL-610ng/mL、IL-2310ng/mL、抗IFN-γ5μg/mL、抗IL-45μg/mL）和HBV抗原（HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml）作用小鼠脾脏单个核细胞；HBV抗原组用HBsAg20μg/ml和HBcAg20μg/ml作用细胞；PBS组仅用PBS作用细胞。72小时后用CD4+T细胞磁珠分选脾脏单个核细胞的CD4+T细胞，把CD4+T细胞与抗原提呈细胞（通过Mitomycin C处理健康小鼠脾脏单个核细胞获得）按5：1混合，并加用上述刺激因素继续作用72小时。收集小部分细胞悬液用ConA刺激24小时后，ELISA检测上清中IL-17、IL-22、INF-γ和IL-4的水平；流式细胞术（FCM）分析IL-17+CD4+T细胞、INF-γ+CD4+T细胞和IL-4+CD4+T细胞的百分比；Real-time PCR检测细胞IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平。2．构建小鼠肝脏急性损伤模型通过C57BL/6小鼠尾静脉注射HBV重组腺病毒，感染病毒3天后予以细胞过继转移。洗涤上述培养的HBV抗原特异性CD4+T细胞，PBS重悬细胞，将200μl含2×107个细胞的悬液尾静脉注射给已感染HBV重组腺病毒3天的C57BL/6小鼠。24小时后处死小鼠，取小鼠血清用改良赖氏法检测谷丙转氨酶，取肝脏石蜡包埋，切片进行HE染色观察肝脏病理学改变。结果1．HBV抗原+细胞因子组IL-17+CD4+T细胞的百分比，以及IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平显着性高于HBV抗原组和PBS组，P＜0.01，且IL-17和IL-22分泌水平也显着性高于其它两组，P＜0.01。HBV抗原组的IL-17+CD4+T细胞百分比，以及IL-17和IL-22mRNA水平和分泌显着性高于PBS组，P＜0.01；HBV抗原组INF-γ+CD4+T细胞的百分比和INF-γ的分泌显着性高于HBV抗原+细胞因子组和PBS组，P＜0.01。HBV抗原+细胞因子组、HBV抗原组和PBS组IL-4+CD4+T细胞的百分比和IL-4分泌无显着性差异。2．HBV抗原+细胞因子组和HBV抗原组的CD4+T细胞分别过继转移给感染Ad-HBV的C57BL/6小鼠，均能导致小鼠血清谷丙转氨酶升高，以及肝脏组织明显的炎症反应，如肝细胞明显肿胀，部分坏死，肝脏结构紊乱，大量的炎症细胞浸润。结论1．用HBV抗原（HBsAg和HBcAg）联合细胞因子在体外成功定向诱导初始CD4+T细胞向Th17型细胞分化。2．HBV抗原特异性Th17型细胞可导致感染Ad-HBV小鼠的肝脏炎症反应与组织损伤。第四部分研究HBV抗原对Th17型细胞分化的影响及机制目的研究HBV抗原对小鼠Th17型细胞分化的影响及机制方法1．分别用重组HBsAg、HBcAg、HBeAg免疫C57BL/6小鼠，取三种抗原免疫组小鼠的脾脏单个核细胞，一部分细胞用相应HBV抗原（HBsAg20μg/ml，HBcAg2.5μg/ml，HBeAg2.5μg/ml）作用24小时，流式细胞术检测细胞的IL-17+CD4+T细胞百分含量。另一部分细胞用磁珠分选CD4+T细胞，并与相应抗原和小鼠腹腔巨噬细胞共同培养72小时，real-time PCR检测细胞的IL-17、IL-22和RORγtmRNA水平，以及培养液IL-17和IL-22的含量。2．检测HBV三种抗原免疫组脾脏单个核细胞的TLR2、3、4、7和9mRNA水平。分别用HBV抗原作用相应免疫组小鼠脾脏单个核细胞24小时，检测细胞IL-6和IL-23mRNA水平和分泌。不同剂量HBV抗原作用小鼠腹腔巨噬细胞24小时，检测IL-6、IL-23mRNA水平和分泌及其TLR7mRNA水平和蛋白表达。siRNA沉默巨噬细胞TLR7的表达，Western-Blot分析siRNA抑制效率；以siRNA-TLR7小鼠巨噬细胞为APC，分别加入三种不同的HBV抗原及相应的HBV抗原免疫的CD4+T细胞共同培养72小时，检测CD4+T细胞的IL-17、IL-22和RORγt mRNA水平，以及IL-17和IL-22的分泌水平；用HBV抗原对siRNA-TLR7小鼠巨噬细胞作用后，检测其IL-6和IL-23的分泌和mRNA水平。结果1．HBsAg免疫组、HBcAg免疫组、HBeAg免疫组脾脏单个核细胞的IL-17+CD4+T细胞百分比显着性高于佐剂组，P＜0.01，且CD4+T细胞的IL-17和IL-22mRNA水平和分泌，以及RORγt mRNA水平均显着性高于佐剂组，P＜0.01，但程度不一致。IL-17mRNA水平和分泌依次是HBcAg组—HBeAg组—HBsAg组，三组间差异具有统计学意义，P＜0.01；IL-22mRNA水平和分泌依次是HBsAg免疫组—HBcAg免疫组—HBeAg免疫组，HBsAg免疫组显着性高于HBcAg和HBeAg免疫组，P＜0.01，而在HBcAg和HBeAg免疫组之间无显着性差异；RORγt mRNA水平依次是HBcAg免疫组—HBeAg免疫组—HBsAg免疫组，HBcAg免疫组显着性高于HBsAg和HBeAg免疫组，P＜0.01，而在HBsAg和HBeAg免疫组之间无显着性差异。2．与佐剂对照组比较， HBeAg免疫组小鼠脾脏单个核细胞的TLR2mRNA水平显着性升高，P＜0.01，HBcAg免疫组无明显改变，而HBsAg免疫组则表达显着性下降，P＜0.01；三种抗原免疫组TLR3mRNA水平无明显改变；HBcAg免疫组TLR4mRNA水平显着性升高，P＜0.01，HBeAg免疫组无明显改变，而在HBsAg免疫组其表达显着性下降，P＜0.01；三种抗原免疫组TLR7mRNA水平均显着性升高（P＜0.01），以HBcAg免疫组升高最明显；三种抗原免疫组TLR9mRNA水平均显着下降（P＜0.01）。HBsAg、HBcAg和HBeAg免疫组脾脏单个核细胞的IL-6mRNA水平和分泌均高于佐剂组；而HBcAg和HBeAg免疫组IL-23mRNA水平和分泌显着性高于佐剂组，P＜0.05。体外小鼠巨噬细胞在HBsAg、HBcAg和HBeAg作用下TLR7mRNA水平和蛋白表达显着性升高，P＜0.01。在HBcAg和HBeAg作用下，巨噬细胞IL-6和IL-23mRNA水平和分泌显着性升高，P＜0.01，呈浓度依赖关系，且以HBcAg作用最明显；HBsAg作用巨噬细胞仅IL-6mRNA水平和分泌显着性升高，P＜0.01。siRNA-TLR7抑制靶基因效率近70%；siRNA-TLR7能显着性抑制能显着性抑制三种HBV抗原（HBsAg、HBcAg和HBeAg）免疫组小鼠CD4+T细胞IL-17、IL-22mRNA水平和分泌及RORγt mRNA水平的上调（P＜0.01）；能显着性抑制三种HBV抗原上调小鼠巨噬细胞的IL-6mRNA分泌和水平（P＜0.01），及显着性抑制HBcAg和HBeAg上调小鼠巨噬细胞IL-23mRNA水平和分泌（P＜0.05）。结论1．HBsAg、HBcAg和HBeAg能够促进Th17型细胞分化，以HBcAg诱导作用最强；HBcAg和HBeAg诱导的Th17型细胞以分泌IL-17为主；HBsAg诱导的Th17型细胞以分泌IL-22为主。2．HBcAg和HBeAg通过上调小鼠巨噬细胞TLR7表达，增加IL-6和IL-23分泌，诱导Th17型细胞分化，而HBsAg通过上调小鼠巨噬细胞TLR7表达，仅增加IL-6分泌，诱导Th17型细胞分化。
戴金津[6]（2013）在《慢性HBV感染者肝脏组织IL-12表达及其意义》文中提出背景目前慢性HBV感染的免疫发病机制尚不太清楚。急性自限性HBV感染时Th1占优，宿主启动了强有效的、多克隆的、多特异性的免疫反应，有利于病毒清除和肝功能的恢复。反之，Th2占优时感染者不能产生强有力的免疫反应，不足以及时有效地清除受染肝细胞中的病毒，导致感染的慢性化。IL-12有助于分化调节Th1/Th2平衡，促使Th0细胞向Th1方向分化成熟，阻止Th0向Th2方向的发展，增强细胞毒性T细胞的活性，诱导病毒特异性Th细胞活动的发生，抑制病毒的复制及表达。但IL-12在慢性HBV感染者肝脏组织中的表达及临床意义尚未见报道。目的探讨细胞因子白细胞介素-12在肝脏组织中表达与HBV感染慢性化发病的相关性，采用SP免疫组化法检测慢性HBV感染相关性肝病患者肝脏组织中IL-12表达，研究IL-12在疾病进展中的可能作用，评估检测慢性HBV感染者肝脏组织IL-12表达强度作为常规免疫标记的可能性。方法应用半定量SP免疫组化法检测107例慢性乙型肝炎，41例乙肝后肝硬化，37例乙肝后肝癌，76例慢性HBsAg携带者肝脏组织中IL-12的表达情况，另选9个健康人作对照组。采用常规生化方法检测肝功能，采用ELISA法检测HBV血清学标记物，采用荧光定量PCR试剂盒检测HBV-DNA。结果1. IL-12主要在肝细胞胞浆中表达。半定量分析结果显示，IL-12在CHB、肝硬化、HBV相关性肝癌组织中的表达水平存在显着差异（P<0.05）。2. CHB患者IL-12表达情况与病理分级的相关性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。3. IL-12在肝癌及癌旁组织中的表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）。4. CHB患者IL-12的表达情况与HBeAg阳性、HBV-DNA等因素比较，差异无统计学意义（P>0.05），CHB患者IL-12的表达情况与ALT水平比较差异显着（P<0.05）。5.肝功能正常的慢性HBV感染者中，HBeAg阳性者IL-12阴性表达率显着高于HBeAg阴性者，HBV-DNA水平高的患者IL-12阴性表达率高，HBV-DNA水平低的患者IL-12阳性表达率高（P<0.05）；免疫耐受者IL-12阴性表达率高，低或非复制期者IL-12阳性表达率高（P<0.05）。结论1. IL-12在CHB、肝硬化、HBV相关性肝癌组织中的表达存在显着差异，提示IL-12与HBV感染的免疫发病机制有关，可能参与HBV感染的慢性化、疾病的进展与转归。2.不同HBeAg状态及HBV-DNA病毒载量水平的CHB患者肝脏内IL-12的表达差异有统计学意义，提示IL-12可能参与HBeAb的产生及HBV的清除。
夏妍,张淑云[7]（2013）在《CD4+T淋巴细胞亚群与HBV感染不同临床转归的关系》文中研究说明人体感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）后可有无症状的隐性感染、急性乙型肝炎和急性重型乙型肝炎等多种临床表现.此后有的清除病毒,表现为自限性HBV感染,而约90%的儿童和10%的成人则转为HBV携带者或慢性乙型肝炎,并可进一步发展成肝硬化和肝细胞癌.CD4+T淋巴细胞在抗感染免疫中起核心作用.他有Th1、Th2、Treg、Th17、Th22、Tfh和Th9等多种亚群,均可来自于同一祖细胞（Th0）,有着各自的分化途径和分泌不同的细胞因子,起着不同的作用.但彼此又相互作用和相互转化,尤其是Th1/Th2和Th17/Treg的平衡在HBV感染的临床转归中发挥着重要作用.
陈宇,邱隆敏,姚新生,庄勤建,吕红[8]（2012）在《核苷(酸)类似物抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响》文中研究说明我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染的高流行区,大样本的调查显示我国慢性HBV感染者高达1.2亿人之多.由于持续HBV感染及复制激发的免疫应答失调是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者病情进展的根本原因,要阻止疾病进展,应进行有效的抗病毒治疗.核苷（酸）类似物是目前公认有效的抗HBV的药物之一,被广泛应用于临床,主要通过抑制DNA聚合酶的复制从而发挥抗HBV作用.其在有效抗病毒治疗的同时对机体细胞免疫功能有何影响.本文就近年来此方面的研究进展进行综述.
揣侠[9]（2012）在《乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用》文中研究说明乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）)感染是严重危害人类健康的主要疾病之一。尽管预防性乙肝疫苗的广泛接种,极大的降低了HBV感染的发病率,但仍存在部分疫苗无/低应答人群及免疫逃逸现象,因而迫切需要研制新型有效的治疗性疫苗,打破机体的免疫耐受状态；并且由于HBV宿主范围狭窄,只感染人和少数灵长类动物,缺乏理想的小动物模型,限制了人们对HBV生物学特性、发病机制及新型疫苗与药物的研发和评价等方面的研究。基于HBV动物模型研究现状及疫苗发展的需求,本文在前期研究的基础上,将1.3拷贝的HBV基因组插入到自灭活HIV-1慢病毒载体系统转移载体骨架,构建重组的HBV转基因载体,并利用高压尾静脉注射的方法注入到小鼠体内,建立HBV成体转基因小鼠模型；同时制备含S+PreS1融合抗原的新型HBV颗粒样疫苗与重组病毒载体疫苗,优化不同佐剂组合方案或颗粒样疫苗与不同重组病毒载体疫苗联合应用,分析其在小鼠中诱导的抗原特异的免疫应答,初步优化HBV疫苗的免疫方案；进一步利用已建立的HBV成体转基因小鼠模型,基于前期优化的新型HBV疫苗的免疫方案,综合分析HBV疫苗所诱导的抗原特异性免疫应答特点,并评价疫苗免疫后在HBV感染小鼠体内的免疫保护和免疫清除作用。本研究取得的主要结果简述如下：一、乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化1、HBV基因组转导质粒的构建与结构优化利用慢病毒载体系统的转基因质粒pCS-CG骨架,筛选出正向插入1.3拷贝HBV基因组的pCS-HBV1.3K转基因载体质粒最适宜用作后续实验研究。2、两种HBV转基因载体质粒（pCS-HBV1.3与pAAV-HBV1.3）用于建立HBV成体转基因小鼠模型的比较分别将筛选出的pCS-HBV1.3K（以下简称pCS-HBV1.3）与前期构建的pAAV-HBV1.3质粒经高压水动力法尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内,比较HBV标志物的表达,发现pCS-HBV1.3注射后,小鼠体内上述HBV标志物持续时间长,抗体出现晚,且肝组织中HBV DNA水平高,因而确定转基因载体质粒pCS-HBV1.3更适合于建立HBV持续感染动物模型。3、小鼠品系、性别、年龄及质粒注射量对建立HBV成体转基因小鼠模型的影响分别选择不同品系（C57BL/6和BALB/c）、不同剂量（5μg或10μg）、不同年龄（6周龄和18周龄）、不同性别的小鼠注射pCS-HBV1.3质粒,发现6周龄雌性C57BL/6小鼠更适合建立HBV持续感染模型。二、新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠中诱导的免疫应答特征分析1、HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备与鉴定分别构建制备了含HBVS+PreS1、C+PreS1融合抗原的重组痘苗病毒载体疫苗,含HBV S+PreS1融合抗原的重组腺病毒载体疫苗,证实目的蛋白的表达；用电镜及免疫电镜的方法证实CHO表达的含S+PreS1融合抗原疫苗HBSS1的表达及颗粒结构。2、含HBV S+PreS1融合抗原的新型颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价比较含HBV S+PreS1融合抗原的蛋白颗粒疫苗和重组痘苗病毒的不同联合免疫策略,发现HBV新型蛋白颗粒疫苗初免、重组痘苗病毒加强后可加速抗体阳转,产生高水平的S及PreS1的特异性抗体和细胞免疫反应,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α产生,明显优于蛋白颗粒疫苗同源免疫方案及重组痘苗病毒初免、蛋白颗粒疫苗加强的联合免疫方案。3、HBV颗粒样疫苗结合不同佐剂初免与重组腺病毒载体疫苗联合免疫诱发的免疫应答特点分析HBV疫苗应用CpG和A1（OH）3佐剂可提高HBVS蛋白疫苗的抗体阳转率和抗体滴度,并且重组腺病毒加强以后,抗原特异性的细胞免疫亦有所增强；而对于含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗,CpG和PolyI：C联合铝佐剂可产生高水平的S及PreS1的特异性抗体以及抗原特异性的细胞免疫反应,HBSS1联合Poly I:C/Alum混合佐剂初免重组腺病毒加强后,同时伴有高水平的CD4+和CD8+T细胞分泌的Th1型细胞因子IFN-y和IL-2产生；未观测到CNB佐剂及其联合Alum佐剂后对HBSS1抗体反应和细胞免疫应答的增强作用。三、HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护与免疫清除效果评价1、HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用在前述HBV疫苗免疫方案优化的研究基础上,首先选用含S+PreS1融合抗原新型HBV蛋白颗粒疫苗（HBSS1）与含S蛋白HBV颗粒疫苗（HBS）结合不同佐剂、或蛋白颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗（RVJSS1）,或蛋白颗粒疫苗与重组腺病毒载体疫苗（rAdSSl）联合免疫小鼠,系统比较了其抗原特异性体液与细胞免疫应答特点；末次免疫后2周采用pCS-HBV1.3质粒攻击对照小鼠与各疫苗免疫小鼠建立HBV持续感染状态。然后比较小鼠血清HBsAg、HBeAg、 HBV DNA及肝组织DNA表达水平变化。发现在上述疫苗免疫后诱导的抗S抗体均能清除血清HBsAg;而HBSS1联合RVJSS1或rAdSSl可同时清除血清HBsAg和HBV DNA,并可显着降低血清HBeAg的表达水平。进一步采用统计学方法分析疫苗诱发的免疫应答与免疫保护的相关性,发现免疫保护除与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答相关外,还与其诱发的多种抗原特异性的细胞因子密切相关。2、HBV转基因小鼠模型在HBV新型疫苗免疫清除评价中的应用选取6周龄的C57BL/6小鼠,在免疫前5天尾静脉高压注射5μgpCS-HBV1.3,建立HBV慢性感染的小鼠模型,之后接受不同方案HBV疫苗的组合免疫,如前所述,采用多种方法系统分析不同HBV疫苗免疫方案所诱导的抗原特异性免疫应答及HBV慢性感染的小鼠血与肝组织中HBV标志物,并用统计学方法分析免疫应答与HBV清除效果的相关性。结果发现：HBSS1联合重组痘苗病毒或重组腺病毒载体疫苗,可清除血清HBsAg抗原血症,显着降低血清中HBeAg及HBV DNA水平；清除效果主要与其诱导的高滴度的S、PreS1特异性的抗体应答和Thl型细胞免疫应答密切相关。本研究结果为新型HBV疫苗的进一步研发与应用奠定了基础。
马萍[10]（2012）在《替比夫定治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者免疫功能的影响》文中研究表明研究目的1、观察HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者Th1/Th2细胞相关细胞因子表达水平及其与肝功能损伤程度、HBVDNA定量及HBeAg定量的相关性,探讨Th1/Th2细胞相关细胞因子在HBeAg阳性慢性乙型肝炎免疫防御中的抗病毒效应,为选择抗病毒治疗时机提供参考。2、观察替比夫定治疗后HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者Th1/Th2细胞相关细胞因子水平变化规律,探讨替比夫定治疗对机体免疫功能的影响,为抗病毒治疗预后提供参考。研究方法1、收集2009年10月至2011年1月在山东大学第二医院及天津市传染病医院就诊的HBeAg阳性慢性乙型肝炎病例的临床资料,记录基线时血常规、肝肾功能、心肌酶、HBeAg定量、HBVDNA载量、凝血酶原活动度等指标,分别依据肝功能损伤程度、HBVDNA复制水平和HBeAg定量进行分组。以同期健康成人20例作为对照组。2、全部入组患者均接受替比夫定600mg/日抗病毒治疗,疗程48周；记录治疗12周、24周及48周时各时相点血常规、肝肾功能、心肌酶、HBeAg定量、HBVDNA载量及凝血酶原活动度等临床指标了解应答情况。3、采集治疗前、治疗12周、24周及48周时血清,-20℃冻存。4、采用双抗体夹心ELISA法检测血清Thl型细胞因子IFN-γ、TNF-α和Th2型细胞因子IL-4、IL-10的水平,比较慢性乙型肝炎患者不同肝功能损伤程度、不同HBVDNA复制水平和不同HBeAg定量组别细胞因子表达水平的差异以及替比夫定治疗后血清Th1/Th2细胞相关细胞因子的变化规律。5、应用spss17.0统计软件对结果进行统计学分析。研究结果1、共入组患者58名,依肝功能损伤程度轻、中、重度分组分别为14例、24例、20例；依HBVDNA复制水平高、中、低分组分别为16例、25例、17例；依HBeAg定量高、中、低分组分别为16例、24例、18例；2、不同肝功能损伤程度分组细胞因子水平:IFN-γ水平（pg/ml）:重度组（31.94）、中度组（25.19）和轻度组（24.53）均低于对照组（35.65）,重度组高于轻、中度组（均p<0.05）,轻度组及中度组之间无显着差异。TNF-α水平（pg/ml）:重度组（7.58）、中度组（7.43）、轻度组（7.49）和对照组（7.95）之间无显着差异。IL-4水平（pg/ml）:重度组（40.77）和对照组（43.83）均低于中度组（46.84）和轻度组（52.13）（均p<0.05）,重度组与对照组之间无显着差异,轻度组与中度组之间无显着差异。IL-10水平（pg/ml）:重度组（51.28）和对照组（51.08）均低于中度组（56.47）和轻度组（54.68）（均p<0.05）,重度组与对照组之间无显着差异,轻度组与中度组之间无显着差异。3、依不同HBVDNA复制水平分组细胞因子水平：IFN-γ水平（pg/ml）:高水平组（26.86）、中水平组（25.15）和低水平组（23.18）,各组之间无显着差异。TNF-α水平（pg/ml）:高水平组（7.22）、中水平组（7.28）和低水平组（7.70）,各组之间无显着差异。IL-4水平（pg/ml）高水平组（44.64）、中水平组（42.96）和低水平组（41.90）,各组之间无显着差异。IL-10水平（pg/ml）高水平组（57.92）、中水平组（56.53）和低水平组（56.07）,各组之间无显着差异。4、依不同HBeAg定量分组细胞因子水平：IFN-γ水平（pg/ml）:高定量组（30.21）、中定量组（30.50）和低定量组（35.22）,各组之间无显着差异。TNF-α水平（pg/ml）:高定量组（7.36）、中定量组（8.02）和低定量组（8.12）,各组之间无显着差异。IL-4水平（pg/ml）:高定量组（47.36）、中定量组（44.85）和低定量组（44.21）,各组之间无显着差异。IL-10水平（pg/ml）:高定量组（51.75）、中定量组（48.67）和低定量组（46.74）,各组之间无显着差异。5、肝功能损伤程度与IFN-γ水平呈正相关（r=0.59p<0.05）,与TNF-α水平无相关性（r=0.10p>0.05）,与IL-4（r=-0.479p<0.05）和IL-10水平（r=-0.24p<0.05）呈负相关；6、替比夫定治疗48周后应答情况全部58例患者均取得不同程度的应答,没有无应答的患者,其中取得完全应答15例（25.86%）,部分应答43例（74.14%）。不同肝功能损伤程度组别的完全应答情况：重度组完全应答11例（55.00%）,高于轻度组1例（7.10%）和中度组3例（8.33%）,三组之间差异有统计学意义（x2=27.03p<0.05）。不同HBVDNA复制水平组别的完全应答情况：低水平组完全应答10例（58.82%）,高于高水平组2例（12.5%）和中水平组3例（12.00%）,三组之间差异有统计学意义（x2=29.10p<0.05）。不同HBeAg定量组别完全应答情况：低定量组完全应答12例（75.00%）,高于高定量组1例（5.56%）和中定量组2例（8.33%）,三组之间差异有统计学意义（x2=39.03p<0.05）。完全应答组患者治疗后IFN-γ（z12=-4.62,z24=-4.68,z48=-5.06）水平逐渐升高,IL-4（z24＝-3.28,z48=-4.05）和IL-10（z24=-3.31,z48=-4.12）水平逐渐下降,变化有统计学意义（均p<0.05）,TNF-α水平治疗后无显着变化。部分应答组治疗后细胞因子水平均无显着变化。7、不同肝功能损伤程度组别治疗后细胞因子水平：IFN-γ水平：重度组于治疗12周时显着升高（25.31）（z=-4.68,p<0.05）,治疗24周时进一步升高（26.27）（z=-4.65,p<0.05）,至48周时仍维持在较高的水平（27.35）（z=-5.11,p<0.05）,治疗前后水平变化有统计学意义,轻、中度组无明显变化。TNF-α （pg/ml）水平：轻、中及重度组治疗后无明显变化。IL-4（pg/ml）水平：重度组治疗后12周时无明显变化（z=-0.78,p>0.05）,治疗24周时较前下降（z＝-3.73,p<0.05）,至48周时仍维持在较低的水平（z=-3.06,p<0.05）,差异有统计学意义,轻、中度组无明显变化。IL-10（pg/ml）水平：重度组治疗12周时无明显变化（z=-0.22,p>0.05）,治疗24周时较前下降（z＝-3.33,p<0.05）,至48周时仍维持在较低的水平（z=-2.25,p<0.05）,差异有统计学意义,轻、中度组无明显变化。8、不同HBVDNA复制水平组别治疗后细胞因子水平：IFN-γ（pg/ml）水平：HBVDNA低水平组治疗后逐渐升高（分别为z12=-2.19、z24＝-2.29、z48=-2.91）,变化有统计学意义（均p<0.05）,高及中水平组无明显变化。TNF-α（pg/ml）水平：HBVDNA高、中及低水平组治疗后无明显变化。IL-4（pg/ml）水平：HBVDNA低水平组治疗后逐渐下降（分别为z12=-2.43、z24=-2.26、z48=-2.33）,变化有统计学意义（均p<0.05）,高及中水平组无明显变化。IL-10水平：HBVDNA低水平组治疗后逐渐下降（分别为z12=-2.02、z24=-2.15、z48=-2.02）,变化有统计学意义（均p<0.05）,高及中水平组无明显变化。9、不同HBeAg定量组别治疗后细胞因子水平：IFN-γ （pg/ml）水平：HBeAg低定量组治疗后逐渐升高（分别为z12=-2.05、z24=-2.22、z48=-2.26）,变化有统计学意义（均p<0.05）,高及中定量组无明显变化。TNF-α（pg/ml）水平：HBeAg高、中及低定量组治疗后无明显变化。IL-4（pg/ml）水平：HBeAg低定量组治疗逐渐下降（分别为z12=-2.22、z24=-2.36、z48=-2.22）,变化有统计学意义（均p<0.05）,高及中定量组无明显变化。IL-10（pg/ml）水平：HBeAg低定量组治疗后逐渐下降（分别为z12=-2.07、z24=-1.99、z48=-2.22）,变化有统计学意义（均p<0.05）；高及中定量组无明显变化。研究结论1、HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者不同肝功能损伤程度组Th1/Th2细胞相关细胞因子表达水平存在差异,肝功能损伤程度与IFN-γ水平呈正相关,与TNF-α水平无相关性,与IL-4水平和IL-10水平呈负相关。不同HBVDNA复制水平组和不同HBeAg定量组Th1/Th2细胞相关细胞因子表达水平无显着差异。Th1/Th2细胞相关细胞因子水平可以反应HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的免疫状态,可以作为选择抗病毒治疗时机的免疫学参考指标。2、经替比夫定抗病毒治疗,肝功能损伤程度重、HBVDNA低水平复制、HBeAg定量低的患者应答程度较好。治疗后肝功能损伤重度组、HBVDNA复制低水平组、HBeAg低定量组IFN-γ水平较前升高,IL-4和IL-10水平较前下降,与肝功能损伤轻和中度组、HBVDNA高和中水平组、HBeAg高和中定量组相比,差异有统计学意义。TNF-α水平无明显变化。3、替比夫定治疗后取得完全应答的患者,IFN-γ水平逐渐升高,IL-4和IL-10水平逐渐下降,TNF-α水平无显着变化。部分应答的患者细胞因子水平治疗后均无显着变化。治疗后Th1/Th2细胞相关因子水平变化可以作为疗效预测指标。替比夫定治疗取得较高的HBeAg血清学转换率,可能与其具有一定的免疫调节作用相关。
二、Th1/Th2对HBV特异性抗原HBcAg和HBeAg应答的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Th1/Th2对HBV特异性抗原HBcAg和HBeAg应答的研究（论文提纲范文）
（1）基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 慢性乙肝概述 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 慢性乙肝的疾病进程 |
| 1.1.3 慢性乙肝的免疫耐受 |
| 1.1.4 慢性乙肝的药物治疗 |
| 1.2 乙肝疫苗的免疫学基础及当前研究进展 |
| 1.2.1 免疫概述 |
| 1.2.2 预防性乙肝疫苗 |
| 1.2.3 治疗性乙肝疫苗 |
| 1.2.4 慢性乙肝模型鼠 |
| 1.3 疫苗佐剂概述 |
| 1.3.1 免疫刺激剂类佐剂 |
| 1.3.2 递送系统类佐剂 |
| 1.3.3 疫苗及其佐剂研发的挑战 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 第2章 DDAB-PLA微球制剂制备及细胞水平评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 微球的制备 |
| 2.2.4 微球的表征 |
| 2.2.5 微球的体外释放 |
| 2.2.6 抗原活性与稳定性的检测 |
| 2.2.7 髓源树突状细胞(BMDCs)的提取 |
| 2.2.8 微球细胞毒性检测 |
| 2.2.9 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.2.10 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.2.11 BMDC的活化水平检测 |
| 2.2.12 BMDCs细胞因子检测 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 微球的表征 |
| 2.3.2 微球的体外释放 |
| 2.3.3 抗原的稳定性与免疫原性 |
| 2.3.4 微球的细胞毒性检测 |
| 2.3.5 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.3.6 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.3.7 BMDCs的活化水平 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 DDAB-PLA微球的作用机制探索及体内免疫效果研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 注射部位的炎症反应 |
| 3.2.4 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.2.5 小动物成像检测 |
| 3.2.6 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.2.7 淋巴结中DC、B细胞的激活 |
| 3.2.8 免疫方案 |
| 3.2.9 抗体水平检测 |
| 3.2.10 脾细胞的提取 |
| 3.2.11 脾细胞增殖 |
| 3.2.12 淋巴细胞的激活与杀伤 |
| 3.2.13 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.2.14 Th1型细胞免疫检测 |
| 3.2.15 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.2.16 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 微球制剂在注射部位的驻留 |
| 3.3.2 注射部位的炎症反应 |
| 3.3.3 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.3.4 淋巴结中DCs和B细胞的活化 |
| 3.3.5 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.3.6 体液免疫评价 |
| 3.3.7 脾细胞增殖 |
| 3.3.8 脾细胞的激活与杀伤 |
| 3.3.9 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.3.10 Th1细胞免疫水平 |
| 3.3.11 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 DDAB-PLA微球制剂在慢性乙肝模型鼠中的治疗效果考察 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 慢性乙肝模型鼠的构建 |
| 4.2.4 免疫方案 |
| 4.2.5 血清转阴率检测 |
| 4.2.6 体液免疫水平检测 |
| 4.2.7 脾细胞的提取 |
| 4.2.8 脾细胞增殖 |
| 4.2.9 淋巴细胞活化和杀伤检测 |
| 4.2.10 记忆性淋巴细胞水平检测 |
| 4.2.11 肝脏HBcAg和浸润程度检测 |
| 4.2.12 肝功能检测 |
| 4.2.13 统计分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 模型鼠的构建 |
| 4.3.2 脾细胞增殖 |
| 4.3.3 淋巴细胞的活化和杀伤 |
| 4.3.4 细胞因子分泌 |
| 4.3.5 治疗效果评价 |
| 4.3.6 免疫记忆水平 |
| 4.3.7 安全性评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 DDAB-PLA微球制剂的长效免疫及冻干研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 免疫方案 |
| 5.2.4 抗体水平检测 |
| 5.2.5 脾细胞的活化和杀伤 |
| 5.2.6 安全性评价 |
| 5.2.7 冻干制剂研究 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 抗体水平检测 |
| 5.3.2 脾细胞活化杀伤 |
| 5.3.3 安全性评价 |
| 5.3.4 冻干制剂探究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点总结 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 主要符号表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究目的与意义 |
| 第一章 隐匿性乙型肝炎病毒感染的鉴定和分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器和设备 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 主要溶液的配制 |
| 1.2.5 血清肝功能和HBV血清标志物检测 |
| 1.2.6 血浆HBV DNA提取 |
| 1.2.7 乙肝病毒载量的测定 |
| 1.2.8 BCP/PC、Whole genome、PreS/S片段的扩增 |
| 1.2.9 HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 1.2.10 OBI样品基因分型 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HBsAg-/DNA+人群的基本特征 |
| 1.3.2 HBsAg-/DNA+样品qPCR的检测 |
| 1.3.3 HBsAg-/DNA+样品Nested-PCR的检测 |
| 1.3.4 HBsAg-/DNA+样品的分类 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 隐匿性乙型肝炎病毒感染T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 外周血单个核细胞的提取 |
| 2.2.6 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 2.2.7 CFSE染色、细胞培养及流式细胞术检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究队列基本资料 |
| 2.3.2 PHA刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.3 HBV Core多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.4 HBV Pol多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PHA刺激下的非特异性免疫应答 |
| 2.4.2 HBV Core多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 2.4.3 HBV Pol多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 第三章 隐匿性乙型肝炎病毒感染特异性分子与细胞免疫反应特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 ELISPOT检测IFN-γ试验 |
| 3.2.6 ICS检测胞内细胞因子试验 |
| 3.2.7 CBA检测细胞培养液中细胞因子试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISPOT检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ |
| 3.3.2 ICS检测T细胞亚群的细胞分泌频数 |
| 3.3.3 CBA检测PBMCs分泌细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HBV特异性T细胞应答反应 |
| 3.4.2 HBV特异性T细胞亚群分泌频数 |
| 3.4.3 HBV特异性T细胞分泌细胞因子水平 |
| 第四章 隐匿性乙型肝炎病毒感染与髓源抑制性细胞的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 4.2.5 流式细胞术检测MDSCs |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究队列基本资料 |
| 4.3.2 外周血M-MDSCs和G-MDSCs的频数比例 |
| 4.3.3 M-MDSCs和G-MDSCs频数与肝功能指标的相关性 |
| 4.3.4 M-MDSCs和G-MDSCs频数与HBV DNA及HBsAg的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）LSD1在乙型肝炎病毒感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 LSD1在HBV感染中的作用及机制 |
| 1. 对象与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 健康对照和慢性乙肝患者的相关临床指标 |
| 2.2 流式细胞仪检测CD4~+Th细胞纯度 |
| 2.3 CHB组与对照组的外周血CD4~+Th细胞LSD1表达量 |
| 2.4 CHB患者各组外周血的CD4~+Th细胞LSD1表达量 |
| 2.5 CHB组与对照组外周血IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4及Th1、Th2细胞频率的比较 |
| 2.6 CHB患者之间的血清IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4比较及与LSD1表达量之间的相关性分析 |
| 2.7 不同浓度TCP对Th1、Th2细胞分化的影响 |
| 2.8 TCP对Th1型调控因子T-bet、STAT1、pSTAT1蛋白表达的影响 |
| 2.9 TCP对LSD1作用的影响 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 下调LSD1对HBV模型小鼠的作用及机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HBV模型小鼠相关指标的检测 |
| 2.2 肝脏组织病理学检测 |
| 2.3 LSD1 siRNA和TCP对HBV模型小鼠的作用 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（4）乙型肝炎e抗原在HBV感染过程中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 HBeAg的基因结构及分子生物学特征 |
| 2 HBeAg的免疫调节功能 |
| 2.1 HBeAg致免疫耐受作用 |
| 2.2 HBeAg致免疫激活作用 |
| 2.3 HBeAg的复制调节功能 |
| 3 HBeAg在乙型肝炎病毒感染过程中的可能机制 |
| 4 HBeAg的一般临床意义 |
| 5 结语 |
（5）Th17型细胞在乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的作用及其分化机制（论文提纲范文）
| 英文缩略语词汇表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 HBV 重组腺病毒的构建 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 HBV 感染小鼠模型的建立及小鼠对 HBV 的免疫应答反应 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 HBV 抗原诱导的 Th17 型细胞对感染 HBV 重组腺病毒小鼠的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 研究 HBV 抗原对 Th17 细胞分化的影响及机制 |
| 一、 HBV 抗原对小鼠 Th17 细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 二、HBV 抗原影响 Th17 细胞分化的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）慢性HBV感染者肝脏组织IL-12表达及其意义（论文提纲范文）
| 中英文缩略词一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 标本采集与处理 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 IL-12 在肝脏组织的表达分布特点 |
| 3.2 IL-12 与临床病理分级的相关性 |
| 3.3 IL-12 在肝癌中表达情况 |
| 3.4 IL-12 与 HbeAg 状态、ALT、HBV-DNA 的相关性 |
| 3.5 肝功能正常的慢性 HBV 感染者中 IL-12 的表达情况 |
| 4.讨论 |
| 4.1 IL-12 与 HBV 感染的慢性化 |
| 4.2 IL-12 与慢性 HBV 感染后疾病不同转归 |
| 4.3 IL-12 与其他生化、免疫指标 |
| 4.4 肝功能正常的慢性 HBV 感染者中 IL-12 表达情况 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）CD4+T淋巴细胞亚群与HBV感染不同临床转归的关系（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 CD4+T淋巴细胞亚群的种类和功能 |
| 1.1 Th1细胞 |
| 1.2 Th2细胞 |
| 1.3 Treg细胞 |
| 1.4 Th17细胞 |
| 1.5 Th22细胞 |
| 1.6 Tfh细胞 |
| 1.7 Th9细胞 |
| 2 CD4+T细胞亚群具有可塑性 |
| 2.1 不同C D4+T淋巴细胞亚群可分泌同一种细胞因子 |
| 2.2 CD4+T细胞各亚群有可能相互转换 |
| 2.3 同一细胞因子对多个亚群具有影响 |
| 3 各亚群及其相互关系与HBV感染转归的相关性 |
| 3.1 Th1细胞和Th2细胞与HBV感染的关系 |
| 3.2 Th17细胞和Tr e g细胞与H B V感染相关疾病的关系 |
| 3.3 T h22细胞与H B V感染引起的相关疾病的关系 |
| 3.4 Tfh与乙型肝炎的关系 |
| 4 结论 |
（8）核苷(酸)类似物抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 2 CHB患者核苷类抗病毒治疗后树突状细胞的变化 |
| 3 CHB患者核苷类似物抗病毒治疗后Tregs细胞的变化 |
| 4 CHB患者核苷类似物抗病毒治疗后辅助T细胞的变化 |
| 4.1 Th1/Th2细胞Thl/Th2细胞失衡在乙型肝炎慢性化的发生机制中起着重要作用. |
| 4.2 Th17细胞IL-17是Th17细胞分泌的免疫调节因子. |
| 5 结论 |
（9）乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 图表目录 |
| 前言 |
| 第一章 乙肝成体转基因小鼠模型的建立及条件优化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1 乙肝成体转基因小鼠模型质粒的建立及优化 |
| 2 两种HBV转基因载体pCS-HBV1.3-与pAAV-HBV1.3建立HBV小鼠模型的比较 |
| 3 乙型肝炎病毒成体转基因小鼠模型的制备条件优化 |
| 3.1 小鼠品系和注射质粒的量对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 3.2 小鼠性别对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 3.3 小鼠年龄对建立HBV小鼠模型的影响 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 新型HBV颗粒样疫苗与不同佐剂或不同载体疫苗联合应用在小鼠体内诱发的免疫应答特征分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 HBV新型颗粒疫苗与重组病毒载体疫苗的制备和鉴定 |
| 1 重组痘苗病毒的制备与鉴定 |
| 2 重组腺病毒载体疫苗的制备与鉴定 |
| 3 CHO表达的含S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗HBSS1鉴定 |
| 4 小结 |
| 第二部分 含HBV S+PreS1融合抗原的颗粒疫苗与重组痘苗病毒载体疫苗联合免疫在小鼠体内的免疫效果评价 |
| 1 免疫分组和免疫程序 |
| 2 体液免疫应答检测 |
| 2.1 各免疫小鼠特异性抗体阳转率分析 |
| 2.2 各免疫组小鼠总IgG抗体滴度变化 |
| 2.3 各免疫组IgG抗体分型分析 |
| 3 细胞免疫应答检测 |
| 3.1 ELISpot检测不同联合免疫方案小鼠细胞免疫应答 |
| 3.2 ICS检测各联合免疫组小鼠细胞因子产生情况 |
| 4 小结 |
| 第三部分 结合不同佐剂的HBV颗粒疫苗初免重组腺病毒载体疫苗加强所诱发的免疫应答 |
| 1 免疫分组和免疫程序 |
| 2 CHO表达的HBV S蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫特点 |
| 3 HBSS1结合alum、CpG和Poly I：C佐剂初免免疫应答特点分析 |
| 4 HBSS1结合alum、CNB佐剂初免免疫应答特点分析 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 HBV成体转基因小鼠模型应用于HBV新型疫苗免疫保护和免疫清除效果评价 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第一部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
| 一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫保护效果评价 |
| 二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫保护作用分析 |
| 三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫保护作用分析 |
| 第二部分 HBV转基因小鼠模型在新型HBV疫苗免疫保护评价中的应用 |
| 一 HBV蛋白颗粒疫苗联合不同佐剂同源免疫清除效果评价 |
| 二 HBV重组腺病毒载体疫苗联合蛋白颗粒疫苗免疫清除作用分析 |
| 三 HBV蛋白颗粒疫苗联合重组腺病毒载体疫苗免疫清除作用分析 |
| 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）替比夫定治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研现状、成果研允现状、成果 |
| 研究目的 |
| 研究方法 |
| 一、HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者Th1/Th2细胞相关细胞因子表达水平的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 研究方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 病例资料 |
| 1.2.2 不同肝功能损伤程度患者细胞因子水平比较 |
| 1.2.3 不同HBVDNA复制水平患者细胞因子水平比较 |
| 1.2.4 不同HBeAg定量患者细胞因子水平比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、替比夫定治疗后HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者细胞因子水平变化 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 记录临床指标 |
| 2.1.3 血清细胞因子检测 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 替比夫定治疗48周后总体应答情况 |
| 2.2.2 替比夫定治疗后细胞因子水平变化情况 |
| 2.2.3 替比夫定治疗前后不同应答程度患者细胞因子水平变化情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| Th细胞相关细胞因子与慢性乙型肝炎 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、Th1/Th2对HBV特异性抗原HBcAg和HBeAg应答的研究（论文参考文献）
- [1]基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究[D]. 卢婷. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [2]献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析[D]. 张卫云. 南方医科大学, 2018
- [3]LSD1在乙型肝炎病毒感染中的作用及机制研究[D]. 孙晓雷. 苏州大学, 2015(10)
- [4]乙型肝炎e抗原在HBV感染过程中的研究进展[J]. 袁松松,邬小萍. 南昌大学学报(医学版), 2014(09)
- [5]Th17型细胞在乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的作用及其分化机制[D]. 李映菊. 南华大学, 2013(12)
- [6]慢性HBV感染者肝脏组织IL-12表达及其意义[D]. 戴金津. 安徽医科大学, 2013(01)
- [7]CD4+T淋巴细胞亚群与HBV感染不同临床转归的关系[J]. 夏妍,张淑云. 世界华人消化杂志, 2013(06)
- [8]核苷(酸)类似物抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的影响[J]. 陈宇,邱隆敏,姚新生,庄勤建,吕红. 世界华人消化杂志, 2012(35)
- [9]乙肝成体转基因小鼠模型在新型乙肝疫苗免疫方案优化与评价中的应用[D]. 揣侠. 中国疾病预防控制中心, 2012(12)
- [10]替比夫定治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者免疫功能的影响[D]. 马萍. 天津医科大学, 2012(01)