外膜在动脉粥样硬化发病机制中的应用

一、动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用（论文文献综述）

萨沙^[1]（2014）在《电针对APOE-/-小鼠脂代谢紊乱的调整作用研究》文中提出目的：观察电针对ApoE-/-小鼠Lee’s指数、体脂比；血浆TC、TG、HDL、LDL、ApoA、 ApoB含量的影响,以及APOE-/-小鼠主动脉窦病理变化。从而探讨电针抑制AS病变形成的调脂作用机制,为针灸临床治疗AS提供科学依据。方法：将30例ApoE-/-小鼠随机分为电针组,药物组,模型组。模型组每日双蒸水0.1ml/10g灌胃,并隔日于自制束鼠器上固定10min；药物组：辛伐他汀40mg/kg.d双蒸水配置灌胃,每日灌胃一次,并隔日于自制束鼠器上固定10min；电针组针灸穴位选取“内关”,“神门”,“后三里”,“后三阴交”,局部常规消毒,针刺后接通韩氏电针治疗仪,以输出线路一组接小鼠“内关”、“神门”,一组接“后三里”、“后三阴交”,电针采用疏密波2/15Hz,电流强度为0.3mA,针刺时间为10min,每次针单侧,左右交替治疗,隔日治疗一次。共治疗11周。结果：（1）治疗后各组APOE-/-小鼠体重均明显降低（☆P<0.05）,但电针组与药物组之间比较无明显差异（*P>0.05）,说明电针组和药物组均能降低APOE-/-小鼠的体重。体脂比和Lee’s指数比较,与模型组比较,电针组和药物组（☆P<0.05）,差异有显着性。电针组和药物组比较,*P>0.05,差异无显着性。肝体比各组之间比较无明显差异（*P>0.05）。性腺脂肪重量各组之间比较,电针组与药物组比较无明显差异（*P>0.05）,两组与模型组比较（☆P<0.05）,差异有显着性。肾周脂肪重量各组之间比较无明显差异（*P>0.05）。（2）治疗后各组APOE-/-小鼠血浆氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）和载脂蛋白A、载脂蛋白B （ApoA、ApoB）含量,与模型组比较,药物组和电针组ApoE-/-小鼠血浆OX-LDL和ApoA、ApoB含量存在显着性差异,☆P<0.05；说明针刺和药物均能显着降低OX-LDL和ApoA、ApoB的含量。药物组和电针组比较,血浆OX-LDL和ApoA含量*P>0.05,差异无显着性；血浆ApoB含量比较☆P<0.05,差异有显着性。（3）针刺治疗能保护血管内膜,明显抑制斑块的发展,疗效好于药物治疗。首先,经针刺的治疗后,部分的内弹力纤维被保留住,和平滑肌细胞组成内弹力层维持血管弹性。平滑肌细胞的迁移是动脉粥样硬化发展中的重要进程。药物组组内弹力纤维的含量要明显少于电针组,而模型组内弹力纤维基本消失。其次,电针组治疗后,脂质斑块的面积小于模型组和药物组。电针组斑块内主要含有大量泡沫细胞,而模型组和药物组斑块内主要是大量粥状的坏死核和大量胆固醇结晶体。结论：电针和药物组均能降低APOE-/-小鼠的体重、体脂比和Lee’s指数,以及性腺脂肪含量；电针和药物也能显着降低OX-LDL和ApoA、ApoB的含量。电针和药物能改善ApoE-/-小鼠的脂质代谢从而达到保护血管内膜、抑制斑块发展的作用。说明脂质代谢紊乱可能是导致AS的机制之一。

张媛^[2]（2012）在《耳缘静脉注射高分子右旋糖酐致兔主As早期病变及银杏叶预防作用》文中认为目的：通过兔耳缘静脉连续小剂量注射高分子右旋糖酐的方法,创立动脉粥样硬化早期病变I型病灶的动物模型。通过对血常规、血粘度等检测指标的分析,以及对兔胸、腹主动脉的动态病理观察,以期找到动脉外膜滋养血管微循环障碍与动脉粥样硬化早期病变的关系。从预防动脉粥样硬化早期病变的角度观察银杏叶的疗效。方法：将36只雄性日本大耳白兔随机分为6组,每组6只,分别是生理盐水组、7天模型组、14天模型组、28天模型组、银杏叶组和羟苯磺酸钙组。均常规饲养。三个模型组分别在造模7天、14天、28天后处死,生理盐水组和两个治疗组在给药28天后处死。处死前,各组均采血行血常规、血生化、血粘度检测,将检测结果进行统计学分析。处死后,各组取胸主动脉、腹主动脉行HE染色、RAMll免疫组化染色,进行动态病理观察。结果：血液检测指标的统计学分析结果显示,各模型组不同程度的造成了血液高聚、高粘状态,PLT、PDW、全血高切粘度、全血中切粘度、全血低切粘度、血浆粘度均高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01）；银杏叶对血液高聚、高粘状态有一定改善作用,在PLT、 PDW、全血高切粘度、全血中切粘度、全血低切粘度、血浆粘度水平上,与7天、28天模型组比较有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）。动态观察各组胸主动脉、腹主动脉病理结果,在各模型组动脉内膜发现RAMll标记的阳性表达的巨噬细胞,以28天模型组为着,证实连续静脉注射小剂量高分子右旋糖酐的方法成功制备兔主动脉粥样硬化早期病变I型病灶模型。在7天、14天模型组和两个治疗组中发现动脉外膜滋养血管腔内瘀血,并在模型组中观察到动脉内膜不均匀增厚、内皮下层细胞聚集、平滑肌细胞核增多、外膜增生等动脉粥样硬化早期病变,甚至可见中膜病理性新生滋养血管的形成,而治疗组的病变较模型组轻,提示动脉外膜滋养血管循环障碍可能是动脉粥样硬化早期病变的始动因素,而动脉中膜病理性滋养血管的新生可能是局部缺血缺氧的一种代偿机制,银杏叶具有一定的抗动脉粥样硬化早期病变的作用。结论：1通过兔耳缘静脉连续小剂量注射高分子右旋糖酐的方法能够成功创立动脉粥样硬化早期病变I型病灶的动物模型；2动脉外膜滋养血管循环障碍可能是动脉粥样硬化早期病变的始动因素之一；3银杏叶对动脉粥样硬化早期病变有一定的预防和治疗作用。

周小明^[3]（2010）在《名老中医刘志明辨治冠心病心绞痛经验总结与临床研究》文中认为随着人类生活方式的改变,冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart diseaseCHD）已成为严重危害人类健康和导致死亡的主要疾病,动脉粥样硬化（atherosclerosis AS）是导致冠心病的主要原因,因此预防、治疗、逆转动脉粥样硬化是治疗冠心病的主要方向。动脉粥样硬化发生过程中的一个主要特征是血管壁中层平滑肌细（vascular smooth muscle cell VSMC）穿过内弹力层迁移至内膜继而在内膜增殖,VSMC迁移和增殖的机制目前尚无定论,但是炎症学说颇受重视。经皮冠脉介入治疗（percutaneous coronary intervention PCI）术后再狭窄(（restenosis RS）是CHD治疗的难点,而VSMC的迁移和增殖又被认为是再狭窄形成过程中最具特征的细胞生物学事件之一。近年发现VSMC迁移和增殖在造成VSMC数量和分布发生变化的同时,还大量分泌与合成细胞外基质（extracellular matrix ECM）和基质金属蛋白酶（matrix metaloproteinases MMPs）,后者通过降解ECM一方面促进VSMC迁移和增殖,另一方面降解动脉粥样硬化斑块纤维帽成分而导致斑块破裂,引发心绞痛。冠心病心绞痛属于中医学“胸痹心痛”范畴,中医药在防治胸痹心痛方面积累了丰富的经验,胸痹心痛的发生不外内因和外因两端,内因主要有七情内伤、脏腑虚弱、气血不调,外因主要有饮食伤脾、劳倦过度、痰饮内生。内因起决定作用,外因是发病的重要因素。胸痹心痛的治疗方法多种多样,其中治标之法有芳香温通法、活血化瘀法、化痰祛瘀法等,治本之法有益气养阴法、补肾固本法等。1.名老中医刘志明辨治胸痹心痛的经验总结刘志明老中医从事临床七十载,在继承前人经验的基础上,形成了独具特色的辨治胸痹心痛的理论体系。刘志明老中医认为本虚标实是胸痹心痛的基本病机,具体来讲,本虚有宗气亏虚、心阳亏虚、肾元亏虚,标实主要有痰浊内生、瘀血内阻。胸痹心痛虽然病位在心,但是与肾、脾、肝等五脏关系密切。治疗胸痹心痛提倡扶正为主,燮理脏腑,兼通心阳。临床注重从脏腑、气血津液进行论治。其处方精炼,配伍精当,用药平和,重视滋肾活血、通阳化浊之法。临床用药喜用药对,如生晒参与生地黄,瓜蒌与薤白,丹参与三七。善用瓜蒌薤白半夏汤,生脉散,丹参饮等方化裁。2.名老中医经验方冠心爽合剂治疗冠心病心绞痛（肾阴亏虚,心阳瘀阻型）的临床研究目的：观察冠心爽合剂治疗肾阴亏虚,心阳瘀阻型冠心病心绞痛的临床疗效和安全性,并观察其对炎症因子hs-CRP,斑块稳定因子MMP-9、TIMP-1的影响,探讨冠心爽合剂治疗冠心病心绞痛可能的作用机制,为治疗冠心病心绞痛提供安全有效方法。方法：选取中国中医科学院广安门医院2009年4月至2009年12月心内科住院和门诊冠心病心绞痛患者56例。男性26例,女性30例。采用随机、对照、前瞻性研究方法进行临床研究。脱落2例,实际完成临床观察54例,其中对照组26例,试验组28例。治疗1个月后分别观察两组患者的中医证候及各项临床症状疗效,心绞痛疗效,硝酸甘油停减率,心电图改善情况,SAQ评分及对炎症因子hs-CRP,斑块稳定因子MMP-9、TIMP-1的影响。结果：（1）试验组中医证候改善的总有效率为92.86%,对照组为76.92%,两组间有显着统计学差异（P=0.00）。进一步探讨两组各项临床症状疗效,试验组在改善胸痛、胸闷、气短、腰膝酸软、头晕耳鸣方面明显优于对照组（P<0.05）。试验组能缩短心绞痛持续时间、减少硝酸甘油用量,与对照组比较有显着统计学意义（P<0.05）。此外,试验能明显改善患者机体活动受限程度,稳定心绞痛病情,减少心绞痛的发作频率,提高患者的治疗满意度,从而提高冠心病心绞痛患者生存质量（P<0.05）。两组对心电图ST段改善无差别。两组患者治疗前后血、尿常规及肝肾功能各项指标,无统计学差异（P>0.05）。（2）治疗1个月后,两组hs-CRP值均有显着降低（P<0.05）,但试验组降低的程度较对照组明显（P<0.05）。与治疗前比较,治疗1个月后试验组MMP-9值明显下降,统计学有显着差异（P<0.05）；而对照组无明显降低；治疗后MMP-9值,组间比较,统计学有显着差异（P<0.05）。治疗后两组TIMP-1值变化不显着。结论：（1）冠心爽合剂可明显改善肾阴亏虚,心阳瘀阻型冠心病心绞痛患者的胸痛、胸闷、气短、腰膝酸软、头晕耳鸣等临床症状,缩短心绞痛发作时间,减少硝酸甘油的用量,对肝、肾功能,血、尿常规无影响。临床用药安全有效。（2）冠心爽合剂可显着降低冠心病心绞痛患者血浆hs-CRP、MMP-9水平,具有明显的抗炎,稳定动脉斑块的作用。这可能是其治疗冠心病心绞痛的作用机制之一。

左琦^[4]（2009）在《重组人白细胞介素10对肿瘤坏死因子α诱导大鼠血管平滑肌细胞和NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响》文中研究表明研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致心血管疾病的重要原因之一。日益增多的证据表明,AS是一种对血管损伤的过度炎症反应。血管损伤后,单核细胞、血小板和淋巴细胞粘附到血管壁,释放一系列细胞因子和肽类生长因子,与特异性受体结合后转导影响血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）和血管外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts,AF）表型和生长的信号,因此促进了晚期纤维增殖病变的发生。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在AS发生发展中起着关键的作用。白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）是近年来研究最为广泛的一种由体内产生的内源性的抗炎因子,在多种炎性疾病中发挥效应,其主要功能是限制和终止炎症反应。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素（heparansulfate,HS）类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan-4是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一,它作为一种与生长因子结合的共受体（co-receptor）,调控着多种细胞生物学效应,在细胞伸展、识别、粘附、迁移和增殖控制中扮演着重要的角色,同时也介导炎症反应。因此有必要研究syndecan-4在动脉粥样硬化发生发展过程中所扮演的一系列潜在功能角色及相关干预,从而为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。目的以重组人白细胞介素10（recombinant human Interleukin 10,rhIL-10）为研究对象,通过体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs和NIH/3T3细胞,应用MTS/PMS非放射性技术检测rhIL-10对TNF-α诱导的大鼠胸主动脉VSMCs和NIH/3T3细胞增殖的作用,采用Western blotting蛋白免疫印迹分析方法观察rhIL-10对TNF-α诱导的大鼠胸主动脉VSMCs和NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响,进一步从细胞和分子水平上阐述syndecan-4蛋白在动脉粥样硬化发生发展中的作用。方法1.细胞增殖的检测:实验一:应用96孔板体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设6个副孔,同样实验条件重复6次,每组共36例实验数据,并设立对照组进行比较,以明确应用各药物刺激后的细胞是否比无刺激的细胞有变化。采用MTS/PMS法确定大鼠胸主动脉VSMCs的增殖状态。实验二:应用96孔板体外培养NIH/3T3细胞,用终浓度为20ng/mL TNF-α、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设7个副孔,同样实验条件重复3次,每组共21例实验数据,并设立对照组进行比较,以明确应用各药物刺激后的细胞是否比无刺激的细胞有变化。采用MTS/PMS法确定NIH/3T3细胞的增殖状态。2.Syndecan-4蛋白表达的检测:实验一:体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定大鼠胸主动脉平滑肌细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。实验二:体外培养NIH/3T3细胞,用终浓度为20ng/mL TNF-α、100ng/mLrhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mLrhIL-10联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。结果1、rhIL-10对TNF-α诱导的SD大鼠VSMCs增殖的影响在药物刺激24小时的条件下,各组细胞的增殖率分别为:对照组1.822±0.455,TNF-α20ng/mL组2.130±0.270,rhIL-10 100ng/mL组1.989±0.309,rhIL-10 200ng/mL组2.010±0.370,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 100ng/mL组1.918±0.322,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 200ng/mL组1.924±0.145。统计分析显示:与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显着刺激大鼠VSMCs的增殖（F=12.208,t=-3.494,P=0.001）,而100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无显着影响（F=2.636,P＞0.05）。100ng/mLrhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs增殖均有显着的抑制作用（F=7.964,P＜0.05）,但未存在剂量依赖性。2、rhIL-10对TNF-α诱导的SD大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白相对表达量分别为:TNF-α20ng/mL组1.287±0.070,rhIL-10100ng/mL组1.027±0.075,rhIL-10 200ng/mL组1.017±0.067,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 100ng/mL组0.937±0.119,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 200ng/mL组0.833±0.051。统计分析表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显着刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达（F=49.971,t=-7.069,P=0.002）,而rhIL-10100ng/mL、200ng/mL组单独应用对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均无显着作用（F=0.162,P＞0.05）。100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均有显着抑制作用（F=23.304,P＜0.01）,但未存在剂量依赖性。3、rhIL-10对TNF-α诱导的NIH/3T3细胞增殖的影响在药物刺激24小时的条件下,各组细胞的增殖率分别为:对照组0.577±0.052,TNF-α20ng/mL组0.634±0.040,rhIL-10 100ng/mL组0.587±0.035,rhIL-10 200ng/mL组0.575±0.052,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 100ng/mL组0.571±0.061,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 200ng/mL组0.575±0.068。统计分析显示:与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显着刺激NIH/3T3细胞的增殖（F=15.872,t=3.984,P＜0.001）,而100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10组单独应用对NIH/3T3细胞的增殖均无显着影响（F=0.410,P＞0.05）。100ng/mLrhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对NIH/3T3细胞增殖均有显着的抑制作用（F=7.893,P＜0.01）,但未存在剂量依赖性。4、rhIL-10对TNF-α诱导的NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白相对表达量分别为:TNF-α20ng/mL组2.103±0.220,rhIL-10100ng/mL组1.146±0.054,rhIL-10 200ng/mL组1.235±0.215,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 100ng/mL组0.996±0.072,TNF-α20ng/mL联用rhIL-10 200ng/mL组1.082±0.136。统计分析表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显着刺激NIH/3T3细胞的syndecan-4蛋白表达（F=75.69,t=-8.700,P=0.013）,而rhIL-10100ng/mL、200ng/mL组单独应用对NIH/3T3细胞的syndecan-4蛋白表达均无显着影响（F=2.574,P＞0.05）。100ng/mL rhIL-10联用20ng/mL TNF-α、200ng/mLrhIL-10联用20ng/mL TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对NIH/3T3细胞的syndecan-4蛋白表达均有显着抑制作用（F=47.459,P＜0.001）,但未存在剂量依赖性。结论本研究证明了一定剂量的rhIL-10可显着抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs和NIH/3T3细胞的增殖和syndecan-4蛋白的表达。因此,有必要进一步研究syndecan-4在动脉粥样硬化发生发展过程中所扮演的一系列潜在功能角色及相关干预,从而为动脉粥样硬化的防治提供新的思路。

韩旭^[5]（2008）在《载脂蛋白E基因多态性与冠心病中医证型的关系及通心络胶囊干预的临床与实验研究》文中研究说明目的:1.首次应用国内最先进的基因测序技术为基础,研究冠心病（CHD）的载脂蛋白E（ApoE）基因多态性分布,探究CHD发病遗传易感性的关系,为CHD临床及流行病学研究打下基础。2.探究ApoE基因多态性与CHD中医证型的相关性,为CHD临床辨证施治提供分子生物学依据。3.观察ApoE基因多态性对通心络胶囊干预CHD中医证型和血脂治疗效应的影响,阐述通心络胶囊治疗CHD的作用机制。4.通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除[ApoE（-/-）]模型组小鼠血脂、心肌、冠状动脉斑块、主动脉斑块病理组织学变化及血清血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、内皮素（ET）、循环内皮细胞（CEC）、组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶1（MMP1）和基质金属蛋白酶9（MMP9）水平等指标的干预变化,探究其与CHD ApoE基因多态性的相关度并试析其机理。方法:1.将2006年3月至2007年12月收集的118例符合纳入标准的不同证型CHD患者（全部来源于江苏省中医院心内科、老年科门诊及住院患者）设立为试验组,另设立123例健康人群为对照组（均来自江苏省中医院体检中心）。通过采集血标本,Promega公司血液基因组DNA提取试剂盒进行模板DNA的提取,PCR扩增后进行基因测序。将测序结果用DNA sequencing analysis 5.1自动分析原始测序数据,获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNA star seqman与标准序列进行比对,观察样本基因序列的多态性改变,将正常对照组ApoE基因表型分布和等位基因频率比较;同时将CHD组患者的中医证型及其ApoE基因表型分布和等位基因频率相联系,并进行组间和组内比较分析。2.将临床收集的118例CHD患者随机设立为通心络胶囊治疗组和常规治疗对照组,通过采集血标本,以全自动生化分析仪检测血总胆固醇（TC）、三酸甘油酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等指标,同时记录并分析比较ApoE基因多态性和CHD的不同中医证型对中药通心络干预反应的差异及疗效。3.将40只ApoE（-/-）小鼠作为实验组,建立高脂血症和冠状动脉粥样硬化模型,随机分为模型组、辛伐他汀组、通心络胶囊高、中、低剂量组5组,分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预,另选8只同系的小鼠作为正常对照组。通过对TC、TG、HDL-C、LDL-C等指标变化,模型组小鼠心肌、冠状动脉斑块、主动脉斑块病理组织学变化及血清TXB2、6-Keto-PGF1α、ET、CEC、MMP1、MMP9和TIMP-1水平的观察、比较,分析通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血脂的调节作用和对动脉粥样硬化的影响作用及机理。4.描述性统计分析,定性指标以频数表,百分率或构成比描述;定量指标以均数,标准差描述。两组对比分析,定性资料采用卡方检验,Fisher精确概率法,Wilcoxon秩和检验,CMHx2检验;定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验,以0.05作为检验水准,方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验）,不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验,Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验,给出检验统计量及其对应的P值。以P≤0.05作为有统计学意义,以P≤0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。结果:1.118例CHD患者共检出E2/2、E3/3、E4/4三种纯合子和E2/3、E2/4、E3/4三种杂合子,且ApoE基因表型以E3/3纯合子占大多数,E2/2纯合子最低;CHD组携带的E2/4、E3/4、E4/4三种基因型频率较对照组有增加的趋势,差异有统计学意义（X2=5.004,P＜0.05）;而E3/3基因型其频率较对照组则有减少的趋势,差异有高度统计学意义（X2=6.8743,P＜0.01）。123例对照组中,等位基因分布频率则以ε3最高,占到74.39%。通过比较,CHD组ε3等位基因分布频率明显低于对照组（X2=9.2898,P＜0.05）,而ε4等位基因分布频率则明显高于对照组（X2=13.927,P＜0.01）,差异有高度统计学意义。2.118例入选的CHD患者,根据辨证分型标准,共分为以下6型:寒凝心脉证13例（占总例数的11.02%,以下同）,痰浊闭阻证29例（24.58%）,心血瘀阻证33例（27.96%）,心肾阴虚证11例（9.32%）,气阴两虚证27例（22.88%）,阳气虚衰证5例（4.24%）。3.118例入选的CHD患者不同中医证型检出的基因表型比例不一,经统计学分析可以看出:5例E2/2基因表型中仅见2例寒凝心脉证,痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证各1例;16例E2/3基因表型中以心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证为主,占该基因表型的75.0%;56例E3/3基因表型中心肾阴虚证、阳气虚衰证最少,仅占该基因表型的14.28%,而心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证最多,占75.00%;E3/4基因表型中心血瘀阻证、气阴两虚证比例相对较高,占该基因表型的52.94%;E4/4基因表型中也以心血瘀阻证和气阴两虚证为多,分别占该基因型的50.00%和43.75%。参照国内外丈献常将意义相近的基因表型合并分析的情况,我们也将E2/2基因表型和E2/3基因表型合并,E2/4、E3/4基因表型和E4/4基因表型合并,再与E3/3基因表型一起进行分析,结果表明:E2/4+E3/4+E4/4型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例最高,为82.93%;其次是E3/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为75.00%;最低是E2/2+E2/3型中心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证所占比例为61.90%。经统计学分析可以看出,E2/4+E3/4+E4/4型中:痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证相互比较P＞0.05,痰浊闭阻证、心血瘀阻证、气阴两虚证三种证型与寒凝心脉证、心肾阴虚组证、阳气虚衰证三种证型比较P＜0.05,说明CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。通过对CHD组不同中医证型ApoE等位基因频率比较,则发现:心血瘀阻证、气阴两虚证二种证型ε4等位基因频率明显高于寒凝心脉证、痰浊闭阻证、心肾阴虚证、阳气虚衰证四种证型（p＜0.05）;ε3等位基因频率不同中医证型间则大致相等;ε2等位基因频率不同中医证型间心血瘀阻证较低,而寒凝心脉证、心肾阴虚证、阳气虚衰证较高。4.ApoE多态性对通心络胶囊干预CHD疗效的影响方面:治疗组改善中医证型疗效优于对照组,p＜0.05。ε2、ε3、ε4各等位基因疗后气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证均有明显改善（p＜0.05）,痰浊闭阻证的症状积分降低改善率最高,有统计学意义（p＜0.05）,其它各基因型间的气阴两虚证及心血瘀阻证改善率差异均无统计学意义（p＞0.05）。治疗组ε4型对于中药治疗改善痰浊闭阻证疗效最好,优于ε2、ε3型;对照组,各等位基因对于气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证的症状积分改善率,差异无统计学意义,P＞0.05;两组组内同基因型疗前后自身比较,有统计学意义,P＜0.05。治疗组与对照组组内各不同基因型比较,TC、LDL-C降低和HDL-C升高的改善率,有统计学意义,P＜0.05;TG降低的改善率,差异无统计学意义,P＞0.05,提示两组各基因型对于TC、LDL-C降低和HDL-C升高均有疗效,而对TG的疗效影响无差异。治疗组与对照组组间各相同基因型间疗前后改善率比较,差异无统计学意义,P＞0.05,说明两组各相同基因型对于药物调脂反应相同。5.动物实验,首先造模成功,然后从以下三方面进行了研究:①通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血脂的影响:模型组血清TC、TG和LDL-C均明显增高,HDL-C水平下降,与正常组相比均有统计学意义（p＜0.05）。通心络胶囊中、高剂量组小鼠的血清TC,TG和LDL-C均明显低于模型组,与模型组相比具有统计学意义（p＜0.05或P＜0.01）。通心络胶囊中、高剂量组小鼠的血清HDL-C水平高于模型组,与模型组相比具有统计学意义。低剂量组小鼠的血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平与模型组相比,差异无统计学意义（p＞0.05）。②通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠小鼠AS的影响:实验显示通心络胶囊对冠状动脉粥样硬化的形成有一定的抑制作用,其中以高剂量组效果最好,其作用强于中剂量组、低剂量组。模型组所有小鼠冠状动脉病变主要位于心肌内的小分支,动脉主干及大分支未见明显病变,CHD评分4.0±1.76;辛伐他汀组冠状血管及肝脏病变较模型组减轻,CHD评分为2.3±1.16;通心络低剂量组CHD评分为3.8±2.35,中剂量组CHD评分为3.0±1.25,高剂量组评分为1.7±2.06。不同组AS比较可见,通心络低剂量组与模型组间在AS心肌细胞变性坏死,心肌间质炎症、水肿,冠状动脉心内分支管壁脂质变性程度及管周脂质沉积等方面比较,差异无统计学意义（p＞0.05）,而辛伐他汀组和通心络中剂量组在这些方面与模型组却有统计学意义（P＜0.05）,通心络高剂量组则有高度统计学意义（P＜0.01）。实验显示:通心络胶囊对冠状动脉粥样硬化的形成有一定的抑制作用,其中以高剂量组效果最好,其作用强于中剂量组、低剂量组。通心络胶囊防治小鼠主动脉粥样硬化有一定的减轻作用,但各剂量组间无统计学意义。③通心络胶囊干预ApoE（-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化形成机理的研究:通心络胶囊干预ApoE（-/-）小鼠后,通心络高、中、低剂量组和辛伐他汀组与模型组相比,血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量差异均无统计学意义（P＞0.05）;但是,模型组ApoE（-/-）小鼠血清TXB2、6-Keto-PGF1α含量高于正常组,与正常组相比,有统计学意义（P＜0.05）。模型组小鼠血清ET含量高于正常组,与正常组相比,有统计学意义;通心络胶囊三个剂量组小鼠血清ET含量均低于模型组,与之相比,有高度统计学意义。通心络高剂量组在造模后第4、8、12周血中CEC均低于模型组,与模型组相比,有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,而通心络中剂量组在造模后第4周和12周时血中CEC与模型组相比,有统计学意义（P＜0.05）,表明通心络胶囊可干预高血脂对血管内皮细胞的损伤作用。通心络高剂量组小鼠血清MMP1和MMP9水平均低于模型组,而TIMF-1水平高于模型组,与模型组相比,均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。通心络中、低剂量组小鼠血清MMP9水平低于模型组,与模型组相比有统计学意义（P＜0.05）。表明通心络胶囊有抑制实验性脂质紊乱及动脉硬化小鼠血清MMP1和MMP9活性作用。结论:1.CHD的主要证型为心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证。2.ε4基因是CHD的易感等位基因,是CHD发生的重要遗传易患因素,并可能与CHD患者心脏事件的的发生、发展和预后密切相关;密切关注ε4等位基因携带者的血脂水平,进行积极针对性地干预,将有利于防止或延缓冠心病的发生和发展。3.ε3等位基因可视为CHD发生的保护基因。4.CHD的主要基本证型心血瘀阻证、痰浊闭阻证、气阴两虚证与ApoE E3/4、E4/4基因表型及ε4等位基因密切相关。ApoE基因多态性、血脂水平与CHD之间存在因果关系,ApoE不同基因型可通过血脂代谢作用而影响CHD的发病。5.通心络胶囊干预CHD总疗效显着;ApoE多态性对通心络胶囊干预CHD不同中医证型的疗效均具有影响,但对气阴两虚证、痰浊闭阻证、心血瘀阻证具有明显疗效,尤以ε4等位基因的痰浊闭阻证疗效最为显着;对于TC、LDL-C降低和HDL-C升高均有显着疗效。6.通心络胶囊可干预ApoE（-/-）小鼠血脂水平,并对血管内皮细胞的损伤、内皮功能和炎症因子的抑制有调节作用,从而有利于调节血脂、减轻冠状AS。7.在人群中进行ApoE基因多态性检测,对CHD的早期预防、监测和积极地针对性治疗均有较为重要的意义。8.临床上中医药辨证论治可以有效改善CHD患者症状,提高临床疗效。

王华^[6]（2008）在《血管内、外膜分别损伤诱发的动脉粥样硬化形成及MAPK/NF-κB信号通路的比较研究》文中研究指明血管内皮损伤被一直认为是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病的始动因素,而近年研究发现血管外膜参与了AS的形成,炎症、氧化应激可能是主要机制。无论是从内膜损伤还是从外膜损伤开始诱发的AS形成,炎症、氧化应激、免疫调节的失衡是共同的发病机制。炎症、氧化应激、免疫调节是通过各种信号通路传递信号的,内膜损伤和外膜损伤所引起的信号传递过程可能相似性,也可能有所不同。因此,我们拟通过在同一个体建立外膜损伤和经典的内膜损伤诱导AS形成的动物模型,比较两种病变形成共同和不同的规律、特点,比较“从内而外”和“从外而内”两种信号传递途径的异同,进一步了解外膜在AS发生、发展中的作用。全文由四部分组成。第一部分内外膜损伤致动脉粥样硬化的模型的建立目的:通过在同一个体建立外膜损伤和经典的内膜分别损伤诱导AS形成的动物模型,比较两种病变形成规律和特点的异同。方法:在同一兔的两侧颈动脉,采用胶原酶分别消化颈动脉内皮和外膜的方法建立兔内膜和外膜损伤模型。分别于损伤后1w、2w、4w、8w取材,做石蜡切片和冰冻切片,采用HE、免疫组化、油红O染色方法,观察血管内膜增生情况及其构成成分。结果:血管内、外膜损伤后1周即出现了内膜的增生,随着时间的延长,斑块面积进行性增大。1周时内膜损伤组IMR＜外膜损伤组（0.29±0.02 vs 0.11±0.01,p＜0.05）,而1周后内膜损组内膜增生加速,逐渐与外膜损伤组相近,8w时内膜损伤组IMR＞外膜损伤组（0.63±0.05 vs 0.52±0.03）。油红O染色:可见血管损伤高脂饮食所致的病变中弥漫的橘红色阳性着色。α-actin免疫组化染色显示在血管损伤的早期血管病变内膜中有稀疏的阳性着色,提示病变中部分为平滑肌细胞。而随着病变的进展,无论是内膜损伤组还是外膜损伤组,血管内膜病变中CD68免疫组化染色有较密的阳性着色,提示病变中有大量巨噬细胞聚集。结论:胶原酶消化法分别损伤血管内外膜,可有效破坏血管内外膜的完整性,诱发AS的形成。外膜损伤诱发的内膜增生早于内膜损伤,但AS程度轻于内膜损伤。第二部分经血管外膜给药抑制MAPK及NF-κB信号通路的效果评价目的:以Pluronic-F127（PF127）为载体,制作含有p38、JNK、NF-κB抑制剂的缓释凝胶,经血管外膜局部给药,观察对局部血管p38、JNK、NF-κB表达的抑制作用。方法:制备PF127缓释凝胶,将p38、JNK、NF-κB抑制剂均匀溶解于PF127缓释凝胶,充填于血管周围。于给药后24h、72h、1w、2w、4w取材,用免疫组化和Western blot检测p38、JNK、NF-κB的表达情况。结果:（1）p38抑制组:Western blot检测发现给药即刻、24h、72h p-p38的无明显变化（P＞0.05）,1w开始,p-p38的表达明显下降（P＜0.05）,与免疫组化结果相一致。而p38的表达在给药后的各个时间点均无明显变化。（2）JNK抑制组:给药后1w至4周,血管壁内、中、外膜的p-JNK表达均明显减少,至4w时完全看不到阳性颗粒。（2）NF-κB抑制剂组:免疫组化发现,外膜给药后1w内血管NF-κB p65的表达均无明显变化,而1w后至4w血管完全呈阴性（图2-5）。Western blot结果与免疫组化结果比较一致,蛋白表达量较低,0d～1w无显着差异（p＞0.05）;1w后蛋白表达量明显降低（p＜0.05）结论:经外膜给以PF127缓释凝胶为载体的p38、JNK、NF-κB抑制剂可有效抑制p38、JNK、NF-κB的表达。第三部分MAPK、NF-κB信号通路在内外膜损伤诱导的AS形成中的作用目的:比较MAPK、NF-κB通路在内外膜损伤诱导的AS形成过程中的变化规律;通过外膜给药的方法,特异性的抑制血管MAPK、NF-κB信号通路,明确MAPK—NF-κB信号通路在内外膜损伤致AS形成中的作用。方法:在已建立的内外膜损伤模型的基础上,于模型建立后24h、72h、1w、2w、4w、8w取材,Western blot检测p38、JNK、ERK、NF-κB的表达的变化规律。经血管外膜给予含p38、JNK、NF-κB抑制剂的PF127缓释凝胶,观察2、4w血管内膜增生情况,以及p38、JNK、NF-κB的表达。结果:血管内膜损伤和外膜损伤对MAPK和NF-κB的影响有相似点也不同之处。二者都可以引起p-p38、p-JNK和NF-κB表达的上调,但ERK则内外有别,外膜损伤不能上调ERK的表达,但内膜损伤则以上调ERK1为主。经外膜给含p-p38、p-JNK和NF-κB的缓释凝胶可有效抑制血管p-p38、p-JNK和NF-κB的表达,延缓AS进程。结论:MAPK/NF-κB在内外膜损伤诱导的AS形成过程表达均明显增高,通过抑制MAPK/NF-κB信号通路可减轻损伤诱导的内膜增生。证明MAPK/NF-κBAS发生进展的重要通路。第四部分通心络对内外膜损伤致AS形成的干预作用及机制目的:观察通心络抑制血管内外膜损伤诱导的AS形成的效果,以及对MAPK、NF-κB信号通路的影响。方法:在已建立的内外膜损伤模型的基础上,给予通心络干预8w。行HE、免疫组化和Western blot检查,观察通心络损伤诱导的内膜增生的抑制作用,以及对p38、JNK、ERK、NF-κB的表达影响。结果:通心络可抑制内外膜损伤诱导的AS形成的作用,具有明显的抗动脉粥样硬化作用。通过对MAPK、NF-κB信号通路进行免疫组化和Western blot分析。通心络可以抑制内膜损伤组和外膜损伤组的p-p38、p-JNK的表达,而对于NF-κB,通心络仅能抑制内膜损伤组的表达,而对外膜损伤组则无作用。结论:通心络可以抑制内膜和外膜损伤诱导的动脉粥样化的发生和进展,其机制可能与通心络抑制MAPK、NF-κB信号通路有关。

鹿克风^[7]（2007）在《血脂异常在动脉粥样硬化血管外膜炎症中作用的研究》文中指出引言：长期以来动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）一直被认为是内膜炎症性疾病，血管外膜仅对血管起营养、支持作用。但最近研究发现：血管外膜对血管功能具有重要的调节作用，外膜存在的交感及副交感神经末梢释放神经递质如去甲肾上腺素、神经肽Y、P物质、乙酰胆碱、一氧化氮等可作用于中膜平滑肌细胞，调节血管舒缩功能。外膜的主要细胞成分成纤维细胞在病理状态下可被激活，发生表型转化、增殖、迁移并合成多种细胞因子，参入多种疾病的发生、发展。进一步研究血管外膜将有助于全面认识血管疾病的病理生理机制，拓展对血管病变的防治方法。已有研究证实As中存在着血管外膜炎症，而且血管外膜的炎症细胞浸润与As的病变程度呈正相关，也有报道血管外膜炎症与内膜增生及急性冠脉综合征的发生有关。动脉外膜的滋养血管可能是炎症细胞侵入血管壁的门户。但目前关于As血管外膜炎症发生的机制尚不清楚，外膜成纤维细胞在外膜炎症发生中的作用以及他汀类药物在降脂作用外能否抑制血管外膜炎症等问题国内外研究很少，为此，我们通过动物实验及细胞培养系列研究探讨血脂与As血管外膜炎症及成纤维细胞表型转化、增殖和炎症因子合成的关系以及氟伐他汀的干预作用。论文Ⅰ动脉粥样硬化家兔血脂与血管外膜变化的关系及氟伐他汀干预作用的研究背景：越来越多的证据表明血管外膜炎症可能是As发生、发展的原因之一，外膜浸润的炎症细胞分泌多种细胞因子和粘附分子，不仅可影响内膜的变化诱发As的发生，还可以通过神经末梢及直接作用于平滑肌受体影响中膜，促进As的发生、发展。血脂异常与As形成具有肯定的关系，既往的研究主要针对高胆固醇血症（Hypercholesterolemia，HC）尤其是氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-dentity lipoprotein，ox-LDL）对血管内膜的影响，但有关血脂异常对As血管外膜的影响及他汀类药物干预作用的研究国内少见报道，为此，我们通过高脂饮食建立As模型，探讨血脂与血管外膜变化的关系以及氟伐他汀的干预作用。目的：高脂饮食建立As模型，探讨：①血脂异常与血管外膜炎症细胞浸润、外膜成纤维细胞表型转化以及核因子КBp65（Nuclear factor Kappa B，NF-Kappa B）活性的关系；②外膜炎症细胞浸润与As病变程度的关系；③成纤维细胞NF-КBp65活性与其表型转化的关系；④氟伐他汀对As外膜炎症细胞浸润及成纤维细胞表型转化和NF-КBp65活性的影响。方法：（1）建立As模型：选择健康雄性新西兰家兔34只，随机分为①对照组10只：给予普通颗粒饲料喂养；②高脂饮食组12只：给予高脂饮食喂养12周（胆固醇+猪油+蛋黄+普通颗粒饲料）建立兔As模型；③氟伐他汀组12只：给予高脂饮食同时+氟伐他汀10mg/kg/d喂养12周；（2）留取兔主动脉，HE染色光镜观察As斑块形成和血管外膜炎症浸润；（3）用自动血生化分析仪进行血脂分析；（4）免疫组织化学检测外膜成纤维细胞NF-κB活性及α-肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMactin）的表达；（5）分析血脂指标分别与血管外膜炎症细胞数、外膜成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin表达的关系；外膜炎症细胞浸润与As斑块面积的关系；成纤维细胞NF-κBp65活性与α-SMactin表达的关系。结果：（1）高脂饮食组及氟伐他汀组总胆固醇（Total cholesterol，TC）及低密度脂蛋白（low-dentity lipoprotein，LDL）较正常对照组均明显增高（P＜0.01），但氟伐他汀组与高脂饮食组比较明显降低（P＜0.01）；（2）高脂饮食组及氟伐他汀组动脉内膜均较正常对照组明显增厚（P＜0.01），有明显粥样斑块形成，但氟伐他汀组与高脂饮食组比较，内膜厚度及斑块面积明显减少（P＜0.01）；（3）正常对照组血管外膜几乎无炎症细胞浸润，血管外膜成纤维细胞也几乎无α-SMactin表达及NF-κBp65活性；高脂饮食组及氟伐他汀组血管外膜均有明显炎症细胞浸润，成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin表达增加，但氟伐他汀组较高脂饮食组外膜炎症细胞浸润、成纤维细胞NF-κBp65活性及α-SMactin的表达均明显减少（P＜0.05）；（4）高脂饮食组及氟伐他汀组TC及LDL与主动脉外膜炎症细胞数、NF-κBp65活性及α-SMactin表达均呈正相关，以LDL相关性较好（高脂组LDL与外膜炎症细胞数及NF-κBp65活性的相关系数均为r=0.683，P＜0.05，LDL与α-SMactin表达的相关系数为r=0.708，P＜0.05；他汀组LDL与外膜炎症细胞数及NF-κBp65活性的相关系数分别为r=0.775，P＜0.01，r=0.726，P＜0.05；LDL与α-SMactin表达的相关系数为r=0.769，P＜0.01；），HDL与外膜炎症细胞数、NF-κB活性及α-SMactin表达呈负相关；TG无明显相关性（P＞0.05）；（5）高脂饮食组和氟伐他汀组外膜成纤维细胞NF-κBp65活性与α-SMactin的表达呈显着正相关（相关系数分别为r=0.633及0.649，P＜0.05），外膜炎症细胞浸润与斑块面积呈正相关（相关系数分别为r=0.648及0.663，P＜0.05）。结论：（1）实验性高脂饮食建立As模型成功，高脂饮食可以引起血脂明显异常。（2）HC尤其是LDL升高与As血管外膜炎症、外膜成纤维细胞表型转化及NF-κBp65的活性有关；（3）血管外膜炎症细胞浸润与As病变程度呈正相关；（4）外膜成纤维细胞NF-κBp65的活性与其表型转化呈正相关；（5）氟伐他汀能抑制As血管外膜炎症细胞浸润及外膜成纤维细胞表型转化和NF-κB的活性。论文Ⅱ氧化低密度脂蛋白对成纤维细胞表型转化、增殖及炎症因子合成的影响背景：成纤维细胞是血管外膜的主要细胞成分，在正常状态下，血管外膜成纤维细胞（Adventitial fibroblasts，AF）处于相对“静止”状态，但某些病理状态下，“静止”的AF可以转化为肌成纤维细胞（Myofibroblasts，MF），MF是具有平滑肌细胞特点的成纤维细胞，能分泌多种细胞因子和炎症介质，参入免疫和炎症反应。我们在动物实验中发现：As的血管外膜成纤维细胞被激活、转化为MF，且AF的转化与HC尤其是LDL升高呈正相关，但LDL能否引起成纤维细胞表型转化、增殖及炎症因子合成目前国内外鲜见报道，为此，我们应用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）直接作用于培养的成纤维细胞，观察ox-LDL对成纤维细胞的表型转化、增殖及炎症因子合成的影响。目的：用含有ox-LDL的培养基孵育人胚肺成纤维细胞（HEFs），并用IκB-α磷酸化抑制剂BAY11-7082进行干预，观察成纤维细胞的表型变化、增殖及炎症因子合成的变化，以探讨ox-LDL对成纤维细胞的影响及其机制。方法：（1）HEFs传代培养，并用特异性抗原波形蛋白（Vimentin）及α-SMactin进行免疫细胞化学特性鉴定，取3-8代进行实验。分为：①正常对照组：培养基中不加刺激物；②ox-LDL1组：培养基中加入25μg/ml的ox-LDL；③ox-LDL2组：培养基中加入50μg/ml的ox-LDL；④ox-LDL3组：培养基中加入100μg/ml的ox-LDL；⑤BAY11-7082组：培养基中先加入10μg/ml的BAY11-7082将HEFs孵育1h，再加入100μg/ml的ox-LDL。将各组HEFs培养24h；（2）MTT比色试验检测细胞增殖；（3）用流式细胞技术检测细胞增殖周期；（4）免疫细胞化学法检测α-SMactin、转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein，MCP-1）的表达和NF-КBp65的活性；（5）原位杂交检测NF-κBp65mRNA、TGF-β1-mRNA及MCP-1mRNA的表达；（6）ELISA检测各组细胞培养液中IL-1α、IL-6的含量；（7）分别分析不同浓度的ox-LDL对HEFs的细胞活性、细胞周期、NF-КBp65的活性、α-SMactin、TGF-β1和MCP-1表达以及IL-1α、IL-6合成的影响。结果：1、细胞特性鉴定显示：培养的细胞特异性Vimentin抗原染色阳性，α-SMactin阴性；2、MTT比色显示：50μg/ml及100μg/ml的ox-LDL组细胞增殖率均较正常对照组明显增强，差异有显着性（P＜0.05），BAY11-7082组细胞增殖率较正常对照组比较无显着性差异（P＞0.05）；3、流式细胞仪检测显示：不同浓度的ox-LDL均能使进入G1期或S期的细胞增加，以100μg/ml ox-LDL组进入S期的成纤维细胞最多，与正常组比较有显着性差异（P＜0.05），BAY11-7082组细胞周期与正常对照组比较无显着性差异（P＞0.05）；4、正常对照组和BAY11-7082组HEFs几乎无NF-КBp65的活性及α-SMactin表达，TGF-β1的表达微弱，原位杂交检测显示：正常对照组几乎无NF-КBp65mRNA表达，而BAY11-7082组NF-КBp65mRNA表达明显，两组细胞TGF-β1mRNA表达微弱；ox-LDL各组均有α-SMactin、TGF-β1表达及NF-КBp65的活性，与原位杂交检测显示的NF-КBp65mRNA及TGF-β1mRNA表达增加一致，且呈浓度依赖性，各组间有显着性差异（P＜0.05）；5、正常对照组和BAY11-7082组无MCP-1及MCP-1mRNA的表达，也无IL-1α、IL-6的分泌；ox-LDL各组均能刺激HEFs表达MCP-1及MCP-1mRNA并分泌IL-1α、IL-6，且呈浓度依赖性，各组间差异具有显着性（P＜0.05）。IL-1α、IL-6的含量均与MCP-1的表达呈显着正相关，相关系数分别为r=0.932，0.834（P＜0.01）。结论：（1）ox-LDL能诱导成纤维细胞表型转化，且呈浓度依赖性：（2）不同浓度的ox-LDL均能影响成纤维细胞的细胞周期，使细胞的增殖增加；（3）ox-LDL能浓度依赖性的诱导成纤维细胞表达炎症因子MCP-1及IL-1α、IL-6；（4）ox-LDL诱导成纤维细胞合成IL-1α、IL-6可能与MCP-1的表达增加有关；（5）ox-LDL可能通过NF-κB通路诱导成纤维细胞的表型转化、增殖和炎症因子的合成。氟伐他汀对氧化低密度脂蛋白诱导的成纤维细胞迁移及炎症因子合成的干预作用背景：大量临床实验已证实3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂（3-Hydroxy-3-methyglutary coenzyme A reductase inhibitors，HMCI）能明显减少冠心病的临床事件，其降脂作用已众所周知，而其非降脂作用尤其是抗炎作用是近几年的研究热点，但大多数研究主要是针对HMCI对血管内膜炎症的影响，有关HMCI对As血管外膜影响的研究目前国内外报道较少。我们在前期动物实验中观察到HMCI类药物-氟伐他汀能明显抑制As的血管外膜炎症细胞浸润及外膜成纤维细胞的表型转化和NF-κBp65的活性，说明氟伐他汀具有抗As血管外膜炎症、抑制成纤维细胞的表型转化，改善血管重塑的作用，但这种作用是否独立于降脂作用之外尚不清楚，为此，我们在HEFs的培养基中直接加入不同浓度的氟伐他汀及ox-LDL，观察对HEFs的迁移和炎症因子合成的影响。目的：将HEFs在含有氟伐他汀及ox-LDL的培养基中孵育，观察成纤维细胞的迁移及炎症因子合成的变化，以探讨氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞变化的抑制作用。方法：（1）人胚肺成纤维细胞（HEFs）传代培养，并用波形蛋白（Vimentin）及a-SMactin免疫细胞化学进行特性鉴定，取3-8代进行实验。分为：①正常对照组：培养基中不加刺激物；②ox-LDL组：培养基中加入100μg／ml的ox-LDL；③他汀1组：培养基中先加入1×10-7mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；④他汀2组：培养基中先加入1×10-6mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；⑤他汀3组：培养基中先加入1×10-5mol／L的氟伐他汀孵育HEFs 4h，再加入100μg／ml的ox-LDL；将各组HEFs培养24h；（2）应用Sarkar等的方法测定细胞迁移距离；（3）免疫细胞化学法检测MCP-1的表达；（4）ELISA检测各组细胞培养液中IL-1α、IL-6的含量；（5）分析MCP-1表达与IL-1α、IL-6合成的相关性。结果：（1）细胞特性鉴定同第二部分；（2）各浓度的氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞迁移均有抑制作用，且呈浓度依赖性，各组间有显着性差异，（F=23.947，P＜0.01）；（3）氟伐他汀组可剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的HEFs的MCP-1表达和IL-1α、IL-6的合成，但各组仍较正常对照组增加，差异有显着性（P＜0.05）；（4）IL-1α、IL-6的合成均与MCP-1的表达呈显着正相关（相关系数分别为r=0.947，P＜0.01及0.757，P＜0.05）结论：（1）氟伐他汀在降脂作用外能剂量依赖性的抑制ox-LDL诱导的成纤维细胞的迁移；（2）氟伐他汀降脂作用外能剂量依赖性抑制ox-LDL诱导的成纤维细胞MCP-1的表达及IL-1α和IL-6的合成；（3）氟伐他汀对ox-LDL诱导的成纤维细胞IL-1α和IL-6合成的抑制作用可能与抑制MCP-1的表达相关。

徐新生^[8]（2007）在《血管外膜淋巴管与内膜增生关系的基础研究》文中认为背景试验及人类病理学研究已经证实血管外膜滋养血管与冠状动脉粥样硬化有关。在动脉支架置入术和球囊成形术的动物模型中，内膜增厚处血管壁新生血管增加，并且损伤造成的新生滋养血管的密度与血管的狭窄程度相一致。人们早就认识到在动脉粥样硬化斑块附近的血管外膜有炎性细胞浸润，而在正常的动脉外膜炎性浸润十分少见，但是一旦动脉粥样硬化发生，那么外膜的炎性浸润则与动脉粥样硬化的严重程度相一致。而且，球囊损伤冠状动脉内膜后外膜出现了炎性细胞浸润。主要表现为巨噬细胞浸润的慢性免疫和炎症反应中的炎症细胞已经被证实能分泌各种细胞因子和生长因子来促进血管新生和淋巴管新生。反之，外膜血管新生又与冠状动脉狭窄和炎症反应程度密切相关。在组织中淋巴管常常与血管相伴行，引流组织中渗出的液体、蛋白质和炎性细胞。近年来研究发现淋巴管在炎症性疾病中表现活跃。淋巴管在慢性皮肤炎症中明显增加；同样，与正常的肾脏比较，有排异反应的移植肾脏中含有大量增生的淋巴管；在慢性气道炎症中，增生的淋巴管防止了粘膜的水肿，并且这些新生的淋巴管能长期存在。然而，人们对血管外膜淋巴管在动脉粥样硬化和内膜增生过程中的作用却几乎一无所知。由于淋巴管总是在免疫和炎症反应中伴随血管增生而增生并且发挥重要的促炎症作用，而动脉粥样硬化或内膜增生时外膜的血管增生和炎症反应也相应增加，因此我们推测淋巴管和血管一样，也参与了这一炎症反应，并在这一病理过程中发挥重要作用。目的1．应用大鼠主动脉球囊损伤模型观察内膜损伤后外膜血管和淋巴管增生的变化规律。2．观察球囊损伤后外膜血管新生、淋巴管新生与内膜增生的关系。3．探讨球囊损伤后外膜炎症和炎症细胞在外膜血管新生和淋巴管新生中的作用。4．探讨球囊损伤后血管壁VEGF-A，VEGF-C和PDGF-B表达的变化规律以及它们与血管、淋巴管增生的调控机制。5．探讨外膜血管新生、淋巴管新生在促进动脉粥样硬化和内膜增生中可能的机制。方法1．动物模型雄性Wistar大鼠，体重450g-500g。饲养条件为恒温（22℃）、12小时光照12小时黑暗、自主进食普通饲料和水。戊巴比妥钠(30mg．kg-1)腹腔内注射麻醉。颈部正中切口切开皮肤暴露左颈外动脉。2F血栓切除术用球囊导管（Baxter Healthcare Corp., Irvine, CA, USA）沿颈外动脉切开口送入腹主动脉，生理盐水充盈球囊后向胸主动脉方向回撤球囊三次以充分扩张血管和剥脱内膜。抽瘪并撤出球囊后将颈外动脉切口的近心端结扎，缝合皮肤并让大鼠自主恢复。假手术组不送入球囊扩张，其余步骤相同。成功进行了球囊损伤手术的60只大鼠随机分为6组，每组10只。另外10只行假手术的大鼠为对照组。球囊损伤组术后1天，3天，7天，14天，28天，90天，对照组于术后1天分别腹腔内注射致死量的苯巴比妥钠处死大鼠，取主动脉标本。部分主动脉组织液氮速冻保存在—80℃低温冰箱日后用于分子生物学试验。其余血管组织用4％磷酸盐缓冲甲醛固定24小时用于免疫组织化学和形态学研究。2．形态学分析石蜡包埋后，6微米厚的组织切片行HE染色。随后用计算机图像辅助分析软件（Image-Pro Plus 5．）计算血管内膜面积与中膜面积之比（I／M ratio）。分别测量外弹力膜面积（external elastic lamina area，EEL area）、内弹力膜面积（internal elastic lamina area，IEL area）和管腔面积（lumen area），血管内膜面积与中膜面积的比值通过下面公式计算：I／M ratio=（IEL area-lumen area）／（EEL area-IEL area）。3．抗体山羊多克隆抗人CD34抗体（1：200；Santa Cruz，CA．）用于标记血管内皮细胞：兔多克隆抗人LYVE-1抗体（1：100；Santa Cruz，CA．）标记淋巴内皮细胞；兔多克隆抗人CD68抗体（1：400；Santa Cruz，CA．）标记巨噬细胞；小鼠单克隆抗α-SMA抗体（1：2000；Abcam，UK）标记VSMC；兔多克隆抗小鼠VEGF-A抗体（1：50；Santa Cruz，CA．），兔多克隆抗人VEGF-C抗体（1：50；Santa Cruz，CA．）以及兔多克隆抗PDGF-B抗体（1：100；Abcam，UK）。抗兔、抗小鼠、抗山羊IgG二抗。4．免疫组织化学切片脱蜡后用5％山羊血清或5％牛血清白蛋白封闭20分钟，然后加入一抗4℃湿盒中孵育过夜。下述过程中每一步骤都用PBS冲洗5分钟×3次。加入二抗后室温孵育30分钟；0.3％过氧化氢甲醇溶液孵育30分钟阻断内源性过氧化物酶活性；组织片加入含有0.02％过氧化氢、0.1％DAB的过氧化物酶底物的PBS溶液产生棕黄色阳性反应，最后用苏木素复染。用PBS代替一抗孵育作为阴性对照。5．定量外膜新生血管和新生淋巴管在高倍镜下（×400）计算每一张切片整个血管外膜中血管（CD34阳性）或淋巴管（LYVE-1阳性）总数。本研究中，血管或淋巴管定义为内皮细胞有棕色着色、至少有一个细胞核被复染的形态上类似环状的结构，单一个点显色不计算在内。Ad-MV和Ad-LV分别代表外膜血管和淋巴管。所有计数由两位研究人员分别完成。6．实时荧光定量RT-PCR按照使用说明用Trizol（Invitrogen，CarlsbAd，CA，USA）抽提主动脉组织中总的RNA。按照反转录酶试剂盒说明书进行反转录酶—聚合酶链式反应（RT-PCR）。1μg RNA加入20μl反转录体系中，应用M-MLV Reverse Transcriptase System（Promega，Madison，USA）寡核甘酸引物法进行反转录。应用LightCycler（Roche Applied Science，USA）实时荧光定量PCR仪对目的基因的表达进行相对定量分析。采用TaqMan荧光探针法进行real—time PCR。采用大连宝生物公司（TaKaRa Biotechnology, Dalian, China）热启动DNA聚合酶（TaKaRa Ex Taq HS polymerase）PCR反应体系。20微升反应体系中含有0.2μl的TaKaRa Ex Taq HS聚合酶，2μl 10×Buffer(含Mg2+)，2μl dNTP Mixture（各含1mM），1μl上游引物，1μl下游引物，1μl探针和1μl cDNA加超纯水至20μl。Real-time PCR反应条件如下：95℃预变性30秒；然后95℃变性0秒，退火10秒，72℃延伸10秒共50个循环。每个基因的引物和探针序列、PCR产物的大小、退火温度、GenBank Access Number见表2。目的基因表达的变化经过内参校正后与对照组比较(2ΔΔCt方法)。7．统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。所有资料都用均数士标准差表示。各组变量间的差异性检验使用单因素方差分析。术后不同时间点的I／M比值与外膜巨噬细胞指数、外膜血管数和淋巴管数的相关性应用Pearson’s相关分析。外膜血管数和淋巴管数对I／M比值的影响应用多元线性回归检验。设P＜0.05为有统计学意义。结果1．内膜损伤后I／M比值的变化HE染色显示对照组主动脉内膜为单层内皮细胞覆盖，内弹力膜完整，外弹力膜与血管外膜紧密相连。球囊损伤组新生内膜由环状的多层细胞构成，主要为血管平滑肌细胞和巨噬细胞。球囊损伤后1天、3天内膜无明显增生，自第7天开始增生明显并持续到术后28天。用I／M评价内膜的增生程度显示第7天I／M比值开始增高，28天时达最大值（0.56±0.06 vs．0.17±0.02，P＜0.001）；术后90天与28天比较没有明显的变化（0.55±0.06 vs．0.56±0.06，P＞0.05）。2．内膜损伤后外膜血管新生术后1天，与对照组比较外膜血管数量没有增加（7.50±1.27 vs．7.80±1.32，P＞0.05）。3天后外膜血管数量开始增加（12.40±1.43 vs．7.80±1.32，P＜0.001），而7天和14天明显增加（19.80±2.74 and 24.20±2.15 vs．7.80±1.32，P1＜0.001，P2＜0.001）。术后28天和90天外膜血管的数量与术后14天相比没有明显变化（24.00±1.49 and 23.90±1.10 vs．24.20±2.15，P1＞0.05，P2＞0.05）。3．内膜损伤后外膜淋巴管新生与对照组比较，术后1天血管外膜淋巴管无明显增生，术后3天和7天增生明显（6.4±1.1 and 12.5±1.4 vs．2.5±0.53，P1＜0.001，P2＜0.001），并于术后14天时达到最大值（12.8±1.0 vs．2.5±0.53，P＜0.001）。术后28天和90天血管外膜淋巴管数量与14天时比较没有明显改变（12.8±1.4 and 12.6±1.3 vs．12.8±1.0，P1＞0.05，P2＞0.05）。4．球囊损伤后巨噬细胞在主动脉壁浸润免疫组化染色发现CD68阳性的巨噬细胞主要分布在靠近外弹力膜的血管外膜和散在分布于血管内膜中。每一张切片分别计算血管外膜中巨噬细胞数占总细胞数的百分比（巨噬细胞指数，macrophage index）。与对照组比较，血管外膜巨噬细胞指数于术后3天开始增高（4.5％±0.8％vs．0.6％±0.2％，P＜0.001），14天时达到最大（12.5％±1.3％vs．0.6％±0.2％，P＜0.001），28天时仍维持在较高水平（12.3％±1.5％vs．0.6％±0.2％，P＜0.001），在90天时降至对照组水平。5．VEGF-A、VEGF-C和PDGF-B在血管壁的表达免疫组化染色发现术后3天和7天VEGF-A在血管壁的平滑肌细胞和巨噬细胞中都呈强阳性表达，此后逐渐减弱，90天时仅有微弱表达。术后7天VEGF-C主要表达在巨噬细胞和成纤维细胞，28天时主要在外膜的巨噬细胞中表达，90天时检测不到阳性表达。术后3天和7天PDGF-B主要表达在血管平滑肌细胞和内皮细胞中，此后逐渐减弱，90天时检测不到阳性表达。对照组仅能检测到VEGF-A的弱表达，VEGF-C和PDGF-B则呈阴性。6．内膜损伤后VEGF-A、VEGFR-1 mRNA的表达VEGF-A mRNA表达在术后第1天开始升高，第3天时达到最高值（约为对照组水平的14倍），第7天时开始下降，28天时降至正常水平。VEGFR-1 mRNA表达的时间变化与VEGF-A的基本一致。7．内膜损伤后VEGF-C、VEGFR-3 mRNA的表达术后1天VEGF-C mRNA的表达没有明显的变化，3天后开始上调并于第7天达到最高值（约为对照组水平的12倍）。术后14天时仍保持在较高水平；28天时明显下降并于90天时恢复到正常水平。VEGFR-3 mRNA表达增高的时间变化晚于VEGF-C。即术后第7天时才开始升高，14天时达到最大值（约为对照组的13倍）。此后，28天时轻度下降，90天时降至对照组水平。8．内膜损伤后PDGF-B、PDGFR-βmRNA的表达术后1天PDGF-B mRNA表达开始升高，3天时达到最大值（约比对照组高16倍）。7天时开始下降，14天时降至对照组水平。PDGFR-βmRNA表达水平于术后1天开始升高，7天时达到最大值（约为对照组的11倍）。术后14天时丌始下降，28天时降至对照组水平。9．内膜增生与巨噬细胞指数以及外膜血管新生和淋巴管新生的关系Pearson’s相关分析显示，I／M比值与术后第7、14及28天外膜巨噬细胞指数呈显着相关（r=.87，p=.001；r=.79，p=.006；r=.68，p=.030），但与术后第90天外膜巨噬细胞指数无显着相关（r=.47，p=.163）；I／M比值与术后第14、28及90天外膜血管计数呈显着相关（r=.68，p=.030；r=.67，p=.032和r=.81，p=.004），而与术后第7天血管计数无显着相关。同时，与术后第14、28及90天外膜淋巴管计数呈显着相关（r=.78，p=.007；r=.75，p=.013和r=.79，p=.006），与术后第7天淋巴管计数无明显相关。以I／M比值为因变量，多元回归分析显示外膜血管数和淋巴管数是影响内膜增殖变化的两个独立影响因素（R2=0.89，P=0.000）。结论1．球囊损伤内膜可导致血管壁中炎症细胞释放生长因子刺激外膜血管新生和淋巴管新生。2．外膜血管增生、淋巴管增生以及巨噬细胞的浸润程度与内膜增生程度相关。3．外膜中的滋养血管、淋巴管和血管相关淋巴样组织共同参与动脉壁的炎症反应，增生的血管和淋巴管可能通过输送炎症细胞促进了炎症反应和内膜的增生。背景近年来血管外膜在内膜的增生和血管重塑中的作用已经受到越来越多的重视。大量的试验和人体病理学证据都支持这一观点：在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的过程中，血管外膜不再是一个旁观者，而是一个相当活跃的参与者。血管外膜对血管壁不仅仅是起支撑作用，而且还通过其中的滋养血管向内膜和中膜输送细胞、氧气和其他物质来影响内膜和中膜的结构与功能。有试验表明外膜诱导的内膜增生可能是由于滋养血管堵塞后继发的血管壁缺氧；大动脉外膜剥脱后滋养血管被破坏，产生类似于动脉粥样硬化早期的内膜和中膜的增殖病变；兔颈动脉外膜剥脱后出现新生内膜增殖，而恢复外膜滋养血管的干预成功地抑制了内膜的增生。但是，Barger等研究发现人冠状动脉外膜滋养血管在动脉粥样硬化斑块形成中可能起促进作用，而且有人发现损伤后新形成的滋养血管的密度与血管再狭窄程度成正比。上述矛盾的结果提示血管外膜在促进内膜增生中可能还存在其他机制。近年来的研究表明炎症在动脉粥样硬化导致的冠心病和其他临床表现中起了重要的作用。外膜炎症与内膜增生的关系已经在猪和兔子等动物试验中进行了研究。人们早已认识到外膜的炎症浸润紧靠动脉粥样硬化内膜处。两者的关系比较清楚，因为在正常的动脉（无动脉粥样硬化）没有外膜的炎症浸润，而一旦出现动脉粥样硬化，则血管外膜的浸润程度就与动脉粥样硬化的范围和程度一致。淋巴管已经被证实存在于动脉粥样硬化的冠状动脉外膜。然而，血管外膜淋巴管增生的功能和结果却很不清楚。由于淋巴管在炎症和免疫反应过程中起重要的作用，因此我们推测血管外膜的淋巴管可能在动脉粥样硬化这一与炎症反应有关的病理过程中也扮演重要角色。目的1．观察大鼠颈动脉外膜剥脱后外膜的血管和淋巴管新生，研究两者对动脉内膜增生的影响。2．研究外膜剥脱后淋巴管增生相关的生长因子VEGF-C、PDGF-B以及它们相应受体VEGFR-3、PDGFR-β变化的时间、程度，探讨外膜剥脱后促进淋巴管新生的分子机制。3．探讨淋巴管与动脉壁炎症反应以及与血管相关淋巴样组织的关系，以期阐明淋巴管在动脉粥样硬化和动脉血管重构中的作用。方法1．动物模型30只雄性Wistar大鼠，体重450g-500g，随机分为3组，每组10只。饲养条件为恒温（22℃）、12小时光照12小时黑暗、自主进食普通饲料和水。戊巴比妥钠(30mg．kg-1)腹腔内注射麻醉。颈部正中切口切开皮肤暴露左颈总动脉，用外科手术刀片轻轻刮除血管外膜。右颈总动脉作为自身对照。缝合皮肤并让大鼠自主恢复。术后7天（group 1），14天（group 2），28天（group 3），分别腹腔内注射致死量的苯巴比妥钠处死各组大鼠，取颈动脉标本。颈总动脉血管近、中、远3段各取2mm长的血管，用4％磷酸盐缓冲甲醛固定24小时用于免疫组织化学和形态学研究。剩余的部分颈动脉组织液氮速冻保存在—80℃低温冰箱，日后用于分子生物学研究。2．形态学分析石蜡包埋后，6μm厚的组织切片行HE染色。随后用计算机图像辅助分析软件（Image-Pro Plus 5．）计算血管内膜面积与中膜面积之比（I／M ratio）。分别测量外弹力膜面积（external elastic lamina area，EEL area）、内弹力膜面积（internal elastic lamina area，IEL area）和管腔面积，血管内膜面积与中膜面积的比值通过下面公式计算：I／M ratio=（IEL area-lumen area）／（EEL area-IEL area）。测量颈动脉近、中、远三段切片的数值取其均值作为结果。3．抗体山羊多克隆抗人CD34抗体（1：200：Santa Cruz，CA．）用于标记血管内皮细胞；兔多克隆抗人LYVE-1抗体（1：100：Santa Cruz，CA．）标记淋巴内皮细胞；兔多克隆抗人CD68抗体（1：400；Santa Cruz，CA．）标记巨噬细胞；兔多克隆抗人VEGF-C抗体（1：50；Santa Cruz，CA．）以及兔多克隆抗PDGF-B抗体（1：100；Abcam，UK）。抗兔、抗山羊IgG二抗（ZSBIO，China）。4．免疫组织化学切片脱蜡后用5％山羊血清或5％牛血清白蛋白封闭20分钟，然后加入一抗4℃湿盒中孵育过夜。下述过程中每一步骤都用PBS冲洗5分钟×3次。加入二抗后室温孵育30分钟；0.3％过氧化氢甲醇溶液孵育30分钟阻断内源性过氧化物酶活性：组织片加入含有0.02％过氧化氢、0.1％DAB的过氧化物酶底物的PBS溶液产生棕黄色阳性反应，最后用苏木素复染。用PBS代替一抗孵育作为阴性对照。5．定量外膜新生血管和新生淋巴管在高倍镜下（×400）计算每一张切片整个血管外膜中血管（CD34阳性，）或淋巴管（LYVE-1阳性）总数。本研究中，血管或淋巴管定义为内皮细胞有棕色着色、至少有一个细胞核被复染的形态上类似环状的结构，单一个点显色不计算在内。Ad-MV和Ad-LV分别代表外膜血管和淋巴管。计算颈动脉近、中、远3张组织片的血管外膜淋巴管和血管的平均数。6．实时荧光定量RT-PCR按照使用说明用Trizol（Invitrogen，CarlsbAd，CA，USA）抽提主动脉组织中总的RNA。按照常规方法进行反转录酶—聚合酶链式反应（RT-PCR）。1μg RNA加入20μl反转录体系中，应用M-MLV Reverse Transcriptase System（Promega，Madison，USA）寡核甘酸引物法进行反转录。应用LightCycler （Roche Applied Science，USA）实时荧光定量PCR仪对目的基因的表达进行相对定量分析。采用TaqMan荧光探针法进行real—time PCR。采用大连宝生物公司（TaKaRa Biotechnology，Dalian，China）热启动DNA聚合酶（TaKaRa Ex Taq HS polymerase） PCR反应体系。20微升反应体系中含有0.2μl TaKaRa Ex Taq HS聚合酶，2μl 10×Buffer(含Mg2+)，2μl dNTP Mixture（各含1mM），1μl上游引物，1μl下游引物，1μl探针和1μl cDNA加超纯水至20μl。Real-time PCR反应条件如下：95℃预变性30秒：然后95℃变性0秒，退火10秒，72℃延伸10秒共50个循环。每个基因的引物和探针序列（上海生工生物技术有限公司，上海，中国）、PCR产物的大小、退火温度、GenBank Access Number见表2。目的基因表达的变化经过内参校正后与对照组比较(2△△Ct方法)。7．统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。所有资料都采用均数±标准差表示。各组变量间的差异性检验使用单因素方差分析。术后各组的I／M比值、外膜巨噬细胞指数、外膜血管数和淋巴管数之间的相关性应用Pearson’s相关分析。设P＜0.05为有统计学意义。结果1．外膜剥脱后淋巴管新生与对照组比较，术后7天淋巴管开始增生（5.40±0.97 vs．2.10±0.74，P＜0.001），并于术后14天时达到最大值（11.50±1.08 vs．2.50±0.53，P＜0.001）。术后28天时外膜淋巴管数量与14天时比较没有明显改变，仍然保持在较高水平（10.90±0.99 vs．11.50±1.08，P＞0.05）。2．外膜剥脱后血管新生同外膜淋巴管的变化相似，与对照组比较外膜血管于外膜剥脱后7天开始明显增加（11.90±0.99 vs．6.10±0.99，P＜0.001）。与术后7天相比，14天和28天外膜血管的数量也都明显增加（18.50±0.85 vs．11.90±0.99，P＜0.001：17.70±1.06 vs．11.90±0.99，P＜0.001）。3．外膜淋巴管新生、血管新生和内膜增生的关系HE染色显示对照组颈总动脉内膜为单层内皮细胞覆盖，内弹力膜完整，外弹力膜与血管外膜紧密相连。由环状的多层平滑肌细胞构成的新生内膜出现在血管外膜剥脱后7天，并且内膜增厚的程度在14天时达到最大值（0.33±0.03 vs．0.13±0.02，P＜0.001）。术后28天I／M比值与术后14天比较没有明显变化（0.31±0.01 vs．0.33±0.03，P＞0.05）。Pearson’s相关分析显示，术后第7、14及28天外膜淋巴管数量与I／M比值呈显着相关（r=0.745，P=0.013；r=0.781，P=0.008 and r=0.711，P=0.021），其中术后第14天外膜淋巴管数量与I／M比值相关性最好（r=0.781，P=0.008）；对照组中，外膜淋巴管数和血管数与I／M比值均无相关性。术后第7、14及28天外膜血管数与I／M比值亦无相关性。4．血管壁中巨噬细胞的分布变化免疫组化染色发现CD68阳性的巨噬细胞主要分布在血管外膜。每一张切片分别计算血管外膜中巨噬细胞数占总细胞数的百分比（巨噬细胞指数，macrophage index）。与对照组比较，巨噬细胞指数于术后7天开始增高（10.00％±1.89％vs．1.80％±0.79％，P＜0.001），14天时达到最大（12.40％±1.43％vs．2.00％±0.67％，P＜0.001），28天时仍维持在较高水平（11.50％±1.65％vs．2.10％±0.74％，P＜0.001）。外膜剥脱术后14天和28天巨噬细胞指数和I／M比值显着相关（r=0.933，P=0.000；r=0.714，P=0.020），14天时相关性更好，术后7天两者相关无显着性（r=0.560，P=0.092）。5．VEGF-C和PDGF-B在颈动脉壁的表达免疫组化研究发现VEGF-C和PDGF-B在对照组没有表达。外膜剥脱术后7天和14天VEGF-C主要表达在整个血管壁的巨噬细胞中，术后28天时仅在外膜的巨噬细胞中呈阳性表达。术后7天和14天PBGF-B主要表达在血管平滑肌细胞和内皮细胞中，28天时则检测不到阳性表达。6．外膜剥脱后VEGF-C、VEGFR-3、PDGF-B以及PDGFR-βmRNA的表达VEGF-C mRNA的表达水平于外膜剥脱术后第7天达到最高值（约为对照组水平的8倍），术后14天时下降（约为对照组水平的5倍）并于28天时恢复到对照组水平。VEGFR-3 mRNA术后第7天时达最高水平（约为对照组水平的10倍），14天时轻微下降（约为对照组的8倍），并且在28天时仍然保持在较高水平（约为对照组水平的5倍）。术后7天PDGF-B mRNA表达升高并且达到峰值（约比对照组高8倍），14天时降至对照组水平。PDGFR-βmRNA表达水平于术后7天时达到最大值（约为对照组的5倍），14天时开始下降，28天时降至对照组水平。结论1．大鼠颈动脉外膜剥脱后产生局部的血管新生和淋巴管新生。2．外膜新生淋巴管数量、巨噬细胞浸润程度与内膜增生程度相关。3．动脉外膜淋巴管可能通过输送炎症细胞参与血管壁的炎症反应，促进了血管内膜的增生。

王建丽^[9]（2003）在《动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用》文中认为动脉粥样硬化的发生是多因素综合作用的结果。动脉外膜炎细胞浸润能通过各种细胞因子的产生,协同其他多种因素引发中间许多复杂的信号传导过程促进动脉粥样硬化形成。

顾兴建^[10]（2002）在《几丁糖抗实验性家兔动脉粥样硬化的研究》文中研究表明动脉粥样硬化（AS）是目前人类主要的死亡原因，高血脂是一种重要的致病因素。几丁糖已被证明可降低血脂，其对AS的作用值得探讨。血小板衍生生长因子（PDGF）的配体和受体参与了AS的发生和发展过程，为此，我们观察了PDGFR-β在细胞、动物实验中的变化，探讨几丁糖作用的可能机理。主要研究内容:1. 采用原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（RVSMC），观察在oxLDL、TNF-α诱导下，几丁糖对细胞增殖的影响，MTT法测定其OD值，免疫印迹法测定其PDGFR-β的表达。2. 采用原代培养的人血管成纤维细胞（HVFB），观察在PDGF-BB、TNF-α诱导下，几丁糖对细胞增殖的影响，MTT法测定其OD值，免疫印迹法测定其PDGFR-β的表达。3. 采用高脂饮食喂养的家兔AS模型，应用血清学指标、免疫组织化学、免疫印迹的方法观察几丁糖对家兔血脂、AS斑块的影响，了解几丁糖作用的可能机制。主要研究结果:1. 几丁糖抑制RVSMC的增殖，呈时效和量效关系，促使PDGFR-β下调。2. 几丁糖抑制FB的增殖，呈时效和量效关系，促使PDGFR-β下调。3. 几丁糖可降低高脂饮食家兔的血脂，可减小AS斑块面积；普通饮食添加几丁糖不影响家兔的血脂和肝功能；免疫组化及免疫印迹均显示几丁糖促使高脂组PDGFR-β的表达下调。本实验结果提示几丁糖可减轻高脂饮食家兔的AS程度，一方面与降低其血脂水平有关，另一方面与几丁糖抑制VSMC、FB的增殖，下调PDGFR-β有关。

二、动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用（论文提纲范文）

（1）电针对APOE-/-小鼠脂代谢紊乱的调整作用研究（论文提纲范文）

（2）耳缘静脉注射高分子右旋糖酐致兔主As早期病变及银杏叶预防作用（论文提纲范文）

（3）名老中医刘志明辨治冠心病心绞痛经验总结与临床研究（论文提纲范文）

（4）重组人白细胞介素10对肿瘤坏死因子α诱导大鼠血管平滑肌细胞和NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响（论文提纲范文）

（5）载脂蛋白E基因多态性与冠心病中医证型的关系及通心络胶囊干预的临床与实验研究（论文提纲范文）

（6）血管内、外膜分别损伤诱发的动脉粥样硬化形成及MAPK/NF-κB信号通路的比较研究（论文提纲范文）

（7）血脂异常在动脉粥样硬化血管外膜炎症中作用的研究（论文提纲范文）

（8）血管外膜淋巴管与内膜增生关系的基础研究（论文提纲范文）

（10）几丁糖抗实验性家兔动脉粥样硬化的研究（论文提纲范文）

四、动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用（论文参考文献）

• [1]电针对APOE-/-小鼠脂代谢紊乱的调整作用研究[D]. 萨沙. 南京中医药大学, 2014(02)
• [2]耳缘静脉注射高分子右旋糖酐致兔主As早期病变及银杏叶预防作用[D]. 张媛. 北京中医药大学, 2012(10)
• [3]名老中医刘志明辨治冠心病心绞痛经验总结与临床研究[D]. 周小明. 中国中医科学院, 2010(01)
• [4]重组人白细胞介素10对肿瘤坏死因子α诱导大鼠血管平滑肌细胞和NIH/3T3细胞syndecan-4蛋白表达的影响[D]. 左琦. 南方医科大学, 2009(01)
• [5]载脂蛋白E基因多态性与冠心病中医证型的关系及通心络胶囊干预的临床与实验研究[D]. 韩旭. 南京中医药大学, 2008(12)
• [6]血管内、外膜分别损伤诱发的动脉粥样硬化形成及MAPK/NF-κB信号通路的比较研究[D]. 王华. 第二军医大学, 2008(01)
• [7]血脂异常在动脉粥样硬化血管外膜炎症中作用的研究[D]. 鹿克风. 山东大学, 2007(03)
• [8]血管外膜淋巴管与内膜增生关系的基础研究[D]. 徐新生. 山东大学, 2007(03)
• [9]动脉外膜炎在动脉粥样硬化发病学中的应用[J]. 王建丽. 中国动脉硬化杂志, 2003(S1)
• [10]几丁糖抗实验性家兔动脉粥样硬化的研究[D]. 顾兴建. 第二军医大学, 2002(01)

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