一、表位疫苗:疫苗研制新策略（论文文献综述）
张冰莎,磨美兰[1]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展》文中指出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）对全球养鸡业造成严重经济损失。由于IBV极易发生变异,血清型众多,且不同血清型间交叉保护性差,使其诊断和疫苗研制面临巨大挑战。抗原表位也称抗原决定簇,是抗原中引起免疫应答的最小单元,可分为B细胞表位和T细胞表位。筛选出免疫优势表位对于研发特异性诊断试剂、广谱交叉保护疫苗和疾病防控具有重要作用。文章就抗原表位种类、已鉴定的IBV抗原表位和IBV抗原表位应用的最新进展进行综述,为IBV抗原表位的深入研究和应用提供参考。
韦金佞[2]（2021）在《基于金葡菌疫苗免疫后人体血清鉴定Hla抗原中和表位及其应用初步研究》文中认为研究背景:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA,简称金葡菌）是一种重要的革兰氏阳性致病菌,在一定条件下能够感染机体,引起以急性、化脓性为特征的感染,它不仅可引起皮肤和软组织、心内膜、肺部、骨髓等局部的化脓性感染,甚至还可导致脓毒血症乃至死亡。2019年最新全国细菌耐药监测报告数据表明,金葡菌院内感染的分离率稳居革兰氏阳性菌首位,金葡菌抗生素耐药的增加导致其感染性疾病的治疗异常困难,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）,其高度耐药性使得临床上常规抗生素治疗效果有限。金葡菌严重威胁人类健康,其感染的预防和治疗已经成为目前临床医学难题之一。疫苗免疫是防控金葡菌感染最经济、最有效的方法,但目前还未有研制成功的金葡菌疫苗供临床使用。α-溶血素（alpha-hemolysin,Hla）是金葡菌的关键致病因子之一,是疫苗的重要候选抗原。疫苗保护效果主要依赖于保护性表位诱导的免疫应答,鉴定Hla的保护性表位,以此来设计疫苗,可去除全抗原中无效以及致病表位,降低疫苗使用风险,提高疫苗效力。虽然有研究报道了Hla的保护性表位,但是由于条件限制,这些表位鉴定结果主要来源于动物实验,尚未在人体上进行验证。从动物模型中鉴定的保护性表位为人用疫苗研究提供的信息非常有限,更不能直接用于人用金葡菌疫苗的设计。铁蛋白作为一种自组装蛋白,具有极低的毒性,将表位肽偶联到铁蛋白的表面,制备纳米表位疫苗,可增强表位的免疫原性。本实验室自2009年开始研制了1.1类新药—重组金葡菌疫苗(Recombinant five SA antigen vaccine,r FSAV。疫苗的主要抗原成分有:Hla、Isd B、m SEB、Sp A5和Mnt C,目前已经完成了II期临床试验研究。本研究利用从Ib期临床试验中收集的144名志愿者血清,基于Luminex多重芯片检测技术,鉴定人体针对Hla的具有中和活性的B细胞免疫优势表位,并以此设计和构建基于自组装铁蛋白载体的纳米疫苗,为阐明疫苗的应答规律和下一步疫苗的优化打下基础。研究目的:1.建立Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.利用金葡菌疫苗Ib期疫苗接种前（D0）和接种后14天（D14）各144名志愿者血清鉴定人体针对Hla的具有中和活性的免疫优势表位。3.制备基于中和表位的自组装铁蛋白纳米疫苗,并阐明其在小鼠皮肤感染模型中的保护作用。研究方法:1.利用大肠杆菌表达并纯化Hla毒素蛋白,制备高质量抗Hla中和性抗体,获取新鲜兔红细胞,建立Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.利用上述建立的方法,检测金葡菌疫苗Ib期疫苗接种前（D0）和接种后14天（D14）各144名志愿者血清的中和活性。结果以抑制50%溶血活性时的抗体稀释度即—IC50来体现,即每份血清都有对应的IC50值。3.步移法合成23条Hla表位肽,随机挑选疫苗接种后14天的血清24份,利用Luminex多重芯片检测技术,检测Hla表位肽对这24份血清的反应强度。4.通过统计软件SPSS对Hla表位肽反应强度与血清中和活性进行相关性分析。制备针对中和活性相关表位的多克隆抗体,并评价其中和活性,以此鉴定具有中和活性的Hla表位。5.将鉴定具有中和活性的表位融合至自组装铁蛋白的N端,构建中和表位自组装铁蛋白纳米疫苗（Epitope based Nanoparticle,EpNP）。在大肠杆菌中表达EpNP,并采用分子筛层析、动态光散射和透射电镜检测EpNP的理化性质。6.利用Al（OH）3佐剂吸附EpNP,在第0、14、21天免疫小鼠,收集小鼠血清,检测抗Hla抗体效价以及其在体外的中和活性。用金葡菌USA300标准株经背部皮下攻毒EpNP疫苗免疫后的小鼠,评价EpNP的免疫保护效果。研究结果:1.表达并纯化Hla毒素,分子量约为33k Da。体外验证了Hla毒素的溶血活性及其抗体阻断Hla毒素溶血的作用,成功建立了Hla毒素溶血中和活性评价方法。2.完成了288份疫苗临床实验血清中和活性测定。3.随机挑选金葡菌疫苗接种后14天的24个志愿者血清,利用Luminex多重芯片检测技术,检测出血清针对Hla反应性较强的免疫优势表位。4.通过统计学分析与血清中和活性正相关的表位,成功鉴定出了Hla的中和表位Hla121-138;5.构建了携带中和表位Hla121-138的自组装铁蛋白纳米疫苗（EpNP）,纯化并获得EpNP,分子量约为25 k Da。分子筛检测其分子量为562 k Da,是单体分子量的24倍。动态光散射、电镜结果均表明Hla铁蛋白能在体外自组装形成直径为13.2 nm、呈均一性良好的纳米颗粒。6.EpNP免疫能诱导小鼠产生较强的抗Hla抗体水平,其在体外具有明显中和活性中和抗体。EpNP免疫能够通过减少皮肤感染程度,降低细菌在皮肤局部、肝、脾、肺、肾的定植,在小鼠皮肤感染模型中发挥良好的保护作用。研究结论:1.表位Hla121-138是人用金葡菌疫苗Hla抗原的中和表位。2.EpNP能在体外自组装形成均一性良好的纳米颗粒。3.EpNP免疫可诱导产生中和抗体并在小鼠皮肤感染模型上发挥保护作用。
魏威[3]（2021）在《多房棘球蚴抗原14-3-3优势抗原表位的生物信息学预测与鉴定》文中研究表明目的:评价重组抗原蛋白14-3-3的免疫原性和其在多房棘球绦虫原头节继发性感染BALB/c小鼠模型中的预防/治疗效果,并筛选出多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3的T、B细胞优势抗原表位。方法:1.构建多房棘球绦虫重组抗原蛋白14-3-3的原核表达系统,经IPTG诱导和Ni2+亲和层析法得到高纯度的14-3-3重组蛋白后免疫BALB/c小鼠;ELISA法检测免疫后小鼠血清中的抗体和细胞因子水平变化以评估其免疫原性;结合泡球蚴小鼠继发性感染模型并观察囊泡数量和重量变化以评估其预防与治疗效果。2.多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3的氨基酸序列信息通过SOPMA进行分析,并通过SWISS-MODEL对其进行同源模型的建立;通过IEDB、SYFPEITHI预测14-3-3潜在的优势T细胞抗原表位;根据Bcepred、ABCpred综合预测、分析出优势B细胞抗原表位;并与人源、犬源、鼠源的氨基酸序列比对以排除共同抗原表位,进一步通过脾淋巴细胞增殖、ELISA、ELISpot、流式细胞术等方法对生物信息学预测表位进行鉴定筛选。结果:成功表达并获取高纯度的多房棘球绦虫重组14-3-3抗原蛋白,免疫原性研究发现重组抗原蛋白14-3-3具有较好的免疫原性并可激活小鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答;在预防效果评价模型中,经14-3-3抗原免疫后小鼠囊泡数量减少（59.84±15.09%,P=0.049）,囊泡重量减轻（83.28±18.01%,P=0.000）;在治疗效果评价模型中,经14-3-3抗原免疫后小鼠囊泡重量减轻（72.28±11.47%,P=0.006）。根据各预测软件的结果并排除人、鼠、犬共同抗原表位后,筛选出了8个潜在的抗原表位:14-3-31-15、14-3-36-21、14-3-371-86、14-3-3144-157、14-3-3145-166、14-3-3146-160、14-3-3153-161、14-3-3164-177;成功构建了14-3-3抗原蛋白的3D结构模型,并对潜在的表位位置分布进行了定位;最终鉴定出的B细胞优势抗原表位为:14-3-3145-166、14-3-3164-177;Th1优势抗原表位为:14-3-36-21、14-3-3145-166;Th2优势抗原表位为:14-3-3145-166。结论:多房棘球绦虫重组抗原蛋白14-3-3对继发性小鼠泡球蚴病具有预防与治疗作用并进一步鉴定出了2个B细胞优势抗原表位、2个Th1优势抗原表位、1个Th2优势抗原表位,本研究为后续研制高效、安全的多房棘球蚴表位疫苗提供了理论依据与实验基础。
王颖[4]（2021）在《诱导肺部Th17应答的重组双亚单位铜绿假单胞菌疫苗设计、构建及其保护机制研究》文中提出研究背景:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是战创伤感染、院内获得性感染最常见的病原菌之一。为应对PA感染高发和高度耐药的问题,在研发新型抗生素的同时,研发PA疫苗亦迫在眉睫。迄今为止虽有多个PA疫苗进入了临床试验阶段,但仍没有PA疫苗获批上市。综合分析,现阶段PA疫苗主要依赖血清特异性抗体发挥保护效果,而无法在感染入侵的第一线发挥作用。此外,PA基因组的高度多样性也可能是现阶段疫苗研发失败的原因。因此高效诱导广谱的粘膜保护应答是成功研制PA疫苗的关键。疫苗诱导的Th17（T helper cell 17）应答在抵抗肺部病原体感染的过程中发挥关键作用。Th17应答不依赖血清特异性抗体,而主要通过募集中性粒细胞和巨噬细胞等途径发挥广谱保护效果。组织驻留记忆T细胞（Tissue resident memory T cell,TRM）长期存在于非淋巴器官,在局部粘膜组织（如皮肤、呼吸道等）发挥免疫监察和快速应对病原体感染的作用。PA感染后细胞因子IL-17A显着升高,抗体中和IL-17A后PA感染症状显着加重。减毒PA疫苗能够通过诱导Th17应答发挥抵御多种血清型PA感染的保护作用。因此我们推测鉴定可诱导粘膜Th17应答的保护性抗原,将是成功研制PA疫苗的关键。研究目的:1.基于重组PA蛋白抗原库筛选高效诱导肺部Th17应答的保护性抗原。2.明确保护性抗原中诱导Th17应答的优势表位,并以此为基础设计和构建亚单位疫苗,并研究其保护效果和机制。3.探索TRM细胞在PA疫苗介导的免疫保护中的作用及其机制。研究方法:1.制备10个纯度高、稳定性好的可溶PA抗原并经滴鼻免疫小鼠,利用流式细胞术检测肺部Th17（CD3+CD4+IL-17A+）细胞的比例和数量,评价候选抗原诱导肺部Th17应答水平的能力;采用致死剂量PA攻毒免疫后小鼠,评价候选抗原的保护效果。2.通过抗原特异性CD4+T细胞过继实验、IL-17A KO小鼠及IL-17A中和实验明确新抗原re Pcr V和re Amp C的免疫保护效果与Th17应答的关系。3.将抗原re Pcr V分别滴鼻免疫和肌注免疫小鼠,攻毒后从生存率、肺组织病理改变、细菌定植以及促炎细胞因子浓度方面比较两种免疫方式的保护效果;检测免疫后血清中anti-re Pcr V抗体效价及其OPK活性;利用流式细胞术检测肺部re Pcr V特异性Th17比例和数量。4.利用ELISpots鉴定re Pcr V和re Amp C中诱导Th17应答的优势表位,再构建并制备双亚单位抗原PVAC;将PVAC滴鼻免疫小鼠,检测其抗体效价和肺部Th17应答水平;用四株不同血清型PA临床菌株评价PVAC的广谱保护效果。5.将re Pcr V滴鼻免疫小鼠,利用流式细胞术、免疫荧光检测小鼠肺部IL-17A+CD4+TRM(CD44highCD4+CD69+CD62L-IL-17A+)的数量和比例;利用FTY720清除循环淋巴细胞后,攻毒后观察小鼠生存率、感染症状等指标变化,评价IL-17A+CD4+TRM的保护效果;亚致死剂量PA攻毒免疫后小鼠,检测感染后IL-17A+CD4+TRM比例及数量变化,抗体中和IL-17A和IFN-γ实验研究IL-17A+CD4+TRM的保护机制。研究结果:第一部分:铜绿假单胞菌诱导Th17应答的保护性抗原筛选1.诱导Th17应答水平排名前三的抗原是re Opr L、re Amp C和re Pcr V,其免疫后小鼠生存率分别为50%、50%和100%,其余候选抗原组小鼠生存率与对照组比均无显着差异。re Amp C和re Pcr V为本研究首次发现可诱导Th17应答的保护性抗原。2.Re Pcr V滴鼻免疫组（I.n）小鼠生存率显着高于肌注免疫组（I.m）。与I.m组相比,I.n组肺部炎症较轻、细菌定植量和促炎细胞因子水平较低,表明re Pcr V滴鼻免疫保护效果优于肌注免疫。虽然I.n组血清anti-re Pcr V Ig G效价显着低于I.m组,但两种免疫血清的OPK活性无显着差异;I.n组诱导肺部re Pcr V特异性Th17细胞的比例及数量显着高于I.m组。第二部分:re Pcr V和re Amp C保护效果依赖于Th17应答1.过继re Pcr V或re Amp C滴鼻免疫小鼠来源的CD4+T细胞给naive小鼠,攻毒后发现其肺部细菌定植量、肺部炎症改变和炎症因子水平显着低于对照组;经re Pcr V或re Amp C免疫的IL-17A KO小鼠,攻毒后生存率分别为30%和10%,显着低于野生型小鼠;经re Pcr V或re Amp C免疫小鼠使用抗体中和IL-17A后,攻毒后的生存率分别降低至30%和0%,显着低于对照组。2.Re Amp C滴鼻免疫小鼠的血清特异性抗体无显着OPK活性。第三部分:诱导Th17应答的表位筛选及融合疫苗构建和保护效果评价1.Re Pcr V中诱导Th17应答的优势表位分别为Pcr V8-25、Pcr V29-46、Pcr V43-60、Pcr V57-74、Pcr V64-81、Pcr V78-95、Pcr V92-109、Pcr V106-123、Pcr V197-214、Pcr V218-235;Re Amp C中诱导Th17应答的优势表位为Amp C64-81、Amp C78-95、Amp C99-116、Amp C155-172、Amp C169-186、Amp C183-200、Amp C204-221、Amp C281-298。2.成功构建并在大肠杆菌中表达多表位融合疫苗抗原PVAC（取re Pcr V N端[27Glu-126Gly]用GSGGSG Linker连接至re Amp C全长）,经纯化后获得纯度为87.6%的PVAC蛋白;PVAC免疫后血清抗体效价及肺部Th17应答水平均显着高于未免疫组;PVAC免疫小鼠后分别使用致死剂量的临床菌株PA 464、PA XN-1、PA ZNJ004和PA 451（血清型分别为F、I、J和A型）攻毒,小鼠生存率分别为70%、60%、100%和50%,均显着高于未免疫组。第四部分:TRM在re Pcr V滴鼻免疫增强保护的作用机制研究1.Re Pcr V滴鼻免疫后肺CD4+IL-17A+TRM细胞的比例显着高于未免疫组,但CD4+IFN-γ+TRM细胞的比例无显着变化;免疫荧光结果显示,re Pcr V免疫组小鼠肺CD69+IL-17A+细胞较未免疫组明显增多;RT-PCR结果表明,re Pcr V免疫后肺CD4+T细胞Hobit、Blimp-1和RORγt的m RNA水平显着高于未免疫组,而T-bet的m RNA水平与未免疫组相比无显着差异。2.FTY720耗竭循环淋巴细胞后致死剂量PA攻毒小鼠,结果显示re Pcr V免疫组小鼠生存率为50%,显着高于未免疫组;亚致死剂量攻毒后免疫组小鼠的疾病评分、体重变化、肺部细菌定植量及炎症病理评分均显着低于未免疫组;re Pcr V免疫组小鼠肺部CD4+IL-17A+TRM细胞的比例显着高于未免疫组,免疫荧光观察发现re Pcr V滴鼻免疫组小鼠肺部CD69+IL-17A+细胞相较未免疫组明显增多;抗体中和IL-17A后re Pcr V免疫组小鼠生存率为0%,显着低于非特异性抗体处理组,而抗体中和IFN-γ后re Pcr V免疫组小鼠生存率无显着变化。研究结论及意义:1.首次发现滴鼻免疫re Pcr V和re Amp C能够诱导小鼠肺部保护性Th17应答。2.与肌注免疫相比,re Pcr V滴鼻免疫可增强免疫保护效果,与其诱导的肺部Th17应答相关。3.鉴定出re Pcr V和re Amp C中诱导Th17应答的优势表位,以此为基础成功构建并制备双亚单位融合抗原PVAC,并证明其可抵御四种不同血清型PA菌株的肺部感染。4.Re Pcr V滴鼻免疫可诱导小鼠肺部IL-17A+CD4+TRM细胞产生并在抗PA感染中发挥作用。5.PVAC在一定程度上解决了传统PA疫苗很难诱导粘膜应答和基因组高度变异的难题,为下一步成功研发PA疫苗打下坚实的基础,也为及其它呼吸道感染病原体疫苗的研发提供了思路。
董茂丽[5]（2021）在《猪圆环病毒2型小鼠T细胞免疫应答与表位疫苗初步鉴定》文中研究说明猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）在猪群中广泛存在,被认为是引起猪免疫抑制的主要原因之一。PCV2疫苗的接种起到了一定的预防效果,这些疫苗通过体液免疫诱导保护。然而现有的研究表明,体液免疫不足以清除感染猪体内的PCV2病毒,疫苗免疫猪携带PCV2病毒的现象广泛存在,提示了 PCV2的完全保护可能需要细胞免疫的参与。但目前对于PCV2感染诱导的细胞免疫应答以及激活的T细胞识别的抗原表位尚无深入研究。BALB/c小鼠被广泛用作PCV2感染和疫苗评价的小动物模型,本课题利用此模型用于分析PCV2感染诱导的细胞免疫应答以及筛选PCV2 Cap蛋白上的小鼠T细胞表位。主要分为两部分工作:1、PCV2TB16毒株感染小鼠,在感染后的不同时间点,分别采集不同组织器官通过荧光定量PCR检测病毒含量;收集血清通过ELISA检测PCV2 Cap蛋白抗体效价;采集脾脏和淋巴结,制备单细胞悬液,通过多色流式分析NK细胞和不同T细胞亚群的动态变化和激活状态。结果显示,PCV2感染小鼠后病毒复制在第7天达到顶峰,随后开始下降,但能够在组织中持续存在至感染后第28天（至本试验结束）,其中,肺脏组织的病毒含量最高。在感染后第14天抗体滴度达到高峰并维持至第28天。这些结果表明PCV2成功感染小鼠,与预期一致。多色流式分析表明,PCV2感染后第7天NK细胞在脾脏和淋巴结中激活并增加,而γδ T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞出现减少的现象,呈现一种免疫抑制状态。但在第14天γδT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应记忆T细胞和中央记忆性T细胞均增加明显,PD-1显着上调。感染后第28天效应记忆T细胞增加明显。通过胞内细胞因子染色发现感染后第28天的小鼠CD4+和CD8+T细胞在有丝分裂原刺激下能分泌更多的IFN-γ和TNF-α。2、采用IEDB数据库生物信息学在线软件,对PCV2 Cap蛋白上存在的小鼠或猪T细胞表位进行了预测,合成了 14条包含9-15个氨基酸的多肽。以PCV2感染或免疫后激活的T细胞为效应细胞,采用IFN-γ ELISpot筛选鉴定不同多肽激活小鼠T细胞分泌IFN-γ的能力。结果显示,PCV2感染激活的T细胞在第14天识别19号肽（116-125aa）、25 号肽（93-107aa）、26 号肽（89-103 aa）、27 号肽（144-158 aa）和 28 号肽（179-193 aa）;灭活的PCV2+脂质体佐剂免疫组激活的T细胞识别的表位为19号肽、25号肽和28号肽,而商用的PCV2疫苗激活的T细胞仅在免疫后第14天识别25号肽（93-107aa）,表明该疫苗主要诱导的是体液免疫并非细胞免疫。这些结果为进一步鉴定PCV2 Cap蛋白上的猪T细胞表位以及开发新型PCV2 T细胞疫苗提供了重要的数据和基础。
薛菲,杨梓纯,许炎辉,王娅玲,喻婷,樊毛迪,刘娟华,高崧,刘秀梵[6]（2020）在《禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定》文中研究指明旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体,本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT,利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法,最适抗原包被浓度为0.625μg·mL-1,最适血清稀释度为1∶6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合,采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1∶200、1∶3 200和1∶3 200。Western blot结果显示,3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定,结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是83DQDWMDS89、90SNPGTW95和197TFKYSGW203。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。
薛菲[7]（2020）在《禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定》文中指出禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是一种寄生在禽类肠道及黏膜表面、可引起局部或全身性感染的细菌性疾病,属于肠道外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic coli,ExPEC）,是禽大肠杆菌病的主要病原菌。APEC分布较广,给世界各地养禽业带来了较大经济损失,同时也给人类食品安全构成潜在威胁。目前,已知的APEC的毒力因子有黏附素、内毒素、外膜蛋白、铁摄取系统和Ⅲ型分泌系统等。外膜蛋白酶T（Outer membrane protease T,OmpT）多位于细菌表面,属于革兰氏阴性菌外膜蛋白酶家族。有研究表明OmpT在增强细菌表面的黏附和侵袭能力发挥作用,与APEC的致病性相关,并且具有良好的免疫原性,因此有一定的研究价值。APEC E058株的OmpT蛋白由位于染色质的compT基因和位于质粒中的pompT基因分别编码。本研究将课题组保存的重组表达菌株pET-28a-compT和pET-30a-pompT进行复苏并鉴定,经IPTG诱导表达的重组蛋白,再采用尿素梯度透析法进行复性。PCR结果显示,pET-28a-compT和pET-30a-pompT菌液扩增出的基因片段大小均为894 bp,与预期大小一致;SDS-PAGE电泳结果显示,两个重组蛋白均以包涵体的形式表达,cOmpT和pOmpT的蛋白分子量分别为36 kD和33.6 kD,与预期大小相符,且纯度较高。Western blot鉴定结果表明cOmpT的抗原性较好。将表达纯化后的cOmpT作为免疫原,接种至BALB/c小鼠体内。采用方阵滴定法,建立间接ELISA的检测方法,抗原最适包被浓度为0.625 μg/mL,血清最适稀释度为1:6400。四次免疫后采血,间接ELISA检测效价,取免疫小鼠脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。采用杂交瘤细胞技术和有限稀释法,多次筛选后得到3株能稳定分泌抗cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,杂交瘤细胞上清中抗体效价分别为 1:200、1:3200 和 1:3200。其中,2C3 和 2G3 的腹水效价分别为 1:512000、1:256000。单抗亚类鉴定结果显示,3株杂交瘤细胞株分泌的抗体均为IgG2b亚类。根据Western blot鉴定分析,制备的3株单克隆抗体与cOmpT蛋白均发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。为确定获得的单克隆抗体所针对的抗原表位,将去信号肽的compT基因作为模板,按照不同的细胞外环对应的氨基酸序列,分别设计引物进行PCR扩增,经酶切后再分别连接至原核表达载体pET-28a上,将鉴定正确的阳性菌株进行诱导表达。截短表达蛋白cOmpT A、cOmpTB、cOmpTC、cOmpTD和cOmpTE,经SDS-PAGE检测正确后,利用单克隆抗体1G8、2C3和2G3分别对表达产物进行Western blot分析。结果显示,1G8、2C3的抗原表位确定在cOmpT B上,2G3的抗原表位初步定位在cOmpT D。为了缩小抗原表位区域,对cOmpT B和cOmpT D截短表达,结果显示单抗1G8识别的抗原表位是83DQDWMDS89,单抗2C3识别的抗原表位是90SNPGTW95,单抗2G3识别的抗原表位是197TFKYSGW203。本研究成功制备了 3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体并对其识别的抗原表位进行了鉴定,为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。
曹惠[8]（2020）在《以乙肝病毒核心蛋白为载体的脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及其免疫效果研究》文中研究说明[目的]将利用生物信息学软件筛选的B群脑膜炎奈瑟菌MC58菌株表面蛋白A（Neisseria surface protein A,NspA）的优势表位肽,与截短的HBc-N144融合,探究构建的重组表位疫苗HBc-N144-epitope（1+2）通过肌注和滴鼻途径免疫雌性BALB/c小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,尤其是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找NspA的功能性抗原表位、研制高效B群流脑表位疫苗提供相关实验依据。[方法]1.构建HBc-N144-epitope（1+2）重组原核表达质粒。通过NCBI查找GenBank中的脑膜炎奈瑟菌MC58标准株,获取NspA的基因序列,运用生物信息学软件预测和筛选NspA的优势抗原片段。将预测的表位的碱基序列插入到截短的乙肝核心蛋白（HBc-N144）免疫显性区域（MIR）的78-79位氨基酸所对应的的碱基序列之间,获得测序正确的重组原核表达质粒pET28a-HBc-N144-epitope（1+2）。2.制备HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗。扩大培养含有pET-28a-HBc-N144-epitope（1+2）融合质粒的E.coli BL21菌株,诱导表达重组蛋白后经镍柱亲和层析纯化,采用Western Blot法对HBc-N144-epitope（1+2）的表达进行鉴定,并通过透射电镜检测病毒样颗粒的形成。3.评价HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗的免疫效果。将纯化后的重组蛋白HBc-N144-epitope（1+2）,通过肌注和滴鼻途径免疫3周龄的雌性BALB/C小鼠,采用间接ELISA法检测血清中特异性I gG及其亚类以及生殖道分泌物和肺泡灌洗液中sIgA抗体水平。分离培养小鼠脾淋巴细胞,双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A水平;流式细胞术分析脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞亚群。末次免疫两周后,制备致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58菌液,进行小鼠攻击实验,记录HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗的免疫保护率。使用人源补体,进行血清体外杀菌试验,检测免疫小鼠血清抗体的体外杀菌活性。4.观察疫苗接种部位炎症细胞浸润情况。采集肌注组中小鼠接种部位的肌肉组织、滴鼻组小鼠肺组织作H&E染色,分析各蛋白免疫组相应组织的炎性浸润情况。[结果]1.成功构建了HBc-N144-epitope（1+2）病毒样颗粒表位疫苗。经透射电镜检测构建的HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗形成直径为30nm左右的颗粒样结构;2.HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗通过肌注和滴鼻途径免疫小鼠后,能够诱导小鼠产生抗NspA的特异性抗体,并且随着免疫次数增加,抗体水平呈上升趋势。（1）经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组小鼠血清特异性IgG水平明显高于NspA组、HBc-N144组和PBS组（p<0.05）;HBc-N144-epitope（1+2）和HBc-N144-NspA组之间无显着差异（p>0.05）。HBc-N144-epitope（1+2）组、HBc-N144-NspA组和NspA组的特异性IgG1/IgG2a比值均大于1。（2）经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组小鼠生殖道分泌液和肺泡灌洗液中特异性sIgA水平明显高于HBc-N144和PBS组（p<0.01）,其中HBc-N144-epitope（1+2）组明显高于NspA组（p<0.05）,而HBc-N144-epitope（1+2）和HBc-N144-NspA组之间相比较无显着性差异（p>0.05）。（3）流式细胞术检测结果显示肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epito pe（1+2）、HBc-N144-NspA和NspA组诱导的免疫应答均倾向于Th2型。ELISA试剂盒定量检测免疫小鼠脾细胞上清中细胞因子结果显示,经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组和HBc-N144-NspA组脾细胞上清中产生的IL-4、IFN-γ、IL-17A含量均高于Nsp A组（p<0.05）,而两组之间相比较无明显差异（p>0.05）。3.HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗具有较好的免疫保护效果:（1）免疫小鼠存活率。肌注法:HBc-N144-epitope（1+2）、HBcN144-NspA和NspA组在致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72h内的存活率分别为90%、90%和80%;HBc-N144和PBS组在48h内的存活率均为0。滴鼻法:HBc-N144-epitope（1+2）、HBc-N144-Nsp A和NspA组在72h内的存活率分别为85%、85%和70%;HBc-N144和PBS组在48h内的存活率均为0。（2）补体介导的免疫血清体外杀菌活性。肌注法:HBc-N144-epit ope（1+2）、HBc-N144-NspA和NspA组在第42d血清杀菌抗体滴度分别为1:16、1:16和1:8,其中HBc-N144-epitope（1+2）组末次免疫后一个月加强免疫获得的血清杀菌抗体滴度可达1:32;滴鼻法:HBc-N144-epitope（1+2）、HBc-N144-NspA和NspA组在第42d分别为1:8、1:8和1:4;HBc-N144-epitope（1+2）组加强免疫后的血清杀菌抗体滴度可达1:16。病理切片结果显示,肌注法中,与PBS组相比,HBc-N144-epit ope（1+2）、HBc-N144-NspA、NspA及HBc-N144蛋白免疫组小鼠肌肉组织均无明显的炎性细胞浸润;滴鼻法中,与PBS组相比,HBcN144-epitope（1+2）、HBc-N144-NspA、NspA及HBc-N14蛋白免疫组小鼠肺组织呈现散在少量炎性细胞浸润。[结论]1.构建的B群脑膜炎奈瑟菌表位嵌合疫苗HBc-N144-epitope（1+2）具有良好的免疫原性,经肌注和滴鼻免疫均可以诱导小鼠产生较高水平的细胞免疫和体液免疫应答（包括黏膜免疫应答）。2.HBc-N144-epitope（1+2）表位嵌合疫苗对MC58感染的实验小鼠有较强的免疫保护作用,免疫血清体外杀菌活性和实验小鼠存活率均高于NspA组。
郭乐,王淑娥,何萌,张帆,刘宏鹏,刘昆梅[9]（2019）在《幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究》文中研究表明目的:利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法:通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28aCWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H.pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果:通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21（DE3）经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93. 2%; GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性; ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论:H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。
王川[10]（2019）在《鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSITp7的鉴定及新型疫苗抗感染免疫保护效果评价》文中研究说明背景与目的:鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）是一类专性胞内寄生,多宿主人兽共患病病原体,能感染包括人类在内的多种哺乳动物以及鸟类,引起严重的疾病。有研究报道,质粒缺失株可作为减毒活疫苗抵抗衣原体的感染。Pgp3是衣原体质粒编码的唯一的分泌蛋白,是衣原体的重要毒力因子之一,参与衣原体与宿主细胞相互作用、疾病发生与宿主免疫反应过程。然而以往研究多集中于沙眼衣原体、鼠衣原体,鹦鹉热衣原体质粒蛋白Pgp3鲜有报道。此外,Cps具强致病性及强传染性、疾病常呈隐性感染或持续性感染且存在抗生素耐药,极大威胁人类和畜牧业健康,设计开发相应Cps防治药物与疫苗,对提高全民生活水平和畜牧业健康发展具有重要的科学意义。本研究旨在筛选和鉴定Cps质粒蛋白Pgp3,通过亚定位和同源性分析等确定Cps Pgp3（CPSITp7）。以此为基础,构建基于质粒蛋白CPSITp7多表位多肽疫苗及DNA疫苗,分析其免疫后诱导的特异性体液和细胞免疫应答情况;Cps滴鼻感染小鼠进一步评估其抗感染免疫保护效果,阐明相关新型疫苗的保护效能。本研究将为Cps质粒蛋白Pgp3进一步分析与鉴定及相关疫苗研发提供新思路和实验依据,对Cps防控靶点筛选具有重要指导价值。方法:1.构建Cps质粒基因原核表达载体,IPTG诱导重组质粒蛋白表达、纯化。蛋白超滤、去内毒素后BCA测浓度。重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行Western Blot鉴定及多克隆抗体效价测定。He La细胞感染Cps,用制备的蛋白多克隆抗体为一抗,分析目的蛋白在Cps感染的He La细胞中的定位。2.Gen Bank获取Cps 6BC质粒基因序列及蛋白序列以及其它含有质粒的代表性衣原体菌株质粒Pgp3、Pgp4基因序列和蛋白序列,进行相似性与同源性分析。对质粒蛋白CPSITp7与CPSITp8进行抗原表位预测与分析,预测优势抗原表位。3.构建质粒蛋白CPSITp7的串联多表位疫苗SP,分三次免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行多克隆抗体效价测定;末次免疫后14 d分离小鼠脾脏,收集脾淋巴细胞进行SP刺激脾细胞增殖实验,对SP刺激脾细胞上清进行细胞因子检测。SP免疫三次后滴鼻感染Cps,感染后第10 d处死感染小鼠,无菌分离肺组织,计数肺组织匀浆上清中包涵体数量及细胞因子表达水平,余下行H&E染色和S-P免疫组化分析。4.构建pc DNA3.1/CPSITp7,转染至He La细胞中并鉴定其在He La细胞中的表达。真核载体pc DNA3.1/CPSITp7分三次免疫BALB/c小鼠,获取小鼠血清进行多克隆抗体效价测定。Cps感染BALB/c小鼠,感染后第10 d处死感染小鼠,无菌分离肺组织,计数肺组织匀浆上清中包涵体数量及细胞因子表达水平;H&E染色和S-P免疫组化分析感染部位病理情况及衣原体载量。无菌分离心、肝、脾、肾和脑组织,部分固定后进行S-P免疫组化分析各组织病理情况及衣原体载量;另一部分行实时定量PCR,检测各组织中Cps载量。结果:1.成功构建了8种重组质粒蛋白原核表达载体并诱导表达纯化出带His标签的重组质粒蛋白CPSITp2、CPSITp6、CPSITp7和CPSITp8;重组质粒蛋白均具有较好的免疫原性与特异性。CPSITp2、CPSITp6、和CPSITp8均定位于包涵体内,CPSITp7大部分定位于包涵体内,未观察到明显的分泌特征。2.Cps质粒基因CPSITp7与CPSITp8及其编码的蛋白与其它衣原体属编码质粒蛋白具有较高的序列相似性及同源性,质粒蛋白CPSITp7是沙眼衣原体Pgp3的同源物,质粒蛋白CPSITp8是沙眼衣原体Pgp4的同源物。质粒蛋白CPSITp7具有丰富的抗原表位;而质粒蛋白CPSITp8没有合适的抗原表位。3.通过联合分析筛选出三个优势抗原表位,成功构建富含T、B表位的多肽疫苗SP,具有较好的免疫原性,能诱导产生较高水平的特异性Ig G和Ig A抗体,表明能诱导产生特异性体液免疫应答;SP能显着刺激小鼠脾细胞增殖,诱导偏于Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ）和促炎因子IL-6的产生,表明能诱导产生细胞免疫应答。4.多表位疫苗SP免疫小鼠在Cps感染后表现出较为轻微的感染症状,能有效清除肺部Cps,肺组织上清IFN-γ水平和IL-6水平显着低于PBS和佐剂对照组;H&E染色和S-P免疫组化结果显示SP免疫小鼠肺组织病理改变明显减轻,衣原体包涵体数量明显少于对照组;表明多表位疫苗SP产生了良好的抗感染免疫保护作用。5.成功构建了pc DNA3.1/CPSITp7。Western Blot鉴定pc DNA3.1/CPSITp7成功转染至He La细胞中并能在细胞内高效表达,在28 k Da处有明显的特异性反应条带。pc DNA3.1/CPSITp7具有较好的免疫原性,能诱导特异性抗体反应。6.pc DNA3.1/CPSITp7免疫小鼠显示较轻的感染症状,相对PBS和空载体对照组,感染部位衣原体载量更低,IFN-γ水平和IL-6水平更低,组织病理改变明显轻于对照组且包涵体数量明显减少。pc DNA3.1/CPSITp7免疫组能改善Cps引起的各组织病变程度,降低各组织Cps的载量,抑制Cps向远端器官扩散,有效加强Cps的清除;特别能有效减轻心、肝组织的Cps载量,但对Cps脑组织传播抑制作用不明显。结论:1.Cps质粒蛋白CPSITp7和CPSITp8均定位于包涵体内且具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性免疫应答;质粒基因CPSITp7与CPSITp8及其编码的蛋白与其它衣原体属质粒基因及编码蛋白具有较高的序列相似性及同源性。2.质粒蛋白CPSITp7具有丰富的抗原表位,多表位疫苗SP能诱导特异性体液和细胞免疫应答;能有效清除免疫后小鼠肺部Cps,改善肺组织病变程度,降低衣原体载量,表明产生了良好的抗感染免疫保护作用。3.真核载体pc DNA3.1/CPSITp7可在真核细胞内高效表达,具有较好的免疫原性,抗感染免疫实验显示其能改善Cps引起的各组织病变程度,降低各组织内Cps的载量,抑制Cps向远端器官扩散,有效加强Cps的清除。
二、表位疫苗:疫苗研制新策略（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表位疫苗:疫苗研制新策略（论文提纲范文）
（1）鸡传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展（论文提纲范文）
| 1 抗原表位种类 |
| 1.1 B细胞表位 |
| 1.2 T细胞表位 |
| 2 已识别的IBV抗原表位 |
| 2.1 S1蛋白抗原表位 |
| 2.2 S2蛋白抗原表位 |
| 2.3 M蛋白抗原表位 |
| 2.4 N蛋白抗原表位 |
| 2.5 E蛋白抗原表位 |
| 3 IBV抗原表位的应用 |
| 3.1 多表位疫苗的构建 |
| 3.2 IBV诊断试剂的研制 |
| 4 结论与展望 |
（2）基于金葡菌疫苗免疫后人体血清鉴定Hla抗原中和表位及其应用初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 金葡菌感染的免疫预防 |
| 1.2 α-溶血素在金葡菌致病中的地位 |
| 1.3 本论文拟解决的问题 |
| 第二章 Hla抗原中和表位鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 技术路线 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 Hla纳米表位疫苗的构建及其保护效果评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 设计路线 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 结果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 耐甲氧西林金葡菌α-溶血素的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）多房棘球蚴抗原14-3-3优势抗原表位的生物信息学预测与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 的原核表达与纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 质粒及菌株 |
| 2.1.1.2 实验仪器 |
| 2.1.1.3 实验试剂 |
| 2.1.1.4 试剂配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 获取14-3-3 蛋白的氨基酸序列 |
| 2.1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.1.2.3 重组14-3-3 蛋白的原核表达 |
| 2.1.2.4 14-3-3 包涵体蛋白的变复性 |
| 2.1.2.5 重组14-3-3 蛋白的纯化 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 获取的14-3-3 蛋白的氨基酸序列 |
| 2.2.2 重组质粒的构建与鉴定结果 |
| 2.2.3 重组14-3-3 蛋白的表达与纯化结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 免疫原性及预防/治疗效果评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 原头节的获取 |
| 3.1.1.2 实验动物 |
| 3.1.1.3 实验仪器 |
| 3.1.1.4 实验试剂 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 原头节的获取 |
| 3.1.2.2 预防效果的评价 |
| 3.1.2.3 治疗效果的评价 |
| 3.1.2.4 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 14-3-3 预防多房棘球绦虫原头节感染的效果评价 |
| 3.2.2 14-3-3 治疗多房棘球绦虫原头节感染的效果评价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 的优势表位预测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 不同来源的14-3-3 蛋白氨基酸序列比对 |
| 4.1.2 14-3-3 蛋白的二级结构特征预测 |
| 4.1.3 14-3-3 蛋白的B细胞表位预测 |
| 4.1.4 14-3-3 蛋白的T细胞表位预测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同来源的14-3-3 蛋白氨基酸序列比对结果 |
| 4.2.2 14-3-3 蛋白的二级结构特征预测结果 |
| 4.2.3 14-3-3 蛋白的B细胞表位预测结果 |
| 4.2.4 14-3-3 蛋白的T细胞表位预测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 的优势表位鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 实验仪器 |
| 5.1.1.2 实验试剂 |
| 5.1.1.3 试剂配制 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 小鼠免疫 |
| 5.1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 5.1.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验 |
| 5.1.2.4 抗原小肽与免疫后小鼠血清ELISA反应 |
| 5.1.2.5 小鼠脾脏淋巴细胞因子ELISpot检测 |
| 5.1.2.6 小鼠脾脏淋巴细胞因子流式细胞术检测 |
| 5.1.2.7 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 同源模型的构建 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 14-3-3 的优势B细胞表位的鉴定 |
| 5.2.1.1 14-3-3 的抗原小肽刺激后淋巴细胞增殖反应的检测 |
| 5.2.1.2 14-3-3 的抗原小肽与免疫后小鼠血清ELISA反应的检测 |
| 5.2.2 14-3-3 的优势T细胞表位的鉴定 |
| 5.2.2.1 不同细胞因子ELISpot鉴定优势Th1/Th2 型细胞表位 |
| 5.2.2.2 流式细胞术对优势Th1/Th2 型细胞表位优的鉴定 |
| 5.2.3 多房棘球蚴抗原蛋白14-3-3 同源模型的构建结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 T、B 细胞表位预测 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）诱导肺部Th17应答的重组双亚单位铜绿假单胞菌疫苗设计、构建及其保护机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 铜绿假单胞菌的感染特点及其防治手段 |
| 1.2 PA疫苗研究进展 |
| 1.3 肺粘膜免疫特点及研究进展 |
| 第二章 铜绿假单胞菌诱导Th17 应答的保护性抗原筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Th17 应答在rePcrV和 reAmpC介导的保护效果中的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 诱导Th17 应答的表位筛选及多表位融合疫苗构建和保护效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 TRM在 rePcrV滴鼻免疫增强保护的作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 吸入性疫苗递送研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及课题参与情况 |
| 致谢 |
（5）猪圆环病毒2型小鼠T细胞免疫应答与表位疫苗初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒 |
| 1.1 猪圆环病毒的简述 |
| 1.2 猪圆环病毒的基因组及功能简介 |
| 1.3 现有的商用疫苗 |
| 2 细胞免疫与T细胞表位 |
| 2.1 PCV2诱导的细胞免疫应答 |
| 2.2 T细胞表位疫苗的优势 |
| 2.3 T细胞表位疫苗的制备与鉴定 |
| 2.4 动物T细胞表位疫苗的研究进展 |
| 2.5 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第1章 PCV2感染小鼠诱导的NK和T细胞免疫变化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荧光定量PCR检测组织病毒含量 |
| 2.2 间接ELISA检测血清抗体滴度 |
| 2.3 T细胞的动态变化和激活状态 |
| 2.4 PCV2感染后记忆T细胞的动态变化 |
| 2.5 PCV2感染激活的T细胞的细胞因子表达 |
| 3. 讨论 |
| 第2章 PCV2 Cap蛋白T细胞表位疫苗的初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCV2 TB16株间接免疫荧光结果 |
| 2.2 PCV2感染组ELISpot结果 |
| 2.3 灭活PCV2+脂质体佐剂免疫组ELISpot结果 |
| 2.4 商用PCV2疫苗免疫组ELISpot结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒及细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.2.4 细胞融合及筛选 |
| 1.2.5 单抗亚类鉴定 |
| 1.2.6 Western blot鉴定 |
| 1.2.7 单抗特异性鉴定 |
| 1.2.8 交叉反应性鉴定 |
| 1.2.9 抗原表位的初步定位 |
| 1.2.10 抗原表位的精确定位 |
| 1.2.11 抗原表位分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.1.1 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 2.3 小鼠血清效价的检测 |
| 2.4 细胞融合与筛选 |
| 2.5 抗体效价鉴定 |
| 2.6 单抗亚类鉴定 |
| 2.7 Western blot鉴定 |
| 2.8 单抗特异性鉴定 |
| 2.9 交叉反应性鉴定 |
| 2.10 抗原表位鉴定 |
| 2.10.1 抗原表位的初步定位 |
| 2.10.2 抗原表位的精确定位 |
| 2.11 抗原表位分析 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（7）禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 禽致病性大肠杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 防治措施 |
| 1.2 外膜蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 Omps结构组成 |
| 1.2.2 Omps致病性 |
| 1.3 单克隆抗体技术 |
| 1.3.1 单克隆抗体技术的概述 |
| 1.3.2 单克隆抗体技术的应用 |
| 1.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第2章 禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpT的表达与纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株、蛋白和引物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 重组表达菌的基因组提取 |
| 2.1.5 重组表达菌的鉴定 |
| 2.1.6 重组表达菌的诱导表达 |
| 2.1.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.1.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.1.9 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组表达菌的鉴定 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达检测 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.4 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 禽致病性大肠杆菌OmpT染色体编码外膜蛋白的单克隆抗体制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、蛋白、实验动物及细胞 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 动物免疫 |
| 3.1.5 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1.6 小鼠血清效价的测定 |
| 3.1.7 骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.1.8 饲养细胞的准备 |
| 3.1.9 脾细胞的准备 |
| 3.1.10 细胞融合 |
| 3.1.11 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 3.1.12 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.2 小鼠血清效价的测定 |
| 3.2.3 杂交瘤细胞的建立 |
| 3.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆 |
| 3.2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 禽致病性大肠杆菌OmpT染色体编码外膜蛋白的抗原表位鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒、菌株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 引物设计 |
| 4.1.5 截短基因的扩增与鉴定 |
| 4.1.6 重组质粒的构建 |
| 4.1.7 感受态细胞的制备 |
| 4.1.8 热激法转化E.coli DH5α |
| 4.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.1.10 重组质粒转化 coli BL21 (DE3) |
| 4.1.11 截短蛋白的诱导表达 |
| 4.1.12 抗原表位的初步鉴定 |
| 4.1.13 抗原表位的精确鉴定 |
| 4.1.14 抗原表位分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 截短基因的PCR鉴定 |
| 4.2.2 重组质粒的菌液鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 4.2.4 抗原表位的初步鉴定 |
| 4.2.5 compTB、compTD截短基因的菌液鉴定 |
| 4.2.6 抗原表位的精确鉴定 |
| 4.2.7 抗原表位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）以乙肝病毒核心蛋白为载体的脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词索引 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 主要的实验仪器 |
| 2.2 菌株、抗体及相关试剂 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 NspA的表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 3.2 HBc/脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及表达 |
| 3.3 重组蛋白HBc-N144-epitope(1+2)的形态学检测 |
| 3.4 pET28a/HBc-N144、pET-28a/HBc-N144-NspA的转化、表达、纯化及 Western blot鉴定 |
| 3.5 重组蛋白 HBc-N144、HBc-N144-Nsp A的形态学检测 |
| 3.6 免疫小鼠以及采集标本 |
| 3.7 HBc-N144-epitope(1+2)疫苗免疫活性检测 |
| 3.8 HBc-N144-epitope(1+2)、HBc-N144-NspA以及NspA免疫安全性分析 |
| 3.9 统计学分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 抗原表位的选择-软件分析与筛选 |
| 4.2 HBc-N144-epitope(1+2)构建以及NspA,HBc-N144-epitope(1+2),HBc-N144,HBc-N144-NspA的表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 4.3 重组蛋白HBc-N144、HBc-N144-NspA和 HBc-N144-epitope(1+2)形态学观察 |
| 4.4 HBc-N144-epitope(1+2)、HBc-N144-NspA和 NspA重组蛋白疫苗的免疫活性 |
| 4.5 疫苗的免疫保护效果 |
| 4.6 疫苗免疫小鼠血清体外杀菌活性(serumbactericidal activity,SBA) |
| 4.7 疫苗免疫安全性评估 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（9）幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 多价表位疫苗CWAE的设计和生物信息学分析 |
| 1.3 重组质粒p ET28a-CWAE的构建与鉴定 |
| 1.4 CWAE疫苗抗原蛋白的表达和纯化 |
| 1.5 GM1-ELISA |
| 1.6．抗CWAE多克隆抗体的制备 |
| 1.7 ELISA |
| 1.8 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 CWAE疫苗的设计和抗原结构分析 |
| 2.2 p ET28a-CWAE质粒的构建和鉴定 |
| 2.3 CWAE蛋白的表达及纯化 |
| 2.4 CTB组分的免疫佐剂活性检测 |
| 2.5 H.pylori特异性抗体的检测 |
| 2.6 H.pylori特异性淋巴细胞增殖反应 |
| 3 讨论 |
（10）鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSITp7的鉴定及新型疫苗抗感染免疫保护效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 鹦鹉热衣原体质粒编码蛋白的表达、纯化与定位 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 质粒蛋白CPSIT_p7、CPSIT_p8 的生物信息学分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于CPSIT_p7 蛋白设计的多表位疫苗的抗感染免疫保护效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSIT_p7DNA疫苗的抗感染免疫保护性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 衣原体疫苗候选抗原研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 本研究受以下基金资助 |
| 致谢 |
四、表位疫苗:疫苗研制新策略（论文参考文献）
- [1]鸡传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展[J]. 张冰莎,磨美兰. 中国家禽, 2021(09)
- [2]基于金葡菌疫苗免疫后人体血清鉴定Hla抗原中和表位及其应用初步研究[D]. 韦金佞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]多房棘球蚴抗原14-3-3优势抗原表位的生物信息学预测与鉴定[D]. 魏威. 青海大学, 2021(01)
- [4]诱导肺部Th17应答的重组双亚单位铜绿假单胞菌疫苗设计、构建及其保护机制研究[D]. 王颖. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]猪圆环病毒2型小鼠T细胞免疫应答与表位疫苗初步鉴定[D]. 董茂丽. 扬州大学, 2021(02)
- [6]禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定[J]. 薛菲,杨梓纯,许炎辉,王娅玲,喻婷,樊毛迪,刘娟华,高崧,刘秀梵. 畜牧兽医学报, 2020(12)
- [7]禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定[D]. 薛菲. 扬州大学, 2020
- [8]以乙肝病毒核心蛋白为载体的脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及其免疫效果研究[D]. 曹惠. 南华大学, 2020
- [9]幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究[J]. 郭乐,王淑娥,何萌,张帆,刘宏鹏,刘昆梅. 中国生物工程杂志, 2019(12)
- [10]鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSITp7的鉴定及新型疫苗抗感染免疫保护效果评价[D]. 王川. 南华大学, 2019