一、黏膜免疫及其在疫苗研制中的应用（论文文献综述）
陈小燕[1]（2021）在《ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究》文中指出产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起新生仔猪和断奶仔猪高发病率和高死亡率的重要病原之一,其中ETEC K99是已发现的新生仔猪病例最多的一种。黏膜免疫为机体免受病原菌ETEC攻击及保持肠道稳态发挥着重要作用。SIgA作为黏膜免疫的核心免疫球蛋白,具有阻止病原微生物黏附及免疫清除等作用。据文献报道,免疫复合物能够有效增强免疫应答,因此,本研究通过体外制备ETEC K99-SIgA免疫复合物,探究免疫复合物是否增强肠道黏膜免疫,从而更全面地认识SIgA在黏膜免疫应答中的复杂作用,为口服免疫复合物疫苗的设计奠定理论基础。本实验构建了pET-32a-K99/BL21原核表达载体,经1.2 m M的IPTG诱导6 h后,以Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化制备了重组蛋白K99;K99蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备鼠源K99多克隆抗体;以ETEC K99菌液口服感染BALB/c小鼠,获得含有特异性SIgA抗体的粪便上清,采用His pull-down方法制备ETEC K99-SIgA复合物,利用还原剂β巯基乙醇和SDS还原复合物后,Western blot鉴定制备的ETEC K99-SIgA复合物。结果表明重组蛋白K99在E.coli BL21中高效表达,纯化蛋白浓度约4.5 mg/m L;腹腔免疫后的小鼠血清能有效地与ETEC K99进行反应;ETEC K99菌液口服感染小鼠后,特异性SIgA抗体水平在感染后42 d达到高峰;鉴定正确的ETEC K99-SIgA复合物浓度约为2 mg/m L,为后续免疫学相关实验奠定物质基础。为了揭示ETEC K99-SIgA免疫复合物对激发黏膜免疫应答的影响,首先利用小肠袢试验检测K99-SIgA免疫复合物被肠道上皮细胞的什么细胞所摄取。然后建立M细胞体外培养模型,进一步揭示M细胞对K99-SIgA免疫复合物的摄取方式。最后以K99-SIgA复合物刺激DC细胞,探究其对DC成熟的影响;用ETEC K99-SIgA复合物刺激ETEC K99口服感染的小鼠脾淋巴细胞,采用ELISPOT检测细胞因子,CCK-8法检测脾T淋巴细胞增殖以及效应T细胞CTLL-2活性。小肠袢试验表明K99-SIgA免疫复合物主要由PP结M细胞摄取。采用抑制剂封闭相应的摄取通路,检测体外培养模型的M细胞摄取ETEC K99-SIgA复合物能力,结果表明K99-SIgA复合物主要以网格蛋白介导的方式被M细胞所摄取。K99-SIgA复合物能有效促进DC细胞成熟,从而增强其抗原呈递能力。ETEC K99-SIgA复合物刺激感染后的脾淋巴细胞,相比K99单独抗原组,能更有效地上调TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-5细胞因子分泌水平,促进小鼠脾T淋巴细胞及小鼠效应T细胞CTLL-2的增殖活化,揭示了ETEC K99-SIgA免疫复合物能有效地增强小鼠的黏膜免疫应答。本研究为免疫复合物口服疫苗的研制及应用提供了参考依据。
薛静[2]（2021）在《重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价》文中研究指明禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的,严重危害我国养鸡业发展和人类健康的一种重要疫病,其中H9N2亚型AI在我国呈地方流行性,具有重要的经济和公共卫生学意义。灭活疫苗的免疫是我国目前防控的主要措施之一,但存在抗原谱窄,诱导免疫类型单一等问题,难以应对抗原的快速变异,所以免疫的养殖场仍时有暴发疫情的现象。相比之下,冷适应减毒活疫苗易于接种,能快速诱导机体产生黏膜、细胞和体液免疫,且更为安全。本实验室前期研制了一株H9N2亚型重组冷适应疫苗候选株rTX-HA-NA,现进一步对其生物学特性及理化特性进行测定;同时对其安全性和免疫效力进行评价,为疫苗的进一步开发奠定理论基础。1重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价首先对rTX-HA-NA进行了纯净性检测;接着将rTX-HA-NA分别在SPF鸡胚和SPF鸡上连续培养,检测其在体外和体内的遗传稳定性;最后将rTX-HA-NA经不同理化条件处理后,接种到鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast,CEF）中,通过测定细胞半数感染量（50%tissue culture infective dose,TCID50）以及血凝试验（HA）结果的变化探究rTX-HA-NA的理化特性。结果表明疫苗株无细菌和支原体污染。疫苗株在鸡胚上连续传代基因未发生突变,未改变生物学特性以及冷适应表型;经SPF鸡连续传代后,疫苗株的病毒检出率的显着降低,无毒力返强风险。疫苗株和母本毒rTX均对高温、乙醚和氯仿高度敏感,而对于1%胰酶具有较强耐受性。pH3.0-9.0范围内rTX-HA-NA的HA变化不显着。2重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全性评价将病毒通过滴鼻点眼方式接种SPF鸡和麻鸭,观察临床表现、局部反应和组织病理学变化,同时检测血液理化指标、病毒体内分布、环境传播及接触传播能力,系统评价冷适应疫苗株对靶标动物和非靶标动物的安全性。结果显示rTX-HA-NA接种SPF鸡后,血液的个别指标稍有变化,对增重、体温无影响;组织病理学观察及体内分布结果显示,肺脏充血出血,但较rTX组轻微,其他脏器病变不明显;喉头排毒率显着低于rTX组,泄殖腔不排毒;接触传播结果显示,rTX-HA-NA不发生接触传播;与母本毒相比,饲料、饮水、粪便拭子排毒率降低,对周围环境安全;rTX-HA-NA接种麻鸭后结果显示,疫苗株不引起非靶动物的临床表现,病理组织变化以及血液理化指标的改变。3重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价本研究通过对rTX-HA-NA免疫SPF鸡后诱导的体液、细胞及黏膜免疫水平进行了评价。血清检测结果显示rTX-HA-NA免疫后1周的HI抗体达5.2 log2,免疫后5周达到峰值8.75 log2。细胞因子检测结果显示,免疫后3 d和5 d,rTX-HA-NA组的细胞因子表达水平均显着高于rTX。黏膜免疫结果显示rTX-HA-NA组鼻腔和气管黏膜诱导产生的IgA表达水平均高于灭活rTX组;而灭活rTX组免疫后7 d鼻腔和气管中IgG表达水平高于rTX-HA-NA组。免疫效力试验结果显示,攻击同源病毒TX,P1和P15的rTX-HA-NA提供喉头排毒保护率分别为80%和90%的,泄殖腔排毒保护率均为100%;灭活rTX组提供喉头排毒保护率为80%,泄殖腔排毒保护率为100%。攻击异源毒株YZ-C,rTX-HA-NA只能提供一定的交叉保护。
姚瑶[3]（2021）在《新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）强毒株引起的禽类高度接触性传染病,被公认为是除高致病性禽流感外对全球养禽业危害最为严重的禽类疾病。近年来NDV分子流行病学数据显示,我国鸡群和水禽中NDV主要的流行基因型为基因Ⅶ型。2014年针对ND基因Ⅶ型的灭活疫苗A-Ⅶ问世,使得我国基因Ⅶ型NDV的流行得到了有力控制。但由于灭活疫苗主要依赖于注射免疫,免疫操作过程中往往带来较强烈的动物应激,同时大规模免疫下花费的人力成本较高,因此迫切需要适用于喷雾、饮水等大规模免疫途径的ND弱毒活疫苗。本研究以Ⅰ型NDV为骨架,构建一株表达基因Ⅶ型F和HN蛋白胞外区的嵌合重组病毒,并通过不同的免疫方式对该重组毒进行免疫效力评价。1.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价为获得一株安全性好、抗原性与流行株相匹配的ND疫苗株,本研究以基因Ⅰ型NDV弱毒株LX为骨架,将实验室前期获得的A-Ⅶ疫苗株的F和NDV强毒JS14/12/Ch株HN基因胞外区替换至骨架毒株相应区域,利用反向遗传技术成功拯救获得重组嵌合病毒LX-OAI4S。重组嵌合病毒LX-OAI4S毒力弱（ICPI=0.00,MDT>120h）,在鸡胚中能高效复制（EID50=10-9/0.1 mL）。将该毒株在鸡胚中连续传9代,毒力和繁殖能力依然保持稳定。为比较重组嵌合病毒株LX-OAI4S的免疫原性,LX-OAI4S和另一个前期获得的疫苗候选株LX/AI4-E34K分别以106 EID50、105 EID50、104 EID50剂量滴鼻点眼免疫SPF鸡,均能提供100%保护,证明最小免疫剂量为104 EID50。LX-OAI4S疫苗株105 EID50剂量组和106 EID50剂量组在免疫后第一周平均HI抗体水平分别达到6.30 log2和6.53 log2,明显高于LX/AI4-E347K株的相同剂量组,这些结果表明LX-OAI4S株免疫原性优于LX/AI4-E347K株。此外,用疫苗候选株LX-OAI4S、商品化弱毒疫苗株La Sota和VG/GA分别免疫3周龄SPF鸡,免疫后一周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均为4.71 log2,比La Sota免疫组（3.43 log2）高1个滴度,比VG/GA免疫组（2.83 log2）高2个滴度;而且免疫后第二周和第三周,LX-OAI4S免疫组血清中HI抗体平均水平均高于其他免疫组。免疫三周后用基因Ⅶ型强毒株JS02/06进行攻毒,攻毒后所有免疫组都没有出现临床症状,攻毒保护率为100%。LX-OAI4S免疫组喉头和泄殖腔未发现排毒,La Sota免疫组和VG/GA免疫组在攻毒后第3天喉头（分别为2/7和3/7）和泄殖腔（分别为2/7和1/7）均有排毒。综上,传统滴鼻点眼免疫方式下LX-OAI4S株的免疫原性优于LX/AI4-E347K株和现有ND活疫苗,是值得期待的疫苗候选株。2.重组嵌合疫苗株LX-OAI4S喷雾免疫效力评价选择LX-OAI4S、La Sota和VG/GA不同免疫剂量喷雾免疫1日龄SPF鸡和商品鸡,连续观察14天,每天称重。所有免疫组鸡体重都呈增长趋势,但SPF鸡免疫后出现了一定的应激,SPF鸡免疫组的体重比对照组增长慢;商品鸡免疫后体重增长正常。不同剂量的La Sota株免疫SPF鸡和商品鸡后都出现了不同程度的呼吸道症状。在2×106 EID50剂量SPF鸡免疫组,LX-OAI4S免疫组诱导的抗体高于La Sota和VG/GA免疫组。免疫两周后攻毒,La Sota组有一只鸡出现神经症状,La Sota组感染后第5和7天泄殖腔可以测到排毒,阳性率为10%;LX-OAI4S组和VG/GA组在观察期内未出现任何的临床症状,免疫保护率为100%,并且喉头和泄殖腔均未测到排毒。在10×106EID50剂量免疫组,La Sota免疫SPF鸡和商品鸡组HI抗体水平均高于其他免疫组,但是La Sota免疫商品鸡组有1只鸡死亡;免疫后14天进行剖检,La Sota组鸡喉头出血比例（SPF鸡8/10,商品鸡8/9）最多,其次是LX-OAI4S组（SPF鸡6/10,商品鸡5/10）,VG/GA对鸡呼吸道的刺激最小（SPF鸡4/10,商品鸡5/10）,但是该组有一只鸡腺胃出血。在LX-OAI4S抗体监测组,前三周抗体滴度增长迅速,第5周达到高峰之后缓慢平稳地下降,监测到第12周的抗体滴度依然能提供保护。证明重组嵌合病毒LX-OAI4S有潜力成为可用于喷雾免疫的候选疫苗株。综上所述,本研究构建了一株重组嵌合弱毒ND疫苗LX-OAI4S,最小免疫剂量可达104 EID50,滴鼻点眼免疫三周龄SPF鸡,能提供100%的临床保护,并能有效减低NDV强毒株的分离率;喷雾免疫1日龄雏鸡,对雏鸡的生长发育影响小,安全性优于La Sota株,免疫效力优于VG/GA株。LX-OAI4S株有望成为安全有效、可用于喷雾免疫的疫苗候选株。
杨雨晴[4]（2021）在《ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价》文中进行了进一步梳理产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）引起的仔猪黄痢是当前集约化养猪的常见病和多发病,是一种导致初生仔猪腹泻的高度致死性传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。ETEC有黏附素和肠毒素两种致病因子,ETEC入侵机体后首先是借助黏附素的黏附作用定植在肠道,不断繁殖,然后产生肠毒素导致腹泻,因此黏附素是ETEC致病的第一步,起到了决定性作用。ETEC常携带的黏附素为K88、K99、987P、F41。构建ETEC 987P和K88蛋白的重组干酪乳杆菌,并对重组干酪乳杆菌免疫原性进行分析。根据ETEC 987P和ETEC K88的基因序列,设计合成特异性引物,用原核表达体系分别构建表达了987P蛋白、K88蛋白和987P-K88融合蛋白,Western blot结果表明重组蛋白具备良好的反应原性,可用于后续试验。987P-K88基因连接至穿梭质粒p LA,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,将鉴定为阳性的重组质粒电转化进干酪乳杆菌中,得到了重组菌。对PCR鉴定为阳性的菌株进行Western blot鉴定,结果显示,获得大小约85 k Da的重组蛋白,可与抗987P、K88血清结合,具有很好的反应原性。对间接免疫荧光筛选出的阳性表达菌进行流式细胞术检测,随机筛选的10 000个重组菌中阳性率达92.81%。激光共聚焦检测表明蛋白成功展示于干酪乳杆菌表面。将获得的重组干酪乳杆菌命名为p LA-987P-K88/L.casei。为探讨重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei的免疫效果,试验选用5～6周龄SPF级BALB/c小鼠灌胃免疫重组菌,免疫三次。分别设立p LA-987P-K88/L.casei组、p LA-987P/L.casei组、p LA-K88/L.casei组、p LA/L.casei组、生理盐水组和空白对照组。间接ELISA方法检测小鼠血清Ig G和粪便、肠道、肺脏中s Ig A抗体水平,攻毒后计算试验组小鼠攻毒保护率。结果显示各免疫组Ig G和s Ig A抗体水平显着高于对照组（p<0.0001）,p LA-987P-K88/L.asei组抗体水平与p LA-987P/L.casei组和p LA-K88/L.casei组没有显着差异。末免14 d后进行攻毒试验,p LA-987P-K88/L.caseic组小鼠对ETEC参考菌株C83916（987P）和C83902（K88）的保护率分别为80%和90%。淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫重组菌后的细胞免疫水平显着高于p LA/L.casei组（p<0.001）。试验结果表明,重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei可诱导小鼠产生黏膜免疫、细胞免疫及体液免疫应答,有效的预防ETEC的感染。免疫p LA-987P-K88/L.casei相对于分别免疫p LA-987P/L.casei和p LA-K88/L.casei,更具经济效益,也为该病的多价重组乳酸菌口服疫苗的研制奠定了坚实的基础。
宁唤唤[5]（2021）在《结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用》文中提出研究背景结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的呼吸道传染病。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是目前唯一批准使用的结核病疫苗,但对成人结核病的保护效果不完善,可能与BCG在减毒传代过程中丢失了一些编码保护性抗原的基因序列有关,例如:差异编码区1（region difference,RD1）。因此,新型疫苗的研发有助于更好地防控结核病。6k Da早期分泌靶抗原（6 k Da early secretory antigenic target,ESAT-6）是Mtb与BCG的差异抗原。研究发现,ESAT-6能够诱导机体产生抗Mtb感染的保护性免疫应答,被广泛用于结核病疫苗研究。目前,包含ESAT-6及其他抗原的四种疫苗已进入临床试验。此外,ESAT-6作为毒力因子与Mtb的致病性有关,且参与调控Mtb感染宿主的免疫应答。因此,ESAT-6是结核病疫苗研究中有潜能的候选抗原之一。然而,课题组前期研究发现,ESAT-6抗原诱导的机体免疫应答水平不高。研究发现,细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP）不仅调控细菌生理功能,还能诱导宿主固有免疫应答,且作为黏膜佐剂能够增强抗原诱导的特异性免疫应答。因此,本研究旨在探究ESAT-6的免疫学特性,评价ESAT-6亚单位疫苗及以c-di-AMP为佐剂黏膜接种对Mtb感染的保护作用,为ESAT-6用于结核病黏膜疫苗的研制提供理论与实验依据。研究目的探究Mtb ESAT-6同系物Ms ESAT-6在快速生长型分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms）调控免疫应答中的作用;探究Mtb的重组ESAT-6蛋白对巨噬细胞固有免疫的调控作用;明确基于Mtb ESAT-6的亚单位疫苗以c-di-AMP为佐剂经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答特点,评价ESAT-6为基础的亚单位疫苗抗Mtb感染的保护效率。方法与结果（1）耻垢分枝杆菌ESAT-6敲除株的免疫学特性1)Ms ESAT-6是Mtb ESAT-6在Ms中的同系物,二者氨基酸序列相似性为72%。采用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ms ESAT-6敲除株MsΔE6（ΔE6）,并构建了互补菌株ΔE6 C。生长及染色特性结果显示,敲除ESAT-6对细菌生长有一定影响,但不影响细菌抗酸染色特性。2)建立Ms体外感染巨噬细胞模型,发现ESAT-6在Ms感染诱导巨噬细胞产生炎症因子、诱导炎症小体活化以及自噬中发挥作用,但影响水平有限。3)细菌胞内存活结果显示,敲除ESAT-6的菌株在巨噬细胞内复制减少,说明ESAT-6与Ms在巨噬细胞内存活有关。（2）ESAT-6在调节巨噬细胞固有免疫中的作用1)建立巨噬细胞体外刺激模型,发现c-di-AMP促进了Mtb ESAT-6重组蛋白诱导的I型IFN应答;ESAT-6和c-di-AMP在处理早期可诱导巨噬细胞自噬起始,二者长时间处理主要表现为抑制自噬降解,该过程受m TOR调控但不依赖于IL-17。2)ESAT-6可诱导巨噬细胞炎症因子应答,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的炎症因子应答。3)Mtb胞内存活结果显示,在感染早期ESAT-6和c-di-AMP以协同的方式限制了Mtb的复制;随着感染时间延长,抑制Mtb生长的作用逐渐不明显。（3）ESAT-6亚单位疫苗的免疫学特性1)以ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经鼻黏膜接种小鼠,体液免疫应答检测结果显示,ESAT-6可诱导机体系统性和黏膜局部特异性抗体产生,c-di-AMP为黏膜佐剂增强了ESAT-6诱导的体液免疫应答。2)细胞免疫应答检测结果显示,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的系统性Th1/Th2/Th17型以及炎症因子应答;同时促进了黏膜局部的Th17型和炎症因子应答。3)肺组织免疫细胞亚群分析结果显示,ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP接种导致CD8+T细胞和巨噬细胞比例减少;同时,c-di-AMP为黏膜佐剂促进了ESAT-6诱导的固有淋巴样细胞ILC1和NK细胞的分化。（4）ESAT-6亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率1)ESAT-6免疫小鼠Mtb感染后黏膜免疫应答增强,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答。2)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP免疫小鼠Mtb感染后,Th1型（IFN-γ）、Th2（IL-10）、Th17（IL-17）以及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的产生均减少。3)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经黏膜接种小鼠提供了抗Mtb感染的保护作用,且c-di-AMP为佐剂在一定程度上提高了ESAT-6的免疫保护作用。研究结论Ms ESAT-6在Ms感染诱导的宿主固有免疫中发挥一定的作用,影响细菌胞内存活,整体上作用有限。Mtb ESAT-6与免疫调节子c-di-AMP协同激活I型IFN,调控细胞自噬,诱导炎症应答,促进了巨噬细胞清除Mtb感染。ESAT-6经黏膜接种,可诱导体液免疫应答,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答以及Th1/Th2/Th17型细胞免疫应答。ESAT-6经黏膜免疫可提供对Mtb感染的保护力,且c-di-AMP在一定程度上可提高ESAT-6的免疫保护效率。
梁正敏,王元智,刘一朵,周向梅[6]（2020）在《抗原85复合物的致病机制及其在结核病疫苗研制中的应用进展》文中指出结核分枝杆菌（MTB）的传播亟需开发有效的疫苗来控制。目前已鉴定出多种MTB免疫原性分子,其中,抗原85（Ag85）复合物（Ag85A、Ag85B和Ag85C）是重要的毒力因子,介导MTB的黏附和侵袭及其细胞壁的合成。Ag85抗原已被用作多种新型疫苗的构建中,如重组减毒疫苗、蛋白佐剂疫苗和病毒载体疫苗。作者综述了Ag85复合物的致病机制及其在结核病疫苗研制中的应用进展,探讨了Ag85复合物作为抗原在不同类型疫苗研制中的作用。
王翌[7]（2020）在《表达猪瘟病毒E2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫效力评价》文中进行了进一步梳理猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起猪的一种传染性、致死性疾病,对我国乃至全世界范围养猪业造成巨大的经济损失。目前,CSF在我国呈散发或地方性流行,疫苗免疫仍然是预防、控制和消灭CSF的主要手段。猪瘟兔化弱毒疫苗株（C株）因其安全有效而获得广泛应用,在CSF防控中发挥了巨大作用。但是,C株不具有标记特性,无法区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于CSF的根除与净化。另外,C株、亚单位疫苗等常规疫苗均采用肌肉注射的免疫途径,易产生应激反应,且无法满足野猪的免疫需求。而口服疫苗免疫简单、方便,不仅能够诱导全身性免疫反应,也能够诱导局部黏膜免疫,可在病原入侵位点建立屏障,直接切断病原的入侵。乳酸菌是一种理想的口服疫苗递呈载体,能够抵抗胃肠道酸性环境和胆盐等的侵蚀,将抗原完整地递呈至肠道免疫诱导位点,同时在维持机体肠道菌群动态平衡、促进动物营养物质的吸收等方面发挥着巨大作用。本研究首先利用食品级诱导表达NICE系统,以其配套的载体pNZ8149分别融合表达CSFV E2蛋白与沙门氏菌侵袭蛋白RCK或耶尔森氏菌外膜蛋白OmpH,成功构建了两株重组乳酸乳球菌rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH。Western blotting检测结果显示rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH分别成功表达了42 kDa和39 kDa的融合蛋白,大小与预期一致;通过家兔免疫攻毒试验评价两株重组乳酸乳球菌的免疫效力,结果显示,将rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH口服免疫家兔后,检测一免、二免及三免后的不同时间点免疫组家兔血清中抗CSFV特异性ELISA抗体均为阴性,中和抗体滴度﹤10;三免后7 d使用C株进行攻毒,rL.lactis-E2-RCK和rL.lactis-E2-OmpH免疫家兔全部产生定型热反应,两株重组乳酸乳球菌未能提供免疫保护。之后,本研究选择定植能力更强、定植时间更长的植物乳杆菌作为载体,将植物乳杆菌NC8作为宿主菌株,构建了表达CSFV E2蛋白的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2,体外检测证实NC8-pSIP409-E2成功表达了42 kDa E2蛋白,蛋白大小与预期一致;将重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2口服免疫小鼠进行免疫效力评价,免疫后不同时间点检测血清中的特异性IgG抗体水平和粪便中特异性sIgA抗体水平,结果显示与阴性对照组相比,重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2免疫组小鼠血清中IgG抗体水平无明显变化,而粪便中sIgA抗体水平略微升高;进一步分离小鼠外周血淋巴细胞和脾脏淋巴细胞分别进行T淋巴细胞亚型分析和淋巴细胞增殖试验,与对照组相比,免疫组小鼠CD4+和CD8+T细胞比例和淋巴细胞刺激指数显着升高,表明重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-E2免疫后能够增强细胞免疫应答。最后,为了开发更合适的乳酸菌载体,优化E2抗原蛋白的表达和递呈,本研究中分离得到3株野猪源乳酸菌,并对其进行了载体开发的初步研究和安全性评价,有望将其改造为口服疫苗载体诱导高水平的免疫应答。本研究利用乳酸乳球菌和植物乳杆菌两种载体,成功构建了表达CSFV E2蛋白的重组乳酸乳球菌和重组植物乳杆菌。动物试验结果表明:重组乳酸乳球菌免疫家兔后未诱导机体产生免疫应答,未能提供免疫保护;重组植物乳杆菌免疫小鼠后诱导机体产生了细胞免疫应答。另外,分离得到的3株野猪源乳酸菌,有作为口服疫苗载体的潜力,可进一步应用于CSF口服疫苗的研制。
姜红蕾[8]（2020）在《可德兰多糖-季铵化壳聚糖纳米颗粒的制备及作为流感病毒亚单位鼻黏膜疫苗佐剂的研究》文中提出流行性感冒每年都会产生季节性流行,对所有人群普遍易感,传播迅速,严重威胁着人类的健康。接种疫苗是预防流感病毒性流行的重要方式。现在上市使用的流感疫苗普遍为皮下或者肌内接种,接种耐受性差、免疫效果差。为了增加疫苗接种的依从性和免疫效果,人们将流感相关疫苗的接种方式转向了鼻黏膜接种。鼻黏膜接种不仅易于操作无痛,而且由于模拟了流感病毒感染机体的途径,产生的免疫效果更加全面。但是,由于鼻腔表面黏膜的屏障保护作用,单纯的流感病毒抗原并不能很好地穿过鼻黏膜引起机体免疫应答。因此,人们需要寻找新的鼻黏膜佐剂来辅助流感抗原发挥免疫效果。课题组前期研究也发现,将水溶性硫酸化可德兰多糖（curdlan sulfate,CS）与6-O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（OHTCC）通过静电结合形成纳米粒能够活化抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APCs）,刺激 NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子的表达,引起交叉递呈。将纳米粒荷载模式抗原（ovalbumin,OVA）,对小鼠滴鼻给药后,能够引起APCs的活化和递呈,增加T细胞的数量,引起全身系统性免疫应答以及局部黏膜免疫应答,是很好的候选佐剂。但是其存在现配现用、稳定性差的缺点,限制了其发展。因此,我们将可德兰多糖（curdlan）和OHTCC通过化学连接制备可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物（C-O）,并制成纳米粒,研究其理化性质和体外活性,并将其作为H1N1流感病毒重组亚单位疫苗佐剂进行研究,考察其对H1N1诱导的免疫应答的作用。本文主要研究内容包括:（1）采用EDC/NHS为催化剂,通过优化反应条件化学连接将可德兰多糖与OHTCC连接制备得到C-O;通过红外光谱光谱、核磁共振1H谱、元素分析对其结构进行表征。（2）采取超声法制备C-O纳米粒,并用电位粒径仪对粒径、电位检测,并用BCA法测定其抗原荷载率以及体外释放。（3）对C-O纳米粒的体外免疫活性进行评价,检测其对腹腔提取的巨噬细胞的增殖、吞噬作用以及NO、IL-6、IL-1β等炎症因子分泌的影响;检测对树突状细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86以及MHC Ⅱ、MHC Ⅰ的表达影响;检测其对脾淋巴细胞的增殖作用。（4）对C-O纳米粒作为流感病毒亚单位鼻黏膜疫苗佐剂的体内免疫活性进行评价,分两次滴鼻免疫小鼠,对免疫后小鼠的血清以及黏膜表面所产生的H1N1特异性抗体浓度进行检测,并检测相关细胞的表面标记。研究结果与结论:（1）制得的C-O为白色絮状固体,产率为75.1%,其含有的琥珀酰化可德兰多糖和OHTCC的比例为1:6.14。制备工艺相对简单,安全低毒。（2）C-O能制成了形态均一的球型纳米粒,粒径为190.53 nm,Zeta电位为15.93 mV,在4℃下能稳定保存6 w左右。其抗原吸附率为60.02%,并且能够在中性条件下能缓慢释放,延长抗原作用时间,具有成为蛋白等负电荷物质载体的可能性。（3）在体外实验中,C-O纳米粒能够促进APCs的活化,刺激脾淋巴细胞的增殖。能够促进巨噬细胞对外来抗原的吞噬作用,提高NO、IL-1β、IL-6等因子的分泌,同时能够促进下游COX-2蛋白的表达;能够使DCs表面的MHC II以及共刺激分子CD40、CD80、CD86上调,促使DCs活化和成熟,提高IL-12的分泌,并且能上调MHC Ⅰ的表达,从而引起交叉递呈;并且能直接刺激脾淋巴细胞大量增殖。证明C-O纳米粒能够促进APCs的活化,刺激脾淋巴细胞的增殖。（4）在体内试验中,将C-O纳米粒作为佐剂H1N1流感疫苗鼻黏膜佐剂,能提高重组H1N1血凝素（hemagglutinin,HA）的免疫原性,促进APCs的募集和活化,使淋巴细胞增殖、活化,并且诱导机体产生H1N1特异性抗体,并且能够引起口腔和阴道黏膜分泌sIgA抗体,引起局部黏膜免疫。C-O纳米粒性质稳定,具有载体性质,在体内外实验研究中表现出了良好免疫活性,并能诱导黏膜免疫应答。这些性质都表明C-O纳米粒具有成为鼻黏膜佐剂的潜能,为流感疫苗的研制提供了新的思路。
冯启峥[9]（2020）在《产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究》文中研究表明产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起旅行者、儿童及幼龄动物腹泻的主要病原菌之一,其引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和断奶仔猪腹泻严重影响仔猪的健康,给养猪业造成了巨大经济损失。由于耐药菌株的出现使抗生素疗效明显下降,因此,生产上迫切需要新型、高效的药物或疫苗来保障仔猪哺乳期的健康。口服疫苗具有诱导肠道局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的优点,为仔猪大肠杆菌病疫苗研究提供了新思路。ETEC产生的肠毒素主要有热不稳定肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）和热稳定肠毒素（Heat-stable enterotoxin,ST）,是主要致病因子。LT虽具有良好的抗原性,但自身的毒性限制了其作为抗原被直接用于动物的免疫。减毒LT突变体（Mutant heat-labile enterotoxin,mLT）的研究已有报道,但不同mLT突变菌株的构建及其生物学特性尚缺乏系统研究。本研究构建了3株产肠毒素性大肠杆菌的mLT突变菌株,旨在通过对其主要生物学特性系统地比较研究,为仔猪大肠杆菌性腹泻口服疫苗的研制筛选出较理想的候选菌株。本研究选择E.coli C83903（K88、STb、LT）为初始菌株,使用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除est B基因获得E.coli C83903（35）est B后,对编码LT的基因elt定点突变,分别构建了E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、和E.coli mLT-R192G。经实验检测,3株突变菌在连续50次传代后基因突变位点遗传稳定;细菌生长曲线、菌毛的生长、对IPEC-J2细胞的黏附等生物学特性与初始菌比较无明显差异;耐药性无改变;对p H>2.5的胃液环境和0.3%的胆汁环境有良好的耐受性。为检测LT和mLT,本研究构建了E.coli p ET-32a-S1-BL21、E.coli p ET-32a-S2-BL21重组菌,表达纯化了重组蛋白LTA-S1、LTA-S2,免疫家兔并制备了兔抗LTA-S1和兔抗LTA-S2血清,其中兔抗LTA-S1血清效价较高,用于后续LT和mLT的检测。兔肠袢结扎试验和兔肠组织切片观察结果显示,3种不同mLT均有一定的肠毒性,其中E.coli mLT-S63K产生的mLT肠毒性最弱,且对肠组织造成的损伤最轻。Y1细胞毒性试验结果显示,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,毒力效价为103.48 TCID50/0.1m L,是初始菌E.coli C83903产生的LT毒性的1/10 000(107.61 TCID50/0.1m L)。将5周龄BALB/c小鼠随机分为6组（A、B、C、D、E、F）,每组25只,连续3天分别灌胃0.3 m L无菌PBS,3×1010CFU的E.coli C83903（35）est B（35）eltⅠ、E.coli C83903（35）est B、E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、E.coli mLT-R192G,间隔2 w共免疫3次。检测结果与对照组比较表明,突变菌对小鼠采食量、体重无影响,对回肠组织无损伤,安全性良好;用间接ELISA检测各组小鼠血清、肠黏液中特异性Ig G和s Ig A水平,结果显示,在初次免疫后的第14 d,从实验组小鼠血清和肠黏液检测到针对LTA-S1蛋白的特异性Ig G和s Ig A,抗体水平显着高于对照组（p<0.05）,其中E.coli mLT-R192G组在第35 d检测到的Ig G水平显着高于其他组（p<0.05）,而E.coli mLT-S63K组在第42 d检测到的s Ig A水平显着高于其他组（p<0.05）,在三免后的2周内仍能维持较高水平。针对K88菌毛蛋白和E.coli C83903全菌的特异性Ig G和s Ig A抗体水平检测结果表明,在首免后的第7 d可在部分免疫组的肠黏液中检出特异性s Ig A,其中E.coli mLT-A72R组产生s Ig A的速度最快,抗体水平在第21 d便显着高于其他组并能持续保持较高水平;E.coli mLT-S63K组的K88特异性Ig G自第21 d一直处于较高水平,第42 d时仍显着高于其他组（p<0.05）。针对E.coli C83903全菌所产生的特异性抗体,在第35 d E.coli mLT-S63K组的Ig G水平显着高于其他实验组（p<0.05）,同时该组与E.coli mLT-R192G组肠黏液中的s Ig A水平显着高于其他实验组（p<0.05）,并能在第42d仍维持较高水平。免疫组化试验结果显示,免疫后第35 d,E.coli mLT-S63K组和E.coli mLT-R192G组小鼠Peyer’s淋巴结组织切片可见大量Ig A阳性细胞,数量明显多于其他组。小鼠脾淋巴细胞增殖实验和流式细胞术检测结果表明,IFN-γ和IL-4阳性脾淋巴细胞数显着高于对照组,IFN-γ/IL-4的比值小于1;血清IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子检测结果表明,口服活菌均可有效刺激小鼠产生Th1、Th2以及Th17型细胞免疫反应,血清中IL-4的表达水平更高。结合淋巴细胞亚群的检测结果表明口服突变菌株诱导的细胞免疫以Th2型细胞为主。抗体中和试验结果表明,免疫组血清和肠黏液中的Ig G和s Ig A具有中和LT活性,三组突变株的血清中和抗体效价均为1:89.1,肠黏液的中和抗体效价均为1:44.7,但分别高于E.coli C83903（35）est B组的1:53.7与1:26.9。综上所述,本研究构建的三株mLT突变株具有良好的遗传稳定性,基因编辑操作对其主要生物学特性无显着影响。突变株的生物学特性符合口服疫苗候选菌株基本条件,口服免疫小鼠后能诱导产生局部黏膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。其中E.coli mLT-S63K株毒性最小、免疫效果最好,可作为ETEC口服疫苗候选菌株进行后续研究。本研究为仔猪大肠杆菌性腹泻的新型疫苗研究提供了实验数据和候选菌株。
杜逸群[10]（2020）在《多组分疫苗的合理化组装及其免疫应答效果研究》文中认为疫苗作为一种关乎国计民生的重要药品,在疾病预防和控制方面起着不可替代的作用。随着对疫苗免疫机制研究的不断深入,由抗原、免疫刺激剂和递送系统等组分组成的多组分疫苗已成为疫苗开发的重要方向。但是如何合理化组装和递送疫苗的各个组分以进一步提升疫苗的免疫应答效果仍面临着巨大挑战。针对上述问题,本论文基于生物可降解的聚乳酸羟基乙酸（PLGA）分别构建了刚性阳离子纳米颗粒和甘露糖基靶向的柔性Pickering核酸乳液用于抗原和免疫刺激剂的合理化装载与高效递送,同时通过体内外实验考察了免疫应答过程中的相关作用机制。论文具体开展的研究工作如下:1.利用刚性阳离子纳米颗粒PLNP共同装载抗原、免疫刺激剂CpG和全反式维甲酸（atRA）,实现各组分的胞内高效协同递送。PLNP以PLGA为内核,以脂质DC-胆固醇为正电荷修饰剂,通过疏水包埋将atRA装载于PLGA内核中,同时利用纳米颗粒表面携带的正电荷高效吸附负电荷的抗原（76.95%±4.82%）和CpG（80.10%±4.17%）。结合动态光散射仪和扫描电镜数据表明PLNP呈粒径均一的球形形貌（粒径:190.4±2.1nm,PDI:0.143±0.068）。体外细胞实验表明PLNP可以有效地促进BMDCs对抗原的摄取,并可以通过溶酶体逃逸效应实现抗原的交叉递呈。同时,PLNP可以有效地提升BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达,从而促进BMDCs的成熟和活化。2.通过“引流淋巴结放大”效应实现系统性免疫和肠道黏膜免疫的高效双重响应。PLNP通过上调募集至注射部位的DCs表面引流淋巴结归巢受体CCR7的表达实现DCs向引流淋巴结的迁移和富集。同时利用引流淋巴结中丰富的免疫微环境促进OVA+DCs与T细胞的相互作用,促进T细胞表面肠道归巢受体CCR9的表达,从而诱导T细胞的肠道归巢。小鼠经过两次免疫后（OVA模式抗原）,PLNP组可以有效地促进血清中抗原特异性IgG和肠道黏膜IgA抗体的产生和分泌,同时脾脏和肠系膜淋巴结中的抗原特异性CD8+T细胞比例均得到了显着性提升。基于EV71重组蛋白抗原VP1的动物实验也证明了PLNP可以高效地引发系统性免疫和肠道黏膜免疫的双重应答。3.协同装载抗原肽、CpG和靶向配体甘露糖,实现高效的APCs靶向识别和活化。为了进一步提高Pickering乳液的靶向性,以具有良好生物安全性的嵌段共聚物PLGA-PEG-甘露糖和PLGA-PEG-N3组装形成的纳米颗粒为乳液稳定剂,制备了带有甘露糖基修饰的柔性Pickering乳液。通过CpG-DBCO与Pickering乳液表面的-N3基团之间的点击化学反应（N3-DBCO）实现了CpG在乳液表面的高效连接,从而构建了表面带有甘露糖基修饰的Pickering核酸乳液Man-PMPE-CpG。通过对乳液形成过程中的纳米颗粒浓度、外水相缓冲液种类和pH、超声功率和超声时间进行优化,制备得到了粒径约为1μm的Pickering乳液。另外,为了解决多肽抗原在Pickering乳液中负载率低的缺点,我们基于多肽抗原的棕榈酸修饰和“一步乳化法”实现了多肽类抗原在Pickering乳液中的高效装载。体外细胞实验表明Man-PMPE-CpG可以利用甘露糖的靶向作用提升BMDCs对乳液的摄取,同时利用CpG的免疫刺激效应高效激活BMDCs。4.利用甘露糖基修饰的Pickering核酸乳液构建多肽肿瘤疫苗用于提升肿瘤免疫治疗效果。Man-PMPE-CpG可以在注射部位形成较强的抗原储库效应,同时可以有效地募集大量的免疫细胞,例如DCs和巨噬细胞,从而可以延长抗原与APCs的作用时间、提升抗原递呈效率。经Man-PMPE-CpG免疫的小鼠体内抗原特异性的细胞免疫应答显着增强。在基于E.G7-OVA肿瘤细胞的小鼠肿瘤模型中,Man-PMPE-CpG组可以显着地抑制肿瘤的生长,另外,Man-PMPE-CpG联合免疫检查点抑制剂PD-1抗体后可进一步协同提升Man-PMPE-CpG的抗肿瘤能力。
二、黏膜免疫及其在疫苗研制中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、黏膜免疫及其在疫苗研制中的应用（论文提纲范文）
（1）ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 产肠毒素大肠杆菌概述 |
| 1.2 黏膜免疫机制 |
| 1.2.1 T细胞及树突状细胞（DC）、巨噬细胞在SIgA产生中的作用 |
| 1.2.2 M细胞在启动黏膜免疫中的关键作用 |
| 1.3 免疫复合物研究进展 |
| 1.3.1 免疫复合物在免疫反应中的作用 |
| 1.3.2 免疫复合物的免疫抑制作用 |
| 1.3.3 ICs疫苗研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验主要材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 ETEC K99-SIgA免疫复合物的制备 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 pET-32a-K99重组质粒的构建 |
| 2.2.3 pET-32a-K99重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.4 pET-32a-K99重组蛋白的纯化 |
| 2.2.5 小鼠K99特异性IgG抗体的制备 |
| 2.2.6 小鼠K99特异性SIgA抗体的制备 |
| 2.2.7 以His pull-down方法制备ETEC K99-SIgA复合物 |
| 2.3 ETEC K99-SIgA免疫复合物增强肠道黏膜免疫应答的初步探究 |
| 2.3.1 小鼠小肠袢结扎实验 |
| 2.3.2 M细胞对K99-SIgA免疫复合物的摄取机制 |
| 2.3.3 K99-SIgA复合物对DC细胞成熟的影响 |
| 2.3.4 淋巴细胞免疫学实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ETEC K99-SIgA免疫复合物的制备 |
| 3.1.1 目的基因的扩增结果 |
| 3.1.2 重组质粒pET-32a-K99鉴定 |
| 3.1.3 测序结果 |
| 3.1.4 目的蛋白最佳诱导条件的确定 |
| 3.1.5 蛋白可溶性鉴定 |
| 3.1.6 纯化蛋白的Western blotting鉴定结果 |
| 3.1.7 小鼠血清中K99特异性IgG抗体水平 |
| 3.1.8 小鼠粪便中K99特异性SIgA抗体水平 |
| 3.1.9 ETEC K99-SIgA复合物的Western blotting鉴定结果 |
| 3.2 ETEC K99-SIgA免疫复合物增强肠道黏膜免疫应答的初步探究 |
| 3.2.1 小鼠小肠袢结扎实验结果 |
| 3.2.2 M细胞体外培养模型的鉴定 |
| 3.2.3 M细胞摄取K99-SIgA免疫复合物的结果 |
| 3.2.4 K99-SIgA复合物刺激DC细胞成熟的结果 |
| 3.2.5 小鼠脾淋巴细胞因子分泌水平 |
| 3.2.6 小鼠脾T淋巴细胞增殖水平 |
| 3.2.7 小鼠效应T细胞活力检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（2）重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: H9N2亚型AIV疫苗研究进展及生物安全评价 |
| 1 H9N2亚型禽流感病毒的致病性研究 |
| 2 H9N2亚型AIV疫苗研究进展 |
| 3 疫苗生物安全评价 |
| 4 本研究的目的意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的遗传稳定性和理化特性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的安全评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组冷适应H9N2亚型减毒活疫苗的效力评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 新城疫疫苗种类及不同的免疫方式 |
| 1 NDV概述 |
| 1.1 NDV简介 |
| 1.2 ND流行情况 |
| 2 ND疫苗种类 |
| 2.1 活疫苗 |
| 2.2 灭活苗 |
| 2.3 ND反向遗传疫苗 |
| 2.4 以NDV为载体构建的疫苗 |
| 2.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.6 DNA疫苗 |
| 3 免疫方式 |
| 3.1 喷雾免疫 |
| 3.2 其他免疫方式 |
| 3.2.1 传统免疫方式 |
| 3.2.2 鸡胚免疫 |
| 4 本课题研究目的和意义 |
| 第一章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S的构建及滴鼻点眼免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒与细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 分子生物学试剂和主要化学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 分子生物学软件 |
| 1.6 主要试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 中间质粒的构建 |
| 2.2.1 中间质粒pLX-F的构建 |
| 2.2.2 中间质粒pLX-FHN的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pLXS-S的构建 |
| 2.2.4 全长克隆pLX-OAI4S的构建和鉴定 |
| 2.2.5 质粒的提取 |
| 2.3 病毒拯救 |
| 2.4 获救病毒的鉴定 |
| 2.5 生物学特性的测定 |
| 2.6 嵌合病毒的稳定性试验 |
| 2.7 最小免疫剂量试验 |
| 2.8 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 LX-OAI4S全长克隆构建、病毒拯救和鉴定 |
| 3.2 病毒的生物学特性的测定 |
| 3.3 嵌合病毒稳定性试验 |
| 3.4 最小免疫剂量试验 |
| 3.4.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.4.2 攻毒后剖检及排毒情况 |
| 3.5 不同疫苗株滴鼻点眼免疫效力试验 |
| 3.5.1 免疫后抗体水平变化 |
| 3.5.2 攻毒后排毒情况 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组嵌合疫苗株LX-OAI4S气雾免疫效力评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 仪器 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 喷雾免疫方法 |
| 2.2 喷雾免疫效力试验 |
| 2.2.1 喷雾免疫SPF鸡试验 |
| 2.2.2 喷雾免疫商品鸡试验 |
| 2.3 喷雾免疫抗体监测试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察结果 |
| 3.2 免疫后抗体水平变化 |
| 3.3 对鸡的生长性能的影响 |
| 3.4 免疫后剖检结果 |
| 3.5 攻毒后排毒情况 |
| 3.6 抗体监测试验 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌概述 |
| 1.1.1 黏附素 |
| 1.1.2 肠毒素 |
| 1.1.3 ETEC疫苗的研究进展 |
| 1.2 乳酸菌概述 |
| 1.2.1 乳酸菌作为活疫苗载体的优势 |
| 1.2.2 乳酸菌作为活疫苗载体的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 ETEC987P、K88 原核表达载体构建及蛋白纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 其他实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 模板DNA的制备 |
| 2.2.3 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.4 原核表达载体构建与鉴定 |
| 2.2.5 重组载体的原核表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 抗血清的制备 |
| 2.2.8 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的基因的扩增结果 |
| 2.3.2 基因序列同源性比对 |
| 2.3.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 目的蛋白最佳诱导条件的确定 |
| 2.3.5 蛋白可溶性鉴定 |
| 2.3.6 Western blot鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 共表达ETEC987P、K88 重组干酪乳杆菌的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 菌株、质粒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒p LA-987P-K88 的构建与鉴定 |
| 3.2.2 重组干酪乳杆菌p LA-987P-K88/L.casei的构建 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒p LA-987P-K88 鉴定结果 |
| 3.3.2 p LA-987P-K88/L.casei鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 p LA-987P-K88/L.casei的免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 菌株、实验动物 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫用重组干酪乳杆菌菌悬液的制备 |
| 4.2.2 试验动物分组 |
| 4.2.3 样品的采集 |
| 4.2.4 免疫效果评价 |
| 4.2.5 攻毒保护性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清中抗987P、K88 特异性Ig G检测 |
| 4.3.2 粪便及肠道、肺脏冲洗液中s Ig A效价检测 |
| 4.3.3 脾脏T淋巴细胞增殖检测结果 |
| 4.3.4 攻毒保护性试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核病新疫苗研究进展 |
| 1.1.1 进入临床试验的结核病疫苗 |
| 1.1.2 结核病亚单位疫苗的候选抗原 |
| 1.2 ESAT-6 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 ESAT-6 蛋白概述 |
| 1.2.2 ESAT-6在Mtb致病性中的作用 |
| 1.2.3 ESAT-6 调控宿主固有免疫应答 |
| 1.2.4 ESAT-6 作为疫苗候选抗原的研究 |
| 1.3 亚单位疫苗的佐剂研究 |
| 1.4 细菌信号分子c-di-AMP在感染与免疫中的作用 |
| 1.4.1 c-di-AMP调节细菌的生理 |
| 1.4.2 c-di-AMP调节宿主固有免疫应答 |
| 1.4.3 c-di-AMP在疫苗佐剂中的应用 |
| 1.5 黏膜免疫 |
| 1.5.1 sIgA介导的体液免疫应答 |
| 1.5.2 黏膜局部的细胞免疫应答 |
| 1.6 本研究设想 |
| 第二章 耻垢分枝杆菌ESAT-6 敲除株的免疫学特性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 培养基及缓冲液 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sg RNA敲除质粒的构建 |
| 2.2.2 Ms的培养、计数与感受态制备 |
| 2.2.3 MsΔE6 敲除株的构建与鉴定 |
| 2.2.4 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.2.5 r Ms生长及抗酸特性检测 |
| 2.2.6 r Ms感染巨噬细胞模型建立 |
| 2.2.7 基因转录水平检测 |
| 2.2.8 蛋白表达水平检测 |
| 2.2.9 r Ms在巨噬细胞内的存活 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Ms ESAT-6与Mtb ESAT-6 氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 MsΔE6 突变株的构建与鉴定 |
| 2.3.3 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.3.4 rMs的生长及抗酸特性 |
| 2.3.5 rMs感染巨噬细胞诱导炎症因子的转录水平 |
| 2.3.6 rMs感染巨噬细胞诱导i NOS的转录水平 |
| 2.3.7 rMs感染巨噬细胞激活炎症小体 |
| 2.3.8 rMs感染诱导巨噬细胞自噬 |
| 2.3.9 rMs在巨噬细胞内的存活 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ESAT-6 在调节巨噬细胞固有免疫中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞系 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ESAT-6 蛋白纯化 |
| 3.2.2 BMDM的分离与诱导 |
| 3.2.3 Mtb培养与计数 |
| 3.2.4 巨噬细胞体外刺激 |
| 3.2.5 基因转录水平检测 |
| 3.2.6 蛋白表达水平检测 |
| 3.2.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.8 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 3.2.9 Mtb在巨噬细胞中的存活 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ESAT-6 蛋白的纯化 |
| 3.3.2 ESAT-6 诱导巨噬细胞I型 IFN应答 |
| 3.3.3 ESAT-6 调控巨噬细胞自噬 |
| 3.3.4 m TOR在 ESAT-6 调控自噬中的作用 |
| 3.3.5 IL-17在ESAT-6 通过m TOR调控自噬中的作用 |
| 3.3.6 ESAT-6 促进MH-S细胞炎症因子的释放 |
| 3.3.7 ESAT-6 抑制Mtb在 MH-S细胞内存活 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ESAT-6 亚单位疫苗的免疫学特性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 临床样本信息 |
| 4.1.2 伦理声明 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 细胞培养基 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.0 亚单位疫苗的制备 |
| 4.2.1 动物免疫策略 |
| 4.2.2 抗体水平检测 |
| 4.2.3 肺组织免疫细胞亚群分析 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.5 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 4.2.6 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 4.2.7 组织总RNA提取 |
| 4.2.8 呼吸道菌群分析 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 结核病患者血清特异性抗体水平 |
| 4.3.2 亚单位疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 4.3.3 亚单位疫苗诱导的脾脏细胞免疫应答 |
| 4.3.4 亚单位疫苗诱导的肺部细胞免疫应答 |
| 4.3.5 亚单位疫苗黏膜免疫对呼吸道菌群的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ESAT-6 亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与实验动物 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Mtb感染模型的建立 |
| 5.2.2 抗体水平检测 |
| 5.2.3 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 5.2.4 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 5.2.5 脏器荷菌数 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠Mtb感染后的体液免疫应答水平 |
| 5.3.2 免疫小鼠Mtb感染后脾淋巴细胞增殖 |
| 5.3.3 免疫小鼠Mtb感染后诱导的脾细胞因子分泌水平 |
| 5.3.4 免疫小鼠Mtb感染后脏器荷菌数 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）抗原85复合物的致病机制及其在结核病疫苗研制中的应用进展（论文提纲范文）
| 一、Ag85作为毒力因子的作用 |
| 1．结合纤维连接蛋白、弹性蛋白及纤溶酶原： |
| 2．分枝菌酸转移酶活性： |
| 3．毒力： |
| 二、Ag85作为一种免疫显性抗原在候选疫苗中的作用 |
| 1. Ag85在重组BCG疫苗中的作用： |
| 2. Ag85在蛋白佐剂疫苗中的作用： |
| 3. Ag85在病毒载体疫苗中的作用： |
| 4. Ag85在DNA疫苗中的作用： |
（7）表达猪瘟病毒E2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪瘟及猪瘟病毒 |
| 1.1.1 猪瘟的流行与危害 |
| 1.1.2 猪瘟病毒与E2蛋白 |
| 1.1.3 猪瘟疫苗研究现状 |
| 1.2 黏膜免疫 |
| 1.2.1 黏膜免疫系统 |
| 1.2.2 黏膜免疫的优势 |
| 1.3 乳酸菌在黏膜免疫中的应用 |
| 1.3.1 乳酸菌的免疫调节作用 |
| 1.3.2 乳酸菌是理想的黏膜免疫抗原递呈载体 |
| 1.3.3 乳酸菌载体的开发与改造 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 表达CSFVE2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及免疫效力评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞、毒株及试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.1.6 目的片段的扩增 |
| 2.1.7 乳酸乳球菌感受态细胞的制备 |
| 2.1.8 重组质粒p NZ8149-E2-RCK和 p NZ8149-E2-Omp H的构建 |
| 2.1.9 重组乳酸乳球菌r L.lactis-E2-RCK和 r L.lactis-E2-Omp H的构建 |
| 2.1.10 Western blotting鉴定目的蛋白的表达 |
| 2.1.11 家兔免疫攻毒试验 |
| 2.1.12 免疫家兔特异性抗体的测定 |
| 2.1.13 免疫家兔中和抗体滴度的测定 |
| 2.1.14 家兔定型热反应的检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因的扩增 |
| 2.2.2 重组乳酸乳球菌r L.lactis-E2-RCK和 r L.lactis-E2-Omp H的 PCR鉴定 |
| 2.2.3 目的蛋白在重组乳酸乳球菌中的表达 |
| 2.2.4 免疫家兔血清中IgG抗体水平 |
| 2.2.5 免疫家兔粪便中sIgA抗体水平 |
| 2.2.6 免疫家兔中和抗体滴度 |
| 2.2.7 免疫家兔定型热反应 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 表达CSFVE2蛋白重组植物乳杆菌的构建及免疫效力评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒、菌株、毒株及试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.1.5 穿梭载体pSIP409-E2的构建 |
| 3.1.6 连接产物转化大肠杆菌 |
| 3.1.7 植物乳杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.1.8 表达E2蛋白重组植物乳杆菌的构建 |
| 3.1.9 Western blotting鉴定目的蛋白的表达 |
| 3.1.10 重组植物乳杆菌口服免疫小鼠试验 |
| 3.1.11 免疫小鼠特异性抗体的测定 |
| 3.1.12 免疫小鼠T淋巴细胞亚型测定 |
| 3.1.13 免疫小鼠淋巴细胞增殖试验 |
| 3.1.14 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 穿梭载体pSIP409-E2的构建 |
| 3.2.2 重组植物乳杆菌NC8-p SIP409-E2的PCR鉴定 |
| 3.2.3 目的蛋白在重组植物乳杆菌中的表达 |
| 3.2.4 免疫小鼠血清中IgG抗体水平 |
| 3.2.5 免疫小鼠粪便中sIgA抗体水平 |
| 3.2.6 免疫小鼠外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞亚型分析 |
| 3.2.7 免疫小鼠淋巴细胞增殖情况 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 野猪源乳酸菌作为口服疫苗载体的初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株、细胞及试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 乳酸菌的分离鉴定及耐酸耐胆盐评价 |
| 4.1.5 乳酸菌的黏附能力测定 |
| 4.1.6 乳酸菌的抑菌能力测定 |
| 4.1.7 溶血性试验 |
| 4.1.8 毒力因子的检测 |
| 4.1.9 乳酸菌在小鼠体内的安全性评价 |
| 4.1.10 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 乳酸菌分离株的分类及耐酸耐胆盐能力 |
| 4.2.2 乳酸菌的黏附能力 |
| 4.2.3 乳酸菌的抑菌能力 |
| 4.2.4 乳酸菌的安全性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）可德兰多糖-季铵化壳聚糖纳米颗粒的制备及作为流感病毒亚单位鼻黏膜疫苗佐剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 流感病毒 |
| 1.1 病毒学特征 |
| 1.2 抗原变异 |
| 1.3 流感疫苗 |
| 2 呼吸道黏膜免疫系统 |
| 3 多糖作为佐剂的研究 |
| 4 课题设计以及拟解决问题 |
| 第二章 可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒的制备及其表征g |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 OHTCC的制备及其结构表征 |
| 2.2 德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒的制备及其结构表征 |
| 2.3 荷载OVA的C-O纳米颗粒的体外释放研究 |
| 3 结果 |
| 3 1 OHTCC及C-O的制备 |
| 3.2 C-O纳米颗粒的理化性质及其稳定 |
| 3.3 载OVA的C-O纳米粒的体外释放 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 第三章 可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒体外免疫调节活性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 C-O纳米颗粒对巨噬细胞活性的影响 |
| 2.2 C-O纳米颗粒对DCs成熟的影响 |
| 2.3 C-O纳米颗粒对脾淋巴细胞增殖活性的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 C-O纳米粒对巨噬细胞活性的影响 |
| 3.2 C-O纳米粒对DCs成熟的影响 |
| 3.3 C-O纳米粒对脾淋巴细胞增殖活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 C-O纳米颗粒用于鼻黏膜重组H1N1亚单位流感疫苗的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组及鼻黏膜免疫 |
| 2.2 脾细胞增殖能力检测 |
| 2.3 流式细胞术检测脾细胞的表面标记 |
| 2.4 血清中H1N1特异性IgG、IgG亚型及IgA抗体水平检测 |
| 2.5 黏膜灌洗液中H1N1特异性IgA抗体水平检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 鼻黏膜免疫C-O纳米颗粒对脾淋巴细胞增殖影响 |
| 3.2 鼻黏膜免疫C-O纳米颗粒对脾淋巴细胞分群和活化的影响 |
| 3.3 鼻黏膜免疫C-O纳米颗粒对抗原递呈细胞增殖、成熟的影响 |
| 3.4 鼻黏膜免疫C-O纳米颗粒对小鼠血清中抗体的影响 |
| 3.5 鼻黏膜免疫C-O纳米颗粒对小鼠黏膜特异性sIgA产生的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新性 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻简介 |
| 1.2 ETEC主要毒力因子 |
| 1.2.1 热稳定肠毒素 |
| 1.2.2 热不稳定肠毒素 |
| 1.2.3 K88菌毛 |
| 1.2.4 其他黏附素 |
| 1.3 ETEC疫苗研究进展 |
| 1.4 黏膜免疫 |
| 1.5 口服疫苗 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 简述 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 实验动物及细胞系 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要试剂和抗体 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 2.2.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 2.2.3 突变菌株的部分生物学特性检测 |
| 2.2.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 2.2.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 2.3 实验数据的统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 3.1.1 pTarget-T△estB质粒的鉴定结果 |
| 3.1.2 estB基因敲除菌株的鉴定结果 |
| 3.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 3.2.1 pTarget-T-N425 质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.2 pTarget-T-S63K/A72R/R192G质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.3 基因编辑质粒的消除结果 |
| 3.3 突变菌株的部分生物学特性 |
| 3.3.1 遗传稳定性检测结果 |
| 3.3.2 菌毛生长能力的测定结果 |
| 3.3.3 生长曲线的测定结果 |
| 3.3.4 胃肠道环境耐受性的测定结果 |
| 3.3.5 耐药性的测定结果 |
| 3.3.6 黏附能力的测定结果 |
| 3.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 3.4.1 LTA-S1、LTA-S2 蛋白的表达及多抗的制备结果 |
| 3.4.2 mLT体内外毒性的测定结果 |
| 3.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 3.5.1 突变菌株定植能力测定结果 |
| 3.5.2 突变菌株安全性检验结果 |
| 3.5.3 特异性抗体的测定结果 |
| 3.5.4 Peyer’s集合淋巴结免疫组化结果 |
| 3.5.5 淋巴细胞亚群的检测结果 |
| 3.5.6 淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3.5.7 血清中细胞因子水平的测定结果 |
| 3.5.8 抗体中和活性的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mLT突变菌株的构建策略 |
| 4.2 mLT突变菌株的毒力分析 |
| 4.3 E.coli m LT-S63K的应用前景 |
| 4.4 本研究的局限性和后续研究的建议 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）多组分疫苗的合理化组装及其免疫应答效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 疫苗免疫的基本原理 |
| 1.1.1 天然免疫应答 |
| 1.1.2 适应性免疫应答 |
| 1.2 多组分疫苗的组成 |
| 1.2.1 免疫刺激剂 |
| 1.2.2 疫苗靶向配体 |
| 1.3 多组分疫苗的递送 |
| 1.3.1 基于铝盐佐剂的递送 |
| 1.3.2 基于油乳佐剂递送 |
| 1.3.3 基于聚合物纳米颗粒递送 |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 论文立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 PLGA纳米颗粒用于抗原、CpG和全反式维甲酸的协同装载与高效递送 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂的配制 |
| 2.2.2 PLNP的制备优化及表征 |
| 2.2.3 PLNP中内毒素含量测定 |
| 2.2.4 OVA和 CpG吸附率测定 |
| 2.2.5 atRA和 CpG释放曲线测定 |
| 2.2.6 流式细胞术检测免疫细胞表面分子表达 |
| 2.2.7 BMDCs的提取和诱导分化 |
| 2.2.8 BMDCs细胞摄取 |
| 2.2.9 细胞成熟和活化检测 |
| 2.2.10 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 阳离子脂质DC-Chol与 PLGA的合理化配比 |
| 2.3.2 at RA添加量对纳米颗粒的影响 |
| 2.3.3 PLNP的表征 |
| 2.3.4 抗原和CpG的释放曲线 |
| 2.3.5 PLNP促进BMDCs对抗原的内吞 |
| 2.3.6 PLNP促进BMDCs对抗原的交叉递呈 |
| 2.3.7 PLNP促进BMDCs活化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 利用“引流淋巴结放大”效应实现系统性免疫和肠道黏膜免疫的双重应答 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 主要试剂配制 |
| 3.2.2 注射部位免疫活化 |
| 3.2.3 引流淋巴结抗原靶向 |
| 3.2.4 免疫细胞归巢特性 |
| 3.2.5 小鼠肌肉注射免疫方案 |
| 3.2.6 血清IgG抗体滴度测定 |
| 3.2.7 肠道灌洗液IgA抗体滴度测定 |
| 3.2.8 小鼠脾脏脾细胞的分离和提取 |
| 3.2.9 抗原特异性CD8 T细胞染色 |
| 3.2.10 Elisopt法检测IFN-γ |
| 3.2.11 流式细胞术检测免疫细胞胞内分子表达 |
| 3.2.12 生化分析 |
| 3.2.13 小鼠主要脏器HE染色 |
| 3.2.14 动物实验伦理说明 |
| 3.2.15 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 注射部位免疫活化 |
| 3.3.2 引流淋巴结富集 |
| 3.3.3 利用引流淋巴结放大效应实现免疫细胞的肠道迁移 |
| 3.3.4 系统性免疫应答 |
| 3.3.5 肠道黏膜免疫应答 |
| 3.3.6 EV71 重组蛋白免疫 |
| 3.3.7 CpG和 atRA协同作用 |
| 3.3.8 安全性和生物相容性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 利用甘露糖基修饰的Pickering乳液提升短肽抗原和CpG的靶向递送 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 甘露糖基修饰PLGA纳米颗粒的制备 |
| 4.2.2 甘露糖基Pickering乳液的制备优化 |
| 4.2.3 Pickering乳液表面偶联核酸CpG |
| 4.2.4 抗原装载效率测定 |
| 4.2.5 乳液Man-PMPE-CpG的表征 |
| 4.2.6 乳液稳定性检测 |
| 4.2.7 内毒素和细胞毒性测定 |
| 4.2.8 细胞内吞和活化 |
| 4.2.9 数据处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 甘露糖基PLGA-Man纳米颗粒的制备和表征 |
| 4.3.2 Pickering乳液的制备优化 |
| 4.3.3 甘露糖基修饰的Pickeing核酸乳液的表征 |
| 4.3.4 内毒素测定和细胞毒性 |
| 4.3.5 甘露糖基靶向作用促进柔性识别 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 甘露糖基修饰的Pickering核酸乳液用于肿瘤免疫治疗 |
| 5.1 实验材料与设备 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 注射部位抗原停留时间 |
| 5.2.2 注射部位细胞募集 |
| 5.2.3 淋巴结活化 |
| 5.2.4 小鼠免疫方案 |
| 5.2.5 ELISOPT实验 |
| 5.2.6 小鼠T细胞杀伤能力检测 |
| 5.2.7 预防性肿瘤抑制实验 |
| 5.2.8 治疗性E.G7 肿瘤抑制实验 |
| 5.2.9 肿瘤浸润性T细胞 |
| 5.2.10 动物实验伦理 |
| 5.2.11 数据处理与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 注射部位 |
| 5.3.2 淋巴结富集和活化 |
| 5.3.3 体内免疫响应评价 |
| 5.3.4 体外细胞杀伤实验 |
| 5.3.5 肿瘤抑制效果 |
| 5.4 实验小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
四、黏膜免疫及其在疫苗研制中的应用（论文参考文献）
- [1]ETEC K99-SIgA复合物制备及其增强肠道黏膜免疫应答的研究[D]. 陈小燕. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]重组冷适应H9N2亚型禽流感减毒活疫苗的免疫效力及安全评价[D]. 薛静. 扬州大学, 2021(02)
- [3]新城疫病毒基因Ⅰ/Ⅶ型F和HN基因嵌合弱毒疫苗候选株LX-OAI4S的构建和免疫效力评价[D]. 姚瑶. 扬州大学, 2021(02)
- [4]ETEC 987P、K88重组干酪乳杆菌的构建及免疫效力评价[D]. 杨雨晴. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [5]结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用[D]. 宁唤唤. 西北大学, 2021(12)
- [6]抗原85复合物的致病机制及其在结核病疫苗研制中的应用进展[J]. 梁正敏,王元智,刘一朵,周向梅. 中国防痨杂志, 2020(11)
- [7]表达猪瘟病毒E2蛋白重组乳酸菌的构建及免疫效力评价[D]. 王翌. 中国农业科学院, 2020
- [8]可德兰多糖-季铵化壳聚糖纳米颗粒的制备及作为流感病毒亚单位鼻黏膜疫苗佐剂的研究[D]. 姜红蕾. 山东大学, 2020(02)
- [9]产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究[D]. 冯启峥. 东北农业大学, 2020(04)
- [10]多组分疫苗的合理化组装及其免疫应答效果研究[D]. 杜逸群. 江南大学, 2020(01)